CN110996973A - 用于治疗神经退行性眼科病变的血清 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及优选地来自脐带血的血清，所述血清用于治疗眼科领域的神经退行性病变，特别是治疗青光眼，其中所述血清包含神经生长因子‑β(NGF‑β)以及其他因子，诸如例如，BDNF。血清还可以用于治疗其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变。本发明还涉及组合物，所述组合物包含所述血清和对于人类使用可接受的一种或更多种赋形剂和/或载体和/或防腐剂；所述组合物可以例如呈洗眼剂形式。本发明的另一个方面涉及一种用于从血液，优选地从脐带血制备用于根据本发明的用途的血清的方法。
Description
描述
技术领域
本发明涉及血清，优选地来自脐带血的血清，用于治疗神经退行性眼科病变，特别是视网膜的退行性病变和视神经的退行性病变，诸如青光眼、以及其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变的用途。用于根据本发明的用途的血清包含优选地浓度等于或大于5pg/ml的神经生长因子-β(NGF-β)。
本发明还涉及呈洗眼剂、滴眼剂、眼软膏或眼凝胶形式的包含本发明的血清的组合物。
发明背景
神经退行性眼科病变，特别是视网膜的退行性病变、视神经的退行性病变以及其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变，导致视觉功能的进行性和致残性损害，从最广泛的社会和经济意义上理解，这伴随着受它们影响的个体的生活质量的急剧降低。最普遍和致残性的退行性眼科病变中的一种是青光眼。
术语“青光眼”通常是指共同之处是存在视神经的慢性进行性损伤，具有视神经本身的外观和视网膜神经纤维层的特征性改变的眼部病变的集合。青光眼可以导致视力的不可逆损伤，并且在一些情况中可以导致视力低下或失明。在更晚期的阶段，具有青光眼的患者的视野缩小到仅中央区域，而周围视力受损。“视野”被定义为眼睛注视前方所感知的空间的部分。在不存在改变的情况下，所谓的“正常”视野在颞侧(temporally)延伸超过90°，在鼻侧(nasally)和上侧(superiorly)延伸60°并且在下侧(inferiorly)延伸约70°。在存在改变的情况下，这些范围在四个象限中进行性且选择性地降低。
表述“神经保护”通常是指旨在降低如发生于许多神经退行性病变中的在组织损伤之后对神经元细胞的早期损伤和晚期损伤二者的所有干预。目前正在进行的研究(主要针对神经退行性疾病，诸如帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症)已经证明施用特定神经营养因子(其水平在所讨论的病变中降低)(或诱导这样的特定神经营养因子的内源合成的因子)的治疗有效性。
关于眼科领域的神经退行性病变，目前提出的神经保护治疗主要基于施用天然来源的物质，诸如氨基酸和/或维生素(不存在其有效性的证据，在用于投放上市的注册阶段无论如何都不需要所述证据)，或植物来源的其它化合物(枸杞中包含的姜黄素、类黄酮、LBP多糖等)。这样的天然来源的物质可以直接通过饮食(例如通过增加水果诸如苹果和橘子的摄食)或通过膳食补充剂或营养制品补充剂摄入。一种替代的治疗策略基于施用合成或提取的分子(诸如美金刚(memantine)、胞磷胆碱、溴莫尼定(brimonidine)、高牛磺酸、多酚)。在任何情况中，关于眼科领域中神经退行性病变的神经保护的临床研究仍处于初始阶段，并且还不存在确定这些治疗方法的临床有效性的任何可用的数据。
因此，尽管近年来的临床进展，但开发用于治疗视网膜的神经退行性病变和视神经的神经退行性病变，诸如青光眼、以及其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变的新策略的可能性是令人十分感兴趣的。特别地，对开发不仅减缓病变的进展(以控制功能损伤并且因此控制视力损害)而且还能够使症状和临床表现消退、具有可由患者感知的持久作用的更有效的治疗策略存在强烈需求。
发明概述
本发明涉及血清治疗眼科领域中的神经退行性病变的用途：使用的血清包含优选地浓度等于或大于5pg/ml的神经生长因子-β(NGF-β)。
在一种实施方案中，血清包含浓度等于或小于5pg/ml的因子NGF-β。
在本发明的一种实施方案中，本发明的血清包含优选地浓度等于或大于9500pg/ml的脑衍生神经营养因子(BDNF)。
血清可以优选地是来自脐带血的血清。本发明的血清可以按原样或在组合物内使用，用于治疗视网膜的退行性病变或视神经的退行性病变，特别是青光眼。
本发明的血清可以按原样或在组合物内使用，用于治疗其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变，诸如例如，色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病或Usher综合征。
因此，本发明还涉及包含上文提及的血清以及任选地一种或更多种赋形剂和/或载体和/或防腐剂的组合物。
此外，本发明涉及一种制备用于上文提及的用途的血清的方法，使得血清可以用于治疗神经退行性眼科病变。
附图简述
图1是示出了在用本发明的洗眼剂治疗之前和在用本发明的洗眼剂治疗之后，受原发性开角型青光眼(POAG)影响的患者(PZ 1)的视野的敏感度的MD(平均偏差)值的模式的图。对应于2016年6月的箭头指示用血清治疗的开始。OD＝右眼；OS＝左眼。
图2是示出了在用本发明的洗眼剂治疗之前和在用本发明的洗眼剂治疗之后，受原发性开角型青光眼(POAG)影响的患者(PZ 1)的视野的敏感度的PSD(模式标准偏差)值的模式的图。对应于2016年6月的箭头指示用血清治疗的开始。OD＝右眼；OS＝左眼。
图3是示出了在用本发明的洗眼剂治疗之前和在用本发明的洗眼剂治疗之后，受原发性开角型青光眼(POAG)影响的患者(PZ 2)的视野的敏感度的MD(平均偏差)值的模式的图。对应于2016年3月的箭头指示用血清治疗的开始。血清仅被施用于右眼。OD＝右眼；OS＝左眼。
图4是示出了在用本发明的血清洗眼剂治疗之前和在用本发明的血清洗眼剂治疗之后，受原发性开角型青光眼(POAG)影响的患者(PZ 2)的视野的敏感度的PSD(模式标准偏差)值的模式的图。对应于2016年3月的箭头指示用血清治疗的开始。血清仅被施用于右眼。OD＝右眼；OS＝左眼。
图5是响应于亮度增加的闪光而记录的视网膜电图(fERG)，并且其示出了与以下相关的两种不同强度记录的a-波和b-波的振幅：用本发明的血清治疗的和未治疗的对照动物的眼睛的刺激(A和B)；在暴露于光之后受损的对照眼睛的刺激(LD对照)和暴露于光的同一动物的治疗的眼睛和未治疗的眼睛的刺激(LD治疗的眼睛和未治疗的眼睛)(C和D)。
图6A示出了在均暴露于光LD的治疗的眼睛的样品(上面的线)和未治疗的眼睛的样品(下面的线)中，从背侧视网膜至腹侧视网膜(其穿过视盘)测量的光感受器细胞层(ONL)的厚度。
图6B示出了治疗的眼睛(左)和未治疗的眼睛(右)的样品中“热点”(最大损伤区域)的范围。
图7示出了在FBS/CBS的存在下暴露于H2O2后的RMC-1细胞的细胞生存力分析。该图示出了在用H2O2处理后，用FBS或CBS培养的RMC-1细胞之间关于细胞生存力的差异。该图中的星号分别指示，*：p<0.05；***：p<0.01；****p<0.0001。
发明详述
本发明涉及包含优选地浓度等于或大于5pg/ml的神经生长因子-β(NGF-β)的血清，所述血清用于治疗神经退行性眼科病变或用于治疗其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变。
在一种实施方案中，用于根据本发明的用途的血清可以包含浓度等于或大于6pg/ml的NGF-β；更优选地，用于根据本发明的用途的血清可以包含浓度等于或大于7pg/ml的NGF-β；甚至更优选地，用于根据本发明的用途的血清可以包含浓度等于或大于8pg/ml的NGF-β。
在一种实施方案中，因子NGF-β以等于或小于5pg/ml、优选地被包含在0.5pg/ml和5pg/ml之间、有利地被包含在0.7pg/ml和4pg/ml之间的浓度存在于血清中。
