CN113518619A - 用于治疗眼部新生血管形成的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗眼部新生血管形成的药物组合物，其包含他克莫司和半氟化烷烃。

Description

用于治疗眼部新生血管形成的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种用于治疗眼部新生血管形成的药物组合物，所述药物组合物包含他克莫司。此外，本发明涉及一种治疗眼部新生血管形成的方法，所述方法包括施用包含他克莫司的组合物。

背景技术

血管生成性眼部疾病是全世界最常见的失明原因之一。

血管生成是由促血管生成因子与抗血管生成因子之间的动态平衡控制的。几种情况可能影响平衡并且导致新生血管形成。眼部血管生成，特别是在视网膜和脉络膜中，可能导致显著的视力损害。糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变和视网膜血管阻塞是血管生成相关的视力下降的主要原因。

血管内皮生长因子(VEGF)被认为是最关键的眼部血管生成调节剂。目前，重要的抗VEGF疗法包括贝伐单抗、阿柏西普、兰尼单抗等。然而，目前的治疗方法不够有效，并且部分与显著的不良反应相关。一些患者可能呈现出眼部疾病的恶化，这表明其他血管介体也可能导致眼部血管生成。(Cabral等人,Int.J.Retin.Vitr.(2017)3:31)。

目前，其他方法倾向于或甚至需要全身施用像生长抑素类似物和PKC抑制剂的物质。然而，生物活性物质的全身施用总是具有显著的全身不良反应的风险。由于眼睛的形态特征，局部疗法(包括眼内注射或甚至局部基因转移)可能是可行的。(Wegewitz等人,CurrPharm Des.2005；11(18):2311-30)。

他克莫司(FK506)，从真菌链霉菌属(Streptomyces tsukubaensis)中分离的大环内酯类内酯，是一种有效的免疫抑制药物，主要在器官移植后使用以降低器官排斥的风险。他克莫司还用于抑制与溃疡性结肠炎相关的炎症或用作治疗湿疹的软膏。据报道，他克莫司由于其物理化学特性而具有在局部施用时较差的穿透组织屏障的能力(Tamura等人,2002,J.Pharm.Sci.91,719-729)。

发明内容

本发明的问题是提供一种药物组合物，所述药物组合物为眼部新生血管形成提供了有效的治疗，并且克服了与当前治疗相关的缺点。

根据本发明，此问题通过包含他克莫司和半氟化烷烃的药物组合物得以解决。

本发明基于以下的认识：他克莫司具有抗血管生成作用，并且在半氟化烷烃滴眼液中的他克莫司对血管生成性眼部疾病具有治疗潜力。

根据第一方面，本发明提供了一种用于治疗眼部新生血管形成的方法中的药物组合物，所述药物组合物包含他克莫司和半氟化烷烃。

在第二方面，本发明提供了一种通过以下方式治疗眼部新生血管形成的方法：向有需要的受试者的眼睛施用包含他克莫司和半氟化烷烃的药物组合物。

此外，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含他克莫司和半氟化烷烃，所述药物组合物用于制造用于治疗眼部新生血管形成的药剂。

具体实施方式

如本文所用的术语“半氟化烷烃”(也称为“SFA”)是指由至少一个全氟化区段(F-区段)和至少一个非氟化烃区段(H-区段)构成的线性或支链化合物。优选地，半氟化烷烃是由一个全氟化区段(F-区段)和一个非氟化烃区段(H-区段)构成的线性或支链化合物。优选地，所述半氟化烷烃是在4℃至40℃的温度范围内以液态存在的化合物。在一个实施方案中，所述SFA的全氟化区段和/或烃区段任选地包含环状烃区段或由其组成，或者任选地，所述SFA在烃区段中包含不饱和部分。

优选的是线性或支链半氟化烷烃的F-区段和H-区段彼此独立地包含2至10个碳原子。

根据本发明的一个优选实施方案，所述半氟化烷烃是式(I)CF₃(CF₂)n(CH₂)mCH₃的线性化合物，其中n和m是相互独立地选自2至10的范围，优选地选自2至8的范围并且甚至更优选地选自3至7的范围的整数。

任选地，所述线性或支链SFA可以包含支链非氟化烃区段，所述支链非氟化烃区段包含选自-CH3、-C2H5、-C3H7和-C4H9的一个或多个烷基，和/或所述线性或支链SFA可以包含支链全氟化烃区段，所述支链全氟化烃区段包含选自-CF3、-C2F5、-C3F7和-C4F9的一个或多个全氟化烷基。

根据另一种命名法，所述线性半氟化烷烃可以称为FnHm，其中F意指全氟化烃区段，H意指非氟化烃区段，并且n、m是相应区段的碳原子数。例如，F4H5用于1-全氟丁基-戊烷。

在本发明的优选实施方案中，所述半氟化烷烃是至少一种式(I)的线性半氟化烷烃，其中n选自3至5并且m选自4至7。优选地，所述半氟化烷烃选自F4H5和F6H8。更优选地，所述半氟化烷烃是F4H5。

