CN116650461A - 咖啡酸苯乙酯滴及其眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用 - Google Patents

咖啡酸苯乙酯滴及其眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了咖啡酸苯乙酯及其滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。一种咖啡酸苯乙酯滴眼液，其制备方法包括如下步骤：将咖啡酸苯乙酯与右旋糖酐羟丙甲纤维素混合成溶液，得到咖啡酸苯乙酯滴眼液。本发明公开了咖啡酸苯乙酯在制备糖尿病视网膜病变药物中的应用。本发明发现并证明了咖啡酸苯乙酯在糖尿病视网膜病变中的新应用，通过眼表给药治疗可以有效保护视网膜神经血管单元，为更好的服务临床提供了基础。

Description

咖啡酸苯乙酯滴及其眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物 中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其是一种咖啡酸苯乙酯及其滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
背景技术
根据国际糖尿病联盟(TheInternational Diabetes Federation，IDF)最新统计，我国糖尿病患者数量超过1.4亿。糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病最常见的眼部并发症，全球范围内，高达34.6％的糖尿病患者会继发糖尿病视网膜病变，是发达国家工作人群首位致盲性眼病，其发病率随年龄增长和糖尿病病程延长而增加。据统计，2020年全世界成年糖尿病视网膜病变患者人数估计为1.03亿，到2040年预计全球将有1.61亿糖尿病视网膜病变患者，造成巨大的医疗经济负担。
糖尿病视网膜病变是继发于糖尿病的视网膜血管及神经元变性类疾病。既往研究表明糖尿病视网膜病变是多种致病因素相互作用的结果，持续性高血糖状态、血流动力学障碍、凝血机制异常、糖基化终末产物堆积、氧化应激，多元醇-肌醇代谢异常、炎症反应等均与糖尿病视网膜病变发生发展密切相关。视网膜神经血管单元指视网膜神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞及Müller细胞之间复杂的功能单位，对于维持视网膜正常生理功能具有重要作用。在早期糖尿病视网膜病变患者及动物模型中，一方面可以观察到到视网膜微血管内皮细胞功能障碍、周细胞凋亡、视网膜色素上皮细胞间紧密连接蛋白缺失、血-视网膜屏障破坏、血管渗漏等微血管病变，另一方面可见视网膜神经纤维层和节细胞层变薄，小胶质细胞和Müller细胞活化，玻璃体及视网膜组织内炎症因子水平升高等病理改变，提示神经血管单元功能失代偿。
早期糖尿病性视网膜病变对患者视力的影响可能微乎其微，常被患者忽略，通常只有在行眼底疾病筛查时才会发现。随病情发展患者视力逐渐受损，由于缺乏就诊意识，患者往往在视网膜新生血管破裂出血导致视力丧失才来院诊治，因此患者视力预后较差。依据病变严重程度，糖尿病视网膜病变分为非增生型和增生型：非增生型糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabeticretinopathy，NPDR)中视网膜血流和血管通透性改变，毛细血管无灌注区形成，可见微动脉瘤、静脉串珠和视网膜内微血管异常等眼底病变；病情可进一步发展为增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabeticretinopathy，PDR)，此时已经发生如玻璃体出血、玻璃体内新生血管，视网膜牵拉脱离等新生血管并发症，导致失明。目前对于轻中度NPDR患者的诊疗方案为优化内科治疗，通过维持正常的血糖、血压和血脂以期降低糖尿病视网膜病变进一步恶化的风险，同时建议每3-6个月至眼科就诊密切检测疾病进展，临床上尚无有效药物。因此，如何有效治疗早中期NPDR是近年来眼科基础与临床研究的重要课题。对于重度NPDR，50％患者在1年内将发展为PDR，15％的患者将发展为高危型PDR，临床上可行全视网膜光凝封闭出血点，减轻视网膜缺血缺氧，延缓病情发展，降低视力丧失风险。此外，玻璃体注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是目前的主流治疗方法，但长期反复玻璃体腔注药物不仅增加了患者的经济负担，也增加了眼内炎等并发症发生的风险。另外，部分患者对抗VEGF治疗不应答，40％以上的DME患者经过多次抗VEGF治疗仍无效，有部分患者对抗VEGF治疗存在抵抗，长期过度抑制VEGF可能对正常视网膜神经元功能有所影响，且患者最终视力并没有改善。抗炎治疗主要是玻璃体腔内注射曲安奈德(triamcinoloneacetonide，TA)，但TA带来的并发症如高眼压及白内障的情况较多，因此限制了其临床应用；地塞米松玻璃体内植入剂治疗属于长效注射剂，可减少给药次数，对于黄斑水肿患者治疗效果较好，但此类剂型普遍存在显著的突释效应，存在一定的药物安全性问题，且价格昂贵，给患者造成沉重的经济负担。
局部给药常用于治疗眼前节疾病，但局部用药疗效较弱，难以到达眼后段。具体来说，基于眼球的解剖结构，从外向内分为三层，分别为最外层的角膜/结膜-巩膜、中间的虹膜-睫状-脉络膜以及最内层的视网膜，眼球外表面还有一层由脂质层、水液层和粘蛋白层组成的泪膜维持角膜及结膜湿润，角膜又由结构致密的六层细胞结构组成。眼表局部用药后，药物主要通过两种途径吸收到达眼底视网膜组织：(1)角膜途径：泪膜-角膜-房水-眼内组织-玻璃体-视网膜；(2)非角膜途径：泪膜-结膜-巩膜-脉络膜-视网膜。因此眼表药物的开发要求较高，需要跨越诸多眼部屏障结构才能抵达视网膜发挥作用：(1)药物的溶解性：药物必须具有一定的亲水性才能溶于眼表泪膜，而同时又要求药物具有一定的脂溶性，才能时穿过角膜上皮细胞膜进一步向内渗透；(2)泪液引流作用：泪液由泪腺持续生成，由鼻泪管引流，由于眼表泪膜是动态的，局部给药在眼表的半衰期通常为0.7-1.4分钟，药物平均驻留时间低；(3)粘蛋白屏障：靠近角膜上皮表面的泪膜粘蛋白含量高，形成含水的三维网格结构，阻碍药物分子通过，限制眼部药物吸收；(4)药物热力学活性：可溶于泪液的亲水性药物往往热动力学活性较低，渗透性差，只有在泪液中浓度较高渗透性也高的药物分子才能进入眼内；(5)上皮细胞膜屏障：角膜及结膜上皮细胞的脂质细胞膜阻碍药物分子向眼内穿透；(6)首过效应：眼局部给药可以避免肝脏首过效应，但局部给药因眼部多种生理机制或者化学屏障的作用仍表现出较低的生物利用度(＜5％)。眼部生理屏障包括泪液周转、鼻泪管引流和瞬目，阻碍药物在眼部的递送，眼前节动态屏障包括结膜血、淋巴流动和泪液引流，增加了药物清除率；眼前节静态屏障包括角膜上皮、基质和血房水屏障，眼后节静态屏障包括巩膜、Bruch's膜-脉络膜、视网膜色素上皮等，阻碍药物吸收利用。因此，眼表局部给药往往作为辅助疗法，并不能够完全替代玻璃体腔注药。目前食品药品监督管理局(foodand drug administration，FDA)还没有批准用于治疗眼后部疾病的局部制剂，因此，研发治疗糖尿病视网膜病变尤其是适用于早中期糖尿病视网膜病变患者的多靶点长效药物，优化给药途径是当前的亟待解决的临床问题。
