CN102459337A - 具有增强的体内稳定性的抗神经生长因子(ngf)抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有包含稳定化铰链区突变的IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，并且其中所述抗体在食蟹猴体内显示异常长的血清半衰期。还提供包含所述抗NGF抗体的药物组合物，编码所述NGF抗体的核酸，表达所述NGF抗体的宿主细胞和使用所述抗体来治疗NGF相关性疾病或病状的方法。

Description

具有增强的体内稳定性的抗神经生长因子(NGF)抗体

发明背景

神经生长因子(NGF)是分泌型蛋白质，其在50多年前被发现为促进感觉和交感神经元的存活和分化的分子。NGF的β链独自负责NGF的神经生长刺激活性。β链同源二聚化并且合并到较大的蛋白质复合物中。NGF是被称为神经营养蛋白的神经营养因子家族的成员。NGF以高亲和力与被称为TrkA的原肌球蛋白受体激酶结合。NGF还能够结合被称为p75^NTR的受体，所述受体是肿瘤坏死因子受体超家族的一员并且还和其它神经营养蛋白相互作用。NGF的结构和功能概述于例如Sofroniew，M.V.等人(2001)Annu.Rev.Neurosci.24：1217-1281；Weismann，C.和de Vos，A.M.(2001)Cell.Mol.Life Sci.58：748-759；Fahnestock，M.(1991)Curr.Top.Microbiol.Immunol.165：1-26中。

尽管NGF最初是根据它能够促进神经元的存活和分化而鉴定的，但是越来越多的证据表明这些发育方面的作用仅仅是NGF生物学的一个方面。具体来说，NGF牵涉到持续性或慢性疼痛的传播和维持当中。例如，已证明局部和全身性施用NGF能引发痛觉过敏和异常疼痛(Lewin，G.R.等人(1994)Eur.J.Neurosci.6：1903-1912)。在人体内静脉内输注NGF引起全身肌痛，而局部施用除全身性效应外还诱发注射部位痛觉过敏和异常疼痛(Apfel，S.C.等人(1998)Neurology51：695-702)。此外，在某些形式的癌症中，过量NGF促进神经纤维的生长和浸润，从而诱发癌痛(Zhu，Z.等人(1999)J.Clin.Oncol.17：241-228)。

NGF参与慢性疼痛引起人们对基于抑制NGF作用的治疗方法有了广泛的关注(参见例如Saragovi，H.U.和Gehring，K.(2000)TrendsPharmacol.Sci.21：93-98)。例如，使用TrkA受体的可溶性形式来阻断NGF的活性，显示显著减少导致神经性疼痛的神经瘤的形成，而对病变神经元的细胞体不造成损伤(Kryger，G.S.等人(2001)J.HandSurg.(Am.)26：635-644)。

中和NGF活性的另一方法是使用抗NGF抗体，所述抗体的实例已有描述(参见例如PCT公布No.WO 2001/78698、WO 2001/64247、WO 2002/096458、WO 2004/032870、WO 2005/061540、WO2006/131951、WO 2006/110883；美国专利No.7,449,616；美国公布No.US 20050074821、US 20080033157、US 20080182978和US20090041717)。在神经性疼痛的动物模型(例如，神经干或脊神经结扎)中，全身性注射针对NGF的中和抗体预防异常疼痛与痛觉过敏(Ramer，M.S.和Bisby，M.A.(1999)Eur.J.Neurosci.11：837-846；Ro，L.S.等人(1999)Pain 79：265-274)。此外，在鼠类癌痛模型中用中和型抗NGF抗体进行治疗使疼痛显著减轻(Sevcik，M.A.等人(2005)Pain115：128-141)。

因此，鉴于以上所述，还需要其它NGF拮抗剂。

发明概述

本发明提供显示增强的体内稳定性的抗NGF抗体。具体来说，本发明提供包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含突变，优选为铰链区突变，并且其中所述抗体显示出异常长的终末消除半衰期，如在食蟹猴(cynomolgus monkey)体内的终末消除半衰期为至少15天且通常在约15天至约22天的范围内(或在15天至22天的范围内)，或在约15天至28天的范围内(或在15天至28天的范围内)，或在约21天至约28天的范围内(或在21天至28天的范围内)。这种稳定化抗NGF抗体(例如，铰链稳定化抗体)还显示在大鼠中的终末消除半衰期为至少8天，通常在约8天至约9天的范围内(或在8天至9天的范围内)。在其它实施方案中，稳定化抗NGF抗体(例如，铰链稳定化抗体)在人体内可以显示至少10天至30天、或至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或约10天至约40天范围内、或约15天至约30天范围内(或10天至40天范围内或15天至30天范围内)的平均终末消除半衰期。在其它实施方案中，稳定化抗NGF抗体(例如，铰链稳定化抗体)在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

优选地，IgG4恒定区中的突变为铰链区突变。甚至更优选地，IgG4恒定区中的铰链区突变包含对应于SEQ ID NO：9(所述序列显示人IgG4恒定区的野生型氨基酸序列)的氨基酸位置108的氨基酸位置处的丝氨酸的突变。因此，本发明提供具有人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，所述人IgG4恒定区含有包含对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处的丝氨酸突变的铰链区突变。更优选地，对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处的丝氨酸突变成脯氨酸。在一优选实施方案中，抗NGF抗体的人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。可选地，本文中描述其它可能的IgG4稳定化突变。

本发明的一优选抗NGF抗体是抗体PG110，其重链氨基酸序列示于SEQ ID NO：13中且其轻链氨基酸序列示于SEQ ID NO：16中。因此，本发明提供包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链。在另一实施方案中，本发明提供包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述抗体包含由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码的轻链。在另一实施方案中，本发明提供包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链的抗NGF抗体，其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天的终末消除半衰期(且通常在约15天至约22天范围内、或在15天至22天范围内、或在约15天至28天范围内、或在15天至28天范围内、或在约21天至约28天范围内、或在21天至28范围内)，和/或在人体内至少10至30天的终末消除半衰期(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在约10天至约40天范围内、或在约15天至约30天范围内、或在10天至40天范围内、或在15天至30天范围内)。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。优选地，重链由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码。优选地，所述抗体包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链。优选地，轻链由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码。

在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1(其显示PG110的重链可变区)的氨基酸序列的重链可变区。在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：2(其显示PG110的轻链可变区)的氨基酸序列的轻链可变区。在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。在另一实施方案中，抗NGF抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区(其中SEQ ID NO：3、4和5分别显示PG110的重链可变区CDR 1、2和3)。在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区(其中SEQ ID NO：6、7和8分别显示PG110的轻链可变区CDR 1、2和3)。在另一实施方案中，抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区并且包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

优选地，所述抗NGF抗体具有一种或多种以下功能性质：

a)结合人NGF但不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；

b)以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF；

c)抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合；

d)抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖；

e)抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；

f)抑制NGF依赖性PCI2细胞神经突增生。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体在施用于受试者时不显示反弹效应。例如，可选择施用抗体的剂量和给药频率以使得抗体在施用于受试者时不显示反弹效应。

在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后本发明的抗NGF抗体能够长期缓解受试者的疼痛，例如持续时间为至少约一周、或至少约两周、或至少约四周、或至少约八周、或至少约十二周、或至少约一周至约十二周、或至少约四周至约十二周、或至少约八周至约十二周，或持续时间为至少一周、或至少两周、或至少四周、或至少八周、或至少十二周、或至少一周至十二周、或至少四周至十二周或至少八周至十二周。

在一特别优选的实施方案中，本发明提供具有延长的终末消除半衰期和延长的疼痛缓解持续时间的组合有利特征的抗NGF抗体。因此，本发明还提供包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含突变(优选为铰链区突变)，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在约10天至约40天范围内、或在约15天至约30天范围内(或在10天至40天范围内或在15-30天范围内)的终末消除半衰期，并且其中在向人受试者施用单一剂量的抗体后所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周至约十二周、或至少一周至十二周、或至少约四周至约十二周或至少四周至十二周(或在向人受试者施用单一剂量的抗体后持续时间为至少一周、或至少两周、或至少四周、或至少八周、或至少十二周、或一周至十二周、或四周至十二周或八周至十二周)。优选地，铰链区突变包含对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处丝氨酸的突变，优选为对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处丝氨酸到脯氨酸的突变。更优选地，所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在各个实施方案中，抗体可显示一种或多种本文所述的功能性质。在一优选实施方案中，所述抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

在另一实施方案中，本发明提供包含人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。优选地，所述抗体在人体内具有至少10天至30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天或约10天至约40天范围内或约15天至约30天范围内(或10天至40天范围内或15天至30天范围内)的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。所述抗体可以进一步显示一种或多种另外的功能性质，如结合人NGF而不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；和/或抑制NGF依赖性PCI2细胞神经突增生。优选地，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周至约十二周、或至少约四周至约十二周、或至少约八周至约十二周、或至少一周至十二周、或至少四周至十二周或至少八周至十二周(或至少一周、或至少四周、或至少八周、或至少十二周、或一周至十二周、或四周至十二周或八周至十二周)。优选地，所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，或所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，或所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR1、2和3的重链可变区以及含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。优选地，所述抗体包含含有SEQID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，或所述抗体包含含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或者所述抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

在各个优选实施方案中，本发明提供具有以下特征的抗NGF抗体：

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)包含铰链区突变的恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含突变，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含突变，并且其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天的终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。

在各个实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以是例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或为已经去除了潜在T细胞表位的抗体。

在另一方面，本发明提供包含本发明的抗NGF抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一方面，本发明提供减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的方法，所述方法包含向受试者施用本发明的抗NGF抗体。NGF相关性疾病和病状的非限制性实例包括炎性痛、手术后疼痛、神经性疼痛、骨折痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、癌痛、骨关节炎或类风湿性关节炎痛、坐骨神经痛、与镰状细胞危象相关的疼痛、头痛、痛经、子宫内膜异位、肌肉骨骼痛、慢性下背痛、纤维肌痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、膀胱炎、间质性膀胱炎、切口疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创伤引起的疼痛、与外伤相关的疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、强直性脊柱炎、围关节病变、骨转移引起的疼痛、HIV引起的疼痛、红斑性肢痛病或由胰腺炎或肾结石引起的疼痛。NGF相关性疾病和病状的其它实例包括恶性黑色素瘤、肖格伦综合症(Sjogren’s syndrome)和哮喘，如具有严重气道高反应性的不受控制性哮喘和顽固性咳嗽。根据本发明的方法治疗的特别优选的疾病和病状包括炎性痛(特别是骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛)、肌肉骨骼痛(特别是慢性下背痛)、神经性疼痛(特别是糖尿病性神经疾病)、癌痛和骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎/疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤相关的疼痛以及手术后疼痛。

抗体可例如静脉内、皮下(例如，通过注射笔或皮下植入物)、肌肉内或关节内施用，不过本文也描述其它合适的施用途径。优选地，抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内的剂量或0.1mg/kg至30mg/kg范围内的剂量施用。抗体可以例如约3μg/kg至约3000μg/kg范围内的剂量施用，其中优选剂量包括100μg/kg或300μg/kg。在其它实施方案中，抗体以0.1mg/kg至30mg/kg范围内、或0.1mg/kg至20mg/kg范围内、或0.1mg/kg至10mg/kg范围内、或1mg/kg至30mg/kg范围内、或1mg/kg至20mg/kg范围内或1mg/kg至10mg/kg范围内的剂量施用，不过本文也描述其它适合剂量和剂量范围。此外，可使用抗体的固定剂量制剂。

抗体可单独施用或与一种或多种另外的药剂组合施用。例如，第二药剂如NSAID、止痛剂(例如，阿片类止痛剂)、局部麻醉剂、神经阻断剂、酚阻断剂、治疗性抗体、抗惊厥剂、抗抑郁剂、局部外用辣椒素、类固醇或抗病毒剂可以与本发明的抗NGF抗体组合施用。用于与本发明的抗体组合治疗的特别优选的第二药剂包括阿片类止痛剂，如吗啡等。用于组合治疗的其它优选的第二药剂包括TrkA抑制剂和蛋白激酶C(PKC)抑制剂。

在一优选的实施方案中，本发明提供减弱或抑制受试者的疼痛的方法，所述方法包含向受试者施用包含人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且其中在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解受试者的疼痛的持续时间为至少四周至十二周(或至少一周至十二周、或至少八周至十二周、或四周至十二周、或一周至十二周、或八周至十二周、或至少一周、或至少四周、或至少八周、或至少十二周)。优选地，抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区和含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。优选地，抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。优选地，抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内的剂量或0.1mg/kg至30mg/kg范围内的剂量施用。优选地，抗体通过静脉内或皮下施用。优选地，抗体在人体内具有至少10天至30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天或约10天至约40天范围内、或约15天至约30天范围内、或10天至40天范围内、或15天至30天范围内)的终末消除半衰期。

在另一优选的实施方案中，本发明提供减弱或抑制受试者的神经生长因子(NGF)相关性疾病或病状以使得在受试者体内避免反弹效应的方法，所述方法包含向受试者施用包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含铰链区突变，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在约10天至约40天范围内、或约15天至约30天范围内、或10天至40天范围内、或15天至30天范围内)的终末消除半衰期，并且其中所述抗体以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。优选地，人IgG4恒定区在对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处包含突变。优选地，对应于SEQID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处的丝氨酸突变成脯氨酸。优选地，所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。优选地，抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区和含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。优选地，抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，所述抗体与包含含有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。优选地，NGF相关性疾病或病状是选自由以下组成的组的疼痛：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。优选地，抗NGF抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内或0.1mg/kg至30mg/kg范围内的剂量施用。优选地，抗体通过静脉内或皮下施用。

在另一方面，本发明提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途。NGF相关性疾病和病状的非限制性实例包括上文所述的那些。优选的NGF相关性疾病或病状是疼痛。优选地，疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

在另一方面，本发明提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的疼痛的药物的用途，以使得在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，受试者的疼痛减弱或抑制的持续时间为至少约一周至约十二周、或至少约四周至约十二周、或至少约八周至约十二周(或持续时间为一周至十二周、或四周至十二周、或八周至十二周、或至少一周、或至少两周、或至少四周、或至少八周或至少十二周)。

在另一方面，本发明提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途，以使得在受试者体内避免反弹效应。具体来说，抗体以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用。

在其它方面，本发明提供编码本发明的抗NGF抗体的重链和/轻链的核酸分子，以及包括所述载体的载体(例如，表达载体)，包含所述载体的宿主细胞，和使用本发明的宿主细胞表达抗NGF抗体的方法。

在另一方面，本发明提供减弱或抑制受试者的神经生长因子(NGF)相关性疾病或病状以使得在受试者体内避免反弹效应的方法。所述方法包含向受试者施用包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含突变(优选为铰链区突变)并且其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天、更优选至少21天的终末消除半衰期，且其中所述抗体以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用。在另一实施方案中，抗体在食蟹猴体内具有在约15天至约22天(或15天至22天)范围内、或约15天至约28天(或15天至28天)范围内或约21天至约28天(或21天至28天)范围内的终末消除半衰期。在另一实施方案中，抗体在大鼠体内具有至少8天的终末消除半衰期。在另一实施方案中，抗体在人体内具有至少10天至30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天或在约10天至约40天范围内、或约15天至约30天范围内、或10天至40天范围内或15天至30天范围内)的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。优选的突变包括上文所述的那些突变。优选的抗体包括具有如上文所述的序列和/或其它功能性质的那些抗体。NGF相关性疾病和病状的非限制性实例包括上文所述的那些。

本发明还提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途，以使得在受试者体内避免反弹效应。

本文还提供包含本发明的抗NGF抗体的试剂盒。例如，试剂盒可以包含抗NGF抗体和所述抗体用于治疗NGF相关性疾病或病状的使用说明。

附图简述

图1是显示如通过ELISA所测定，PG110与人神经生长因子(NGF)结合而不与人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)结合的图。