神经生长因子-β(NGF-β)是支持神经细胞和胶质的生长和存活的一种强有力的神经营养因子(属于神经营养因子家族)。NGF-β，与存在于血清中的其他因子组合，负责根据本发明的血清的神经保护和抗炎作用。
许多生长因子和细胞因子在细胞生长、增殖和分化中的作用已经被已知晓了一定时间；然而，许多细胞通信途径尚未被完全理解，并且多种细胞通信途径彼此交叉的方式仍然是未知的。因此，除了NGF-β之外，多种其他分子可能在介导针对眼科病变的神经保护作用中起重要作用；在这些分子中，可以指出生长因子，诸如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-碱性)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)。
与上文指定的一种或更多种其它因子组合的、可能在介导针对眼科病变的神经保护或抗炎作用中起重要作用的其它因子是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3(转化生长因子-β1、转化生长因子-β2和转化生长因子-β3)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IGF-2(胰岛素样生长因子2)和VEGF(血管内皮生长因子)。
转化生长因子-α(TGF-α)由巨噬细胞、脑细胞和角质细胞产生。TGF-α诱导上皮的发育并且其作用与表皮生长因子(EGF)的作用密切相关，其在调控细胞生长、增殖和分化中发挥重要作用。TGF-α还刺激受损的成人脑中的神经元细胞的增殖。
血小板衍生生长因子(PDGF)是间充质来源的细胞的主要的血清有丝分裂原。生物活性蛋白是两种多肽(亚基A和亚基B)的二聚体，其可以以同二聚体(AA或BB)的形式和以异二聚体(AB)的形式存在。
成纤维细胞生长因子(FGF)是参与诸如血管生成、伤口愈合和胚胎发育的过程以及多种内分泌信号传导通路的生长因子家族。例如，在中枢神经系统的发育期间，FGF在神经元细胞的增殖、神经生成、轴突的发育和分化中起重要作用。FGF2由Müller细胞(视网膜胶质)产生并释放，并且在自我保护机制中被活化。
根据最近的实验证据，BDNF似乎在动物模型中保护光感受器免受光诱导的损伤，并且GDNF似乎具有保护视网膜神经元的能力。
一些细胞因子诸如白细胞介素10和白细胞介素13(IL-10和IL-13)还可以由于它们的抗炎作用起间接的神经保护或抗炎作用，对阻碍神经退行性过程有贡献。白细胞介素IL-1β、IL-4和IL-6也可能具有神经保护或抗炎作用。
因此，在优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的血清还可以包含除了NGF-β之外的一种或更多种生长因子或细胞因子。特别地，血清可以包含选自由以下组成的组的一种或更多种分子：
-优选地浓度等于或大于500pg/ml的EGF；
-优选地浓度等于或大于50pg/ml的TGF-α；
-优选地浓度等于或大于5000pg/ml的PDGF；
-优选地浓度等于或大于200pg/ml的FGF；
-优选地浓度等于或大于5pg/ml的IL-10；
-优选地浓度等于或大于100pg/ml的IL-13；
-浓度等于或大于9500pg/ml的BDNF；
-浓度等于或大于0.5pg/ml的GDNF。
在一种实施方案中，EGF可以以等于或大于700pg/ml、优选地等于或大于1000pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中。
在一种实施方案中，EGF以500pg/ml至1500pg/ml、优选地500pg/ml至1200pg/ml、有利地700pg/ml至1000pg/ml的浓度存在于血清中。
在一种实施方案中，TGF-α可以以等于或大于60pg/ml、优选地等于或大于75pg/ml、以被包含在例如50pg/ml和100pg/ml之间、优选地60pg/ml和90pg/ml之间的值的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中。
在一种实施方案中，TGF-α可以以等于或小于50pg/ml、优选地15pg/ml和45pg/ml之间、有利地20pg/ml和40pg/ml之间的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中。
在一种实施方案中，PDGF可以以等于或大于7000pg/ml、优选地等于或大于9000pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中，具有被包含在例如5000pg/ml和14000pg/ml之间、优选地7000pg/ml和10000pg/ml之间的值。
在一种实施方案中，FGF可以以等于或大于300pg/ml、优选地等于或大于400pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中，具有被包含在例如200pg/ml和500pg/ml之间的值。
在一种实施方案中，IL-10可以以等于或大于7pg/ml、优选地等于或大于9pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中，具有被包含在例如5pg/ml和15pg/ml之间、优选地7pg/ml和13pg/ml之间的值。
在一种实施方案中，IL-13可以以等于或大于130pg/ml、优选地等于或大于150pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中，具有被包含在例如130pg/ml和300pg/ml之间、优选地130pg/ml和200pg/ml之间的值。
在一种实施方案中，BDNF可以以等于或大于10000pg/ml、优选地等于或大于12000pg/ml、有利地等于或大于13000pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中。
在一种实施方案中，BDNF以被包含在9500pg/ml和20000pg/ml之间、优选地10000pg/ml和18000pg/ml之间的浓度被包含在血清中。
在一种实施方案中，GDNF以等于或大于1pg/ml、优选地等于或大于1.1pg/ml的浓度存在于用于根据本发明的用途的血清中。
在一种实施方案中，GDNF以被包含在0.5pg/ml和4pg/ml之间、优选地1pg/ml和3pg/ml之间的浓度存在于血清中。
在一种特别优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的血清包含：
-优选地浓度等于或大于5pg/ml的NGF-β；
-优选地浓度等于或大于500pg/ml的EGF；
-优选地浓度等于或大于50pg/ml的TGF-α；
-优选地浓度等于或大于9500pg/ml的BDNF；
-优选地浓度等于或大于0.5pg/ml的GDNF。
在一种实施方案中，本发明的血清包含任选地与GDNF组合的BDNF，所述BDNF优选地以等于或大于9500pg/ml的浓度存在，所述GDNF以等于或大于0.5pg/ml的浓度存在。
在一种实施方案中，包含优选地以等于或大于9500pg/ml的浓度存在的BDNF的血清还包含浓度等于或小于5pg/ml、优选地被包含在0.5pg/ml和5pg/ml之间、有利地被包含在0.7pg/ml和4pg/ml之间的NGF-β。
在一种实施方案中，血清包含BDNF、NGF-β、GDNF、EGF和TGF-α。
在本发明的一种实施方案中，用于此处描述的用途的血清可以是来自脐带血的血清。在下文中，出于简洁起见，术语“脐带”将被用于指示来自脐带的某些原材料的来源；因此，例如，“脐带血”意指脐带的血液，“脐带血清”意指源自于脐带的血液的血清等。关于优选用于根据本发明的用途的脐带血清的基本原理由其中天然包含的高含量的生长因子给出。可选地，用于此处描述的用途的血清还可以是来自成年生物体的血液的血清。
在本发明的另一种实施方案中，用于如此处描述的用途的血清可以优选地从人类血液获得。
在本发明的另一种实施方案中，用于如此处描述的用途的血清可以通过将在下文描述的制备方法获得。
根据本发明的包含生长因子和/或细胞因子的血清具有治疗眼科领域中的神经退行性病变的用途。此外，该血清可以用于治疗其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变，例如色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病或Usher综合征。