对于糖尿病视网膜病变这种发病机制复杂的慢性病，作用单一的药物很难取得好的疗效，在药物研发领域，小分子化合物在靶点、制剂、成本、安全性及适应症范围等多个维度上保持优势。天然化合物作为药物发现的重要来源，具有疗效好、副作用少等特点，是新药研发的重要资源。蜂胶是一种芳香酯类化合物，具有抗氧化、抗微生物、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性，广泛应用于医药保健领域。目前已从蜂胶中发现了200多种化合物，如类黄酮、芳香酸、萜烯类、类固醇类和酯类等。咖啡酸苯乙酯(caffeic acidphenethylester，CAPE)是蜂胶的主要活性成分，其分子量为284.31，可以穿透细胞膜弥散至细胞器内发挥作用，咖啡酸苯乙酯的0-二羟基(儿茶酚)苯基结构有重要的生物活性功能，该结构亲脂性较强，且有两个邻位酚羟基，苯环上电子密度高，易于清除氧自由基，调节多种抗氧化通路从而发挥抗氧化作用。最初研究发现极微量的咖啡酸苯乙酯即可抑制肿瘤相关因子引起的炎症反应，对肿瘤细胞有显著杀伤作用，而对正常细胞没有影响，提示其有良好的生物安全性。后续咖啡酸苯乙酯的抗氧化，抗炎，抗微生物及免疫调节等作用陆续被揭示，在不同的疾病模型中显示出多种药理学潜力。同时，发现咖啡酸苯乙酯是一种有效的核因子κB(Nuclear Factor Kappa B，NF-κB)抑制剂，可通过修饰巯基直接抑制NF-κB与DNA的结合，抑制炎症信号通路激活，对神经系统，心血管系统，肝脏，皮肤等多个器官具有保护作用。在眼科领域，咖啡酸苯乙酯在白内障、角膜纤维化、葡萄膜炎、视网膜缺血/再灌注损伤等疾病中的保护作用也有相关报道，但目前鲜有关于咖啡酸苯乙酯在糖尿病视网膜病变中作用的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种咖啡酸苯乙酯及其滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
咖啡酸苯乙酯及其结构类似物在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
进一步地，所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
进一步地，所述咖啡酸苯乙酯的结构类似物具有与咖啡酸苯乙酯相同/类似的结构、功能基团、理化特性、生物功能等；
或者，所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括全身给药或局部给药。
进一步地，所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括口服、局部注射、玻璃体腔注射、眼周注射或眼表给药，眼表给药时咖啡酸苯乙酯的给药浓度至少为50μM。
进一步地，所述药物的载体或辅料包括右旋糖酐羟丙甲纤维素；
或者，所述药物的局部施用剂包括渗透促进剂、载体化合物或赋形剂；
或者，所述药物包括滴眼液、眼膏、眼用凝胶制剂、眼用脂质体、眼用乳剂或眼用植入剂；
或者，所述糖尿病视网膜病变包括NPDR。
咖啡酸苯乙酯在制备抑制血-视网膜屏障损伤药物和/或制备抑制视网膜神经退行性变药物和/或制备抑制视网膜炎症反应药物中和/或制备包括年龄相关性黄斑变性等视网膜神经退行性病变药物中的应用。
进一步地，所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
一种咖啡酸苯乙酯滴眼液，其制备方法包括如下步骤：
将咖啡酸苯乙酯与右旋糖酐羟丙甲纤维素混合成溶液，得到咖啡酸苯乙酯滴眼液。
进一步地，所述右旋糖酐羟丙甲纤维素为复方制剂，其组份为0.1％右旋糖酐70和0.3％羟丙甲纤维素2910，溶剂为水；上述百分数均为质量百分数；
所述右旋糖酐70的结构式如下：
所述羟丙甲纤维素2910的结构式如下：
或者，所述咖啡酸苯乙酯滴眼液中咖啡酸苯乙酯的摩尔浓度至少为50μM。
如上所述的咖啡酸苯乙酯滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明公开了咖啡酸苯乙酯在制备糖尿病视网膜病变药物中的应用。本发明发现并证明了咖啡酸苯乙酯在糖尿病视网膜病变中的新应用，通过眼表给药治疗可以有效保护视网膜神经血管单元，为更好的服务临床提供了基础。
2、本发明针对临床上首位工作人群致盲性眼病——糖尿病视网膜病变亟待攻克的难题，即尚无用于NPDR患者的有效药物、现有治疗PDR患者药物单一且须反复玻璃体腔注射等突出问题，提供咖啡酸苯乙酯在制备糖尿病视网膜病变药物中的应用，所述剂型为咖啡酸苯乙酯滴眼液，具有良好的生物相容性，制备简单，使用方便，具有维持血-视网膜屏障完整、神经保护作用。
3、本发明咖啡酸苯乙酯滴眼液能够抑制视网膜血管渗漏，减少视网膜血管内皮白细胞粘附，保护视网膜色素上皮细胞间紧密连接结构，促进视功能恢复，减少视网膜神经节细胞丢失，下调NF-κB信号，抑制视网膜小胶质细胞和Müller细胞活化。
4、本发明咖啡酸苯乙酯滴眼液通过点眼方式局部给药，生物相容性良好，并且在角膜、房水、玻璃体及视网膜组织中分布，药物渗透性良好；
本发明咖啡酸苯乙酯滴眼液对糖尿病视网膜病变模型具有良好的治疗效果，且长期应用生物安全性良好，眼表刺激性小；
本发明咖啡酸苯乙酯滴眼液制备采用临床批准的配伍药物成分，容易转化为糖尿病视网膜病变治疗的临床应用，可用于疾病早期控制病情进展，也可考虑与手术等其他治疗方法联合使用，减少眼内注药次数，避免病情反复，提高视力预后。
附图说明
图1为本发明中用PBS稀释CAPE至相应浓度后局部应用的生物相容性图。
图2为本发明中用右旋糖酐羟丙甲纤维素配置CAPE滴眼液在眼内的药物代谢动力学图：(A)不同浓度CAPE滴眼液点眼1月后小鼠前节情况及角膜荧光素钠染色情况；(B)各组小鼠角膜损伤程度临床评分；(C)500μM CAPE滴眼液点眼后15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时各组小鼠眼内液中CAPE含量；(D)500μM CAPE滴眼液点眼后15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时各组小鼠视网膜中CAPE含量；(E)500μM CAPE滴眼液点眼后15分钟，30分钟，1小时，2小时，兔角膜、房水、玻璃体及视网膜中CAPE含量。
图3为本发明中对STZ诱导的小鼠糖尿病模型评估图：STZ注射前，注射后0.5，1，3个月各组小鼠血糖(A)及体重(B)变化，n＝25，****p<0.0001；裂隙灯显微镜下小鼠连续点眼3周后各组小鼠角膜荧光素钠染色情况(C)及临床评分(D)，无荧光0分，散在点状荧光1分，密集点状荧光2分，非常密集点状荧光3分，荧光斑块4分，n＝6，*p<0.05。数据以平均值±标准误表示。
图4为本发明中CAPE滴眼液对糖尿病小鼠血-视网膜屏障功能的保护作用图：(A)各组小鼠眼底FFA荧光造影成像；(B)基于眼底FFA荧光成像各组视网膜大血管计数情况；(C)各组Evans Blue视网膜微血管染色情况，比例尺：40μm；(D)渗漏面积荧光强度统计；(E)各组RPE-Bruch’s膜-脉络膜复合体铺片后视网膜色素上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1染色，20×倍率对应比例尺：40μm；63×倍率对应比例尺：10μm；(F)各组ZO-1荧光染色强度统计。n＝6，数据以平均值±标准误表示，*p<0.05，***p<0.001。