图2A是显示如通过放射性标记配体结合实验所测定，PG110抗体抑制NGF与TrkA受体结合的图。

图2B是显示如通过放射性标记配体结合实验所测定，PG110抗体抑制NGF与p75^NTR受体结合的图。

图3A是显示PG110抗体对由人NGF刺激的TF-1细胞增殖的抑制作用的图。

图3B是显示PG110抗体对由大鼠NGF刺激的TF-1细胞增殖的抑制作用的图。

图3C是显示PG110抗体对由小鼠NGF刺激的TF-1细胞增殖的抑制作用的图。

图4是显示PG110抗体处理对大鼠的皮肤病变的作用的图。

发明详述

本发明涉及如通过例如在食蟹猴体内异常长的终末消除半衰期所证明显示增强的体内稳定性的抗神经生长因子抗体。本发明的抗体包括通过将突变引入IgG4恒定区中，优选引入所述恒定区的铰链区中对所述抗体的人IgG4恒定区进行的修饰。

为使本发明可以更容易被人理解，首先定义某些术语。另外的定义在整个详细描述中阐述。

I.定义

术语“神经生长因子”或“NGF”在本文中可互换使用并且包括变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人NGF特异的抗体在某些情况下可以与来自除人之外的其它物种的NGF交叉反应。在其它实施方案中，对人NGF特异的抗体可对人NGF完全特异并且可能不显示物种或其它类型的交叉反应性。术语“人NGF”是指如包含人NGF-β链的氨基酸序列的人序列NGF，其前体形式的Genbank登记号为NP_002497，并且由Genbank登记号NM_002506的核苷酸序列编码。人NGF-β链序列可能与Genbank登记号NP_002497的人NGF-β的不同之处在于例如具有保守取代或在非保守区中具有取代，其中所述人NGF-β具有与Genbank登记号NP_002497的人NGF-β基本上相同的生物功能。术语“大鼠NGF”是指如包含大鼠NGF-β链的氨基酸序列的大鼠序列NGF，其前体形式的Genbank登记号为XP_227525，并且由Genbank登记号XP_227525的核苷酸序列编码。术语“小鼠NGF”是指如包含小鼠NGF-β链的氨基酸序列的小鼠序列NGF，其前体形式的Genbank登记号为NP_038637，并且由Genbank登记号NM_013609的核苷酸序列编码。

本文所用的术语“TrkA受体”是指NGF受体，在本领域中也称为原肌球蛋白激酶受体A和1型神经营养酪氨酸激酶受体(NTRK1)。人TrkA受体的示例性非限制性序列包括Genbank登记号NP_001012331(同种型1)、NP_002520(同种型2)和NP_001007793(同种型3)的氨基酸序列。

本文所用的术语“p75^NTR受体”是指分子量为约75kDa并且结合NGF和其它神经营养蛋白的神经营养蛋白受体，这种受体描述于例如Bothwell，M.(1996)Science 272：506-507中。人p75^NTR受体的示例性非限制性序列为Genbank登记号NP_002498的氨基酸序列，由Genbank登记号NM_002507的核苷酸序列编码。

本文关于抗NGF抗体所用的术语“终末消除半衰期”是指如在已施用了抗体的受试者的血清中所测量的一旦抗体吸收和重新分布完成后抗体浓度降低一半所需要的时间量。当使用一组受试者时，可使用所述受试者体内的终末消除半衰期的几何平均值作为抗体的终末消除半衰期的量度。

本文中关于抗NGF抗体所用的术语“药理学半衰期”是指在体内维持药效的平均时间量(药效的MRT)。其可使用以下公式计算为第一时刻基线校正效应-时间曲线的面积(AUMEC)与随时间累积的基线校正药物效应曲线的面积(效应时间曲线下的面积，AUEC)的比率：

当使用一组受试者时，可使用所述受试者体内药理学半衰期的几何平均值作为抗体的药理学半衰期的量度。

本文中所用的术语“铰链区突变”是指免疫球蛋白恒定结构域的铰链区中的突变，如点突变、取代、添加或缺失。

本文中所用的术语“抑制”是指生物活性的任何统计上显著的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

如在本文中互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”，包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其保留本文所述的增强的体内稳定性的单链。“抗体”包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有较保守的区，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，所述三个CDR和四个FR从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的宿主组织或因子的结合。

本文中所用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同源的抗体获得抗体，即构成所述群的单个抗体是相同的，除了可以较少量存在的可能的天然产生的突变。单克隆抗体在针对单一抗原位点时具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可使用任何本领域公认的技术制备，例如Kohler等人(1975)Nature，256：495所描述的杂交瘤方法，例如(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)所描述的转基因动物，重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)或使用例如Clarkson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中所述的技术使用噬菌体抗体文库进行制备。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体，并且可以天然存在或者重组产生。

术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)从免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经过转化以表达抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)使用噬菌体展示技术从重组、组合抗体文库(例如，含有人抗体序列)分离的抗体，和(d)通过涉及免疫球蛋白基因序列(例如，人免疫球蛋白基因)与其它DNA序列的剪接的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组抗体可以具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而在某些实施方案中，所述重组人抗体可以经受体外诱变并且因此所述重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是虽然来源于人种系V_H和V_L序列并与这些序列相关，但可能并不天然存在于体内的人抗体种系谱系内的序列。

术语“嵌合免疫球蛋白”或抗体是指可变区是来源于第一物种而恒定区是来源于第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可以例如通过基因工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建。

术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指包括至少一个人源化抗体或免疫球蛋白链(即，至少一个人源化轻链或重链)抗体或免疫球蛋白。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即，“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指具有包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDR)(例如，至少一个CDR，优选两个CDR，更优选三个CDR)的可变区并且进一步包括恒定区(例如在轻链的情况下至少一个恒定区或其部分，并且在重链的情况下优选三个恒定区)的免疫球蛋白或抗体链(即分别为轻链或重链)。术语“人源化可变区”(例如“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(CDR)的可变区。

本文中所用的术语“人抗体”预期包含包括具有其中框架区和CDR区都是来源于的人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体，例如，如Kabat等人所述(参见Kabat等人(1991)Sequences of proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版号91-3242)。此外，如果抗体含有恒定区，那么所述恒定区也是来源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。然而，本文中所用的术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列移植到人框架序列上的抗体。

本文中所用的“分离的抗体”预期指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合NGF的分离的抗体基本上不含特异性结合除NGF以外的抗原的抗体)。另外，分离的抗体通常基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。

本文所使用的术语“特异性结合”、“特异性地结合”、“选择性结合”和“选择性地结合”是指抗体或其抗原结合部分对特定的抗原或表位显示显著的亲和力而一般不显示与其它抗原和表位的明显的交叉反应性。“显著的”或优选的结合包括以至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和力进行结合。大于10⁷M^-1，优选大于10⁸M^-1的亲和力更优选。处于本文所述值中间的值也预期处于本发明的范围内并且优选结合亲和力可以表示为亲和力的范围，例如10⁶至10¹0M^-1，优选10⁷至10¹⁰M^-1，更优选10⁸至10¹⁰M^-1。“不显示明显交叉反应性”的抗体是不会显著结合于不需要的实体(例如，不需要的蛋白质实体)的抗体。特异性结合或选择性结合可根据用于测定这种结合的任何本领域公认的手段进行测定，包括例如根据斯卡查分析(Scatchardanalysis)和/或竞争性结合测定。

本文所使用的术语“K_D”预期指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或者抗体对抗原的亲和力。在一个实施方案中，根据本发明的抗体以约100pM或以下(即，或更佳)(例如，约90pM或约80pM或约70pM或约60pM或约50pM或约40pM或约30pM)的亲和力(K_D)结合抗原(例如，NGF)，如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量。在优选实施方案中，抗体以在约25-35pM的范围内的亲和力(K_D)结合NGF。

本文所使用的术语“K_ass”预期指抗体结合成抗体/抗原复合物的结合速率常数。

本文所使用的术语“K_diss”预期指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。

本文所使用的术语“IC₅₀”是指在体外或体内测定中将反应抑制到最大抑制反应的50％的水平(即，最大抑制反应和未处理反应之间的一半)时抗体的浓度。

本文所使用的术语“核酸分子”预期包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。本文在提到编码结合NGF的抗体或抗体部分(例如，V_H、V_L、CDR3)的核酸时所使用的术语“分离的核酸分子”预期指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合除NGF以外的抗原的抗体的其它核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列在人基因组DNA中可以天然侧接所述核酸。

术语“可操作地连接”是指使一核酸序列与另一核酸序列处于功能性关系中。例如，如果信号序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质，那么信号序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接于所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子可操作地连接于所述编码序列；或者如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，那么所述核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。一般来说，“可操作地连接”是指所连接的DNA序列是邻接的，且在分泌前导序列的情况下是邻接的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在适宜的限制位点进行连接来实现。如果这些位点不存在，那么可以根据常规实践使用合成寡核苷酸接头或连接子。当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系中时，所述核酸“可操作地连接”。举例来说，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子可操作地连接于所述编码序列。关于转录调控序列，可操作地连接意指所连接的DNA序列是邻接的，且在有必要联接两个蛋白质编码区的情况下是邻接的并且处于阅读框中。对于转换序列来说，可操作地连接表示所述序列能够影响转换重组。

本文中所使用的术语“载体”预期指一种核酸分子，其能够运输与其连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以向其中连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接至所述病毒基因组。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般来说，可用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本发明预期包括能起同等功能的这些其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本文中所使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)预期指已引入了重组表达载体的细胞。应了解，这些术语预期不仅指特定受试者细胞，而且也指这种细胞的后代。因为由于突变或环境影响而导致可能在后代中存在某些改变，所以这些后代可能实际上不同于亲本细胞，但仍包括在本文中所使用的术语“宿主细胞”的范围内。

本文中所使用的术语“治疗”是指本文中所述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向受试者(例如，患有NGF相关性疾病或病状的受试者)施用本发明的抗体以便预防、治愈、延缓所述疾病或病状，降低所述疾病或病状的严重性，或改善所述疾病或病状的一种或多种症状。

本文中所使用的术语“NGF相关性疾病或病状”是指其中NGF活性牵涉于所述疾病或病状的一种或多种症状，与所述疾病或病状的一种或多种症状相关或者介导或所述疾病或病状的一种或多种症状的疾病或病状。

本文中所使用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。在特定实施方案中，受试者是人。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

本文中所使用的术语“反弹效应”是指在单次或重复施用后效力的初始期后在受试者中发生NGF掩蔽剂(如抗NGF抗体)功效减弱。举例来说，用抗NGF抗体进行治疗可能最初缓解例如由于炎症或神经损伤或其它病因造成的疼痛，但随后是止痛功效减弱时期，在这段时期内疼痛最终变得大致与治疗前一样强烈或者更强。在另一实例中，抗NGF抗体可以在单次或重复施用后的一段时间在受试者体内显示最初效力，如施用后一周的时间(例如，施用后1至7天)，接着是功效减弱时期，如施用后1至2周的时间(例如，施用后7至14天)。此“反弹”期之后可以是抗NGF抗体的功效恢复期。例如，单次或重复施用抗NGF抗体后可以存在痛觉丧失的双相曲线，具有功效降低或者甚至痛觉增强的中间期。这种反弹效应可以在例如临床疼痛研究、疼痛实验模型和/或抗NGF抗体的其它模型中进行评估。这种反弹效应可能与例如反弹期中受试者的疼痛增强和/或不良事件增加(如异常疼痛到触痛范围内的异常感觉、感觉异常和感觉过敏或感觉迟钝)有关。尽管不预期受机制限制，但反弹效应可能由NGF表达改变、TrkA或p75受体表达或信号转导改变或者导致在单次或重复施用抗NGF抗体后功效的初始期后功效暂时减弱的任何其它机制引起。

本发明的各个方面在以下章节中更详细地描述。

II.本发明的抗体

A.增强的体内稳定性

本发明的抗NGF抗体的特征在于具有增强的体内稳定性，如由在体内观察到的长终末消除半衰期所证明。尽管不预期受机制限制，但认为抗体的终末消除半衰期延长是由抗体的清除率降低引起而不是由抗体的分布体积增加。本发明的抗体包含含有突变的人IgG4恒定区。优选的突变是铰链区突变。优选地，铰链区突变包含SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸的突变(其中SEQ ID NO：9显示野生型人IgG4恒定区的氨基酸序列)。更优选地，铰链区突变包含SEQ IDNO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸突变成脯氨酸。在优选实施方案中，人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

本发明的抗NGF抗体显示异常长的终末消除半衰期，如在食蟹猴体内的终末消除半衰期为至少15天，且通常在约15天至约22天范围内(或在15天至22天范围内)，或在约15天至约28天范围内(或在15天至28天范围内)，或在约21天至约28天范围内(或在21天至28天范围内)。这种稳定化抗NGF抗体还显示在大鼠体内的终末消除半衰期为至少8天，通常在约8天至约9天的范围内(或在8天至9天的范围内)。如实施例4中详细描述，本发明的抗NGF抗体PG110在食蟹猴体内显示至少15天且通常更长的平均终末消除半衰期。例如，在一项食蟹猴研究中，观察到约15天至约22天范围内的平均终末消除半衰期。在另一项食蟹猴研究中，观察到约21天至约28天范围内的平均终末消除半衰期。此外，PG110在大鼠体内显示约8天至约9天的平均终末消除半衰期。另外，因为本领域中已知IgG在人体内的终末消除半衰期约为在猴体内的两倍，因此可以预测，本发明的抗NGF抗体(如PG110)在人体内将具有至少10天至30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或更优选至少30天或至少40天、或在约10天至约40天的范围内(或在10天至40天的范围内)或在约15天至约30天的范围内(或在15天至30天的范围内)的终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。如实施例8中进一步描述，本发明的抗NGF抗体已显示在人体内具有上述范围内的平均药理学半衰期。

PG110在食蟹猴体内的终末消除半衰期显著长于本领域中报道的其它IgG4抗体在食蟹猴体内的半衰期。例如，CDP571(一种IgG4抗TNF抗体)在食蟹猴体内的半衰期据报道为约40小时至90小时(约1.6天至3.8天)(参见Stephens，S.等人(1995)Immunol.85：668-674)。类似地，那他珠单抗(natalizumab)(一种IgG4抗整联蛋白抗体)在食蟹猴中半衰期据报道为约3天(参见Refusal CHMP Assessment Report forNatalizumab，European Medicines Agency，London，2007年11月15日，Doc.Ref.EMEA/CHMP/8203/2008)。

本发明中所用的优选铰链区突变是SEQ ID NO：9中位置108的丝氨酸突变成脯氨酸。这一突变在本领域中先前已有描述(参见Angal，S.等人(1993)Mol.Immunol.30：105-108)并且据报道消除IgG4分子的异质性，尤其是含有单一重链和单一轻链的半抗体的形成。因此，本发明还涵盖SEQ ID NO：9的位置108处除脯氨酸以外的氨基酸的取代，其中所述取代在消除IgG4分子的异质性方面(例如，半抗体的形成)达到与丝氨酸突变成脯氨酸相同的效果。位置108处的突变消除IgG4分子的异质性的能力可如上文Angal等人(1993)所述进行评估。

除了SEQ ID NO：9的位置108处的修饰以外或者替代这一修饰，还描述了提高FcRn-IgG相互作用的亲和力从而使被修饰的IgG的半衰期延长的其它IgG铰链区突变。这些其它或替代修饰的实例包括对应于以下的一个或多个IgG恒定区残基的突变：Thr250、Met252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu308、Met428、His433和/或Asn434(如以下文献中进一步描述：Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604；Petkova，S.B.等人(2006)Int.Immunol.18：1759-1769；Hinton，P.R.等人(2004)J.Biol.Chem.279：6213-6216；Kamei，D.T.等人(2005)Biotechnol.Bioeng.92：748-760；Vaccaro，C.等人(2005)NatureBiotechnol.23：1283-1288；Hinton，P.R.等人(2006)J.Immunol.176：346-356)。

另外，替代铰链区突变，也已描述了IgG4恒定区的其它稳定化修饰。例如，在其它实施方案中，人IgG4恒定区的突变包括IgG4 CH3区被IgG1 CH3区取代、IgG4 CH2和CH3区被IgG1 CH2和CH3区取代，或者IgG4恒定区位置409的精氨酸(根据Kabat编号)被赖氨酸取代，如美国专利公布20080063635中所进一步描述。在其它实施方案中，人IgG4恒定区的突变包括Arg409、Phe405或Lys370(根据Kabat编号)的取代，如Arg409被Lys、Ala、Thr、Met或Leu取代，或者Phe405被Ala、Val、Gly或Leu取代，如PCT公布WO 2008/145142中所进一步描述。