特别地，如此处描述的血清可以用于治疗视网膜的退行性病变和视神经的退行性病变。随时间的推移，这些类型的退行性眼科疾病导致视野的显著缩小和视力的永久性损伤。因此，使用本发明的血清治疗这样的病变是极其有利的，因为通过控制神经元损伤和/或减缓其进展，它能够使受这样的病变影响的受试者改善他们的生活质量。
更详细地，本发明的血清可以用于治疗青光眼；在一种实施方案中，本发明的血清可以用于治疗原发性开角型青光眼；在另一种实施方案中，本发明的血清可以用于治疗原发性闭角型青光眼。
本发明的另一个方面涉及一种制备用于本文描述的用途的血清的方法。根据本发明的方法包括以下步骤：
i.分析从对应血液样品中获得的血清样品中的NGF-β浓度；和
ii.选择具有等于或大于5pg/ml的NGF-β浓度的血清样品。
在本发明的方法的步骤i.中，对血清进行表征：分析血清样品以确定NGF-β的浓度。基于针对多个样品确定的NGF-β浓度，在该方法的步骤ii.中仅选择NGF-β浓度大于5pg/ml的样品。
在一种实施方案中，在步骤i.中，还可以任选地评价任何其他感兴趣的生长因子和/或细胞因子的浓度；在该情况中，还可以基于这些另外的生长因子和/或细胞因子(以及NGF-β)的浓度进行步骤ii中的血清样品的选择,这些另外的生长因子和/或细胞因子(以及NGF-β)的浓度可以优选地大于上文指定的阈值浓度。在一种实施方案中，在表征血清的步骤i.中，确定选自由以下组成的组的一种或更多种分子的浓度是可能的：EGF、TGF-α、PDGF、FGF、IL-10和IL-13、BDNF和GDNF。
例如，用于制备血清以便使用的替代方法包括以下步骤：
i.分析从对应血液样品中获得的血清样品中的BDNF浓度；和
ii.选择具有等于或大于9500pg/ml的BDNF浓度的血清样品。
在本发明的方法的步骤i.中，对血清进行表征：分析血清样品以确定BDNF的浓度。基于针对多个样品确定的BDNF浓度，在该方法的步骤ii.中仅选择BDNF浓度大于9500pg/ml的样品。
经历该方法的步骤i.中的分析的血清样品可以根据本领域已知和常用的标准程序从血液中获得。通常允许血液样品在室温凝固约2小时-3小时的时间段(使得血液的固体组分沉淀)，然后进行通常被包含在2500rpm和3500rpm之间的速度的离心。然后例如通过抽吸收集血清(上清液)。
在该方法的一种实施方案中，在步骤ii.期间选择的血清样品可以被冷冻不长于24个月的时间段。血清样品可以优选地被冷冻在被包含在-20℃和-85℃之间的温度。
如本领域技术人员已知的，血清样品的储存温度与其最长的储存时间段直接相关。因此，例如，血清样品可以在-20℃保持最长6个月的时间段，或在-80℃保持最长48个月的时间段。
样品可以优选地保持冷冻(优选地在约-70℃)约6周-8周。
将冷冻状况维持至少6周-8周的时间段被称为“隔离期(quarantine period)”，并且使验证收集的血清不具有污染物并且维持无菌变得可能。
为了继续使用本发明的血清，可以任选地将一种或更多种选择的血清样品合并在一起(如果它们被冷冻，在解冻后)，并且按原样使用或用于产生用于治疗神经退行性病变或其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变的眼科用制剂。
从其获得用在本发明的方法中的血清的血液样品可以优选地是来自人类脐带的血液样品。
根据本发明的方法能够制备这样的血清，其由于生长因子和/或细胞因子的浓度超过上文指定的作为最小阈值的值，而在患病的眼组织的神经保护方面以及作为抗炎剂方面有效。
根据本发明的用于治疗神经退行性眼科病变的血清可以天然地包含本文指定的生长因子和细胞因子。所述生长因子和细胞因子的天然来源显示出与该生长因子和细胞因子超过通过合成(例如，通过尚未商业可得但可用于研究的重组合成技术)获得的相应产物的生物可利用度的生物可利用度相关。
根据本发明的血清可以按原样，即作为呈纯形式的活性成分使用，用于本文描述的用途，或者它可以被包含在组合物内。
因此，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含如本文描述的用于治疗神经退行性眼科病变或用于治疗其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变的血清以及任选地一种或更多种另外的物质。如本领域已知的，这样的物质通常可以选自由对于人类使用可接受的赋形剂、载体和防腐剂组成的组。组合物可以优选地包含如本文描述的血清以及通常具有被包含在7和8之间的pH的水性生理溶液。
组合物可以呈液体形式、呈凝胶形式、呈水胶体形式、呈喷雾剂形式，例如鼻喷雾剂；组合物可以优选地呈液体形式。此外，组合物通常被局部使用，通过结膜穹窿(conjunctival fornix)内或通过鼻粘膜经鼻施用。
组合物可以被制备成适于眼科使用的形式：例如，组合物可以呈洗眼剂、滴眼剂或滴鼻剂、眼软膏或鼻软膏、眼凝胶或或鼻凝胶或鼻喷雾剂的形式；组合物可以优选地呈洗眼剂的形式。如果血清例如通过使用水性生理溶液被配制成液体形式，则上文描述的生长因子和细胞因子的浓度将按照被包含在1:2和1:10之间的因子，例如1:5的稀释因子被稀释。
因此，在优选的实施方案中，其中配制成液体形式的血清以1:2的因子被稀释，对于上文指定的一些因子基于1:2的稀释度计算的一些浓度值如下文列出的：
-EGF，浓度等于或大于250pg/ml、或等于或大于350pg/ml、或等于或大于500pg/ml；
-PDGF，浓度等于或大于2500pg/ml、或等于或大于3500pg/ml、或等于或大于4500pg/ml；
-FGF，浓度等于或大于100pg/ml、或等于或大于150pg/ml、或等于或大于200pg/ml；
-IL-10，浓度等于或大于2.5pg/ml，、或等于或大于3.5pg/ml、或等于或大于4.5pg/ml；
-IL-13，浓度等于或大于50pg/ml、或等于或大于65pg/ml、或等于或大于75pg/ml；
-BDNF，浓度等于或大于4750pg/ml、或等于或大于5000pg/ml、优选地等于或大于6000pg/ml，
-GDNF，浓度等于或大于0.25pg/ml、或等于或大于0.5pg/ml、或等于或大于0.55pg/ml。
在另一种实施方案中，其中配制成液体形式的血清以1:10的因子被稀释，对于上文指定的一些因子基于1:2的稀释度计算的一些浓度实例如下文列出的：
-EGF，浓度等于或大于50pg/ml、或等于或大于70pg/ml、或等于或大于100pg/ml；
-PDGF，浓度等于或大于500pg/ml、或等于或大于700pg/ml、或等于或大于900pg/ml；
-FGF，浓度等于或大于20pg/ml、或等于或大于30pg/ml、或等于或大于40pg/ml；
-IL-10，浓度等于或大于0.5pg/ml、或等于或大于0.7pg/ml、或等于或大于0.9pg/ml；
-IL-13，浓度等于或大于10pg/ml、或等于或大于13pg/ml、或等于或大于15pg/ml；
-BDNF，浓度等于或大于950pg/ml、或等于或大于1000pg/ml、或等于或大于1200pg/ml；
-GDNF，浓度等于或大于0.05pg/ml、或等于或大于0.1pg/ml、优选地等于或大于0.11pg/ml。
在其中配制成液体形式的血清以1:5的因子或被包含在1:2和1:10之间的任何其它因子或上文未指定的其他因子被稀释的实施方案中，如先前描述的，本领域普通技术人员可以容易地计算存在于组合物中的生长因子和细胞因子的浓度。
本发明还涉及一种用于治疗受神经退行性眼科病变例如青光眼影响或受其进展与神经炎性过程的活化关联的一种或更多种眼科病变影响的人类或动物受试者的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效剂量的本发明的血清的步骤。
施用优选地是局部的，通过结膜穹窿内或通过鼻粘膜经鼻施用。
血清可以按原样施用或被配制为组合物。
在一种实施方案中，方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的包含本发明的血清的组合物。所述组合物可以呈液体形式、呈凝胶形式、呈水胶体形式或呈喷雾剂形式。组合物优选地为洗眼剂、滴眼剂或滴鼻剂、眼软膏或鼻软膏、眼凝胶或鼻凝胶。