图5为本发明中CAPE滴眼液对糖尿病小鼠视网膜的神经保护作用图：(A)各组小鼠视网膜暗适应a波振幅变化；(B)各组小鼠视网膜暗适应b波振幅变化；(C)各组小鼠视网膜OCT成像，左侧地形图内侧圈标记视神经范围，中间圈标记距离视盘3mm处各层视网膜厚度，外层圈标记距离视盘6mm处各层视网膜厚度，暖色调至冷色调不同颜色由高至低表示视网膜厚度，右侧为视网膜中央处OCT扫描图；(D)各组小鼠视网膜全层厚度统计；(E)各组小鼠视网膜GCC层厚度统计；(F)视网膜冰冻切片RBPMS(红色)及NIMPR-14(绿色)免疫荧光染色，DAPI(蓝色)标记细胞核，比例尺：40μm；(G)各组RBMPS阳性染色细胞个数及荧光强度统计；(H)NIMPR-14染色荧光强度统计。n＝6，数据以平均值±标准误表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6为本发明中CAPE滴眼液抑制糖尿病小鼠模型中视网膜Müller细胞活化图：(A)各组小鼠视网膜组织冰冻切片GFAP(绿色荧光)染色特异性标记Müller细胞激活情况，DAPI(蓝色荧光)着染细胞核，比例尺：40μm；(B)GFAP染色荧光强度统计。n＝6，数据以平均值±标准误表示，*p<0.05。
图7为本发明中CAPE滴眼液抑制糖尿病小鼠模型中视网膜小胶质细胞活化图：(A)各组小鼠视网膜铺片中IB4(红色荧光)标记视网膜血管，IBA-1(绿色荧光)特异性标记小胶质细胞，比例尺：40μm；(B)各组小鼠各层视网膜小胶质细胞个数统计；(C)IBA-1染色荧光强度统计。n＝6，数据以平均值±标准误表示，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图8为本发明中CAPE滴眼液减少糖尿病小鼠视网膜血管内皮白细胞黏附图：(A)各组小鼠视网膜血管形态及白细胞淤滞情况，IB4(红色荧光)标记视网膜血管内皮，Concanavalin A-FITC(绿色荧光)着染血管内皮及黏附白细胞，比例尺：40μm；(B)各组小鼠视网膜血管内粘附白细胞计数。n＝6，数据以平均值±标准误表示，****p<0.0001。
图9为本发明中CAPE滴眼液对糖尿病小鼠视网膜NF-κB信号通路的抑制作用图：(A)各组小鼠视网膜冰冻切片p-NF-κB(绿色)及NF-κB(红色)免疫荧光染色，DAPI(蓝色)标记细胞核，比例尺：40μm；(B)各组p-NF-κB染色荧光强度统计；(C)各组NF-κB染色荧光强度统计。n＝6，数据以平均值±标准误表示，*p<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
咖啡酸苯乙酯及其结构类似物在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
较优地，所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
较优地，所述咖啡酸苯乙酯的结构类似物具有与咖啡酸苯乙酯相同/类似的结构、功能基团、理化特性、生物功能等；
或者，所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括全身给药或局部给药。
进一步地，所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括口服、局部注射、玻璃体腔注射、眼周注射或眼表给药。
较优地，所述眼表给药时咖啡酸苯乙酯的给药浓度为至少为50μM。
较优地，所述药物的载体或辅料包括右旋糖酐羟丙甲纤维素；
或者，所述药物的局部施用剂包括渗透促进剂、载体化合物和其他药学上可以接受的载体或赋形剂；
或者，所述咖啡酸苯乙酯单独或与其他药物配伍制备可在临床上使用各种不同剂型的药物，包括滴眼液、眼膏、眼用凝胶制剂、眼用脂质体、眼用乳剂或眼用植入剂；所需具体量根据受试者不同而定，取决于治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、病情严重程度和相应性，因此不可能规定确切的有效剂量，施用医师可根据病患具体情况确定最佳剂量及频次，剂量可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。
或者，所述糖尿病视网膜病变包括NPDR。
进一步地，咖啡酸苯乙酯在制备抑制血-视网膜屏障损伤药物和/或制备抑制视网膜神经退行性变药物和/或制备抑制视网膜炎症反应药物和/或制备包括年龄相关性黄斑变性等视网膜神经退行性病变药物中的应用。
较优地，所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
一种咖啡酸苯乙酯滴眼液，其制备方法包括如下步骤：
将咖啡酸苯乙酯与右旋糖酐羟丙甲纤维素混合成溶液，得到咖啡酸苯乙酯滴眼液。
较优地，本发明中所述右旋糖苷羟丙甲纤维素为复方制剂，其组份为0.1％右旋糖酐70和0.3％羟丙甲纤维素2910，溶剂为水；上述百分数均为质量百分数；
所述右旋糖苷70的结构式如下：
所述羟丙甲纤维素2910的结构式如下：
或者，所述咖啡酸苯乙酯滴眼液中咖啡酸苯乙酯的摩尔浓度为至少为50μM。
如上所述的咖啡酸苯乙酯滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
1、CAPE滴眼液(即本发明咖啡酸苯乙酯滴眼液)眼表刺激性及安全用药浓度评估：
SPF级健康C57BL/6小鼠12只，雄性，体重20-22g，购买于维通利华有限公司，饲养于天津医科大学眼科研究所，实验动物经天津医科大学眼科医院实验动物管理委员会批准，符合美国视觉与眼科研究协会(Association for Research in Vision andOphthalmology，ARVO)动物应用声明。裂隙灯显微镜下观察眼睑、结膜、角膜等组织，确定无任何眼部病变，小鼠适应环境一周后用于后续实验。
用PBS稀释咖啡酸苯乙酯(caffeic acidphenethyl ester，CAPE)至50，100，500，1000μM，采用微量移液器吸取5μl滴于对应组小鼠眼球表面，每日2次，对照组则予以等量等频次PBS点眼。每日观察小鼠前节情况，并用裂隙灯显微镜成像系统记录前节照片。实验结果如图1所示，连续给药一周后，裂隙灯显微镜下可见PBS对照组小鼠角膜上皮完整，前房清、深度正常，晶体透明；随着CAPE施用浓度增加，小鼠晶体可见不同程度混浊，随着CAPE浓度增加晶体混浊程度加重，但在小鼠中该晶体混浊是可逆的，停止用药后小鼠晶体可逐渐恢复透明。可以看出，直接将CAPE应用于眼表对小鼠眼部渗透压的影响较大，导致晶状体中离子转运失衡，造成小鼠晶体一过性混浊。
将小鼠分为正常对照组，100μM咖啡酸苯乙酯滴眼液组，500μM咖啡酸苯乙酯滴眼液组，1000μM咖啡酸苯乙酯滴眼液组。采用右旋糖酐羟丙甲纤维素稀释CAPE至100，500，1000μM，予以组相应浓度CAPE滴眼液，每眼给予5μl，每日2次(bis in die，bid)，连续点眼1个月，正常对照组则予以等量等频次人工泪液(即本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素，也可以市场上直接购买，如商品化名称为“倍然”)，筛选咖啡酸苯乙酯滴眼液安全用药浓度。每次点药后观察有无频繁瞬目、畏光、流泪等眼部刺激症状，1个月后裂隙灯显微镜下观察小鼠眼前节情况，采用改良的Draize眼刺激性评分原则来评估咖啡酸苯乙酯滴眼液的眼表刺激性：(1)角膜：无混浊0分；散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1分；半透明区易分辨，虹膜模糊不清2分；出现灰白色半透明区、虹膜细节不清、瞳孔勉强可见3分；角膜不透明、虹膜无法辨认4分。(2)虹膜：正常0分；褶皱加深、充血肿胀、瞳孔对光仍有反应1分；出血、肉眼可见坏死或对光反应消失(或其中一种)2分。(3)结膜充血(指球结膜和睑结膜)：血管正常0分；血管充血成鲜红色1分；血管充血成深红色、血管不易分辨2分；血管弥漫性充血成紫红色3分。(4)结膜水肿：无水肿0分；轻微水肿(含眼睑)1分；明显水肿伴部分眼睑外翻2分；水肿至眼睑近半闭合3分；水肿至眼睑过半闭合4分。(5)分泌物：无分泌物0分；少量分泌物1分；分泌物使眼睑或睫毛潮湿或黏着2分；分泌物使整个眼区潮湿或黏着3分。最大总积分16分。Draize眼刺激性评分等级：无刺激性0-3分；轻度刺激4-8分；中度刺激9-12分；重度刺激13-16分。荧光素钠角膜染色后钴蓝光下观察角膜上皮损伤情况：以生理盐水(即通识的0.9％氯化钠水溶液)为溶剂配制适量质量浓度0.5％的荧光素钠，使用过滤器(0.22μM孔径)过滤至新的无菌离心管，铝箔包裹离心管避光，现用现配。用微量移液器在小鼠眼表滴加10μl的质量浓度0.5％荧光素钠，将小鼠角膜对准镜头，裂隙灯显微镜钴蓝灯下观察并拍照记录前节情况。角膜损伤临床评分标准：无荧光0分，散在点状荧光1分，密集点状荧光2分，非常密集点状荧光3分，荧光斑块4分。