可以使用标准重组DNA技术将期望的突变引入人IgG4恒定区结构域中，所述技术如编码人IgG4恒定区的核酸的定点诱变或PCR介导的诱变。此外，可将编码抗体重链可变区的DNA引入编码突变型人IgG4恒定区的表达载体中以使得可变区与恒定区可操作地连接，由此产生编码其中恒定区是突变型人IgG4恒定区的全长免疫球蛋白重链的载体。表达载体接着可以用于使用标准重组蛋白质表达方法来表达全长免疫球蛋白重链。例如，本发明的抗NGF抗体可以如实施例1中的更详细描述进行构建。

抗体的终末消除半衰期可以使用本领域中已知的标准方法进行测定。例如，在将抗体施用于受试者(例如，食蟹猴、Sprague-Dawley大鼠)后，可在施用后的不同时间点获得血样，并且可以使用本领域中已知用于测定抗体浓度的技术(如ELISA测定)测定来自血样的血清中抗体的浓度。抗体末端半衰期的计算可以使用已知的药物动力学方法，例如使用设计用来计算药物动力学参数的电脑系统和软件(其一非限制性实例是具有WinNonlin软件的SNBL USA药物动力学分析系统)来完成。

B.抗体可变区

用于本发明抗NGF抗体中的优选抗体可变区是PG110抗体的重链和轻链可变区。PG110的重链可变区示于SEQ ID NO：1中且PG110的轻链可变区示于SEQ ID NO：2中。因此，在一个实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区。在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。

PG110重链的全长氨基酸序列(可变区与恒定区)示于SEQ ID NO：13中。这一重链可以由包括前导序列或信号序列的前体重链(如SEQID NO：12中所示的氨基酸序列)制备。SEQ ID NO：12的前体重链由SEQ ID NO：11中所示的核苷酸序列编码。

PG110轻链的全长氨基酸序列(可变区与恒定区)示于SEQ ID NO：16中。这一轻链可以由包括前导序列或信号序列的前体轻链(如SEQID NO：15中所示的氨基酸序列)制备。SEQ ID NO：15的前体轻链由SEQ ID NO：14中所示的核苷酸序列编码。

因此，在另一实施方案中，本发明提供包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链的抗NGF抗体，其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天的血清半衰期。在另一实施方案中，食蟹猴体内的血清半衰期可以在约15天至约22天的范围内(或在15天至22天的范围内)。在另一实施方案中，大鼠体内的血清半衰期可以是至少8天或在约8天至约9天的范围内(或在8天至9天的范围内)。在其它实施方案中，人体内的血清半衰期可以是至少10天至30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或至少40天或在约10天至约40天范围内(或在10天至40天范围内)或在约15天至约30天范围内(或在15天至30天范围内)。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)、或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。优选地，重链由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码。优选地，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。优选地，轻链由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码。

在另一实施方案中，本发明提供包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链的抗NGF抗体。

在另一实施方案中，本发明提供包含由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码的轻链的抗NGF抗体。

鉴于PG110的结合特异性由可变结构域的互补决定区(CDR)提供，因此在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含PG110的重链、PG110的轻链或两者的CDR。PG110的重链CDR 1、2和3分别示于SEQ ID NO：3、4和5中。PG110的轻链CDR 1、2和3分别示于SEQ ID NO：6、7和8中。因此，在一个实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区。在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区并且包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以包含含有与PG110的重链和/或轻链可变区同源的氨基酸序列的重链和轻链可变区，并且其中所述抗体保留由PG110所表现的增强的体内稳定性。例如，抗NGF抗体的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％同源，更优选至少95％同源，更优选至少97同源％并且甚至更优选至少99％同源的氨基酸序列。抗NGF抗体的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少90％同源，更优选至少95％同源，更优选至少97同源％并且甚至更优选至少99％同源的氨基酸序列。

如本文中所使用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于这两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要引入以便获得这两个序列的最佳比对的间隙数和各间隙长度时由这些序列所共有的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置数/位置总数×100)。序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))并且使用PAM120加权残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4来测定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可以使用已经并入GCG软件包(可以在http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法并且使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及间隙加权16、14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以包含含有PG110的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列的重链和轻链可变区，但其中已在所述序列中引入了一个或多个保守性取代但所述抗体仍保留由PG110所表现的增强的体内稳定性。例如，抗NGF抗体的重链可变区可以包含除与SEQ ID NO：1相比具有1、2、3、4或5个保守性氨基酸取代外与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同的氨基酸序列。抗NGF抗体的轻链可变区可以包含除与SEQ ID NO：2相比具有1、2、3、4或5个保守性氨基酸取代外与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

本文中所用的术语“保守性氨基酸取代”预期指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合或稳定性特征的氨基酸修饰。所述保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术引入本发明的抗体中，所述标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变。保守性氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，PG110的可变区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换并且可以使用本文所述的功能性测定测试改变的抗体的保留功能。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体包含与PG110抗体结合NGF上的相同表位或者与PG110交叉竞争与NGF的结合的抗原结合区(即，可变区)。因此，在一个实施方案中，本发明的抗NGF抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

所述交叉竞争抗体可以在标准NGF结合测定中基于其与PG110交叉竞争的能力进行鉴定。例如，可以使用标准ELISA测定，其中将重组NGF蛋白(例如，人NGF-β)固定于板上，对一种抗体进行荧光标记，并且评估未标记抗体竞争掉所标记抗体的结合的能力。另外地或可选地，可以使用BIAcore分析来评估抗体交叉竞争的能力。可用于测试抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合的能力的适合的结合测定更详细描述于实施例2中。

在其它实施方案中，本发明的抗NGF抗体表现PG110抗体的一种或多种功能性质。例如，本发明的抗NGF抗体可以表现一种或多种以下功能性质：

a)结合人NGF但不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；

b)以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF；

c)抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合；

d)抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖；

e)抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；

f)抑制NGF依赖性PC12细胞神经突增生。

这些功能性质可以使用实施例2和3中详细阐述的体外测定进行评估。关于抗体与人NGF的特异性结合，本文中所用的术语“不结合脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)”预期指在标准结合测定(例如，ELISA或实施例中所述的其它适合的体外测定)中所观察到抗体与BDNF、NT-3或NT-4的结合的量和结合的背景水平(例如，对照抗体)相当，例如不超过背景水平的2倍，或与同人NGF的结合相比与BDNF、NT-3或NT-4的结合小于5％(其中与人NGF的结合的水平设定为100％结合)。

在另一实施方案中，本发明提供包含人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列(或者其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸的突变，优选位置108处的丝氨酸突变成脯氨酸)，并且其中所述抗体以100pM或以下的K_D(或者300pM或以下、200mP或以下、150pM或以下、75pM或以下或者50pM或以下的K_D)结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀(或者500pM或以下、400pM或以下、300pM或以下或者200pM或以下的IC₅₀)抑制NGF与TrkA或p75^NTR结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀(或者150ng/ml或以下、100ng/ml或以下、75ng/ml或以下或者40ng/ml或以下的IC₅₀)抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。优选地，所述抗体在人体内具有至少10天至30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天或约10天至约40天范围内(或10天至40天范围内)、或约15天至约30天范围内(或15天至30天范围内)的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在人体内可以显示至少30天、或至少35天、或至少40天、或至少四周至六周范围内(或四周至六周范围内)、或至少四周至七周范围内(或四周至七周范围内)或至少四周至八周范围内(或四周至八周范围内)的平均药理学半衰期。另外地或可选地，所述抗体在食蟹猴体内可以显示至少15天，且通常在约15天至约22天范围内(或在15天至22天范围内)、或在约15天至约28天范围内(或在15天至28天范围内)或在约21天至约28天范围内(或在21天至28天范围内)的平均终末消除半衰期。另外地或可选地，所述抗体在大鼠体内可以显示至少8天，通常在约8天至约9天范围内(或在8天至9天范围内)的终末消除半衰期。所述抗体可以进一步显示一种或多种其它功能性质，如结合人NGF而不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；和/或抑制NGF依赖性PC12细胞神经突增生。优选地，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周至约十二周。优选地，所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，或所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，或所述抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ IDNO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区以及含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。优选地，所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，或所述抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区以及含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，或者所述抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体在施用于受试者时不显示反弹效应(例如，抗体以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用)。反弹效应(其中抗NGF抗体在单次或重复施用后效力的初始时期后在受试者体内显示功效减弱)已在其它抗NGF抗体的动物模型和临床研究中都有报道。例如，报道了在大鼠的慢性缩窄性损伤(CCI)模型中抗大鼠NGF抗体的这种效应，称为“反弹现象”(Ro，L-S.等人(1999)Pain 79：265-274)。另外，报道了利用抗NGF抗体tanezumab(也称为RN624、E3，CAS登记号880266-57-9)进行的临床疼痛研究，其中观察到在最初的止痛期后有一段不良事件增加的时期，如对触摸敏感和‘针刺’感(参见Hefti，Franz F.的报告，RinatNeuroscience，LSUHSC，Shreveport，Louisiana，2006年9月26日)。尽管不预期受机制限制，但认为本发明抗NGF抗体的终末消除半衰期延长使其可避免表现反弹效应。因此，本发明的抗NGF抗体的其它优势包括与其它现有技术抗NGF抗体相比更加一致和延长的体内活性。鉴于本发明的抗NGF抗体的延长的终末消除半衰期，可以使用较低剂量(与其它抗NGF抗体相比)，并且必要时可以更频繁的间隔使用所述抗体，以使得可选择剂量和时序治疗方案以使得在受试者体内避免反弹效应。

在另一实施方案中，本发明的抗NGF抗体能够长时间缓解受试者的疼痛，例如在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体能够缓解疼痛的持续时间为至少约一周至约十二周(或一周至十二周)。在一个实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周(或至少一周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约两周(或至少两周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周(或至少四周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约八周(或至少八周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约十二周(或至少十二周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周(或四周至十二周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约八周至约十二周(或八周至十二周)。

抗体缓解受试者的疼痛的能力可以使用本领域中已确立的测定进行评估。用于评估抗NGF抗体缓解疼痛的持续时间的适合的动物模型描述于例如PCT公布No.WO 2006/131951和美国专利公布20080182978中。所述动物模型的非限制性实例包括由坐骨神经的慢性缩窄引发的神经性疼痛模型、涉及在后爪上作切口的手术后疼痛模型、涉及完全弗氏佐剂(CFA)诱发的关节炎的类风湿性关节炎疼痛模型和如Halvorson，K.G.等人(2005)Cancer Res.65：9426-9435和Sevcik，M.A.等人(2005)Pain 115：128-141中所述的癌痛模型。此外，疼痛缓解可以在临床上在人体内评估并且疼痛缓解的持续时间可以基于由用抗NGF抗体治疗的人受试者所报告的疼痛程度来进行判定。

在其它实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以包含本领域中所述的抗NGF抗体的重链可变区和/或轻链可变区。例如，本发明的抗NGF抗体中可以使用如以下文献中所述的抗NGF抗体的重链可变区和/或轻链可变区：PCT公布No.WO 2001/78698、PCT公布No.WO2001/64247、PCT公布No.WO 2002/096458、PCT公布No.WO2004/032870、PCT公布No.WO 2004/058184、PCT公布No.WO2005/061540、PCT公布No.WO 2005/019266、PCT公布No.WO2006/077441、PCT公布No.WO 2006/131951、PCT公布No.WO2006/110883、PCT公布No.WO 2009/023540、美国专利No.7,449,616；美国公布No.US 20050074821、美国公布No.US 20080033157、美国公布No.US 20080182978或美国公布No.US 20090041717。

在其它实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以包含通过本领域中已知用于产生单克隆抗体的标准方法制备的抗NGF抗体的重链可变区和/或轻链可变区，如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述用于产生非人单克隆抗体(所述抗体可接着进行人源化)的标准体细胞杂交技术，以及噬菌体展示文库技术或使用表达人免疫球蛋白基因的转基因动物的方法。用于选择抗体的噬菌体展示文库技术描述于以下文献中：例如McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)，Clarkson等人，Nature，352：624-628(1991)，Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)和Hoet等人(2005)Nature Biotechnology 23，344-348；Ladner等人的美国专利No.5,223,409、No.5,403,484和No.5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和No.5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和No.6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793、No.6,521,404、No.6,544,731、No.6,555,313、No.6,582,915和No.6,593,081。使用表达人免疫球蛋白基因的转基因动物来产生抗体的方法描述于以下文献中：例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546；Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、No.5,569,825、No.5,625,126、No.5,633,425、No.5,789,650、No.5,877,397、No.5,661,016、No.5,814,318、No.5,874,299和No.5,770,429；Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布No.WO 92/03918、No.WO 93/12227、No.WO94/25585、No.WO 97/13852、No.WO 98/24884和No.WO 99/45962；Ishida等人的PCT公布WO 02/43478；Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598、No.6,075,181、No.6,114,598、No.6,150,584和No.6,162,963。

在各个实施方案中，本发明的抗NGF抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。此外，所述抗体可以是已经消除了潜在T细胞表位的抗体。消除潜在T细胞表位由此降低抗体的潜在免疫原性的方法在本领域中已有描述(参见例如Carr等人的美国专利公布No.20030153043)。

本发明的抗体或抗体部分可以衍生化或连接到另一功能性分子(例如，另一肽或蛋白质)。因此，本发明的抗体和抗体部分预期包括本文所述的PG110抗体的衍生化或以其它方式修饰的形式。例如，本发明的抗体或抗体部分可以功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价结合或其它方式)到一个或多个其它分子实体，如另一抗体(例如，双特异性抗体或双功能抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或可以介导所述抗体或抗体部分与另一分子(如抗生蛋白链菌素核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。

一种类型的衍生化抗体是通过交联两个或多个抗体(具有相同类型或不同类型，例如以产生双特异性抗体)而产生。适合的交联剂包括具有两个由适当的间隔基隔开的反应性不同的基团的异双官能交联剂(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或者同双官能交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。所述交联剂可从伊利诺伊州罗克福德市(Rockford，IL.)的皮尔斯化学公司(Pierce ChemicalCompany)获得。

可用来衍生化本发明的抗体或抗体部分的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明(rhodamine)、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可用可检测的酶衍生化，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体用可检测的酶衍生化时，其是通过添加酶用来产生可检测的反应产物的其它试剂进行检测。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致产生可检测的有色反应产物。抗体还可用生物素衍生化，并且通过直接测量抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合进行检测。

III.抗体制备

本公开内容的另一方面涉及编码本公开内容的抗体的核酸分子。所述核酸可以存在于完整细胞中、存在于细胞溶解产物中或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术纯化除去其它细胞组分或其它污染物(例如，其它细胞核酸或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“使其基本上纯”，所述技术包括碱性/SDS处理、CsCl条带聚集、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其它技术。参见F.Ausubel等人编著(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。本公开内容的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可不含内含子序列。在一个优选实施方案中，核酸是cDNA分子。本公开内容的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。

本发明的一优选核酸分子包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列。本发明的另一优选核酸分子包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

一旦获得编码V_H和V_L片段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进行进一步操作，例如以便将可变区基因转变成全长抗体链基因，以使得可变区可操作地连接到恒定区(参见例如实施例1)。在此上下文中所使用的术语“可操作地连接”预期指联接两个DNA片段以使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