此外，组合物通常被局部使用，通过结膜穹窿内或通过鼻粘膜经鼻施用。
待施用的组合物优选地包含本发明的血清以及通常具有被包含在7和8之间的pH的水性生理溶液。呈液体形式的包含本发明的血清的组合物的施用的治疗有效剂量(dose)和/或剂量(dosage)取决于存在于其内的生长因子和细胞因子的浓度。本领域技术人员可以容易地推导出所述剂量(dose)和/或剂量(dosage)。
下文提供了与脐带血血清的制备和包含脐带血血清的制剂(洗眼剂)相关的一些实施例，以及所述血清或洗眼剂在治疗神经退行性过程中的有效性的细胞模型上的体外评估和动物模型上的体内评估。另外的实施例涉及所述血清或洗眼剂用于治疗受眼科神经变性(neurodegeneration)影响的患者的用途。实施例明显地不应被理解为限制专利申请的保护范围。
实施例
实施例1.0：脐带血血清的制备
脐带血的样品由接受知情同意书并且许可将血液本身用于移植目的、用于临床或研究使用和/或知识产权保护的用途的一些妇女在分娩后立即捐献。
脐带血在分娩时从胎盘血管获取，收集在用于该用途的临床上验证的专用试管中，并且送至S.Orsola-Malpighi University Hospital and Polyclinic的地区脐带血库。
首先允许脐带血样品在室温凝结2小时，并且然后在+4/+10℃在冷冻离心机中以3000rpm离心15分钟。通过抽吸收集从脐带血样品获得的血清样品(即离心结束时获得的上清液)，将其放置在试管中并且进行分析以评价NGF-β以及其他生长因子和细胞因子的浓度。
将选择的具有大于5pg/ml的NGF-β浓度的血清样品放置在储存管中并且保持在-80℃直到它们用于制备洗眼剂的时间。
特定生长因子(EGF)的浓度在储存时间结束时和之后被评价并且被证明在-80℃维持6个月后也基本上恒定。
实施例1.1：基于脐带血血清的洗眼剂的制备
将储存在-80℃的脐带血清样品解冻，并且在层流罩中在D级受控环境中工作，以使得获得四个“池”的方式集合更多脐带血清样品(相同血型并且经临床验证)，每个池包含体积不少于30ml的血清。
产生的四个池中的生长因子和白细胞介素的浓度如下(值以pg/ml表示)。
| 池1 | 池2 | 池3 | 池4 | |
| NGF-β | 10 | 8.5 | 7.0 | 6.0 |
| EGF | 763.5 | 744 | 1200 | 1200 |
| TGF-α | 78.5 | 64.0 | 96.5 | 99.0 |
| PDGF-BB | 9900 | 8700 | 9600 | 12200 |
| FGF-碱性 | 521.0 | 384.5 | 482.0 | 221.5 |
| IL-10 | 9.0 | 7.5 | 14.5 | 6.0 |
| IL-13 | 207.0 | 125.0 | 312.0 | 139.5 |
在层流罩中，将每个池用体积等于池的体积的4倍的pH 7.4的无菌生理溶液稀释(1∶5稀释度)，过滤并且分散到1ml单剂量小瓶中。
标记各个小瓶并且将每批(由15个用连续数字标记的小瓶组成)包装在透明的气密密封塑料袋中，塑料袋附有识别标签(identification label)。使用被验证用于相关的血液组分的
瓶(Biomerieux)对每批进行需氧和厌氧细菌和真菌的搜索。仅在验证了阴性微生物学结果后，多批洗眼剂才可用于患者的实验性试验。
实施例1.2：对患者的体内评价
视野(VF)的计算机化检查
视野(VF)的计算机化检查测量对眼睛周围的空间的视力，并且用于评价可归因于视网膜和/或视神经病变的视野敏感度的改变的存在。视野敏感度的改变通过评价正常视野的多个点的感知来检查。
VF检查通过视网膜的局部化光刺激进行：实际上，对患者感知和响应投射到位于患者眼睛前方33cm距离处的半穹窿形屏幕(half-dome shaped screen)上或在位于患者眼睛前方的33cm距离处的半穹窿形屏幕上激活的不同形式和强度的光刺激的能力进行了评估。对每一只眼睛单独地进行检查(因此使患者不进行检查的眼睛闭合)，每只眼睛持续约15分钟并且无痛。被用于分析的仪器由光信号投射到其上的具有白色背景的穹隆形屏幕组成：当患者感知光信号时，他或她例如通过按压发光或发声的按钮向操作者指出这一点。在本研究中，使用2003Carl Zeiss Meditec Humphrey HFA II 745-2205仪器。
在检查期间收集的数据通过推导感兴趣的视野计(perimeter)指数的软件来处理。在本研究中，使用了2003Carl Zeiss Meditec Humphrey HFA II 745-2205，升级版12.5/12.6的仪器软件。
在本研究中考虑了视野计指数的MD(平均偏差)和PSD(模式标准偏差)。MD值是进行检查的受试者的视网膜敏感度与针对年龄校正的被认为正常的敏感度之间的平均差，并且被计算为针对检查期间测试的视野的所有点的算术平均值。MD以分贝(dB)测量，并且对于被包含在-2dB和+2dB之间的值被认为是正常的：(正)MD值越高，视觉损害越大。PSD值是平均偏差的方差，即它指示平均偏差在视野中如何分布。PSD指示局部化视觉缺陷的存在并且因此表示缺陷的不均匀性。PSD也以分贝(dB)测量：值越高，缺陷在视野象限中的分布越大。
在下文描述的研究中，对近年来所检查的患者在用本发明的血清治疗之前和之后的视野敏感度的MD值和PSD值的模式进行评估。
患者
对在Alma Mater Studiorum University of Bologna和S.Orsola-MalpighiUniversity Hospital of Bologna的眼科手术科(Operational Ophthalmology Unit)进行治疗的两名患者进行临床研究。
患者1，66岁男性，受(I)型糖尿病影响，自2006年已经进行药理学治疗，并且展示出具有糖尿病性视网膜病和原发性开角型青光眼(POAG)，于2014年1月被诊断并且用局部眼内压降低药物治疗，有效地将眼内压值维持在正常限值内。患者抱怨的症状是双眼疼痛(描述为刺激、灼烧感、眼中进沙的感觉、不适)。生物显微术检查没有揭示任何伴随的角膜病；裂隙灯的观察未显示出角膜上皮缺陷。
患者2，60岁女性，已经受原发性开角型青光眼(POAG)影响10年，定期进行眼压测量术(tonometry)并且正进行用局部眼内压降低药物的治疗。患者抱怨的症状是右眼疼痛强烈和左眼疼痛可忍受(描述为刺激、灼烧感、眼中进沙的感觉、不适)；在观察结果之前六个月内计划的治疗剂(眼泪替代物、抗炎药、局部可的松(cortisone))仅对这些症状产生最小作用。生物显微术检查没有揭示任何伴随的角膜病；裂隙灯的观察未显示出角膜上皮缺陷。
治疗与结果
患者1于2016年6月开始治疗，并且用从血清池1和2准备的2批基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括30个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于双眼的一天治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的12小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在从4℃至10℃的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入每一只眼睛中施用洗眼剂，一天8次，约每2小时一次。
在2016年9月，患者1在进行检查时报告刺激和疼痛症状的显著减轻，这些症状更可忍受的并且有时甚至无法感觉到。
参考附图1，附图1示出了在2014年1月、2016年6月和2016年9月进行的检查中测量的视野敏感度的MD值的趋势，可以观察到MD值在2014年和2016年6月之间的时间段中逐渐恶化，随后在2016年6月-9月的时间段中改善。该时间段与用基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致(治疗的开始在图中用对应于2016年6月的箭头指示)。
相似地，参考附图2，附图2示出了在2014年1月、2016年6月和2016年9月进行的检查中测量的视野敏感度的PSD值的趋势，可以观察到PSD值在2014年和2016年6月之间的时间段中逐渐恶化(增加)。相反，在2016年6月-9月的时间段中，在该时间段中患者用基于脐带血血清的洗眼剂治疗(治疗的开始在图中用对应于2016年6月的箭头指示)，检测到左眼的PSD值的改善(减小)，而右眼的PSD值保持基本上不变，指示在任何情况下用本发明的血清治疗的积极效果。