实验结果如表1所示，100μM、500μM、1000μM CAPE滴眼液实验组均未见眼表刺激性反应。如图2A-B所示，裂隙灯显微镜下观察可见各组小鼠膜前节稳定，角膜染色未见角膜上皮缺损，前房清，深度正常，晶体未见混浊。可以看出，右旋糖酐羟丙甲纤维素作为溶剂溶解CAPE应用于眼表有助于维持正常的眼部渗透压，对眼表具有保护作用。其机制可能为：右旋糖酐可与泪液结合，替代泪膜，修复角膜上皮，维持角膜通透性，减少CAPE对眼部的刺激；羟丙甲纤维素性质与泪液中的黏蛋白接近，使溶液具有一定粘性，通过聚合作用附着于眼球表面，从而减弱CAPE刺激性，增加CAPE在眼表滞留时间。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。在实际点眼过程中，1000μM CAPE滴眼液组在点眼后10秒钟内小鼠瞬目次数增多，无分泌物，无结膜充血水肿，可见该浓度下有轻度的刺激性，但并未造成损伤，因此在后续实验中选用500μMCAPE滴眼液。
表1小鼠眼表刺激性评分结果
2、CAPE滴眼液在眼内的药物代谢动力学
为了明确CAPE是否能穿透眼表进入眼内抵达视网膜，首先检测了CAPE在小鼠眼内液及视网膜组织中的药物代谢动力学。使用右旋糖酐羟丙甲纤维素稀释CAPE至500μM。用微量移液器取5μl 500μM CAPE滴眼液加至小鼠角膜，分别于点眼后15分钟，30分钟，1小时，2小时，4小时处死小鼠立即取眼球，将眼球置于PBS中，洗3次。剪去眼球周围肌肉组织，PBS中洗3次，无菌纱布洇干眼球表面，将眼球移至新培养皿中，沿角巩膜缘剪开眼球，由于小鼠眼部解剖特殊，玻璃体量小，难以将玻璃体液与房水分离，因此将房水及玻璃体统称为眼内液，用微量移液器吸取眼内液至离心管中，计量体积。剪去角膜，分离睫状体，娩出晶体，分离视网膜，将视网膜组织置于新离心管中，称重。尽快取材，迅速转移至-80℃储存。每组设有2个重复样本。药物代谢动力学实验由天津旭和医药科技有限公司代理，进行小鼠眼组织样本中CAPE HPLC-MS/MS定量方法开发及样本检测。具体实验方案如下：
(1)实验耗材
色谱纯甲醇、乙腈(ACN)购于Thermo Fisher公司；甲酸(HCOOH)购于sigma公司；水，MiliQ超纯水仪现用现制。使用Thermo U3000液相色谱串联ABSciexAPI4000+三重四极杆质谱仪检测。
(2)标准溶液的配制
配制35mM CAPE储备液，精密取标准储备液适量，以甲醇进行系列稀释，依次获得CAPE浓度为200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2nM的标准系列工作溶液。上述储备液和标准系列工作溶液均置于4℃储存。
(3)样品处理
眼内液样品处理：取出冻存的小鼠眼内液样品(8μl/管)，每管中加入72μl色谱纯甲醇(稀释10倍)，涡旋30秒，4℃、12000转/分钟离心10分钟，取上清进行质谱检测。
视网膜样品处理：取出冻存的小鼠视网膜样品(8mg/管)，每管中加入100μl色谱纯甲醇，加入研磨珠，在组织研磨仪中进行匀浆处理，50Hz研磨4分钟，每分钟间停5秒，4℃、12000转/分钟离心10分钟，取上清进行质谱检测。
(4)质谱条件
气帘气：25psi
碰撞气(CAD)：5psi
离子源电压(喷雾电压)：4500V
离子源温度：500℃
雾化气(GS1)：50psi
辅助加热气(GS2)：50psi
(5)液相条件
(6)CAPE标准曲线
样品测试校正曲线如下：
y＝0.00347x+0.000317(r＝0.9993)；
线性范围：0.2–200nM
实验结果如图2C-D所示，小鼠眼内液及视网膜组织中均能检测到CAPE，15分钟时CAPE含量最高，在眼内液中CAPE浓度为1193.33±291.60nM，在视网膜组织中含量为0.25±0.07pmol/mg随时间延长而降低，500μM CAPE滴眼液在眼内液及小鼠视网膜组织中的半衰期约为30分钟(在眼内液中CAPE浓度为713.67±98.19nM，在视网膜组织中含量为0.18±0.0pmol/mg)，在2小时及4小时组样本中现有方法未能测出CAPE。可以看出，局部施用CAPE滴眼液后，CAPE可达到眼后段，但是小鼠的眼球较小，与正常人眼球存在较大差异，因此接下来在体积较大的兔眼中进一步研究了CAPE滴眼液在眼部的药物代谢动力学。
清洁级3-4月龄健康新西兰大白雄兔来自天津市科达养殖中心(许可证号：SCXK(津)2021-0001)，体重2.0-2.5kg，饲养于天津医科大学眼科研究所，实验动物经天津医科大学眼科医院实验动物管理委员会批准，符合美国视觉与眼科研究协会(Association forResearch in Vision and Ophthalmology，ARVO)动物应用声明。观察眼睑、结膜、角膜等确定无眼部病变，适应环境一周后用于后续实验。使用右旋糖酐羟丙甲纤维素稀释CAPE至500μM。用微量移液器取50μl、500μM、CAPE滴眼液加至兔下睑结膜囊，轻轻闭合兔上下眼睑数次使滴眼液在眼表均匀分布，分别于点眼后15分钟，30分钟，1小时，2小时肌肉注射过量速眠新处死兔，立即取眼球，将眼球置于PBS中，洗3次。剪去眼球周围肌肉组织，于PBS中再洗3次，无菌纱布洇干眼球表面，将眼球移至新培养皿中，尽快取样：(1)使用1ml无菌注射器行前房穿刺，吸取房水并置于无菌EP管中；(2)沿角巩膜缘剪下角膜置于新无菌EP管中；(3)沿角巩膜缘剪掉睫状体，夹除晶状体，并用剪刀剪除残余的晶状体后囊，取新1ml无菌注射器，将玻璃体吸出至新无菌EP管中；(4)用剪刀剪开巩膜，分离视网膜组织置于新无菌EP管中。将各组样本称重并记录，迅速转移至-80℃储存。每组设有2个重复样本。药物代谢动力学实验由天津科韵科技有限公司代理，进行兔眼组织样本中CAPE HPLC-MS/MS定量方法开发及样本检测。具体实验方案如下：
(1)实验耗材：
氯霉素标准品，来自中国兽医药品监察所，含量：99.5％％；批号：K0350706)；
色谱纯甲醇(MeOH))购于Fisher公司，批号：211769；
甲酸购于CNW公司，批号：51780100；水，屈臣氏超纯水。
美国应用生物系统公司液质联用系统API4000Qtrap(含2台岛津LC-20AD泵，SIL-20AC恒温自动进样器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器，ESI离子源，AnalystSoftware1.5.2色谱工作站)；
涡旋振荡器，型号：VOTREX-3，德国IKA公司生产；
涡旋混合器，型号：MX-S，美国SCILOGEX公司生产、型号：XH-C，金怡公司生产；