可使用本领域中已知的方法在宿主细胞中制备抗体(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。举例来说，为表达抗体，可将编码重链和轻链的DNA插入表达载体中以使得基因可操作地连接于转录和翻译控制序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”预期指抗体基因连接到载体中以使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它调控抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列应以与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入单独的载体中，或者更通常是两个基因插入同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者在不存在限制性位点的情况下进行平端连接)。另外，重组表达载体可以编码有助于从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中以使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除抗体链基因外，重组表达载体通常还带有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”预期包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录和翻译的其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。所述调控序列描述于例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域的技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于如所欲转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，如泛素启动子或β-球蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源的序列构成，如SRα启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复(Takebe，Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除抗体链基因和调控序列外，重组表达载体可携带其它序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。可选择标记基因有助于已引入了载体的宿主细胞的选择(参见Axel等人的美国专利No.4,399,216、No.4,634,665和No.5,179,017)。举例来说，通常选择标记基因赋予已引入了载体的宿主细胞以耐药性，如对G418、潮霉素或甲氨蝶呤的耐药性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于利用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式预期涵盖通常用于将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但最优选在真核细胞且最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这些真核细胞且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装和分泌经过正确折叠并且具有免疫学活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达对于制备高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本公开内容的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr^-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，与DHFR选择标记一起使用，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。另一优选的表达系统是WO 87/04462(Wilson)、WO 89/01036(Bebbington)和EP 338,841(Bebbington)中所公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或者更优选使抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

在一个优选实施方案中，本发明提供编码抗NGF抗体的表达载体，其中所述载体包含编码抗体重链的SEQ ID NO：11的核苷酸序列和编码抗体轻链的SEQ ID NO：14的核苷酸序列。本发明的一优选表达载体包含GS(谷氨酰胺合成酶)基因。在另一优选实施方案中，本发明提供包含本发明的表达载体的宿主细胞。本发明的一优选宿主细胞是CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。在另一优选的实施方案中，本发明提供一种表达抗NGF抗体的方法，其包括培养包含含有SEQ ID NO：11的核苷酸序列(编码抗体重链)和SEQ ID NO：14的核苷酸序列(编码抗体轻链)的表达载体的宿主细胞，以使得包含由SEQ ID NO：11编码的重链和由SEQ ID NO：14编码的轻链的抗NGF抗体得到表达。

在另一方面，本发明涉及制备在抗体的恒定区中具有突变(例如，铰链区突变)的抗NGF抗体的方法，所述方法包括例如通过标准重组DNA技术将适当的突变引入恒定区中。举例来说，本发明提供制备抗NGF抗体的方法，其中所述抗体包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列(并且例如，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期，另外地或可选地在人体内具有至少30天、或至少35天、或至少40天、或在至少四周至六周范围内、或在四周至六周范围内、或在至少四周至七周范围内、或在四周至七周范围内、或在至少四周至八周范围内、或在四周至八周范围内)的平均药理学半衰期，其中制备所述抗体的方法包括使SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸突变成脯氨酸，以产生包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的人IgG4恒定区。优选地，重链可变区包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。优选地，轻链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。优选地，重链包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。优选地，轻链包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

IV.药物组合物

在另一方面，本发明提供含有本发明的抗体与药学上可接受的载体一起配制的组合物，例如药物组合物。在优选的实施方案中，药物组合物适用于静脉内、皮下(例如，通过注射笔)或关节内施用，尽管本文中也描述其它适合的施用途径。在一各实施方案中，组合物可包括本发明多种(例如，两种或多种)抗体(例如，结合NGF上的不同表位的抗体)的组合。

本文中所使用的“药学上可接受的载体”包括在生理上相容的任何和所有溶剂、盐、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。根据施用途径，活性化合物可用材料包覆以保护所述化合物免受酸和可能会使所述化合物失活的其它天然条件的作用。

“药学上可接受的盐”是指保留亲本化合物的期望生物学活性并且不造成任何不期望毒物学效应的盐(参见例如Berge，S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及无毒有机酸(如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)以及无毒有机胺(如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。

本发明的药物组合物可以单独或者以组合疗法(即，与其它药剂组合)施用。例如，组合疗法可以包括本发明的组合物与至少一种或多种其它药剂。例如，至少一种或多种其它药剂可单独施用或者也可并入到所述组合物中。在一个优选实施方案中，本发明的抗NGF抗体是与第二种药剂组合施用，其中所述第二种药剂是选自由以下组成组：NSAID、止痛剂(包括阿片类止痛剂和非典型止痛剂)、局部止痛剂、神经阻断剂、酚阻断剂、治疗性抗体、类固醇、抗惊厥剂、抗抑郁剂、局部外用辣椒素和抗病毒剂。用于缓解疼痛的一类特别优选的第二种药剂是阿片类止痛剂。另外地或可选地，例如在缓解疼痛时可将第二治疗方案与使用本发明的抗体组合。所述第二治疗方案的实例包括放射疗法(例如，用于癌痛)、手术程序(例如，用于三叉神经痛的半月神经节和半月神经节后根消融(针)程序)、催眠术和针灸。

NSAID的实例包括乙酰化水杨酸酯，包括阿司匹林；非乙酰化水杨酸酯，包括双水杨酸酯、二氟尼柳(diflunisal)；乙酸，包括依托度酸(etodolac)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)；丙酸，包括菲诺洛芬(fenoprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生钠、奥沙普嗪(oxaprozin)；灭酸酯(fenamates)，包括甲氯灭酸盐(meclofenamate)、甲灭酸(mefenamic acid)；保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)；COX-2抑制剂，包括塞来昔布(celecoxib)、依他昔布(etoricoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、罗美昔布(lumiracoxib)。止痛剂的实例包括扑热息痛(paracetamol)(对乙酰氨基酚(acetaminophen))、曲马多(tramadol)、他喷他多(tapentadol)、辣椒素(capsaicin)(局部外用)、阿片类止痛剂和非典型止痛剂。阿片类止痛剂的实例包括吗啡(morphine)、可待因(codeine)、蒂巴因(thebaine)、氢吗啡酮(hydromorphone)、氢可酮(hydrocodone)、氧可酮(oxycodone)、氧吗啡酮(oxymorphone)、二氢脱氧吗啡(desomorphine)、二乙酰吗啡(diacetylmorphine)、尼可吗啡(nicomorphine)、二丙酰吗啡(dipropanoylmorphine)、苄基吗啡(benzylmorphine)、乙基吗啡(ethylmorphine)、芬太尼(fentanyl)、哌替啶(pethidine)、美沙酮(methadone)、曲马多和丙氧酚(propoxyphene)。非典型止痛剂的实例包括三环抗抑郁剂卡西平(carbazepine)、加巴喷丁(gabapentin)、普加巴林(pregabalin)、度洛西汀(duloxetine)和咖啡因。类固醇的实例包括关节内皮质内固醇(IAC)和泼尼松(prednisone)。治疗性抗体的实例包括抗TNF抗体，如

和

和抗CD20抗体，如

和Arzerra^TM。抗病毒剂的实例包括阿昔洛韦(acyclovir)和奥塞米韦(oseltamivir)的磷酸盐

在一个优选实施方案中，组合疗法可包括本发明的抗NGF抗体与至少一种或多种TrkA抑制剂(例如，拮抗TrkA活性的化合物)。TrkA抑制剂可以例如通过在细胞外与TrkA受体相互作用或者通过在细胞内与TrkA信号传导机构相互作用(例如，抑制TrkA激酶活性)来起作用。细胞外TrkA抑制剂的非限制性实例包括抗TrkA抗体(如美国专利公布No.20090208490和美国专利公布No.20090300780中所述的人源化抗TrkA抗体)和拮抗TrkA的NGF肽模拟物(如Debeir，T.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4067-4072中所述)。细胞内TrkA抑制剂的非限制性实例包括拮抗TrkA功能的细胞渗透肽(例如，Hirose，M.等人(2008)J.Pharmacol.Sci.106.：107-113；Ueda，K.等人(2010)J.Pharmacol.Sci.，2010年3月30日刊中所述)和小分子抑制剂，如TrkA激酶抑制剂(例如，Wood，E.R.等人(2004)Bioorg.Med.Chem.Lett.14：953-957；Tripathy，R.等人(2008)Bioorg.Med.Chem.Lett.18：3551-3555中所述)。TrkA抑制剂的其它非限制性实例包括ARRY-470和ARRY-872(Array Biopharma)。

在另一优选的实施方案中，组合疗法可包括本发明的抗NGF抗体与至少一种或多种蛋白激酶C(PKC)抑制剂(例如，拮抗PKC活性的化合物)。

本发明的组合物可以利用本领域中已知的多种方法施用。如本领域的技术人员所了解，施用的途径和/或模式将根据期望的结果而变化。优选地，载体适于静脉内、关节内、皮下、肌肉内、胃肠外、肿瘤内、鼻内、肺泡内、滑膜内、口服、粘膜、舌下、脊柱或表皮施用，或滴注到体腔内(例如，腹腔、胸膜腔、鼻窦)或眼睛表面上，或通过吸入施用到肺内。对于特定的施用途径，可以选用适合的递送装置。举例来说，对于皮下或肌肉内施用，可以使用注射笔(例如，可用于自身施用)。所述注射笔也称为注射器，在本领域中是已知的，包括含有液体剂型的抗体的注射笔(如用于施用

的单次使用注射笔)，并且更优选是含有在注射前重新形成液体形式的固体剂型的抗体的注射笔。同样对于皮下施用，可以使用皮下植入物。另外，可以通过使用局部外用皮肤贴片(例如，粘性贴片)来实现透皮递送。透皮递送也可以通过注射干粉(如可从Glide Pharma购得的注射器)来实现。另外，对于递送到肺内(例如，在治疗哮喘或顽固性咳嗽时)，可以使用在雾化装置中雾化的溶液。

活性化合物可以使用保护化合物免于快速释放的载体制备，如控制释放制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊封递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。本领域中提供制备所述制剂的许多种方法或者这些方法通常为本领域的技术人员所已知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

为通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必需将所述化合物用防止其失活的物质进行包衣或者将所述化合物与防止其失活的物质共同施用。例如，化合物可以在适当的载体(例如脂质体)或稀释剂中施用于受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液或用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用这些介质和药剂用于药学活性物质在本领域中是已知的。除非任何常规介质或药剂都与活性化合物不相容，否则预期在本发明的药物组合物中使用这些物质。还可在组合物中并入补充活性化合物。

治疗组合物在制造和储存的条件通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可以通过使用涂层(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中纳入延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来达成。

无菌注射溶液可以通过将所需量的活性化合物并入适当的溶剂(必要时具有一种上述成分或者上述成分的组合)，随后进行灭菌微过滤来制备。一般来说，分散剂是通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上述所需要的其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些方法产生含有活性成分加上来自先前无菌过滤的其溶液的任何其它所要成分的粉末。

调整给药方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次大剂量，可以随时间施用若干次分次剂量，或者可以根据治疗情况的迫切性所指示按比例减少或增加剂量。典型的单一剂量(其可按照如以下进一步描述按给药时程施用)可视本文所述的因素而定，大致在0.1μg/kg至1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3000μg/kg(3mg/kg)至30mg/kg至100mg/kg或更高的范围内。例如，抗NGF抗体可以约1μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约50μg/kg、约100μg/kg、约200μg/kg、约300μg/kg、约400μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg或约3mg/kg施用。在一个优选的实施方案中，抗NGF抗体以约3μg/kg至约3000μg/kg范围内的剂量施用。在另一优选的实施方案中，抗NGF抗体以100μg/kg的剂量施用。在另一优选的实施方案中，抗NGF抗体以200μg/kg的剂量施用。在另一优选的实施方案中，抗NGF抗体以300μg/kg的剂量施用。在另一优选的实施方案中，抗NGF抗体以400μg/kg的剂量施用。

对于在若干天、若干周或若干个月或更长的时间内重复施用，视病状而定，持续治疗直到达到对症状的期望的抑制或直到达到足够的治疗水平(例如减少疼痛)。一示例性给药方案包括施用约3μg/kg至500μg/kg范围内的初始剂量，接着每月施用约3μg/kg至500μg/kg的维持剂量的抗NGF抗体。在另一实施方案中，每月施用一次约200μg/kg的剂量。在另一实施方案中，每两个月施用一次约400μg/kg的剂量。然而，视医师所希望达到的药物动力学衰减的模式而定，其它给药方案也可能适用。例如，在一些实施方案中，预期每周给药一次至四次。然而，鉴于抗NGF抗体缓解疼痛的持续时间较长，可以使用较低的给药频率。在一些实施方案中，抗NGF抗体每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每五周施用一次、每六周施用一次、每七周施用一次、每八周施用一次、每九周施用一次、每十周施用一次、每15周施用一次、每20施用一次、每25周施用一次、每26周施用一次或者更长时间施用一次。在一些实施方案中，抗NGF抗体每一个月施用一次、每两个月施用一次、每三个月施用一次、每四个月施用一次、每五个月施用一次、每六个月施用一次或者更长时间施用一次。

如实施例6中所进一步论述，在一个优选实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.1mg/kg至0.2mg/kg范围内，优选0.15mg/kg的剂量每十二周静脉内施用(例如，施用于人)一次。在另一优选的实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.2mg/kg至0.4mg/kg范围内，优选0.3mg/kg的剂量每十二周皮下施用(例如，施用于人)一次。在另一优选的实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.1mg/kg至3mg/kg范围内、或0.1mg/kg至30mg/kg范围内、或0.1mg/kg至20mg/kg范围内、或0.1mg/kg至10mg/kg范围内、或1mg/kg至30mg/kg范围内、或1mg/kg至20mg/kg范围内或1mg/kg至10mg/kg范围内的剂量施用。

将胃肠外组合物配制成剂量单位形式以便于施用和剂量的均一尤其有利。如本文中所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位，各单位含有根据计算产生期望治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药物载体。本发明的剂量单位形式的规格受制于并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和所欲达到的特定治疗效果，和(b)混配这种活性化合物以用于治疗个体的敏感性的领域中所固有的限制。例如，剂量单位形式的非限制性实例包括0.2mg(对应于约70kg的人的3μg/kg的剂量)、2mg(对应于约70kg的人的30μg/kg的剂量)和7mg(对应于约70kg的人的100μg/kg的剂量)。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

制剂宜以剂量单位形式提供并且可以通过药学领域中已知的任何方法进行制备。如本文中所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位，各单位含有根据计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药物载体。可以与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量将随所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可以与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组合物的量。一般来说，按100％计，此量将在约0.001％至约90％活性成分，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％的范围内。

本文中所用的词语“胃肠外施用”意指除肠内施用和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可用于本发明的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用涂层材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。本领域中熟知的佐剂的具体实例包括例如无机佐剂(如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机佐剂(例如，角鲨烯)、油基佐剂、病毒颗粒(例如，含有来源于流感病毒的膜结合血球凝集素和神经氨酸酶的病毒颗粒)。

可以同时通过灭菌程序(上文)和通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物存在。还可能需要在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长的吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂(如单硬酯酸铝和明胶)来达成。

当本发明的化合物是作为药物施用于人和动物时，其可以单独施用或作为含有例如0.001％至90％(更优选0.005％至70％，如0.01％至30％)活性成分与药学上可接受的载体的组合的药物组合物而施用。

不管所选的施用途径为何，可以适合的水合形式使用的本发明化合物和/或本发明的药物组合物都通过本领域的技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效达到所需治疗效果而不会对患者造成毒性的量的活性成分。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前的病史，和医学领域中熟知的类似因素。具有本领域中的普通技艺的医师或兽医能够容易地判定和开具有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医可以低于达到所需治疗效果所需要的水平开始药物组合物中所用的本发明化合物的剂量，并且逐渐增加剂量直到达到所需效果。一般来说，本发明组合物的适合日剂量将为化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量一般将取决于上文所述的因素。

治疗组合物可利用本领域中已知的医学装置施用。举例来说，在一个优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可利用无针皮下注射装置施用，如美国专利No.5,399,163、No.5,383,851、No.5,312,335、No.5,064,413、No.4,941,880、No.4,790,824或No.4,596,556中所公开的装置。适用于本发明的熟知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，其公开了用于以控制速率分配药物的植入式微输注泵；美国专利No.4.,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于进行连续药物递送的变流速植入式输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利No.4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。本领域的技术人员也已知许多其它此类植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，可配制本发明的单克隆抗体以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)阻挡许多高亲水性化合物。为确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，那么其可以配制到例如脂质体中。制备脂质体的方法参见例如美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性输送到特定细胞或器官中由此增强靶向药物递送的部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同种类可包含本发明的制剂以及本发明分子的组分；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