患者2于2016年3月开始治疗，并且用从血清池3和4准备的2批基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括15个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于仅一只眼睛(右眼)的两天的治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的36小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在从4℃至10℃的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入待治疗的眼睛中施用洗眼剂，一天8次，约每2小时一次。
在2016年6月，患者2在进行检查时报告刺激和疼痛的症状的显著减轻，所述症状可容忍的点达到她能够以可接受的方式参与她的日常活动的程度。
参考附图3，附图3示出了在2006年12月、2008年6月、2011年2月、2012年9月、2013年11月、2016年3月、2016年6月和2016年9月进行的检查中测量的视野敏感度的MD值的趋势，可以观察到MD值在2006年和2016年3月之间的时间段中逐渐恶化，随后所述值在2016年3月-6月的时间段中改善。该时间段与用基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致(治疗的开始在图中用对应于2016年3月的箭头指示)。在治疗结束后4个月，2016年9月记录的MD值仍然显著改善并且接近在疾病的第一年记录的MD值。
相似地，参考附图4，附图4示出了在2006年12月、2008年6月、2011年2月、2012年9月、2013年11月、2016年3月、2016年6月和2016年9月进行的检查中测量的视野敏感度的PSD值的趋势，可以观察到PSD值在2006年和2016年3月之间的时间段中逐渐恶化(增加)。相反，在2016年3月-6月的时间段中，在该时间段中患者用基于脐带血血清的洗眼剂治疗(治疗的开始在图中用对应于2016年3月的箭头指示)，发现PSD值的改善(减小)。在治疗结束后4个月，2016年9月记录的PSD值仍然显著改善并且甚至比病变的第一年(2006年)记录的PSD值更低。
另一个有趣的观察结果产生自对右眼(用基于脐带血血清的洗眼剂治疗)和左眼(未治疗)的MD值和PSD值之间的比较。不仅用基于血清的洗眼剂治疗的眼睛(右眼，图中的OD)显示出MD值和PSD值的显著改善，而且未治疗的对侧的眼睛(左眼，图中的OS)也显示出MD值和PSD值的改善。该结果表明两只眼睛之间的神经交互(neural cross-talk)关系的存在。
实施例2.0：脐带血血清的制备
脐带血样品由接受知情同意书并且许可将血液本身用于移植目的、用于临床或研究使用和/或知识产权保护的用途的一组与实施例1.0的妇女不同的若干妇女在分娩后立即捐献。
脐带血在分娩时从胎盘血管获取，收集在用于该用途的临床上验证的专用试管中，并且送至S.Orsola-Malpighi University Hospital and Polyclinic的地区脐带血库。
首先允许脐带血样品在室温凝固2小时，并且然后在+4/+10℃在冷冻离心机中以3000rpm离心15分钟。通过抽吸收集从脐带血样品获得的血清样品(即离心结束时获得的上清液)，将其放置在试管中并且进行分析以评价NGF-β、EGF以及其他生长因子和细胞因子的浓度。
将选择的具有大于500pg/ml的EGF浓度的血清样品放置在储存管中并且保持在-80℃直到它们用于制备洗眼剂的时间。
特定生长因子(EGF)的浓度在储存时间结束时和之后被评价并且被证明在-80℃维持6个月后也基本上恒定。将储存在-80℃的脐带血清样品解冻，并且在层流罩中在D级受控环境中工作，以使得获得包含体积不少于30ml的血清的“池”的方式集合更多脐带血清样品(相同血型并且经临床验证)。
产生的池中的生长因子和白细胞介素的浓度如下(值以pg/ml表示)。
| 池1 | |
| NGF-β | 0.70 |
| EGF | 890 |
| TGF-α | 66.6 |
| TFG-β1 | 64271 |
| TGF-β2 | 1056 |
| TGF-β3 | 552 |
| PDGF-BB | 7103 |
| FGF-碱性 | 77.5 |
| IL1-B | 33957 |
| IL-4 | 0.38 |
| IL-6 | 116785 |
| IL-10 | 15.4 |
| IL-13 | 262.7 |
| IGF1 | 13.57 |
| IGF2 | 68.54 |
| VEGF | 635 |
实施例2.1：具有诱导的视网膜变性的动物模型的体内评价
测试根据本发明的实施例2.0中获得的纯脐带血血清在具有诱导的视网膜变性的动物模型中的神经退行性过程的治疗中的有效性。
对白化大鼠使用高强度光诱导光感受器的死亡，这因此导致神经退行性过程的进展。
视网膜上的光损伤(LD)是用于测试神经保护剂的有效性的已确立的模型。
特别地，使用的模型显示出被称为“热点”的更敏感的背侧区域：该区域是其中变性开始的区。变性随后由导致神经炎症的不同扩散因素指导，神经炎症随时间的推移而延伸。视觉功能也严重受损：出于这个原因，任何神经保护剂的有效性可以通过这样的方法，通过电生理学方法和形态学方法二者来评估。
对总计24只白化大鼠(Sprague Dawley品系)进行实验，所有白化大鼠的年龄被包含在3个月和4个月之间。动物在本申请人自己的设施中出生和饲养，在低亮度条件下(5lux)和在明暗交替的条件下(12小时的光照与12小时的黑暗交替)；被分析的动物被分成四组：
1)未用本发明的血清治疗的正常对照组；
2)用本发明的血清治疗的正常对照组；
3)具有通过暴露于光诱导的视网膜变性的对照组；
4)具有通过暴露于光诱导的视网膜变性的组，一只眼睛用本发明的血清治疗，而另一只眼睛未治疗。
在暴露于高强度光之前7天，在指示的大鼠的组中开始用本发明的血清进行治疗。在第4组的大鼠的情况中，仅一只眼睛一天三次用单滴(约10μL)治疗，留下未治疗的另一只眼睛作为对照。在暴露于高强度光之后，用相同的方案对大鼠进行监测和治疗，持续七天的时间段。
光损伤
将第3组和第4组的白化大鼠逐一地放置在笼中，其中灯位于上部和下部，以确保笼内在等亮度(1000lux)下的环境的方式。去除垃圾以防止大鼠使它们的眼睛避开光。对光的暴露在自然白天阶段，即在12个小时的黑暗之后立即开始。使动物暴露于1000lux的光连续24小时，在其后将它们立即放回它们的正常笼中，重建正常条件。
电生理学分析
随后，在暴露于损伤性光后一周，响应于亮度增加的闪光记录视网膜电图(fERG)，以便评估视网膜的视觉功能。在记录视网膜电图之前，将白化大鼠保持在黑暗中12小时，并且在黑暗的室中进行分析。
通过腹膜内注射氯胺酮(Ketamine)/赛拉嗪(Xylazine)(10mg/100g–1.2mg/100g)将大鼠麻醉，并且架置在位于Ganzfeld穹隆(Ganzfeld dome)(Biomedica Mangoni,Pisa,Italy)开口的立体定位装置内。使用由直肠探头控制的加热板将体温维持在37.5℃。
用一滴奴佛卡因(novocaine)将角膜麻醉并且用1％托吡卡胺(tropicamide)使瞳孔扩大。
使用的闪光产生单元产生具有被包含在0.001cd/m2和100cd/m2之间的强度的闪光。记录超过300ms加25ms的测试前基线的响应，并且以差分方式(differential manner)放大，用0.3Hz-300 Hz的带通滤波器滤波，并且最后经由PC界面(LabVIEW 8.2,NationalInstruments,Milan,Italy)以0.25ms至0.3ms的间隔数字化。
分析了a-波、b-波和振荡电位。
在两种闪光强度记录的a-波和b-波的振幅在图5中示出。在图5中，字母A和B指示针对用洗眼剂治疗和不用洗眼剂治疗的健康眼睛记录的a波和b波：治疗的眼睛和未治疗的眼睛都显示出可比较的振幅响应。相比之下，字母C和D指示针对用洗眼剂治疗和不用洗眼剂治疗的经受损伤性光的眼睛以及对照眼睛记录的a波和b波。根据预期的结果，由于光诱导的损伤，a波和b波二者的振幅极大地降低。然而，与未治疗的对应物或对照样品相比，用洗眼剂治疗能够使视网膜的功能在治疗的眼睛中被大大地保持。