离心机，型号：MIKRO220R，德国Hettich公司生产；
冷冻匀浆仪，型号：JXFSTPRP-CLN，上海静信实业发展有限公司生产；
4℃冰箱，海尔公司生产；
-80℃冰箱，海尔公司生产。
(2)储备液的配制：
精密量取浓度为35mM的CAPE标准品，以甲醇溶解，配制成浓度为50uM的CAPE标准品中间储备液。
取氯霉素标准品约2mg，以甲醇溶解，配制成浓度为2.00mg/ml的氯霉素标准品储备液。
(3)标准曲线工作液的配制
精密移取CAPE标准品中间储备液适量，以甲醇进行系列稀释，依次获得浓度为2000、500、200、100、50.0、20.0、5.0、2.0、1.0nM的CAPE标线工作液，用于给药分析批中标准曲线样本的配置；
(4)质控工作液的配制
精密移取CAPE标准品中间储备液适量，以甲醇进行系列稀释，依次获得浓度为1600、100、5.0nM的CAPE质控工作液，用于给药分析批中质控样本的配置；
(5)内标工作液的配制
内标工作液1(20μg/ml)：取内标储备液10.0μl，用甲醇稀释至1.00ml，配制成20μg/ml的氯霉素内标工作液并储存于4ml棕色瓶中。
内标工作液2(100.0ng/ml)：精密移取内标工作液1适量，以甲醇进行系列稀释，配制成100.0ng/ml的氯霉素内标工作液并储存于4ml棕色瓶中。
上述储备液和标准系列工作溶液均置于4℃储存。
(6)标准曲线样本制备
取50μl水于1.5mlEP管中，再向该管中加入5μl标准曲线工作液，20μl内标工作液2，充分涡旋混匀后，再加入250μl甲醇，涡旋混匀后进样分析。给药样本分析批中CAFE标准曲线浓度为：200、50、20、10、5.0、2.0、0.5、0.2、0.1nM。
样品测试校正曲线如下：
y＝0.0249x+0.00906(相关系数：r＝0.9981)；
线性范围：0.2–200nM
(7)质控样本制备
取50μl水于1.5ml EP管中，再向该管中加入5μl质控工作液，20μl内标工作液2，充分涡旋混匀后，再加入250μl甲醇，涡旋混匀后进样分析。给药样本分析批中CAFE质控样本浓度为：160、10、0.5nM。
(8)角膜及视网膜组织样品处理
称取装有兔眼角膜及视网膜组织样品的EP管中组织质量，按照组织：样品＝1:5的质量比例加入生理盐水，用封口膜将样品封好放入冷冻匀浆机中匀浆。取50μl匀浆后的兔眼角膜或视网膜组织样品于1.5ml EP管中，再向该管中加入5μl甲醇溶液，20μl内标工作液2，充分涡旋混匀后，再加入250μl甲醇，涡旋1min提取，15000rpm，离心10min，取100μl上清液进样分析。
(9)房水及玻璃体组织样品处理
将装有兔眼房水及玻璃体组织样品的EP管充分涡旋混匀，取50μl匀浆后的兔眼房水或玻璃体组织样品于1.5ml EP管中，再向该管中加入5μl甲醇溶液，20μl内标工作液2，充分涡旋混匀后，再加入250μl甲醇，涡旋1min提取，15000rpm，离心10min，取100μl上清液进样分析。
(10)检测条件
质谱条件：Mode:ESI-；Curtain Gas：20psi；Collision Gas：Medium；IonSprayVoltage：4200V；Temperature：550℃；Ion Source Gas1：60psi；Ion Source Gas2：55psi
MRM模式检测质参数：
化合物名称 Q1 Q3 DP(V) CE(V)
CAFE(定量用) 283.2 134.9 -110 -37
CAFE(定性用) 283.2 178.8 -110 -27
氯霉素 320.8 151.9 -78 -25
液相条件：
实验结果如图2E所示，在兔眼角膜、房水、玻璃体及视网膜组织中均能检测到CAPE。其中，角膜组织CAPE浓度最高，视网膜组织其次，房水及玻璃体中CAPE含量较低。在角膜组织中，15分钟时CAPE含量最高，随着时间延长角膜组织中CAPE含量逐渐降低；但在视网膜组织中，15分钟时即可检测到CAPE，30分钟时CAPE在视网膜组织中含量达高峰，而后随时间增加视网膜组织中CAPE浓度逐渐降低。可以看出，在兔眼中，CAPE主要通过非角膜途径(泪膜-结膜-巩膜-脉络膜-视网膜)抵达眼底，在一定程度上证实了CAPE滴眼液应用于临床的可行性，为其临床转化提供了理论基础。
3、建立糖尿病小鼠模型
称量小鼠体重，取尾血检测小鼠血糖，选取血糖正常，体重20-22g小鼠，禁食8小时后，腹腔注射55mg/kg STZ溶液。(STZ溶液注射液配制：现配现用，按照0.1gSTZ粉末加入10ml质量浓度0.1％柠檬酸钠缓冲液比例配制，使用0.22μM孔径过滤器过滤至新的无菌离心管，铝箔包裹离心管避光，置于冰上备用。)注射完毕后，予以充足食物及水饲养。每日重复上述操作，连续注射5天后恢复正常饲喂。一周后检测小鼠血糖，筛选血糖≥16.7mM的小鼠，继续观察一周后再次测量血糖，连续两周检测血糖均≥16.7mM的小鼠视为成功建立糖尿病模型，模型鼠同时有多饮多食多尿体征，予以充足水食饲喂，每日更换垫料。在后续实验中定期检测小鼠血糖，剔除血糖过低(＜16.7mM)或过高(≥30mM)的小鼠。
通常认为，在STZ诱导的小鼠模型中，注射STZ两周后小鼠血糖稳定升高，在小鼠血糖升高1-3个月内为糖尿病视网膜病变早期模型，因此在注射完成2周开始筛选建模成功小鼠并开始予以CAPE滴眼液治疗，以连续治疗3个月为观察终止点，评估CAPE滴眼液在早期糖尿病视网膜病变模型中的作用。
实验动物分组：STZ注射2周后，将建模成功小鼠随机分为两组，STZ+CAPE组予以500μM、CAPE滴眼液点眼，5μl/眼，早晚各一次(bis in die,bid)，STZ+人工泪液组则予以等量等频次人工泪液(即本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素)点眼，连续给药3个月作为观察终点；另外，予以正常小鼠等量等频次人工泪液作为正常对照组。
统计学方法：采用Prism9软件(Version9.3.1)进行统计学分析。数据以平均值±标准差(SD)表示。Shapiro–Wilk检验验证变量正态分布。使用student's2tailed-t检验或双向方差分析(ANOVA)及Bonferroni's多重比较评估各组之间的统计差异。数据以平均值±标准误表示，P值<0.05为有统计学意义。
实验结果如图3A-B，分别于STZ注射前，注射后15天，1个月，3个月检测小鼠血糖及体重，可见与正常小鼠相比，STZ注射后15天至3个月期间，小鼠血糖稳定升高，差异有统计学意义(p<0.0001)；STZ注射后15天小鼠体重与正常组无显著差异，随后逐渐降低，在1个月及3个月时体重显著低于正常组，差异有统计学意义(p<0.0001)。连续点眼3个月，裂隙灯显微镜下观察小鼠前节情况，采用改良的Draize眼刺激性评分原则来评估CAPE滴眼液的眼表刺激性，如表2，各实验组均未见眼表刺激性反应，前节未见明显异常。如图3C-D角膜荧光素钠染色可见，与正常组相比，STZ+人工泪液组小鼠角膜上皮可见散在点状荧光，角膜上皮粗糙，临床评分升高(p<0.05)；STZ+CAPE组小鼠前节未见异常，角膜染色临床评分与正常组无统计学差异。可以看出，长期局部应用CAPE滴眼液未见眼前节毒性反应，提示CAPE滴眼液具有良好的眼表生物相容性。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
表2小鼠眼表刺激性评分结果
4、CAPE对糖尿病小鼠视网膜血-视网膜屏障功能的影响