V.使用本发明抗体的方法

在另一方面，本发明提供治疗(例如减弱或抑制)受试者的NGF相关性疾病或病状的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗NGF抗体。优选地，使用抗NGF抗体来减弱或缓解疼痛，例如与其中疼痛的发展或维持至少部分是由NGF介导的疾病或病状相关的疼痛。NGF相关性疾病或病状的非限制性实例包括炎性痛、外科手术后疼痛、手术后疼痛(包括牙痛)、神经性疼痛、周围神经疾病、糖尿病性神经疾病、骨折痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、癌痛、骨关节炎或类风湿性关节炎痛、坐骨神经痛、与镰状细胞危象相关的疼痛、头痛(例如，偏头痛、紧张性头痛、丛集性头痛)、痛经、子宫内膜异位、子宫纤维瘤、肌肉骨骼疼痛、慢性下背痛、纤维肌痛、扭伤、内脏痛、卵巢囊肿、前列腺炎、慢性盆腔疼痛综合症、膀胱炎、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症和/或膀胱疼痛综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、切口疼痛、偏头痛、三叉神经痛、烧伤和/或创伤引起的疼痛、与外伤相关的疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、强直性脊柱炎、围关节病变、骨转移引起的疼痛、HIV引起的疼痛、红斑性肢痛病或由胰腺炎或肾结石引起的疼痛、恶性黑色素瘤、肖格伦综合症、哮喘(例如，具有严重气道高反应性的不受控制性哮喘)顽固性咳嗽、脱髓鞘疾病、慢性酒精中毒、中风、丘脑性疼痛综合症、毒素引起的疼痛、化学疗法引起的疼痛、纤维肌痛、炎性肠病、肠易激综合症、炎性眼病、炎性或不稳定型膀胱病症、牛皮癣、具有炎性组分的皮肤病症、晒伤、心脏炎、皮肤炎、肌炎、神经炎、胶原蛋白血管病、慢性炎性病状、炎性痛和相关性痛觉过敏和异常疼痛、神经性疼痛和相关性痛觉过敏或异常疼痛、糖尿病性神经性疼痛、灼痛、交感神经维持性疼痛、传入神经阻滞综合症、上皮组织损伤或功能异常、呼吸、泌尿生殖器、胃肠或血管区的内脏活动紊乱、过敏性皮肤反应、瘙痒症、白癜风、一般性胃肠失调、结肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、血管收缩性或过敏性鼻炎、支气管病症、消化不良、胃食道逆流、胰腺炎和内脏痛。

此外，已发现NGF牵涉于癌症(如前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、催乳素瘤和黑色素瘤)的增殖中。因此，在另一实施方案中，可使用本发明的抗NGF抗体治疗的NGF相关性疾病或病状是癌症，优选是前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、催乳素瘤或黑色素瘤。因此，在另一实施方案中，本发明还提供治疗受试者的癌症，优选前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、催乳素瘤或黑色素瘤的方法，其包括向所述受试者施用本发明的抗NGF抗体。

另外，在另一实施方案中，NGF相关性疾病或病状可以是HIV/AIDS。使用本发明的抗NGF抗体阻断NGF可以阻断HIV感染的巨噬细胞，由此治疗HIV/AIDS。因此，在另一实施方案中，本发明还提供治疗受试者的HIV/AIDS的方法，其包括向所述受试者施用本发明的抗NGF抗体。

根据对于用本发明方法治疗特别优选的疾病和病状包括炎性痛(特别是骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛)、肌肉骨骼痛(特别是慢性下背痛)、癌痛、神经性疼痛(特别是糖尿病性神经性疼痛)、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎/疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤引起的疼痛以及手术后疼痛。

与子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤相关的疼痛和/或其它症状可包括痛经；慢性非经期骨盆痛；性交疼痛；大便困难；月经过多；下腹或背痛；不育症和生育力低下；排尿困难；胃气胀和排尿时疼痛；恶心、呕吐和/或腹泻。症状还可包括与位于腹膜腔外部的子宫内膜异位病变或纤维瘤有关的症状，例如表现为咳血、气胸或血胸的胸部子宫内膜异位综合症，和表现为呼吸困难和肺部块状阴影的肺部平滑肌瘤症。

在一个特别优选的实施方案中，使用本发明的抗NGF抗体来治疗疼痛。优选地，所治疗疼痛的类型选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛和子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供治疗受试者的疼痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的疼痛得到治疗。优选地，疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛和子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛。因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗受试者的骨关节炎疼痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的骨关节炎疼痛得到治疗。在另一个实施方案中，本发明提供治疗受试者的慢性下背痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的慢性下背痛得到治疗。在另一实施方案中，本发明提供治疗受试者的糖尿病性神经性疼痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的糖尿病性神经性疼痛得到治疗。在另一实施方案中，本发明提供治疗受试者的癌痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的癌痛得到治疗。在另一实施方案中，本发明提供治疗受试者的子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛的方法，其包括施用本发明的抗NGF抗体以使得受试者的子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛得到治疗。

在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗NGF相关性疾病。NGF相关性疾病或病状的非限制性实例包括上文所列举的那些。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗疼痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗选自由以下组成的组的疼痛：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛和子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗骨关节炎疼痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗慢性下背痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗糖尿病性神经性疼痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗癌痛。在另一实施方案中，本发明提供如本文所述的抗NGF抗体，用于治疗子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛。

在一个具体的实施方案中，本发明提供减弱或抑制受试者的疼痛的方法，所述方法包括向受试者施用包含人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且其中在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解受试者的疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周(或至少四周至十二周，或至少四周，或至少八周，或至少十二周，或一周至十二周，或四周至十二周，或八周至十二周)。优选地，疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、子宫内膜异位疼痛和子宫纤维瘤疼痛。优选地，抗NGF抗体是以约0.1mg/kg至3mg/kg，或0.1mg/kg至3mg/kg，或约0.1mg/kg至约30mg/kg，或0.1mg/kg至30mg/kg的范围内，或一种本文所述其它剂量范围内的剂量施用。

在另一具体的实施方案中，本发明提供减弱或抑制受试者的神经生长因子(NGF)相关性疾病或病状以使得在受试者体内避免反弹效应的方法，所述方法包括向受试者施用包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区在SEQ ID NO：9的氨基酸位置108包含铰链区突变，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或至少40天，或在约10天至约40天范围内、或10天至40天范围内、或约15天至约30天范围内、或15天至30天范围内)的终末消除半衰期，其中所述抗体以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用于受试者。优选地，SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸突变成脯氨酸。优选地，所述人IgG4恒定区包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列。优选地，所述抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。优选地，NGF相关性疾病或病状是选自由以下组成的组的疼痛：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、子宫内膜异位疼痛和子宫纤维瘤疼痛。优选地，抗NGF抗体是以约0.001mg/kg至约30mg/kg，更优选0.1mg/kg至3mg/kg范围内，或一种本文所述的其它剂量范围内的剂量施用。更优选地，为避免反弹效应，抗体是以较低剂量范围施用，例如在0.001mg/kg至1mg/kg范围内、或在0.001mg/kg至1mg/kg范围内，或在0.001mg/kg至0.5mg/kg范围内、或在0.001mg/kg至0.3mg/kg范围内、或在0.01mg/kg至1mg/kg范围内、或在0.01mg/kg至0.5mg/kg或者0.01mg/kg至0.3mg/kg范围内。更优选地，为避免反弹效应，抗体是以较低剂量范围(如上文所述)和较频繁的间隔施用，如每周一次，或每两周一次，或每四周一次。

本发明还提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途。NGF相关性疾病或病状的非限制性实例包括上文所列举的那些。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗疼痛的药物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗选自由以下组成的组的疼痛的药物：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛和子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗骨关节炎疼痛的药物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗慢性下背痛的药物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗糖尿病性神经性疼痛的药物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗癌痛的药物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的抗NGF抗体，用于制造用于治疗子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤疼痛的药物。在一个优选的实施方案中，抗NGF抗体是以约3μg/kg至约3000μg/kg范围内的剂量，或以100μg/kg的剂量，或以300μg/kg的剂量施用。在另一优选实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.1mg/kg至0.2mg/kg范围内，优选0.15mg/kg的剂量每十二周静脉内施用(例如，施用于人)一次。在另一优选的实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.2mg/kg至0.4mg/kg范围内，优选0.3mg/kg的剂量每十二周皮下施用(例如，施用于人)一次。在另一优选实施方案中，本发明的抗NGF抗体是以0.1mg/kg至3mg/kg范围内、或0.1mg/kg至30mg/kg范围内、或0.1mg/kg至20mg/kg范围内、或0.1mg/kg至10mg/kg范围内、或1mg/kg至30mg/kg范围内、或1mg/kg至20mg/kg范围内或1mg/kg至10mg/kg范围内的剂量施用。然而，上文在药物组合物的章节中还阐述了其它适合的剂量范围和剂量。

在一个优选的实施方案中，抗NGF抗体是静脉内施用。在另一优选的实施方案中，抗NGF抗体是皮下或关节内施用。然而，上文在药物组合物的章节中还阐述了其它适合的施用途径。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗NGF抗体长时间缓解施用所述抗体的受试者的疼痛。例如，在一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周至约十二周(或至少一周至十二周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约一周(或至少一周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约两周(或至少两周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周(或至少四周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约八周(或至少八周)。在另一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约十二周(或至少十二周)。在一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周(或四周至十二周)。在一实施方案中，在向受试者施用单一剂量的抗NGF抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约八周至约十二周(或八周至十二周)。

在另一实施方案中，抗NGF抗体是连同第二药剂或第二治疗方案一起施用。抗体与第二药剂或者抗体与第二治疗方案可同时施用或进行，或者可首先施用抗体，随后施用第二药剂或第二方案，或者可首先施用或进行第二药剂或方案，随后施用抗体。适合的第二药剂和第二治疗方案的非限制性实例在上文药物组合物的章节中阐述。用于与本发明的抗体组合使用的特别优选的第二药剂是阿片类止痛剂。用于与本发明的抗体组合使用的其它优选的第二药剂是TrkA抑制剂(例如，细胞外TrkA抑制剂或细胞内TrkA抑制剂，如药物组合物章节中所详细描述)和蛋白激酶C(PKC)抑制剂。

在另一方面，本发明提供减弱或抑制受试者的神经生长因子(NGF)相关性疾病或病状以使得在受试者体内避免反弹效应的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的抗NGF抗体，如包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含突变(优选为铰链区突变)并且其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天的终末消除半衰期。在另一实施方案中，抗体在食蟹猴体内具有在约15天至约22天范围内(或15天至22天范围内)，或约15天至约28天范围内(或15天至28天范围内)，或约21天至约28天范围内(或21天至28天范围内)的终末消除半衰期。在另一实施方案中，抗体在大鼠体内具有至少8天的终末消除半衰期。在另一实施方案中，抗体在人体内具有至少10天至30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或至少40天或在约10天至约40天范围内、或10天至40天范围内、或约15天至约30天范围内或15天至30天范围内)的平均终末消除半衰期。优选的突变包括上文详细描述的那些突变。优选的抗体包括具有上文详细描述的序列和/或功能性质的抗NGF抗体。NGF相关性疾病或病状的非限制性实例包括上文详细描述的那些。本发明还提供本发明的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途，以使得在受试者体内避免反弹效应(例如，所述抗体是以使得在受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用)。

VI.制品

包含本发明的抗体的试剂盒也在本发明的范围内，所述试剂盒任选地包括关于在治疗NGF相关性疾病或病状时使用的使用说明。所述试剂盒可包括指示试剂盒内含物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上提供或随试剂盒一起提供或者以其它方式伴随试剂盒的任何文字、销售材料或记录材料。

举例来说，本发明还提供包装药物组合物，其中如本文所述的PG110抗体(具有如SEQ ID NO：13中所示的重链并且具有如SEQ IDNO：16中所示的轻链)或衍生化形式包装在试剂盒或制品内。本发明的试剂盒或制品含有用于治疗(包括预防、治疗和/或诊断)受试者的NGF相关性疾病或病状的材料。在优选的实施方案中，NGF相关性疾病或病状是炎性痛(特别是骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛)、肌肉骨骼疼痛(特别是慢性下背痛)、神经性疼痛(特别是糖尿病性神经性疼痛)、癌痛(特别是骨转移引起的疼痛)、与子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。试剂盒或制品包括容器和在容器上或与容器相关联的提供关于使用PG110抗体来治疗本文所述的NGF相关性疾病或病状的信息的标签或包装插页或印刷材料。

试剂盒或制品是指包含用来施用PG110抗体以便治疗NGF相关性疾病或病状的组分的包装产品。试剂盒优选包括容纳试剂盒的组分的盒子或容器，并且还可包括用于施用PG110抗体的方案和/或“包装说明书”。盒子或容器容纳本发明的组分，所述组分优选含于塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器中。例如，适用于PG110的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、注射笔等。

术语“包装说明书”用于指通常包含于治疗产品的商业包装中的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用所述治疗产品的警告的信息。在一个实施方案中，本发明的包装说明书告知将施用PG110用于治疗的读者(包括受试者，例如购买者)PG110指定用于治疗本文所述的NGF相关性疾病或病状。在一个实施方案中，包装说明书描述PG110抗体的某些治疗效益，包括缓解疼痛。在另一实施方案中，包装说明书可包括PG110抗体的剂量的描述。在另一实施方案中，包装说明书可包括施用PG110抗体的途径和频率的描述。在另一实施方案中，本发明的包装说明书还可出于安全性和功效的目的向将接受PG110抗体的受试者提供关于组合使用的信息。例如，在某些实施方案中，试剂盒进一步包含含有另一治疗剂的药物组合物，与其一起包装或销售的说明书说明同时施用这两种药剂来治疗NGF相关性疾病或病状。特别优选的使用本发明的试剂盒进行治疗的疾病或病状包括炎性痛(特别是骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛)、肌肉骨骼疼痛(特别是慢性下背痛)、神经性疼痛(特别是糖尿病性神经性疼痛)、癌痛和骨转移引起的疼痛、与子宫内膜异位和/或子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

本发明的其它实施方案描述于以下实施例中。

进一步利用以下实施例说明本发明，这些实施例不应解释为造成进一步限制。序列表、附图和本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文。

实施例

实施例1：构建具有突变型IgG4铰链区的抗NGF抗体PG110

在本实施例中，通过在IgG4恒定区的铰链区中引入丝氨酸到脯氨酸的突变来产生人源化抗NGF抗体的突变形式。

使用人源化抗NGF抗体αD11的重链可变区和轻链可变区。人源化αD11抗体进一步详细描述于PCT公布WO 2005/061540和WO2006/131951中。αD11的重链可变区(Hu-αD11 V_H)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1中。αD11的轻链可变区(Hu-αD11 V_L)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2中。Hu-αD11 V_H的CDR 1、2和3区分别示于SEQID NO：3、4和5中。Hu-αD11 V_L的CDR 1、2和3区分别示于SEQID NO：6、7和8中。

编码Hu-αD11 V_H的核酸序列在3′端联接于Lonza Biologics公司的IgG4-Pro恒定区(其编码将恒定序列的氨基酸残基108从丝氨酸改变成脯氨酸的突变)。在5′端引入鼠类IgG1来源的信号序列以产生完整Hu-αD11重链cDNA序列。野生型人IgG4恒定区的氨基酸序列示于SEQ ID NO：9中，而突变型人IgG恒定区的氨基酸序列示于SEQID NO：10中。在SEQ ID NO：9和10中，从丝氨酸(在SEQ ID NO：9中)突变成脯氨酸(在SEQ ID NO：10中)的氨基酸位于氨基酸位置108。

编码Hu-αD11 V_L的核酸序列在3′端连接于人κ恒定区(由LonzaBiologics供应)并且在5′引入鼠类IgG1来源的信号序列由此编码全长轻链可变区。

因为预期在中国仓鼠卵巢(CHO细胞)中表达抗体，所以进行密码子优化(Geneart；使用GeneOptimizer^TM软件)，所述优化涉及使抗体序列适应黑线地鼠(Cricetulus griseus)(中国仓鼠)基因的密码子偏好。另外，可能时避免极高(＞80％)或极低(＜30％)GC含量的区域。在优化过程中，避免以下顺式作用序列基序：内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC的序列段；ARE、INS、CRS序列元件(参与细菌中的载体复制)；重复序列和RNA二级结构；(隐藏)剪接供体和接受体位点和分支点；指定的内部限制性内切酶位点(EcoRI、Hind III、Pvu I和Not I)。抗体基因序列优化(包括密码子优化)和抗体基因在CHO细胞中的表达详细描述于由Lonza Biologics PLC拥有的PCT公布WO 2006/122822中。