就振荡电位而言，未检测到显著影响。
在记录时期结束时，处死动物。眼睛和视网膜被移除并且被用于随后的形态学分析。
形态学分析
为了准备视网膜，将眼睛切片并且随后通过浸入4％多聚甲醛的固定缓冲液中在4℃的温度固定24小时。
在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤三次后，将眼睛留在15％蔗糖溶液中过夜以确保其将来的冷冻保护。然后通过在液氮中快速冷冻将眼睛插入封固介质(Tissue TekOCT化合物；Sakura Finetek,Torrance,CA)中。随后，获得从背侧区域延伸到腹侧区域的20mm的冷冻切片。
然后将切片封固在明胶和用聚L-赖氨酸包被的载玻片上，并且随后在烘箱中在50℃干燥过夜并且储存在-20℃。
出于评价细胞层的目的，将切片用DNA特异性染料双苯甲亚胺(Calbiochem,LaJolla,CA)标记并且在0.1M PBS中的1:10000溶液中孵育2分钟。选择以穿过乳头(papilla)(视神经的起源)的方式切割的切片。从视网膜的背侧至腹侧边缘扫描每一个切片。
在被强光损伤的视网膜中，光感受器最初在“热点”区域中死亡，并且神经元死亡在相邻区域中逐渐增加，并且因此外核层(ONL)的厚度明显地降低。
然后通过测量外核层(ONL)的厚度来估计光感受器的存活。特别地，在视网膜的整个范围内，从穿过乳头的背侧至腹侧区域记录ONL厚度；所述厚度以0.40mm的间隔测量。使用ONL厚度和视网膜的厚度之间的比率，而不是使用ONL的绝对厚度(mm)，作为对ONL本身的厚度的量度，以补偿任何斜的切片。此外，测量“热区域”的范围以便评估损伤的程度和保护的有效性。所有测量使用Image J 2.0软件进行。
如图6A中可观察到的，在被治疗的眼睛中，在背侧视网膜中，ONL被保持得比在相应的未治疗的眼睛中更好，而腹侧视网膜呈现出相似的情况。此外，测量了从背侧周围至视盘的“热点”的范围，并且在图6B中示出了两个值的比率。在被治疗的眼睛中，受损区的范围显著缩小。
因此，本研究的结果验证了基于脐带血的洗眼剂可以被成功地用于缓解视网膜神经退行性过程的假设。与暴露于损伤的未治疗的动物相比，功能被部分地维持并且视网膜的形态学保持良好状态。
实施例3.0：脐带血血清的制备
脐带血的样品由接受知情同意书并且许可将血液本身用于移植目的、用于临床或研究使用和/或知识产权保护的用途的一组与实施例1.0和2.0的妇女不同的若干妇女在分娩后立即捐献。
脐带血在分娩时从胎盘血管获取，收集在用于该用途的临床上验证的专用试管中，并且送至S.Orsola-Malpighi University Hospital and Polyclinic的地区脐带血库。
首先允许脐带血样品在室温凝固2小时，并且然后在+4/+10℃在冷冻离心机中以3000rpm离心15分钟。通过抽吸收集从脐带血样品获得的血清样品(即离心结束时获得的上清液)，将其放置在试管中并且进行分析以评价NGF-β以及其他生长因子和细胞因子的浓度。
将选择的具有大于9500pg/ml的BDNF浓度的血清样品放置在储存管中并且保持在-80℃直到它们用于制备洗眼剂的时间。
特定生长因子(EGF)的浓度在储存时间结束时和之后被评价并且被证明在-80℃维持6个月后也基本上恒定。
将储存在-80℃的脐带血清样品解冻，并且在层流罩中在D级受控环境中工作，以使得获得包含体积不少于30ml的血清的“池”的方式集合更多脐带血清样品(相同血型并且经临床验证)。
产生的池中的生长因子和白细胞介素的浓度如下(值以pg/ml表示)。
| 池1 | |
| NGF-β | 2.65 |
| BDNF | 13618.95 |
| GDNF | 1.34 |
| EGF | 744.06 |
| TGF-α | 39.1 |
实施例3.1：体外细胞模型的评价
到目前为止，一个公认的事实是，相对于神经元，胶质细胞在针对多种神经损伤的保护中起作用。
在对视网膜造成损伤的情况中，Müller细胞(其为视网膜中的主要胶质元件)经历显著的形态学、细胞和分子变化，因此保护视网膜免于进一步损伤。Müller细胞表达生长因子并且对生长因子的作用敏感，是神经递质转运体并且产生能够在预防对视网膜的神经元的细胞毒性损伤时具有重要作用的抗氧化剂。此外，Müller细胞与内皮细胞接触以促进缺氧条件期间的新血管形成的过程。
用rMC-1细胞系(视网膜胶质细胞，大鼠Müller细胞)进行实验。
该细胞系表达存在于Müller细胞中的标志物GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和CRALBP(细胞视黄醛结合蛋白)，并且通过用病毒癌基因SV-40T转染而永生化。
细胞培养：rMC-1细胞模型
rMC-1细胞购自ABM,Materials for Life(Richmond,BC,Canada)，并且如由供应商推荐的，使用由供应商推荐的特定培养基在24孔板中培养。氧化损伤的诱导和细胞生存力测试
初步实验促使选择在半汇合(覆盖了80％的孔)的条件下对培养物使用标量浓度的H2O2。简言之，通过将10μM、50μM、100μM、200μM、500μM添加到培养基中，在37℃在CO2培养箱中持续3小时、6小时和24小时的接触时间，对培养物进行氧化损伤的诱导。
因为较低浓度的H2O2对细胞生存力具有可忽略不计的影响并且由于较大浓度的H2O2诱导显著的细胞脱落使结果难以重现，所以选择100μM和200μM的H2O2浓度用于进一步实验。相似的考虑指向选择6小时的孵育以获得由H2O2导致的损伤。
使用培养基中的10％胎牛血清(FBS)作为用于维持rMC-1细胞培养物的标准组合物进行一系列实验，同时使用培养基中的10％脐带血血清(如实施例3.0中描述的批次给药)平行地进行一系列实验，作为比较百分比。
生存力测试使用MTT测试(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)进行，MTT测试是一种基于通过线粒体酶琥珀酸脱氢酶(SDH)将四唑鎓盐细胞内还原成被称为甲
的深蓝色产物的晶体的方法。因此，反应仅可以发生在代谢活跃的细胞中，并且可以将通过分光光度读取获得的光密度(O.D.)的值与存在的活细胞的量相关联。
数字图像和统计分析
记录每一个实验治疗所重复的至少一个孔的中央部分的相差图像以显示出细胞形态学；使用配备有Coolpix数码相机的具有倒置CFL技术的Axiovert 25照相显微镜(CarlZeiss Microscopy LLC,Thornwood,NY)，这些图像被记录为.tif文件。细胞生存力分析的结果在图7中示出并且以平均值±标准偏差(SD)表示。统计分析使用GraphPad Prism 6软件进行。用在没有FBS和CBS的培养基中培养的RMC-1对照将光密度值归一化。通过单向ANOVA检验和Tukey多重比较检验进行统计分析。结果证明H2O2显著地降低细胞生存力(在两个浓度下)；此外，在具有10％CBS的培养基中培养并且用200μM H2O2处理的RMC-1显示出比在存在FBS的情况下培养并且用200μM H2O2处理的RMC-1更大的存活率。
实施例4.0：脐带血血清的制备
脐带血样品由接受知情同意书并且许可将血液本身用于移植目的、用于临床或研究使用和/或知识产权保护的用途的一组与实施例1.0、2.0或3.0的妇女不同的若干妇女在分娩后立即捐献。
脐带血在分娩时从胎盘血管获取，收集在用于该用途的临床上验证的专用试管中，并且送至S.Orsola-Malpighi University Hospital and Polyclinic的地区脐带血库。
首先允许脐带血样品在室温凝固2小时，并且然后在+4/+10℃在冷冻离心机中以3000rpm离心15分钟。通过抽吸收集从脐带血样品获得的血清样品(即离心结束时获得的上清液)，将其放置在试管中并且进行分析以评价BDNF以及其他生长因子和细胞因子的浓度。
将选择的具有大于9500pg/ml的BDNF浓度的血清样品放置在储存管中并且保持在-80℃直到它们用于制备洗眼剂的时间。
特定生长因子(EGF)的浓度在储存时间结束时和之后被评价，并且被证明在-80℃维持6个月后也基本上恒定。
实施例4.1：基于脐带血血清的洗眼剂的制备