糖尿病视网膜病变的基本病理改变包括血管病变和神经变性。血管病变包括周细胞选择性丢失，基底膜增厚，微血管瘤形成，血管通透性增加，血浆渗出，新生血管形成等。血管内皮细胞与视网膜色素上皮构成外层血-视网膜屏障，糖尿病视网膜病变可见血-视网膜屏障(blood-retinabarrier，BRB)损害，细胞间紧密连接蛋白丢失，结构完整性破坏，视网膜色素上皮细胞转运水电解质及营养物质障碍，视觉周期蛋白形成异常，导致视力损伤。
因此，CAPE滴眼液点眼治疗3个月后，为明确CAPE滴眼液对小鼠BRB的影响，一方面行视网膜血管荧光造影观察血管渗漏情况，另一方面行RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体铺片观察视网膜色素上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1完整性，评估BRB功能损伤情况。
(1)小鼠麻醉
使用生理盐水将舒泰和盐酸塞拉嗪分别稀释至5mg/ml，将二者按体积比为4:1混合，根据小鼠体重，按65mg/kg舒泰+16.25mg/kg盐酸塞拉嗪腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后予以小鼠复方多吡卡胺点眼散瞳，操作前予以盐酸奥布卡因点眼麻醉角膜神经。小鼠实验完毕后置于37℃保暖垫上保持体温予以右旋糖酐羟丙甲纤维素点眼保护角膜，留待苏醒后放回原环境饲养。
(2)眼底成像
小鼠麻醉后充分散瞳，眼表麻醉，将加替沙星眼用凝胶涂于角膜保持角膜湿润预防仪器划损角膜导致感染，行荧光素眼底血管造影术(fluorescein fundus angiography，FFA)：腹腔注射200μl质量浓度0.5％荧光素钠，将小鼠置于37℃恒温操作台，迅速调整角度将角膜对准镜头，观察并记录注射荧光素钠后30秒至10分钟内典型眼底像，FFA血管成像参数设置为Gain10dB；Framerate 15.0fps；Exposure time 166.7msecs。
(3)视网膜/RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体铺片染色
将小鼠眼球完全浸于4ml 4％多聚甲醛中，充分固定30分钟，取出眼球置于4ml提前在冰上预冷的PBS中，浸泡5分钟后取出眼球，置于PBS润湿的纱布上，手术显微镜下去除眼周肌肉，剪掉视神经，沿角巩膜缘剪去角膜，分离睫状体，娩出晶体，将剩余的眼球杯置于培养皿上，上下左右对称从边缘剪入2毫米，用无齿眼科手术镊沿边缘轻轻分离视网膜及RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体，展平呈四叶草状，剥净视网膜上残存的玻璃体及睫状体，在展平的视网膜或RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体上先滴加少量提前于冰上预冷的甲醇使组织快速固定，避免边缘卷曲，然后将视网膜或RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体铺片分别置于装有500μl甲醇的2ml平底离心管中，储于-20℃备用。
视网膜或RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体铺片免疫荧光染色：用微量移液器吸去离心管内甲醇，加入1.5ml 0.3％PBST，置于摇床上，4℃慢摇浸洗10分钟。弃去管内液体，加入500μl封闭液完全浸没组织，4℃慢摇60分钟。弃去管内液，封闭液稀释一抗至相应浓度，加入500μl一抗完全浸没组织，4℃慢摇孵育过夜。弃去管内液，加入1.5ml 0.3％PBST，4℃慢摇浸洗1小时/次，洗3次。弃去管内液，封闭液稀释荧光二抗至相应浓度，加入500μl二抗完全浸没组织，避光，4℃慢摇孵育过夜。弃去管内液，加入1.5ml 0.3％PBST，4℃慢摇浸洗1小时/次，洗3次。将组织从管内移至载玻片上，展平呈四叶草状，滤纸吸净组织周围多余液体，在组织上滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂，确保封片剂覆盖组织，但不宜过多。从一侧轻轻盖上载玻片，避免起泡。置于4℃冰箱中暂存，或封片15分钟后置于共聚焦显微镜下观察成像。当视网膜需要共染血管标记物植物凝集素b4(isolectin b4，IB4)时，将IB4按照1:500用封闭液稀释，可与荧光二抗共同孵育。后续步骤同二抗孵育完毕后。封闭液配制：0.02gBSA+500μl山羊血清+9.5ml 0.3％PBST(含有0.3％TritonX-100的PBS溶液)。
(4)Evans Blue实验
小鼠尾静脉注射45mg/kg 37℃预热的Evans Blue，可见小鼠肢体末端变蓝，循环30分钟后处死小鼠，取眼球行视网膜铺片，展平视网膜滴加甲醇固定后，PBS洗去表面甲醇，将视网膜移至载玻片上，滤纸吸净组织周围多余液体，在组织上滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂，确保封片剂覆盖组织，但不宜过多。从一侧轻轻盖上载玻片，避免起泡。封片15分钟后置于共聚焦显微镜下观察成像。
实验结果如图4A-B，平光下观察各组眼底未见异常，提示长期使用CAPE滴眼液未见视网膜毒性反应；FFA眼底血管造影可见各组小鼠视网膜中央大血管及分支血管形态正常，未见渗漏，各组大血管计数无统计学差异。如图4C-D，尾静脉注射Evans Blue后行视网膜铺片，共聚焦显微镜下进一步观察视网膜微血管形态及渗漏情况，与正常组对比，STZ+人工泪液组可见视网膜毛细血管走行迂曲，管径不均一，血管周围染料渗漏面积增加(*p<0.05)；CAPE滴眼液干预后，视网膜血管染色清晰，管壁平滑，血管形态及管径与正常组相似，渗漏面积无统计学差异。如图4E-F，RPE-Bruch's膜-脉络膜复合体铺片后行紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光染色，可见与正常组相比STZ+人工泪液组视网膜色素上皮细胞边缘ZO-1形态纤细，部分染色缺失，相邻细胞间ZO-1染色荧光强度显著下降(***p<0.001)；与STZ+人工泪液组相比，视网膜色素上皮细胞之间ZO-1形态完整，呈连续性线状，STZ+CAPE组ZO-1荧光染色强度显著增加，差异有统计学意义(*p<0.05)。可以看出，长期应用CAPE滴眼液未见视网膜毒性反应，且能保护视网膜色素上皮紧密连接结构，对视网膜微血管渗漏有改善作用，因此在糖尿病视网膜病变中CAPE滴眼液可能有助于维持血-视网膜屏障完整，具有良好的临床应用潜力。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
5、CAPE对糖尿病小鼠神经变性的影响
既往认为糖尿病视网膜病是一种原发性血管病变，近年来越来越多研究表明，早期糖尿病视网膜病变伴随视网膜神经元退行性病变，包括视网膜神经纤维层变薄，视网膜神经节细胞凋亡，光感受器功能受损，对比敏感度和视网膜电图异常等，可能与持续高血糖状态，视网膜微血管功能障碍，视网膜色素上皮细胞屏障和吞噬功能异常，以及视网膜炎症反应有关。因此，接下来评估了CAPE滴眼液对糖尿病视网膜小鼠视功能及视网膜神经结构的影响。
(1)视网膜电图(electroretinogram，ERG)
小鼠暗适12小时，麻醉后充分散瞳，眼表麻醉后将小鼠置于37℃恒温操作台，将红色电极针插入小鼠颈部皮下针头朝向头部，将绿色电极针插入小鼠尾部，胶带固定电极。将加替沙星眼用凝胶涂于角膜保持角膜湿润预防仪器划损角膜导致感染，调整角度将角膜对准镜头，根据国际临床视觉电生理标准化方案(ISCEV)，由低至高给予小鼠刺激并记录视网膜电图。刺激强度范围为-1.7至3.1log(cd·s/m2)。根据低(-1.7～0.4)、中(0.7～2.2)、高刺激强度(2.5～3.1)，ERG分别记录7、5、3次单次闪光平均值，刺激间隔分别为15、30、60秒。