将优化的重链和轻链可变区序列(包括信号序列)分别克隆到GS载体pEE6.4和pEE12.4(由Lonza Biologics供应)中以产生两个单基因载体(SGV)。接着，通过将来自重链载体的完整表达盒连接到轻链载体来构建双基因载体(DGV)，以产生表达完整重链和轻链基因两者以及GS(谷氨酰胺合成酶)基因的单一载体。

所得突变型抗体称为PG110。完整PG110重链(包括信号序列、可变区和突变型IgG4恒定区)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11中。完整PG110重链(包括信号序列、可变区和突变型IgG4恒定区)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12中，其中氨基酸残基1-19构成信号序列并且氨基酸20-141构成可变区。没有信号序列的成熟PG110重链(包括可变区和突变型IgG4恒定区)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：13中。

完整PG110轻链(包括信号序列、可变区和κ恒定区)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：14中。完整PG110轻链(包括信号序列、可变区和κ恒定区)的氨基酸序列示于SEQ ID NO：15中，其中氨基酸残基1-20构成信号序列并且氨基酸21-127构成可变区。没有信号序列的成熟PG110轻链(包括可变区和κ恒定区)的氨基酸序列示于SEQ IDNO：16中。

为了验证PG110抗体的表达，将编码PG110的重链和轻链的DGV瞬时转染到CHOK1SV细胞(由Lonza Biologics供应)中。将细胞(每孔0.125×10⁶个活细胞)在补充有10％胎牛血清和6mM L-谷氨酰胺的基于DMEM的培养基中涂铺到24孔培养板中，并且在37℃(10％ CO₂恒温箱)下孵育过夜。转染前，用800μl新鲜培养基置换接种培养基并且将细胞在37℃下孵育1小时。

每次转染时，将5μg PG110 DGV再悬浮于100μl转染培养基(OptiMEM，Invitrogen)中。使用编码另一IgG₄/κ抗体的载体作为阳性对照并且仅使用缓冲液作为阴性对照。每次转染时，将5μlLipofectamine-2000试剂(Invitrogen)稀释于100μl转染培养基中。在室温下孵育5分钟后，将DNA和稀释的Lipofectamine试剂合并、混合并在环境温度下静置20分钟。然后将此205μl混合物添加到24孔培养板的含有细胞的孔中。将细胞在37℃下孵育68-72小时。收集培养物上清液并通过离心进行澄清，随后测定抗体的存在。

使用标准ELISA方法测定来自转染细胞的培养基中的组装IgG。此举涉及将样品和标准物捕捉到涂有抗人IgG Fc的96孔板上。用连接于辣根过氧化物酶和发色底物四甲基联苯胺的抗人κ链抗体显示结合的分析物。颜色显现与样品中存在的组装抗体的量成比例。由IgG4/κ抗体的市售储备液制备标准样品。结果显示，编码PG110重链和轻链的DGV能够表达组装抗体。

实施例2：突变型抗NGF抗体PG110的结合特征

在本实施例中，检验如实施例1中所述制备的突变型抗NGF抗体PG110的结合特异性和结合动力学。

A.结合特异性

使用酶联免疫吸附测定(ELISA)结合测定来测定PG110与人神经营养蛋白的结合选择性特征。用每孔100ng的人NGF(R&D Systems，目录号256-GF)、脑源性神经营养因子(BDNF)(R&D Systems，目录号248-BD)、神经营养蛋白3(NT3)(R&D Systems，目录号267-N3)或神经营养蛋白4(NT4)(R&D Systems，目录号268-N4)涂布ELISA板。将PG110以3pM至3nM的浓度范围添加到涂有神经营养蛋白的孔中。洗涤(含PBS的0.5％(v/v)Tween 20，pH 7.3)后，使用偶合有抗生蛋白链菌素连接的碱性磷酸酶(Sigma Aldrich，目录号S2890)的生物素化抗人IgG抗体(Rockland Immunochemical Inc.，目录号609-1602)检测PG110结合，接着通过添加磷酸4-甲基伞形酮酯(Sigma Aldrich，目录号M3168)进行显色反应。使用荧光计(在360nm下激发，在440nm下发射)对反应产物进行定量。

结果概述于图1的曲线图中。PG110与涂有人NGF的孔以浓度依赖性方式结合，其中最大结合浓度为726pM(由单一测定板上的三次重复测定获得)。相比之下，PG110未显示与涂有人BDNF、NT3或NT4的测定孔的明显结合，这些孔另外可使用对这些神经营养蛋白具有特异性的阳性对照抗体检测。这些结果表明，当在体外以高达3nM的浓度测试时，PG110特异性结合人NGF并且显示与相关神经营养蛋白无交叉反应性。

B.结合动力学

使用BIAcore分析来评估PG110与重组大鼠NGF(rrNGF)或重组人NGF(rhNGF)之间相互作用的结合动力学。

将重组人β神经生长因子(rhNGF)(R&D Systems，目录号256GF/CF)或重组大鼠β神经生长因子(rrNGF)(R&D Systems，目录号556GF/CF)使用胺偶合试剂盒(GE Healthcare)通过伯胺基团共价固定于CM5传感器芯片(GE Healthcare，先前称为Biacore AB，Uppsala，瑞典)上，其中使用HBSEP(10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)，150mM NaCl，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.005％20，pH 7.4)作为操作缓冲液。传感器芯片表面通过以10μl/min的流速注射400mM N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺(EDC)和100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1∶1，v/v)的混合物7分钟进行活化。将β-NGF(rh或rr)在10mM乙酸钠pH 4.0中稀释到200ng/ml并将稀释的溶液注射到活化的表面上持续各种时间段以产生不同表面密度。进行定量相互作用分析时，通过注射50μl稀释的β-NGF(接触时间5分钟)制备60RU的表面密度。用70μl(接触时间7分钟)乙醇胺溶液(1M，pH 8.5)使用未反应的NHS酯失活。

用固定的NGF执行的实验的参数如下：操作缓冲液：含有100μg/ml牛血清白蛋白的HBSEP；流速：25μl/min；温度：37℃；配体密度：60RU/60RU(对于rhNGF/rrNGF)；分析物：PG110浓度：操作缓冲液中2nM、4nM、8nM、17nM、33nM和66nM；接触时间：240秒；解离时间：600秒；再生：2×1分钟10mM甘氨酸，pH 1.5。

用GraphPad Prism软件(5.01版，GraphPad Software Inc.，加利福利亚州圣地亚哥市)和BIAevaluation软件(4.0.1版，GE Healthcare)进行数据和动力学评估，数据拟合到1∶1朗缪尔结合模型(Langmuirbinding model)中。

结果汇总于下表1中(其中K_ass表示结合速率常数，K_diss表示解离速率常数并且K_D表示平衡解离常数)。数据表示3次单独测定的平均值±(sem)

表1.PG110与固定的NGF相互作用的动力学常数

分析物	配体	K ass(1mol-1s-1 )	K diss(s-1 )	K D
					PG110	rhNGF	1.6×105±3.5×103	1.2×10-5±3.0×10-6	72±2pM
PG110	rrNGF	1.7×105±2.0×103	1.5×10-5±5.6×10-6	92±34pM

研究结果显示，PG110与NGF的相互作用是以高亲和力结合为特征以及同源物种(人与大鼠)的亲和力之间检测不出明显差异。

使用通过在木瓜蛋白酶-琼脂糖(Thermo Scientific)上断裂PG110产生的PG110Fab材料进行结合动力学的进一步分析。使用HBSEP作为操作缓冲液在25℃下进行rhNGF的固定。通过以10μl/min的流速注射200mM EDC和50mM NHS(1∶1，v/v)的混合物7分钟对传感器芯片进行活化。将rhNGF在10mM乙酸钠pH 4.0中稀释到500ng/ml并将20μl(接触时间2分钟)稀释溶液注射到三个孔各自的活化表面上以产生93.1RU、100.3RU和88.7RU的固定水平。用70μl(接触时间7分钟)乙醇胺(1M，pH 8.5)使未反应的NHS酯失活。

在37℃下于含有100μg/ml牛血清白蛋白的HPSEP操作缓冲液中以50μl/min的流速使250μl一系列浓度的PG110Fab(0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5和25nM)流经新固定的rhNGF表面。监测解离30分钟，并在相互作用分析完成后，使用一次脉冲(30μl)的10mM甘氨酸pH 1.5实现再生。另外，为更精确地定义极慢k_diss，在各rhNGF表面上监测一个高浓度(100nM)PG110Fab的解离8小时并且用于解离速率常数(k_diss)的定量。使用从延长的解离测量测得的固定k_diss通过1∶1朗缪尔结合模型对数据进行全体拟合。为评估动力学常数的再现性，在三个新固定的表面上重复进行三次分析。计算出的动力学常数汇总于表2中。

表2：PG110Fab与固定rhNGF的相互作用的动力学常数。

实施例3：突变型抗NGF抗体PG110的功能特征

在本实施例中，在体外测定中检验如实施例1中所述制备的突变型抗NGF抗体PG110的各种功能性质。

A.抑制NGF与TrkA和D75 ^NTR 受体的结合

进行放射性配体结合研究以比较PG110对NGF与人TrkA和p75^NTR受体的结合的抑制作用。表达全长人TrkA或p75^NTR受体的HEK293细胞在最终浓度为0.01nM至100nM的PG110存在下与2nM¹²⁵I-NGF一起孵育。在反应中也包括未标记的NGF(浓度在0至1μM间变化)。反应在高壁PT1276平底一次性管(Thermo Life Sciences)中进行。首先，将放射性标记的NGF、未标记的NGF和PG110抗体合并并且于室温下震荡下在结合缓冲液(1×PBS，0.9mM CaCl，0.5mM MgCl，0.1％BSA组分V，0.1％(w/v)葡萄糖)中在管中孵育10分钟。接着添加200μl所制备的细胞(稀释到每毫升5×10⁵个细胞)。在室温下在强力震荡下再孵育30分钟后，将各反应物分到三个塑料管(0.4ml微管PE，Sarstedt 72.700)中，每个管中添加100μl反应物。各微管已含200μl在结合缓冲液溶液中的150mM蔗糖。接着将这些管在4℃下以20,000×g离心30秒以使细胞沉淀。蔗糖提供用于隔离任何所置换的放射性标记的NGF的密度梯度。将这些管接着在干冰/乙醇浴中冷冻。接着将这些冷冻管的尖头移到单独的塑料管(NaiadLtd)中以使用LKB Wallac微型γ计数器进行计数，由此定量结合到细胞的¹²⁵I-NGF。

结果示出在图2A和图2B的曲线图中，其中PG110对NGF与TrkA的结合的作用示于图2A中并且PG110对NGF与p75^NTR的结合的作用示于图2B中。PG110以浓度依赖性方式抑制¹²⁵I-NGF与TrkA和p75^NTR受体的结合，其中几何平均(95％CI)IC₅₀值分别为170(88-331)pM和206(86-491)pM(皆n＝3)。同种型对照抗体不抑制¹²⁵I-NGF与任一受体的结合。这些结果表明，PG110在体外有效阻断人NGF与其两种受体的结合相互作用。

B.TF-1细胞增殖测定

TF-1是表达人TrkA并且响应NGF而增殖的人红白血病细胞系。在这些实验中，TF-1细胞在10ng/mL人、大鼠或小鼠重组NGF存在下与递增浓度的PG110抗体一起培养，并且在40小时后使用比色法基于黄色四唑盐MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四钠]被代谢还原成紫色甲臜(formazan)来对细胞增殖进行定量。

在测定中使用前，将TF-1细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和2ng/ml GM-CSF(R&D Systems，目录号215-GM-50)的RPMI-1640中培养一周。洗涤细胞，在RPMI-1640+10％FBS中再悬浮到每毫升300,000个细胞的浓度并且涂铺到96孔微量滴定板上(50μl每孔15,000个细胞)。添加到96孔测定板中至少60分钟后，使细胞接触含10％FPB(每孔50μl)(含有PG110抗体)的RPMI-1640中的人、大鼠或小鼠重组NGF(10ng/ml)。将含有NGF和测试抗体的培养基在添加到预先接种的细胞中前至少30分钟制备成2×最终测定浓度。在0.6ng/ml至24μg/ml的浓度范围内测定测试抗体。包括仅含培养基或含有TF-1细胞但不存在NGF(“细胞空白”)的对照孔。各种处理重复进行三次。40小时孵育期(37℃，5％CO₂)后，使用MTT细胞增殖试剂盒(ATCC目录号30-1010K)对增殖进行定量。添加10μl MTT试剂，随后再在37℃下孵育4小时。随后将孔与清洁剂试剂(每孔100μl，轻缓混合)一起孵育，室温下在黑暗中孵育过夜。此后，在570nm下记录吸光度。通过减去细胞空白的平均值计算三次重复测量的最终平均OD值。

TF-1细胞与NGF在PG110(0.6ng/mL至24μg/mL)存在下一起孵育导致对细胞增殖的浓度相关性抑制。将结果示出在图3A至图3C的曲线图中，其中图3A示出PG110处理对由人NGF刺激的TF-1细胞增殖的影响，图3B示出PG110处理对由大鼠NGF刺激的TF-1细胞增殖的影响，并且图3C示出PG110处理对由小鼠NGF刺激的TF-1细胞增殖的影响。PG110显示对于所测试NGF的所有同源物具有类似的抑制效力，并且IC₅₀值约为30ng/mL。IC₅₀值汇总于下表3中(IC₅₀值表示为ng/ml)：

表3：在TF-1细胞增殖测定中PG110的IC₅₀值汇总

TF-1细胞增殖测定证明PG110同等有效地中和人或啮齿动物NGF对人TrkA受体的活化。

C.抑制鸡背根神经节存活

为测试PG110抑制NGF对感觉神经元的作用的能力，使用从8日龄鸡胚胎获得的背根神经节(DRG)细胞的原代培养物进行的体外测定。在这些条件下，鸡DRG的存活依赖于添加到培养基中的外源NGF的存在。

从8日龄鸡胚胎分离背根神经节并收集于50ml Falcon管中(于5ml F-12汉氏养分混合物(Ham’s nutrient mixture)+Glutamax I：GIBCO31765-027中)。在各实验中，所收集的神经节的总数为约400，大致对应于20只胚胎。将神经节随后在37℃下用胰蛋白酶处理5分钟(胰蛋白酶-EDTA Euroclone，ECB3052D)并用10ml注射器(20G“黄色”针头)解离4至5次，接着在以800rpm离心3分钟。

仔细去除含胰蛋白酶的培养基后，将细胞再悬浮于10ml新鲜培养基(F-12汉氏养分混合物+Glutamax I)中，接着重复解离程序，并调整培养基体积为每毫升100,000至400,000个细胞的接种浓度。将细胞在不存在处理下在含有20％马血清(Euroclone ECS0091L)的一半最终体积中进行接种，其中使用已用溶解于蒸馏水中的聚L-赖氨酸(100×＝聚L-赖氨酸氢溴酸盐的1mg/ml溶液；Sigma P2636)涂布的24孔多孔板(UV下30分钟，接着在无菌防护罩下干燥30分钟)。

细胞附着于板(5％ CO₂恒温箱中30分钟，37℃)的同时，制备一半最终体积的2×浓度的NGF或NGF/抗NGF抗体的溶液，并逐孔添加达到正确的最终浓度(即，马血清的最终百分比＝10％；NGF的最终浓度＝5ng/ml)。包括含有DRG细胞并且不存在NGF的对照孔。各种条件重复测试两次。添加NGF或NGF/抗NGF混合物后，将板放回到恒温箱(5％ CO₂，37℃)中。48小时后通过对沿各孔的垂直直径观察到的所有DRG细胞进行计数来对细胞数进行评分。计数中仅包括DRG细胞，它容易根据它的形态特征进行鉴别，即具有长神经突的圆形、明亮、折光细胞。