将储存在-80℃的脐带血清样品解冻，并且在层流罩中在D级受控环境中工作，以使得获得四个“池”的方式集合更多脐带血清样品(相同血型并且经临床验证)，对于每名患者一个池，每个池包含体积不少于30ml的血清。
对于四名患者产生的四个池中的生长因子和白细胞介素的浓度如下(值以pg/ml表示)。
在层流罩中，将每个池用体积为池的体积的4倍的pH 7.4的无菌生理溶液稀释(1:5稀释)，过滤并且分散到1ml单剂量小瓶中。
标记各个小瓶并且将每批(由15个用连续数字标记的小瓶组成)包装在透明的气密密封塑料袋中，塑料袋附有识别标签。使用被验证用于相关的血液组分的
瓶(Biomerieux)对每批进行需氧和厌氧细菌和真菌的搜索。仅在验证了阴性微生物学结果后，多批洗眼剂才可用于患者的实验性试验。
实施例4.2：对患者的体内评价
视野(VF)的计算机化检查
视野(VF)的计算机化检查测量对眼睛周围的空间的视力，并且用于评价可归因于视网膜和/或视神经病变的视野敏感度的改变的存在。视野敏感度的改变通过评价视野的多个点的感知来检查。
VF检查通过视网膜的局部化光刺激进行：实际上，对患者感知和响应投射到位于患者眼睛前方33cm距离处的半穹窿形屏幕上或在位于患者眼睛前方的33cm距离处的半穹窿形屏幕上激活的不同形式和强度的光刺激的能力进行了评估。对每一只眼睛单独地进行检查(因此使患者不进行检查的眼睛闭合)，每只眼睛持续约15分钟并且无痛。被用于分析的仪器由光信号投射到其上的具有白色背景的穹隆形屏幕组成：当患者感知光信号时，他或她例如通过按压发光或发声的按钮向操作者指出这一点。在本研究中，使用2003CarlZeiss Meditec Humphrey HFA II 745-2205仪器。
在检查期间收集的数据通过推导感兴趣的视野计指数的软件来处理。在本研究中，使用了2003Carl Zeiss Meditec Humphrey HFA II 745-2205，升级版12.5/12.6的仪器软件。
在本研究中考虑了视野计指数的MD(平均偏差)和PSD(模式标准偏差)。MD值是进行检查的受试者的视网膜敏感度与针对年龄校正的被认为正常的敏感度之间的平均差，并且被计算为针对检查期间测试的视野的所有点的算术平均值。MD以分贝(dB)测量，并且对于被包含在-2dB和+2dB之间的值被认为是正常的；(正)MD值越高，视觉损害越大。PSD值是平均偏差的方差，即它指示平均偏差在视野中如何分布。PSD指示局部化视觉缺陷的存在并且因此表示缺陷的不均匀性。PSD也以分贝(dB)测量：值越高，缺陷在视野象限中的分布越大。
在下文描述的研究中，对近年来所检查的患者在用本发明的血清治疗之前和之后的视野敏感度的MD值和PSD值的模式进行评估。
眼内压的检查
在正常条件下，眼内压(IOP)的值在从12mmHg至20mmHg的范围内，并且基本上取决于由睫状体的睫状冠(pars plicata)以连续方式产生的房水的量和在前房角(camerular角)水平通过小梁网排出的量之间的平衡。POAG，还被称为慢性单纯性青光眼，其特征为：于高龄成人发作，IOP>21mmHg，前房角开放或外观正常，乳头凹陷和视野缩小。POAG是一种进展缓慢的慢性疾病，通常是双侧隐匿性发作并且对两种性别的影响程度相等。
视网膜电图
图形视网膜电图(pattern electroretinogram)(PERG)是由棋盘格或光栅图形化刺激诱发的视网膜生物电位；它主要研究神经节细胞的功能，并且在低时间频率(最大4Hz，等同于8次翻转/秒)、2Hz的翻转速率(4次翻转/秒)、黑白方块的最大对比度和白昼视觉亮度(photopic luminance)获得。在图形视网膜电图(PERG)中，通常考虑用P50-N95值指示的波长和用P50值指示的波潜伏期。比较在不同时间进行的两条视网膜电图迹线，改善与第二迹线和第一迹线之间的振幅值的增加和潜伏期值的减少相关。
视觉诱发电位(Visual Evoked Potentials)
视觉诱发电位(VEP)通过记录由视觉刺激诱发的枕叶皮质的生物电电位的变化能够电生理学探索视觉传导通路的功能。
在60’和15’的VEP模式中，通常考虑用N75-P100值指示的波振幅和用P100值指示的波潜伏期。同样在这种情况中，比较在不同时间进行的两条视网膜电图迹线，如果在第二迹线和第一迹线之间的振幅值增加并且潜伏期值减少，观察到改善。
视网膜神经节细胞层厚度的测量。
光学相干断层扫描技术(OCT)是一种非侵入性检查，其使用激光束在体内测量视网膜神经纤维层厚度；因此，它是用于分析神经保护机制的有效技术。在光学相干断层扫描技术中，通常对视网膜神经纤维层(RNFL)的平均厚度进行测量，其在生理学上具有双峰模式(纤维层厚度在颞及上段(temporal and superior sectors)中较大，而在鼻及下段(nasal and inferior sectors)中变得更薄)。
患者
对在Alma Mater Studiorum University of Bologna和S.Orsola-MalpighiUniversity Hospital of Bologna的眼科手术科进行治疗的四名患者进行临床研究。
患者1，76岁女性，已经受原发性开角型青光眼(POAG)影响4年，对通过眼压测量术测量的眼内压具有良好药理学控制并且一直在正常限值内。
患者2，53岁男性，已经受原发性开角型青光眼(POAG)影响2年，对通过眼压测量术测量的眼内压具有良好药理学控制并且一直在正常限值内。
患者3，74岁男性，已经受原发性开角型青光眼(POAG)影响7年，对通过眼压测量术测量的眼内压具有良好药理学控制并且一直在正常限值内。
患者4，74岁男性，已经受原发性开角型青光眼(POAG)影响11年，对通过眼压测量术测量的眼内压具有良好药理学控制并且一直在正常限值内。
治疗与结果
患者1(Pz1)于2018年3月开始治疗，并且用2批按照实施例4.1制备的基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括30个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于双眼的一天治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的12小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在4℃和10℃之间的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入每一只眼睛中施用洗眼剂，一天8次，约每2小时一次。在治疗开始之前两年中进行的HFA30-2分析已经揭示尤其是在右眼(OD)中，MD值的明显降低及其逐渐恶化。特别地，在从2016年12月至2017年9月的时间段中，右眼(OD)的视野敏感度的MD值为从-5.55变化至-7.39，对比左眼(OS)的-5.31至-5.82。
对于本分析，使用具有更精细网格模型的HFA 24-2和中央10-2程序，以改善剩余视野的分辨。
下表1示出了2018年3月-5月的时间段中获得的分析的结果。可以观察到关于视野缺陷的MD值的逐渐改善主要在右眼中，而右眼是两只眼睛中“较差”的。该时间段与用本发明的基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致。
表1
还可能注意到，在治疗两只眼睛之后，RNFL厚度值增加。此外，在左眼中观察到PERG和VEP 60’和15’值的改善，从视野角度来看，左眼是两只眼睛中“较好”的。
患者2(Pz2)于2018年4月开始治疗，并且用2批按照实施例4.1制备的基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括30个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于双眼的一天治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的12小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在4℃和10℃之间的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入每一只眼睛中施用洗眼剂，一天8次，约每2小时一次。