(2)光学相干层析成像(optical coherence tomography，OCT)
小鼠麻醉后充分散瞳，眼表麻醉，将加替沙星眼用凝胶涂于角膜保持角膜湿润预防仪器划损角膜导致感染，将角膜镜置于小鼠角膜上，将小鼠角膜对准镜头，调整角度使视盘位于图像中央，记录参数为768次A扫描，30次B扫描和30度OCT场，以视盘为中心环形扫描。自动量化距离视盘两侧3，6毫米处各层视网膜厚度。
(3)冰冻切片免疫荧光染色
将组织包埋剂加满包埋盒，避免气泡。颈部脱臼处死小鼠，用镊子夹取小鼠眼球完全浸入包埋剂内。将包埋盒放置于液氮中迅速冷凝，后放于-80℃储存备用。将冰冻切片机预冷至-20℃，将组织包埋块固定于切片机内，以15μm层距切片，将眼球矢状面组织片粘附于载玻片上。
将载玻片完全浸于4％多聚甲醛中，室温充分固定1小时。于PBS中5分钟/次，反复洗3次后，室温下浸于0.5％PBST(含有0.5％TritonX-100的PBS溶液)中15分钟。于PBS中5分钟/次洗3次，用滤纸吸净组织周围多余液体。用免疫组化标记笔在载玻片上圈于眼球周围，待阻水剂干后，将适量封闭液滴加到组织上，确保组织浸于封闭液中，将载玻片置于湿盒中，室温封闭1小时。吸净封闭液，用封闭液稀释一抗至相应浓度，于组织上滴加一抗，确保完全浸没组织，将载玻片置于湿盒中静置4℃冰箱中孵育过夜。吸去一抗，PBS中10分钟/次，洗3次。用封闭液1:500稀释荧光二抗，用滤纸吸净组织周围多余液体，在组织上滴加二抗，将载玻片置于湿盒中，室温封闭3小时，避光。吸净二抗，PBS中10分钟/次，洗3次，避光。用滤纸吸净组织周围多余液体，在组织上滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂，确保封片剂覆盖组织，但不宜过多。从一侧轻轻盖上载玻片，避免起泡。置于4℃冰箱中暂存，或封片15分钟后置于共聚焦显微镜下观察成像。
实验结果如图5A-B，为探明CAPE对糖尿病小鼠视网膜电生理功能的影响，暗适应后行ERG检测，a波由锥杆感受器电位共同产生，b波来源于Müller细胞或双极细胞，与正常组相比，STZ+人工泪液组在低强度刺激下a波振幅无显著变化，随着刺激强度增加，在中、高强度刺激下a波振幅低于正常组，CAPE滴眼液治疗后a波振幅有回升趋势，但各组间差异没有统计学意义；STZ+人工泪液组b波振幅在低、中、高强度刺激下均低于正常组，随着刺激强度增加差异也增大，在中、高刺激下差异显著(*p<0.05)，而STZ+CAPE组b波振幅增大，在低、中、高刺激下b波振幅均与正常组相似，无统计学差异，提示CAPE对小鼠视网膜电生理功能有保护作用。如图5C-E，通过OCT观察比较各组小鼠视网膜结构变化，统计视网膜各层厚度，视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer，RNFL)与视网膜神经节细胞层(ganglioncell layer，GCL)合计为节细胞复合体(ganglion cell complex，GCC)，视网膜环状地形图及视网膜中央处OCT扫描成像可见，与正常组相比STZ+人工泪液组在距离视神经3mm处视网膜全层厚度下降(**p<0.01)，在距离视神经3mm(***p<0.001)和6mm(**p<0.01)处视网膜GCC层厚度均显著下降，其他层视网膜厚度差异无统计学意义；相较于STZ+人工泪液组，STZ+CAPE组距离视网膜3mm处视网膜全层厚度和GCC层厚度有增加趋势，但差异没有统计学意义，在距离视网膜6mm处GCC层明显增厚(*p<0.05)，表明在小鼠糖尿病模型中，视网膜可见神经变性，CAPE滴眼液对视网膜有神经保护作用。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
进一步验证CAPE对视网膜神经节细胞是否发挥保护作用，RBPMS免疫荧光染色标记视网膜神经节细胞，观察各组视网膜神经节细胞变化，同时行NIMP-R14染色观察视网膜中性粒细胞浸润及Müller细胞活化情况。如图5F-H所示，红色荧光为RBPMS阳性染色，标记视网膜神经节细胞，与正常组相比STZ+人工泪液组神经节细胞计数显著下降(*p<0.05)，RBPMS荧光强度下降(***p<0.001)；CAPE滴眼液干预后，较模型组小鼠神经节细胞计数显著增加(*p<0.05)，RBPMS荧光强度增强(*p<0.05)；NIMPR-14特异性标记Ly-6G/Ly-6C(Gr1+细胞)，在外周血中可特异性标记中性粒细胞，在组织中则可标记单核细胞，视网膜组织中Müller细胞属于单核细胞系统，因此可能标记视网膜组织中Müller细胞激活情况(绿色荧光)，各组视网膜中无明显点状阳性细胞染色，提示未见中性粒细胞浸润，与正常组相比STZ+人工泪液组NIMPR-14荧光强度增强，CAPE干预后NIMPR-14荧光强度减弱，差异均有统计学意义(*p<0.05)。可以看出，CAPE滴眼液可能通过抑制Müller细胞激活从而减少视网膜神经节细胞丢失，维持视网膜电生理功能，因此CAPE滴眼液可能在糖尿病视网膜病变中等眼部神经退行性病变(如青光眼、年龄相关性黄斑变性等)中发挥神经保护作用，具有较广泛的临床应用价值。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
6、CAPE对视网膜Müller细胞活化的影响
Müller细胞是视网膜损伤时首先做出反应的细胞，由于NIMPR-14总体荧光染色强度不高，不能直观表现视网膜组织炎症细胞聚集及活化情况，为进一步明确CAPE对糖尿病小鼠视网膜Müller细胞活化的影响，视网膜冰冻切片免疫荧光染色胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)绿色荧光特异性标记视网膜中Müller细胞，如图6，免疫荧光染色结果可见内层视网膜GFAP绿色荧光着染，呈丝状向视网膜内伸展，阳性染色主要位于标记Müller细胞内侧胞体，突起，和膨大的终足，胞体外侧呈弱阳性；与正常组相比，STZ+人工泪液组小鼠视网膜GFAP染色荧光强度显著升高(*p<0.05),Müller细胞胞体膨大，突触伸长；STZ+CAPE组与STZ+人工泪液组相比，视网膜GFAP染色荧光强度显著降低，Müller细胞胞体缩小，弱荧光丝状突触(*p<0.05)。可以看出，局部应用CAPE滴眼液能够显著抑视网膜组织内的Müller细胞过度激活，因此在糖尿病视网膜病变中CAPE滴眼液可能通过抑制视网膜Müller细胞炎症反应发挥保护作用。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
7、CAPE对模型鼠视网膜小胶质细胞活化的影响