对于重组人NGF(rhNGF)、重组大鼠NGF(rrNGF)或重组小鼠NGF(rmNGF)的中和，在10ng/ml至25μg/ml的浓度范围内测试PG110抗体的NGF中和效力。在这些实验中，存活的100％抑制等于在不存在抗NGF抗体下细胞在没有NGF下培养时所计数的细胞数。相反，0％抑制等于在不存在抗NGF抗体下细胞接触5ng/ml相关NGF同种型时所计数的细胞数。

在PG110存在下(10ng/mL至25μg/mL)孵育细胞使得细胞存活呈浓度依赖性减少，其中对于所有种类的NGF同源物(n＝1)，IC₅₀介于10ng/mL与50ng/mL之间。这些数据表明，PG110抑制NGF对感觉神经元的活性。

D.抑制PC12细胞神经突增生

PC12是表达大鼠TrkA和p75^NTR受体的大鼠嗜铬细胞瘤(嗜铬细胞来源的肿瘤)细胞系。当在NGF存在下在涂有胶原蛋白的板上培养时，PC12细胞分化成交感神经样神经元，变得平坦并且伸出外生长(神经突)。采用抑制NGF介导的神经突增生作为PG110抑制NGF与大鼠TrkA和p75^NTR受体相互作用的能力的半定量体外量度。

通过用无血清培养基(含Glutamax I的RPMI-1640，Gibco-Invitrogen 61870-010)洗涤100,000个细胞并在含有10％FBS和重组大鼠NGF(R&D Systems，目录号556-NG-100)(100ng/ml)的含Glutamax-I的RPMI-1640中再涂铺到用胶原蛋白处理过的塑料培养瓶(I型胶原蛋白，BD 35-4236，以0.5mg/ml工作溶液形式使用)上准备PC12细胞(ECAAC 88022401)(即，预先接触NGF)。接种前，使细胞轻缓地通过21G针头至少5次以解散细胞块。除去含有NGF的培养基并且在准备的1周时间内更换两次。

这一时期结束时，将准备好的PC12细胞用无血清培养基洗涤并且在增湿恒温箱(5％ CO₂，37℃)中以胰蛋白酶处理(胰蛋白酶-EDTAEuroclone，ECB3052D)2至3分钟。通过添加含血清的培养基阻断胰蛋白酶并且将细胞离心，用无血清培养基洗涤并且再悬浮于含有10％FBS的含Glutamax-I的RPMI-1640中。使细胞轻缓通过21G针头至少5次以解散细胞块，随后以每毫升50,000个细胞的密度再涂铺于用胶原蛋白处理过的皮氏培养皿(Petri dish)上。每个测定条件准备三个培养皿。对于抗体测试时，制备2×孵育混合物(重组大鼠NGF+抗NGF)，一小时后添加到预先接种的细胞中。NGF的最终浓度是20ng/ml，而对抗NGF抗体以四种稀释液进行测试：20μg/ml、2μg/ml、200ng/ml和20ng/ml。

72小时后对NGF诱导的神经突增生进行评分。此时，除去培养基并将细胞用不含钙和镁的PBS(GIBCO，10010)洗涤，并且用甲醛的4％PBS溶液固定30分钟。使用Nikon Eclipse TE2000-E显微镜和Leica IM1000影像管理软件获取显微镜图像(20×放大率)。评估对神经突增生的抑制，并且基于显示未分化表型(＝不存在清楚确定的神经突)的细胞数评判分数(++；+/-；--)。

在PG110(20ng/mL至20μg/mL)存在下孵育细胞抑制NGF介导的神经突增生，其中在200ng/mL下明显可见完全抑制，表明PG110是大鼠重组NGF与其天然大鼠神经营养蛋白受体之间相互作用的有效抑制剂。

实施例4：突变型抗NGF抗体PG110的体内稳定性

在本实施例中，在大鼠和食蟹猴中体内测定PG110抗体的终末消除半衰期(T_1/2)。

A.大鼠研究

在研究的第1天和第56天以3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的剂量对Sprague-Dawley大鼠进行10分钟静脉内(IV)PG110抗体输注。使用平均血清浓度和6只动物的时间点/每组中每个时间点进行毒物代谢动力学数据评估。标称血液收集时间是：研究第1天和第56天的给药前和给药后0.25小时、1小时、3小时、6小时和24小时以及研究第1天给药后的48小时、96小时、168小时、336小时、504小时、672小时、840小时、1008小时和1176小时。血清样品生物分析由Alta分析实验室使用经过验证的ELISA方法进行。使用具有WinNonlin专业版4.0软件的SNBL USA药物动力学分析系统2.0(Pharsight Corp.)进行药代动力学数据分析。

IV施用后，T_max值(到达最大血清浓度的时间)在前两个样品收集时间点0.25至1小时的范围内。所有动物显示双相倾向，其中终末消除半衰期为约8至9天。更具体来说，三个处理组的T_1/2(以小时表示)汇总于下表4中。

表4：Sprague-Dawley大鼠体内PG110的终末消除半衰期

剂量水平(mg/kg)	终末消除半衰期(小时)
		3	217
30	192
		100	207

因此，大鼠体内的组平均半衰期值在192至217小时(8至9天)范围内。

B.第一次猴研究

以3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的剂量对食蟹猴进行约30分钟的单次PG110抗体静脉内(IV)输注。动物分成雄性与雌性；各剂量测试两只雄性和两只雌性(除30mg/kg仅测试一只雌性外)。毒物代谢动力学数据分析的标称血液收集时间是：给药后马上(输注结束后2分钟内)、输注结束后0.25小时、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、336小时、504小时、672小时、840小时、1008小时、1176小时、1344小时、1512小时和1680小时。血清样品生物分析由Alta阿尔塔分析实验室使用经过验证的ELISA方法进行。使用具有WinNonlin专业版4.0软件的SNBL USA药物动力学分析系统2.0(Pharsight Corp.)进行药代动力学数据分析。

IV施用后，从输注开始测得的T_max值(到达最大血清浓度的时间)在输注结束至约1.6小时范围内。所有动物显示双相倾向(除用30mg/kg测试的一只雌性以外，其显示在504小时时间点后突然下降)，其中终末消除半衰期为约15至22天。更具体来说，六个处理组的T_1/2(以小时表示)汇总于下表5中：

表5：食蟹猴体内PG110的终末消除半衰期

因此，食蟹猴体内的组平均半衰期值在370至531小时(15至22天)范围内。雄性的平均半衰期值一般长于雌性，不过鉴于所研究动物的数目较少，因此尚不清楚这是否是统计学上显著的差异。

C.第二次猴研究

历时四周的时间对食蟹猴每周进行静脉内PG110抗体输注。在第1天、第8天、第15天和第22天以3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的剂量进行约30分钟的静脉内(IV)PG110抗体输注。动物分成雄性和雌性；各剂量测试3只雄性和3只雌性。在以下标称时间点收集连续血液样品：第1天和第22天的给药前、给药后马上(输注结束后2分钟内)、输注结束后0.25小时、1小时、3小时、6小时、24小时和168小时。在第15天的给药前从所有动物收集另外的样品，并且在第22天最后一次剂量施用后的336小时、504小时、672小时、840小时、1008小时、1176小时、1344小时、1512小时、1680小时、1848小时、2016小时和2208小时从恢复的动物收集另外的样品。从输注后24小时开始所列的小时数对应于药代动力学天数1、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84和92。所有实际血液时间转换成从开始输注开始。

PG110浓度分析的血清样品生物分析由Alta分析实验室使用经过验证的ELISA方法进行。使用具有WinNonlin专业版4.0软件的SNBL USA药物动力学分析系统2.0(Pharsight Corp.)进行药代动力学数据分析。

IV施用后，从输注开始测得的组平均T_max值(到达最大血清浓度的时间)在约0.6小时至2.6小时范围内。所有动物显示双相倾向，其中终末消除半衰期为约21至28天(503至685小时)。更具体来说，六个处理组的T_1/2(以小时表示)汇总于下表6中：

表6：食蟹猴体内PG110的终末消除半衰期

^*基于n＝2的值

因此，食蟹猴体内的组平均半衰期值在约21至28天范围内。雄性的平均半衰期值一般长于雌性，不过鉴于所研究动物的数目较少，因此尚不清楚这是否是统计学上显著的差异。

实施例5：PG110与大鼠前体抗体的效力的比较

在本实施例中，使用TF1细胞增殖测定(如上文实施例3B所述)进行另外的实验来比较PG110与其前体大鼠αD11的NGF中和效力。大鼠αD11抗体以两个分开的批次供应，一个批次的储备液浓度为0.73mg/ml而另一批次的储备液浓度为0.63mg/ml。使用MTT细胞增殖试剂盒(ATCC目录号30-1010K)在由人NGF或大鼠NGF介导的TF1细胞增殖测定中评估PG110和大鼠αD11抗体。

在测定中使用前，将TF1细胞在含有10％胎牛血清(FBS，CambrexDE14-801F，批号6SB0006)和2ng/ml GM-CSF(R&D Systems，目录号215-GM-50)的RPMI-1640(ATCC目录号30-2001)中培养一周。洗涤细胞，在RPMI-640+10％ FBS中再悬浮到每毫升300,000个细胞的浓度并且再涂铺到96孔微量滴定板上(50μl，每孔15,000个细胞)。

添加到96孔测定板中至少60分钟后，使细胞接触含有抗NGF抗体的含人或小鼠重组NGF(10ng/ml)的培养基(含10％ FBS的RPMI-1640；每孔50μl)。含有NGF和测试抗体的培养基在添加到预先接种的细胞中前至少30分钟制备成2×最终测定浓度。将测试抗体在0.6ng/ml至24μg/ml的浓度范围内测定。通常包括仅含培养基或含有TF1细胞但不存在NGF(“细胞空白”)的对照孔。对各种处理重复进行三次。40小时孵育期(37℃，5％ CO₂)后，添加10μl MTT试剂，随后再在37℃下孵育4小时。随后将孔与清洁剂试剂(每孔100μl，轻缓混合)一起孵育，在室温下在黑暗中孵育过夜。此后，在570nm下记录吸光度。通过减去细胞空白的平均值计算三次重复测量的最终平均OD值。最大抑制设定为对应于在不存在测试抗体下所观察到的无NGF的培养细胞的平均OD值。将零抑制设定为对应于在不存在测试抗体下所观察到的细胞接触10ng/ml NGF时的平均OD值。

使用GraphPad Prism v5.01软件将NGF抗体的抑制效力定量为IC₅₀值(即，使NGF介导的增殖反应减少50％所需要的抗体浓度)。单独绘制抑制曲线以便获得各实验中各测试抗体的离散IC₅₀值。相对于在不存在添加测试抗体在所述测定中获得的最大OD值将细胞增殖的量度进行归一化。接着对归一化的反应以对数刻度针对测试抗体浓度进行绘图，并且使用GraphPad Prism非线性曲线拟合函数“log(抑制剂)相对于反应-可变斜率”推导出IC₅₀值。

PG110与其前体抗体大鼠αD11的抑制作用的比较汇总于下表7中。

表7：TF1细胞增殖测定中IC₅₀值(ng/ml)的汇总

结果表明，PG110抗体中和NGF活性的效力是其前体抗体大鼠αD11的约2倍高。此外，由大鼠αD11批次2获得的效力值表面此批次可能具有相比于批次1材料较低的效力。

实施例6：抗NGF抗体PG110在动物模型中不表现反弹效应

在本实施例中，使用大鼠皮肤病变模型来检验PG110 mAb的活性。大鼠皮肤病变模型是基于用抗NGF抗体处理的大鼠发生瘙痒反应，同时观察到抓挠具有剂量依赖性增加的观察结果而发展的。病变与到达表皮的神经分布减少无关。此外，在消除抗体后大鼠显示快速恢复。此皮肤病变活性仅在具有理毛行为的啮齿动物中观察到。尽管不欲受机制限制，但假设在用抗NGF抗体处理的大鼠中，由于反馈环路受损停止抓挠反应而导致持续理毛，进而导致皮肤损伤。接着可对皮肤病变进行定量评分作为大鼠体内抗NGF抗体活性的量度。

在对抗NGF抗体(如人源化抗体RN-642，在美国专利公布No.20040237124和Abdiche，Y.N.等人(2008)Protein Sci.17：1326-1335中进一步描述)的活性进行的各种临床研究中，已报道抗体的有效性在给药后的一段时间后减弱(例如，给药后的第14至21天)，随后抗体的活性恢复。也有报道在给药后抗体活性减弱的这一段时间里疼痛增加和/或不良事件增加(如感觉异常，范围从异常疼痛到麻刺感、针刺痛或针刺感)。给药后的一段时间抗体活性减弱在本文中称为“反弹效应”。

为评估PG110抗体在有意识大鼠中对理毛和抓挠行为的影响，用静脉内大剂量施用的PG110mAb(0.003、0.01、0.03、0.3或3mg/kg)或用媒介物对照处理雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠。大鼠每周接受一次剂量持续四周。评估准则为：理毛和抓挠事件的次数、体温、舔爪潜伏期、跳跃(尝试逃走)潜伏期和皮肤病变随时间的数量和严重程度评分。

结果表明，在施用媒介物的大鼠中未观察到皮肤病变，而在施用了PG110的大鼠组中，在所有所测试的抗体剂量下所有动物中都观察到了皮肤病变。此外，皮肤病变的数量和严重程度随时间增加并且随抗体剂量增加而增加。抓挠发作次数也在抗体处理动物中增加，但抗体处理对理毛行为、体温、舔爪潜伏期或跳跃(尝试逃走)潜伏期没有影响。

使用病变评分对皮肤病变严重程度进行定量，所述病变评分等于病变数量乘以病变面积(以mm²表示)。PG110处理与媒介物处理的随时间的病变评分的比较示于图4的曲线图中。结果显示，PG110处理的大鼠显示病变评分随时间稳定增加，特别是在较高测试剂量(0.3mg/kg和3mg/kg)时。即，所述抗体在实验过程中未表现显著的反弹效应，表明可以选择供在人体内使用的剂量和施用频率参数以便避免反弹效应。

因此，总的来说，大鼠皮肤病变模型说明PG110抗NGF抗体的优势在于，PG110抗体不表现在其它抗NGF抗体中报道的明显反弹效应，表明PG110显示更一致并且延长的体内稳定性。尽管不欲受机制限制，但认为PG110在体内避免反弹效应的此能力与对于此抗体观察到的延长的终末消除半衰期有关。

实施例7：PG110人药代动力学

预期PG110在人体内具有约10天至30天(范围为10天至40天)的半衰期，具有多相倾向。基于约0.25μg/mL(范围为约0.13μg/mL至0.40μg/mL)的目标C_min值，预期每4至12周10mg(约0.15mg/kg；范围为约0.1mg/kg[5mg]至约0.2mg/kg[15mg])的人IV剂量和每4至12周20mg(约0.3mg/kg；范围为约0.2mg/kg[15mg]至约0.4mg/kg[30mg])的SC剂量是有效的。

人药代动力学方案是基于来自两个物种(大鼠和猴)的浓度数据。使用多种方法设计人药代动力学，所述方法包括缩放猴和大鼠药代动力学参数、固定体形变异缩放和基于来自其它单克隆抗体的临床前和临床数据的方法。进行单相和双相倾向两者的方案。

方法1：人药代动力学方案基于拟合两个物种(大鼠和猴)中的PG110浓度-时间曲线的双室模型。利用猴和大鼠药代动力学参数的固定指数使用体形变异缩放设计PG110的人药代动力学参数。

对于清除率：

对于分布体积：

表8.利用固定指数基于体形变异缩放进行的人药代动力学参数预测

接着基于预测的人CL和V1计算PG110人半衰期。预测的PG110人半衰期是26天。

方法2：人药代动力学方案基于从两个物种(大鼠和猴)观测到的数据。使用与方法1相同的方法设计人CL和V。利用0.25的固定指数使用经过修改的体形变异缩放设计PG110的人半衰期：