在治疗开始之前两年中进行的HFA 30-2分析已经揭示两只眼睛的MD值的极大降低及其逐渐恶化。特别地，在从2017年1月至2017年10月的时间段中，右眼(OD)的视野敏感度的MD值为从-4.0变化至-6.73，对比左眼(OS)的-2.87至-3.63。
对于本分析，使用具有更精细网格模型的HFA 24-2和中央10-2程序，以改善剩余视野的分辨。
下表2示出了2018年4月-6月的时间段中获得的分析的结果。可以观察到MD和VEP60’和15’值的逐渐改善主要在右眼中，右眼是两只眼睛中“较差”的。该时间段与用基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致。
表2
还可能注意到，在治疗两只眼睛之后，RNFL厚度值保持基本上不变，然而不仅在左眼中观察到PERG值的明显改善，而且在右眼中观察到PERG值的部分改善，关于视野缺陷，左眼是两只眼睛中“较好”的。
患者3(Pz3)于2018年4月开始治疗，并且用2批按照实施例4.1制备的基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括30个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于双眼的一天治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的12小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在从4℃至10℃的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入每一只眼睛中施用洗眼剂，一天8次，约每2小时一次。
在治疗开始之前两年中进行的HFA 30-2分析已经揭示两只眼睛的MD值的明显降低及其逐渐恶化。特别地，在从2017年12月至2018年3月的时间段中，右眼(OD)的视野敏感度的MD值为从-20.03变化至-22.44，对比左眼(OS)的-7.92至-9.34。
对于本分析，使用具有更精细网格模型的HFA 24-2和中央10-2程序，以改善剩余视野的分辨。
下表3示出了2018年4月-6月的时间段中获得的分析的结果。可以观察到关于视野缺陷的MD值的逐渐改善主要在右眼中，右眼是两只眼睛中“较差”的。该时间段与用本发明的基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致。
表3
还可能注意到，在治疗两只眼睛之后，RNFL厚度值保持基本上不变，然而不仅在左眼中观察到PERG和VEP值的明显改善，而且在右眼中观察到PERG和VEP值的部分改善，关于视野缺陷，左眼是两只眼睛中“较好”的。
患者4(Pz4)于2018年4月开始治疗，并且用2批按照实施例4.1制备的基于脐带血血清的洗眼剂治疗2个月；每一批包括30个小瓶，用于总计60次施用。每一个小瓶包含用于双眼的一天治疗所必需的量的洗眼剂：在已经打开小瓶后的12小时内施用全部内容物，并且在一次施用和另一次施用之间将小瓶储存在被包含在4℃和10℃之间的温度。从醒来的时间到就寝前，通过每次施用时将1滴滴入每一只眼睛施用洗眼剂中，一天8次，约每2小时一次。
在治疗开始之前两年中进行的HFA 30-2分析已经揭示尤其是在左眼中，MD值的明显降低及其逐渐恶化。特别地，在从2014年1月至2018年3月的时间段中，右眼(OD)的视野敏感度的MD值为从-0.33变化至-0.59，对比左眼(OS)的-2.95至-9.33。
对于本分析，使用具有更精细网格模型的HFA 24-2和中央10-2程序，以改善剩余视野的分辨。
下表4示出了2018年4月-6月的时间段中获得的分析的结果。可能观察到在两只眼睛中，仅中央部分的MD值与基线相比适度改善。该时间段与用本发明的基于脐带血血清的洗眼剂的治疗一致。
表4
还可以注意到，在治疗两只眼睛之后，RNFL厚度值保持基本上不变，然而在两只眼中并且尤其是左眼中观察到PERG和VEP值的明显改善，关于视野缺陷，左眼是两只眼睛中“较好”的。还可以观察到右眼中的部分改善。
Claims (17)
1.血清，所述血清用于在治疗神经退行性眼科病变中使用，其中所述血清包含神经生长因子-β(NGF-β)。
2.根据权利要求1所述的用于使用的血清，其中所述神经生长因子-β(NGF-β)以等于或大于5pg/ml的浓度存在。
3.根据权利要求1所述的用于使用的血清，所述血清包含浓度等于或大于6pg/ml、优选地浓度等于或大于7pg/ml、更优选地浓度等于或大于8pg/ml的所述神经生长因子-β(NGF-β)。
4.根据权利要求1所述的用于使用的血清，所述血清包含的所述神经生长因子-β(NGF-β)的浓度等于或小于5pg/ml、优选地被包含在0.5pg/ml和5pg/ml之间、有利地被包含在从0.7pg/ml至4pg/ml。
5.根据权利要求1所述的用于使用的血清，所述血清还包含优选地浓度等于或大于9500pg/ml的脑衍生神经营养因子(BDNF)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于使用的血清，所述血清还包含选自由以下组成的组的一种或更多种分子：
-优选地浓度等于或大于500pg/ml的表皮生长因子(EGF)；
-优选地浓度等于或大于50pg/ml或者等于或小于50pg/ml的转化生长因子-α(TGF-α)；
-优选地浓度等于或大于5000pg/ml的血小板衍生生长因子(PDGF)；
-优选地浓度等于或大于200pg/ml的成纤维细胞生长因子(FGF)；
-优选地浓度等于或大于5pg/ml的白细胞介素10(IL-10)；
-优选地浓度等于或大于100pg/ml的白细胞介素13(IL-13)；
-优选地浓度等于或大于0.5pg/ml的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的血清，其中所述血清是来自脐带血的血清。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的血清，其中所述血清是来自人类血液的血清。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的血清，其中所述神经退行性眼科病变选自由以下组成的组：视网膜的退行性病变、视神经的退行性病变以及其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变。
10.根据权利要求9所述的用于使用的血清，其中所述神经退行性眼科病变是青光眼。
11.根据权利要求9所述的用于使用的血清，其中所述其进展与神经炎性过程的活化关联的眼科病变选自以下之中：色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病或Usher综合征。
12.用于制备根据权利要求1-11中任一项所述的用于使用的血清的方法，所述方法包括以下步骤：
-分析从对应血液样品中获得的血清样品中的NGF-β浓度；和
-选择具有等于或大于5pg/ml的NGF-β浓度的所述血清样品。
13.用于制备根据权利要求1-11中任一项所述的用于使用的血清的方法，所述方法包括以下步骤：
i.分析从对应血液样品中获得的血清样品中的BDNF浓度；和
ii.选择具有等于或大于9500pg/ml的BDNF浓度的所述血清样品。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述一个或更多个血液样品是来自人类脐带的血液样品。
15.组合物，所述组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的用于使用的血清以及任选地对于人类使用可接受的一种或更多种赋形剂和/或载体和/或防腐剂。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述一种或更多种赋形剂是水性生理溶液。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中所述组合物呈选自由以下组成的组的形式：洗眼剂、滴眼剂或滴鼻剂、眼软膏或鼻软膏、眼凝胶或鼻凝胶或鼻喷雾剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200410 |