视网膜受损时，小胶质细胞会迅速迁移到损伤部位参与炎症反应，为明确CAPE对糖尿病小鼠视网膜小胶质细胞激活的影响，用离子钙结合衔接分子1(ionized calciumbinding adapter molecule1，IBA-1)绿色荧光特异性标记全视网膜铺片中小胶质细胞。如图7，全视网膜免疫荧光染色结果可见视网膜神经纤维层至外丛状层(outerplexiformlayer，OPL)均分布有小胶质细胞，分别观察视网膜全层及各层血管网周围小胶质细胞活化情况，视网膜浅层血管对应视网膜节细胞层(ganglion cell layer,GCL)，视网膜中层血管对应视网膜内丛状层(inner plexiform layer，IPL)至视网膜内核层(inner nuclearlayer，INL)，视网膜深层(deep)血管对应视网膜外丛状层(outer plexiform layer，OPL)。IBA-1可着染小胶质细胞胞体及分支状突起，细胞突起包裹血管纵向生长，小胶质细胞彼此之间互不接触。与正常组相比，STZ+人工泪液组小鼠视网膜全层IBA-1染色荧光强度显著升高(****p<0.0001)，小胶质细胞激活在内核层与至外丛状层的视网膜深层血管网周围尤为明显，分别统计各层荧光强度统计发现外核层IBA-1荧光强度增强程度最显著(****p<0.0001)，小胶质细胞突起分支增粗，突起与视网膜血管接触面积增大并平行于血管延伸，小胶质细胞数目增多(*p<0.05)；STZ+CAPE组与STZ+人工泪液组相比，视网膜IBA-1染色荧光强度显著降低(****p<0.0001)，突起收缩，小胶质细胞数目减少(*p<0.0001)。神经血管单元包括神经元，小胶质细胞和血管内皮细胞，协同调控血流流速，血管密度和血管通透性等，糖尿病视网膜病变中可见神经血管单元功能紊乱。CAPE对外丛状层视网膜深层血管周围的小胶质细胞影响尤为明显，在糖尿病小鼠模型中可见外丛状层小胶质细胞体及突触膨大平行附着于血管边缘，与血管密切接触，提示视网膜神经血管单元损伤，而CAPE滴眼液治疗后小胶质细胞胞体及突触回缩，与血管附着程度降低，可以看出，CAPE滴眼液可能通过抑制了小胶质细胞对血管的刺激，对视网膜神经血管单元发挥保护作用。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
8、CAPE对视网膜血管白细胞黏附的影响
炎症反应是促进糖尿病视网膜病变发生发展的重要病理机制之一，为明确糖尿病小鼠视网膜炎症浸润情况及CAPE对其的影响，对各组小鼠行ConA-FITC心脏灌注，绿色荧光着染血管内皮及血管内白细胞，具体操作如下：小鼠麻醉后，予以右旋糖酐羟丙甲纤维素滴眼液点眼保护角膜，固定四肢，暴露小鼠胸腹部，剪去毛发，剪开小鼠胸腔，暴露心脏，向下剪开部分腹腔暴露部分肝脏。注射器抽取37℃预热的0.1％肝素钠连接至静脉输液器，排净管内液体，将静脉注输液器针尖与小鼠平行，轻轻插入心尖至左心室内，开始缓慢推注肝素钠溶液，同时剪开右心耳，可见肝脏由红变黄，共注射10ml 0.1％肝素钠(约90秒完成推注)。保持静脉输液器针尖在心尖内不动，更换注射器，继续缓慢推注10ml 4℃预冷的2％多聚甲醛，可见小鼠肢体末端及尾巴颤动后僵直。更换注射器，继续缓慢推注10ml PBS。更换注射器，继续缓慢推注10ml 1％BSA。更换注射器，继续缓慢推注10ml 20μg/ml ConA-FITC。更换注射器，继续缓慢推注20ml PBS。用镊子取下小鼠眼球，行视网膜铺片，并共染IB4标记视网膜血管。肝素钠，多聚甲醛，BSA均由PBS稀释；ConA-FITC由1％BSA稀释。
实验结果如图8，与正常组相比，STZ+人工泪液组小鼠视网膜微血管内可见点状绿色强荧光着染，为白细胞聚集团块，呈串珠样粘附于血管内皮，多分布于血管分支处，淤滞白细胞团块计数显著升高(****p<0.0001)；STZ+CAPE组与STZ+人工泪液组相比，视网膜微血管内黏附的白细胞数量显著减少，血管腔内未见白细胞淤滞团块(****p<0.0001)。可以看出，CAPE滴眼液抑制了糖尿病模型小鼠视网膜血管内皮白细胞粘附，减轻视网膜组织中炎症细胞浸润，发挥保护作用。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
9、CAPE对模型鼠视网膜NF-κB信号通路的影响
NF-κB经典炎症信号通路介导的炎症反应与糖尿病视网膜病变发生发展密切相关，既往研究已证实CAPE是NF-κB抑制剂，为明确本实施例中CAPE是否通过调控NF-κB信号通路发挥抑制视网膜炎症作用，对各组视网膜冰冻切片行免疫荧光染色观察p-NF-κB(绿色荧光)及NF-κB(红色荧光)激活情况。如图9A-B所示，各组p-NF-κB荧光染色强度均较弱，与正常组相比，STZ+人工泪液组p-NF-κB荧光强度有升高的趋势，但荧光强度差异无统计学意义，CAPE+STZ组p-NF-κB荧光强度显著低于STZ+人工泪液组(*p<0.05)；NF-κB在各组表达丰度较高，可见阳性染色主要位于于外核层，阳性染色分布与Müller细胞位置及形态相似，与正常组相比，STZ+人工泪液组NF-κB荧光强度显著升高，(*p<0.05)，CAPE+STZ组NF-κB荧光强度显著低于STZ+人工泪液组(*p<0.05)。本研究可以看出，CAPE滴眼液治疗可显著抑制糖尿病小鼠视网膜组织中NF-κB信号，且NF-κB阳性染色定位于Müller细胞，提示在糖尿病视网膜病变中，CAPE滴眼液可能通过调控NF-κB信号抑制Müller细胞活化从而保护视网膜神经血管单元。针对目前临床早期糖尿病视网膜病变防治困难的问题，CAPE滴眼液具有无创、安全的优势，同时CAPE对于视网膜神经和血管的双重保护作用体现了其在全面有效解决临床问题的潜力，具有良好的临床转化价值和应用前景。同时，也可以看出，本发明中右旋糖酐羟丙甲纤维素与咖啡酸苯乙酯之间具有协同作用，能够协同提高所制备得到的咖啡酸苯乙酯滴眼液的相关的功能。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.咖啡酸苯乙酯及其结构类似物在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述咖啡酸苯乙酯的结构类似物具有与咖啡酸苯乙酯相同/类似的结构、功能基团、理化特性、生物功能；
或者，所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括全身给药或局部给药。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述咖啡酸苯乙酯的给药方式包括口服、局部注射、玻璃体腔注射、眼周注射或眼表给药，眼表给药时咖啡酸苯乙酯的给药浓度至少为50μM。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于：所述药物的载体或辅料包括右旋糖酐羟丙甲纤维素；
或者，所述药物的局部施用剂包括渗透促进剂、载体化合物或赋形剂；
或者，所述药物包括滴眼液、眼膏、眼用凝胶制剂、眼用脂质体、眼用乳剂或眼用植入剂；
或者，所述糖尿病视网膜病变包括NPDR。
6.咖啡酸苯乙酯在制备抑制血-视网膜屏障损伤药物和/或制备抑制视网膜神经退行性变药物和/或制备抑制视网膜炎症反应药物和/或制备视网膜神经退行性病变药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述咖啡酸苯乙酯的结构式如式(1)所示：
8.一种咖啡酸苯乙酯滴眼液，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
将咖啡酸苯乙酯与右旋糖酐羟丙甲纤维素混合成溶液，得到咖啡酸苯乙酯滴眼液。
9.根据权利要求8所述的咖啡酸苯乙酯滴眼液，其特征在于：所述右旋糖酐羟丙甲纤维素为复方制剂，其组份为0.1％右旋糖酐70和0.3％羟丙甲纤维素2910，溶剂为水；上述百分数均为质量百分数；
所述右旋糖酐70的结构式如下：
所述羟丙甲纤维素2910的结构式如下：
或者，所述咖啡酸苯乙酯滴眼液中咖啡酸苯乙酯的摩尔浓度至少为50μM。
10.如权利要求8或9所述的咖啡酸苯乙酯滴眼液在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
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