表9.利用固定指数基于经过修改的体形变异缩放进行的人药代动力学参数预测

使用方法2，预测的PG110人半衰期是36天。

方法3：人药代动力学方案基于大鼠和猴中的PG110数据和来自其它单克隆抗体的临床前和临床药代动力学参数。缩放基于在大鼠和猴体内观测到的PG110半衰期以及基于其它单克隆抗体半衰期的大鼠/人和猴/人比率。首先将大鼠和猴体内其它单克隆抗体的估算药代动力学参数(清除率、分布体积和半衰期)与临床研究中的参数进行比较。将大鼠、猴和人之间的差异估算为大鼠/人和猴/人的比率。接着基于PG110在大鼠和猴体内的药代动力学参数并根据其它单克隆抗体对大鼠/人或猴/人比率进行校正估算出PG110的人药代动力学参数。使用方法3，预测的PG110人半衰期是11至29天。

表10.基于使用其它单克隆抗体的过去经验的人药代动力学参数预测

R/H：大鼠/人，M/H：猴/人

方法4：人药代动力学方案基于拟合两个物种(大鼠和猴)中的PG110浓度-时间曲线的双室模型。利用猴和大鼠药代动力学参数的回归使用体形变异缩放设计PG110的人药代动力学参数。

对于清除率和分布体积：

Log(药代动力学参数)＝a×Log(BW)+b

基于大鼠和猴的药代动力学参数和体重(BW)进行线性回归以估算斜率(a)和截距(b)。接着使用典型人BW和所估算出来的斜率和截距估算PG110的人药代动力学参数。

表11.利用回归基于体形变异缩放进行的人药代动力学参数预测

接着基于预测的人药代动力学参数计算PG110人半衰期。预测的PG110人半衰期是12天。

基于这些方法，预期PG110在人体内具有约15天至30天(范围为10天至40天)的半衰期，其中多相倾向(预测的药代动力学参数：V₁＝2.5L、CL＝5.0mL/hr、V₂＝2.5L、CL_D＝40mL/hr)。

实施例8：利用PG110治疗人的骨关节炎

开始人临床研究以测试PG110在患有因膝盖骨关节炎引起疼痛的患者体内的安全性、耐受性和药代动力学。研究的设计和初步结果在下文描述。

在此第I阶段、单中心、空白对照、双盲、单次递增剂量研究中，评估六(6)种剂量水平：0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mg/kg。每种剂量水平一组7名患有因膝盖骨关节炎引起疼痛的患者(总共42名患者)按6∶1比率随机分配成活性剂或空白对照剂治疗。每名患者在第0日早晨在清淡早餐后以2小时间隔静脉内施用单次剂量的PG110。输注开始(第1天)后患者在临床药理学单位(Clinical PharmacologyUnit；CPU)留满约24小时，并在研究的第4、7、14、21、28、56和84天返回就诊。

在第0天(给药前，1、2、3、6和12小时)和给药后第1、4、7、14、21、28、56和84小时取血样用于PG110测定。使用经过验证的ELISA测定对PG110的血清浓度进行测定。也对第0(给药前)、14、28、56和84天的样品进行抗PG110测定。

在本研究中进行药效学评定，包括疼痛的患者评定、西安大略和麦克马斯特大学(Western Ontario and McMaster Universities；WOMAC^TM)骨关节炎指数问卷、麦基尔疼痛调查问卷(McGill painquestionnaire)、6分钟步行测试、膝盖超声波和hs-CRP。

疼痛的患者评定的初步结果汇总于表12中。使用疼痛的患者评定作为疼痛强度的评定。询问患者以按0-100mm VAS对其回答进行评分，其中0mm等于无疼痛，而100mm等于最痛。

表12.OA患者中的PG110：疼痛的患者评定(VAS)

基于初步药效数据，在0至0.3mg/kg的PG110剂量范围内观察到明显的剂量反应。

基于维持药物效应的平均时间量(药物效应的MRT)评估药理学半衰期。其可计算为第一时刻基线校正效应-时间曲线的面积(AUMEC)与随时间累积的基线校正药物效应曲线的面积(效应-时间曲线的面积AUEC)的比率：

将估算出的药理学半衰期汇总于表13中。

表13.PG110的药理学半衰期

药理学半衰期的估算基于PG110给药后直到第84天收集的数据。因为尤其在0.1mg/kg和0.3mg/kg的剂量下，在第84天仍存在PG110的持续效应，因此PG110的估算平均药理学半衰期为至少5至7周，范围为至少4至8周。

初步药效学数据与设计的治疗剂量(0.10至0.3mg/kg或7-21mg)一致。初步药理学半衰期表明，每4至12周给药可能是有效的。

等效方案

本领域的技术人员应认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效方案。意欲这些等效方案被以下权利要求书涵盖。附属权利要求中所公开的实施方案的任何组合都涵盖于本发明的范围内。

以引用的方式并入

本文所提到的所有公布、专利和待决的专利申请的全文都在此以引用的方式整体并入本文。

序列表概述

SEQ ID NO：1(PG110V _H )

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKG

LEWVGGVWAGGATDYNSALKSRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAE

DTAVYYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：2(PG110 V _L )

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNALAWYQQKPGKAPKL

LIYNTDTLHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFH

YPRTFGQGTKVEIK

SEO ID NO：3(PG110 V _H CDR1)

GFSLTNNNVN

SEQ ID NO：4(PG110 V _H CDR2)

GVWAGGATDYNSALKS

SEQ ID NO：5(PG110 V _H CDR3)

DGGYSSSTLYAMDA

SEQ ID NO：6(PG110 V _L CDR1)

RASEDIYNALA

SEQ ID NO：7(PG110 V _L CDR2)

NTDTLHT

SEQ ID NO：8(PG110 V _L CDR3)

QHYFHYPRT

SEQ ID NO：9(野生型人IgG4恒定区)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL

TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT

KVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV

TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV

SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSLGK

SEQ ID NO：10(丝氨酸到脯氨酸突变型人IgG4恒定区)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL

TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT

KVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV

TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV

SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSLGK

SEQ ID NO：11(PG110完全重链核苷酸序列，包括信号序列)

ATGGAATGGAGCTGGGTGTTCCTGTTCTTCCTGAGCGTGACCAC

CGGCGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGCGGAGG

GCTGGTGCAGCCAGGCGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCC

AGCGGCTTCAGCCTGACCAACAACAACGTGAACTGGGTGCGG

CAGGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGGCGGCGTGTGG

GCCGGGGGAGCCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGG

TTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCGCCTACCTGC

AGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTG

CGCCAGGGACGGCGGCTACAGCAGCAGCACCCTGTACGCCATG

GACGCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCC

AGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCA

GAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGA

AGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGG

AGCCCTGACCAGCGGGGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG

AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCA

GCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCA

CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAA

GTACGGCCCACCCTGCCCCCCATGCCCAGCCCCCGAGTTCCTGG

GCGGACCCTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACAC

CCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG

GACGTGAGCCAGGAAGATCCAGAGGTCCAGTTCAACTGGTACG

TGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAG

AGGAACAGTTTAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGAC

CGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTG

CAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACC

ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTAC

ACCCTGCCACCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGT

CCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCC

GTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG

ACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGT

ACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGGAAGGCA

ACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCA

CTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAGTGA

SEQ ID NO：12(PG110完全重链氨基酸序列，包括信号序列)

MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

FSLTNNNVNWVRQAPGKGLEWVGGVWAGGATDYNSALKSRFTIS

RDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSSSTLYAMDAWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT

VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN

VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE

QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA

KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO：13(PG110成熟重链氨基酸序列，不包括信号序列)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKG

LEWVGGVWAGGATDYNSALKSRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAE

DTAVYYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP

LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY

GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE

DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO：14(PG110完全轻链核苷酸序列，包括信号序列)

ATGAGCGTGCCCACCCAGGTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGC

TGACCGACGCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAG

CAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGC

AGGGCCAGCGAGGACATCTACAACGCCCTGGCCTGGTATCAGC

AGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAACACCGA

CACCCTGCACACCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGC

TCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCG

AGGACTTCGCCACCTACTTTTGCCAGCACTACTTCCACTACCCC

AGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACC

GTGGCTGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGC

AGCTGAAGAGCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAA

CTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAAC

GCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAG

GACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCC

TGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCG

AGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTT

CAACAGGGGCGAGTGCTGA

SEQ ID NO：15(PG110完全轻链氨基酸序列，包括信号序列)

MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS

EDIYNALAWYQQKPGKAPKLLIYNTDTLHTGVPSRFSGSGSGTDY

TLTISSLQPEDFATYFCQHYFHYPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF

PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES

VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK

SFNRGEC

SEQ ID NO：16(PG110成熟轻链氨基酸序列，不包括信号序列)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYNALAWYQQKPGKAPKL

LIYNTDTLHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFH

YPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY

PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (83)

1.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

2.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

3.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

4.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

5.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

6.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的恒定区，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

7.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

8.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

9.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含SEQID NO：10的氨基酸序列，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

10.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

11.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的人IgG4恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

12.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，(ii)含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

13.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含(i)含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区，(ii)含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区，和(iii)含有铰链区突变的恒定区，其中所述抗体以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF，以250pM或以下的IC₅₀抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合，并且以50ng/ml或以下的IC₅₀抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖。

14.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其具有人IgG4恒定区，所述人IgG4恒定区含有包含对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处的丝氨酸突变的铰链区突变。

15.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含突变，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的平均终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

16.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含突变，并且其中所述抗体在食蟹猴体内具有至少15天的终末消除半衰期。

17.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体在食蟹猴体内具有约15天至约28天范围内的终末消除半衰期。

18.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体在大鼠体内具有至少8天的终末消除半衰期。

19.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，其中所述突变是铰链区突变。

20.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，其中所述铰链区突变包含SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处丝氨酸的突变。

21.根据权利要求20所述的抗NGF抗体，其中对应于SEQ IDNO：9的氨基酸位置108的所述氨基酸位置处的所述丝氨酸突变成脯氨酸。

22.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

23.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体具有一种或多种以下功能性质：

a)结合人NGF但不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；

b)以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF；

c)抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合；

d)抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖；

e)抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；

f)抑制NGF依赖性PC12细胞神经突增生。

24.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体在施用于受试者时不显示反弹效应。

25.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，在向受试者施用单一剂量的所述抗NGF抗体后，所述抗NGF抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周。

26.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区。

27.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

28.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区，并且所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

29.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区。

30.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。

31.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。

32.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

33.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述人IgG4恒定区包含铰链区突变，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期，并且其中在向人受试者施用单一剂量的所述抗体后，所述抗体缓解疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周。

34.根据权利要求33所述的抗NGF抗体，其中所述铰链区突变包含SEQ ID NO：9的氨基酸位置108处的丝氨酸的突变。

35.根据权利要求34所述的抗NGF抗体，其中对应于SEQ IDNO：9的氨基酸位置108的所述氨基酸位置处的所述丝氨酸突变成脯氨酸。

36.根据权利要求35所述的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

37.根据权利要求33所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体具有一种或多种以下功能性质：

a)结合人NGF但不结合人脑源性神经营养因子(BDNF)、人神经营养蛋白3(NT-3)或人神经营养蛋白4(NT-4)；

b)以100pM或以下的K_D结合人或大鼠NGF；

c)抑制NGF与TrkA或p75^NTR的结合；

d)抑制TF-1细胞的NGF依赖性增殖；

e)抑制NGF依赖性鸡背根神经节存活；

f)抑制NGF依赖性PC12细胞神经突增生。

38.根据权利要求33所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

39.根据权利要求33所述的抗NGF抗体，在向人受试者施用单一剂量的所述抗体后，所述抗NGF抗体缓解疼痛的持续时间为至少十二周。

40.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链，其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的血清半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期。

41.根据权利要求40所述的抗NGF抗体，其中所述重链由SEQID NO：11的核苷酸序列编码。

42.根据权利要求40或41所述的抗NGF抗体，所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链。

43.根据权利要求42所述的抗NGF抗体，其中所述轻链由SEQID NO：14的核苷酸序列编码。

44.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链。

45.一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其包含人IgG4恒定区，其中所述抗体包含由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的重链和由SEQID NO：14的核苷酸序列编码的轻链。

46.根据前述权利要求中任一项所述的抗NGF抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，或为已去除潜在T细胞表位的抗体。

47.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体和药学上可接受的载体。

48.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体和所述抗体用于治疗NGF相关性疾病或病状的使用说明。

49.一种减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述NGF相关性疾病或病状是疼痛。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述抗NGF抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内的剂量施用。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述抗体是静脉内施用。

54.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述抗体是皮下或关节内施用。

55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用第二药剂。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二药剂选自由以下组成的组：NSAID、包括阿片类止痛剂和非典型止痛剂在内的止痛剂、局部麻醉剂、神经阻断剂、酚阻断剂、治疗性抗体、类固醇、抗惊厥剂、抗抑郁剂、局部外用辣椒素、抗病毒剂、TrkA抑制剂和PKC抑制剂。

57.一种减弱或抑制受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含人IgG4恒定区的抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且其中在向受试者施用单一剂量的所述抗NGF抗体后，所述抗体缓解所述受试者的疼痛的持续时间为至少约四周至约十二周。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区和含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的轻链可变区。

60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述抗NGF抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内的剂量施用。

62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中所述抗体是静脉内或皮下施用。

63.一种减弱或抑制受试者的神经生长因子(NGF)相关性疾病或病状以使得在所述受试者体内避免反弹效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含人IgG4恒定区的抗NGF抗体，其中所述人IgG4恒定区包含铰链区突变，并且其中所述抗体在人体内具有至少10天至30天的终末消除半衰期或者在人体内具有至少30天的平均药理学半衰期，并且其中所述抗体以使得在所述受试者体内避免反弹效应的剂量和频率施用。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述人IgG4恒定区包含对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的氨基酸位置处的突变。

65.根据权利要求64所述的方法，其中对应于SEQ ID NO：9的氨基酸位置108的所述氨基酸位置处的丝氨酸突变成脯氨酸。

66.根据权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述人IgG4恒定区包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

67.根据权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述抗NGF抗体包含含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、4和5的CDR 1、2和3的重链可变区和含有氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、7和8的CDR 1、2和3的轻链可变区。

68.根据权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述抗NGF抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区。

69.根据权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述抗体与包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的轻链可变区的抗体竞争与NGF的结合。

70.根据权利要求63至69中任一项所述的方法，其中所述NGF相关性疾病或病状是选自由以下组成的组的疼痛：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

71.根据权利要求63至70中任一项所述的方法，其中所述抗NGF抗体以0.1mg/kg至3mg/kg范围内的剂量施用。

72.根据权利要求63至71中任一项所述的方法，其中所述抗体是静脉内或皮下施用。

73.根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体，其用于治疗NGF相关性疾病或病状。

74.根据权利要求73所述的抗NGF抗体，其中所述NGF相关性疾病或病状是疼痛。

75.根据权利要求74所述的抗NGF抗体，其中所述疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

76.根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途。

77.根据权利要求76所述的用途，其中所述NGF相关性疾病或病状是疼痛。

78.根据权利要求77所述的用途，其中所述疼痛选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神经性疼痛、癌痛、骨转移引起的疼痛、间质性膀胱炎、疼痛性膀胱综合症、与慢性非细菌性前列腺炎相关的疼痛、与子宫内膜异位相关的疼痛、与子宫纤维瘤相关的疼痛和手术后疼痛。

79.根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的疼痛的药物的用途，使得在向受试者施用单一剂量的所述抗NGF抗体后，所述受试者的疼痛被减弱或抑制的持续时间为至少约四周至约十二周。

80.根据权利要求1至46中任一项所述的抗NGF抗体用于制造用于减弱或抑制受试者的NGF相关性疾病或病状的药物的用途，使得在所述受试者体内避免反弹效应。

81.一种表达载体，其编码抗神经生长因子(NGF)抗体，其中所述载体包含编码抗体重链的SEQ ID NO：11的核苷酸序列和编码抗体轻链的SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

82.一种宿主细胞，其包含根据权利要求81所述的表达载体。

83.一种表达抗NGF抗体的方法，包括培养根据权利要求82所述的宿主细胞以使得包含由SEQ ID NO：11编码的重链和由SEQ IDNO：14编码的轻链的抗NGF抗体得以表达。

Images