根据本发明的药物组合物可以包含多于一种SFA。例如，组合不同的SFA可能是有用的，以便实现特定的目标特性，诸如特定的密度或粘度。如果使用两种或更多种不同的SFA的混合物，则进一步优选的是，所述混合物包含F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一种，并且特别是F4H5、F6H6和F6H8中的一种。在另一个实施方案中，所述混合物包含选自F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少两个成员，并且特别是选自F4H5、F6H6和F6H8种的至少两个成员。

液体SFA在化学和生理上是惰性的、无色的且稳定的。它们的典型密度范围为1.1至1.7g/cm³，并且其表面张力可以低至19mN/m。FnHm类型的SFA不溶于水但是也有些两亲性，其亲脂性的增加与非氟化区段的尺寸的增加相关。

用于根据本发明的用途的药物组合物包含他克莫司。他克莫司可以以基于组合物的总体积至少0.01％w/v的量、优选以基于组合物的总体积至少0.02％w/v的量存在于组合物中。在优选的实施方案中，他克莫司以相对于组合物的总体积从0.01％w/v至0.1％w/v的量、优选以从0.01％w/v至0.05％w/v的量、更优选以从0.02％w/v至0.05％w/v的量存在。

除非另有说明，否则如整个本文所用的术语“％w/v”将组合物的组分的量表示为相对于组合物总体积的重量百分比(其中“w”表示重量，并且“v”表示体积)。例如，0.02％w/v可以理解为在1mL组合物中涉及0.2mg。

在根据本发明的药物组合物中，他克莫司可以溶解或悬浮于半氟化烷烃中。优选地，用于本发明用途的药物组合物呈溶液形式，更优选呈澄清溶液的形式。

在一个实施方案中，用于本发明用途的药物组合物可以包含基于所述组合物的总重量至少85％wt、优选至少90％wt并且更优选至少95％wt的半氟化烷烃。

在优选的实施方案中，所述半氟化烷烃以基于所述组合物的总重量从96％至99.5％重量百分比的量、优选基于所述组合物的总重量98至99重量百分比的量存在。

在本发明中，所述药物组合物可以任选地包含如以下详细描述的其他溶剂和赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”是指可以添加到本发明的药物组合物中的任何药学上可接受的天然或合成物质，以增强或以其他方式改变其物理或化学构成或稳定性或治疗特性。一种或多种赋形剂例如像抗氧化剂、防腐剂、脂质或油性赋形剂、表面活性剂或润滑剂或其中至少2种赋形剂的组合可以存在于根据本发明的药物组合物中。

用于本发明药物组合物的合适的抗氧化剂包括例如：丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、叔丁基氢醌(TBHQ)、维生素E、维生素E衍生物(即α-生育酚乙酸酯)和/或抗坏血酸。

用于根据本发明药物组合物的合适的脂质或油性赋形剂包含例如甘油三酯油(即大豆油、橄榄油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、甜杏仁油)、甘油三酯、矿物油(即凡士林和液体石蜡)、中链甘油三酯(MCT)、油性脂肪酸、肉豆蔻酸异丙酯、油性脂肪醇、山梨糖醇和脂肪酸的酯、油性蔗糖酯、或在生理上被眼睛耐受的任何其他油性物质。

用于根据本发明药物组合物的合适的润滑剂包括，例如，羧甲基纤维素及其钠盐(CMC、羧甲纤维素)、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素(HPMC、羟丙甲纤维素)、透明质酸及其钠盐和羟丙基瓜尔胶。

根据本发明的药物组合物可以包含或可以不包含药学上合适的天然或合成防腐剂，诸如苯扎氯铵和氯己定。然而，在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物不包含药学上可接受的防腐剂。

除了如上述作为任选组分的赋形剂之外，根据本发明的药物组合物还可以包含一种或多种另外的溶剂。如本文所用，术语“其他溶剂”是指除半氟化烷烃之外的溶剂或两种或更多种不同溶剂的混合物。合适的另外的溶剂可以选自例如醇(诸如乙醇、异丙醇)或在生理上被眼睛耐受的其他另外溶剂。

优选的溶剂是乙醇，其可以以基于所述组合物的总重量至多约2重量百分比、优选至多约1.5重量百分比的量存在于用于根据本发明的用途的药物组合物中。更优选地，用于根据本发明的用途的药物组合物包含基于所述组合物的总重量在0.5与1.5重量百分比之间的乙醇。最优选地，用于根据本发明的用途的药物组合物包含基于所述组合物的总重量1.0至1.5重量百分比的量的乙醇。在甚至更优选的实施方案中，乙醇以基于所述组合物的总重量1.4重量百分比的浓度存在。

如本文所用并且除非另有说明，否则术语“％wt”是指作为相对于药物组合物的总重量的重量百分比的组合物的组分的量。必须对“％w/w”赋予相同的含义，其中w指示重量。

在进一步的实施方案中，水也可以存在于根据本发明的药物组合物中，然而优选以基于所述组合物的总重量至多1.0wt.-％或甚至至多0.1wt.-％或更少的少量存在。在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物是基本上无水的，而残余的水可以归因于他克莫司的潜在的残余水含量。如本文所用，术语“基本上”意指如果存在的话，则为关于本发明目的不赋予技术优点或相关性的这样的痕量或残余量。

在优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的药物组合物包含浓度为从0.01％至0.1％w/v的他克莫司和选自F4H5和F6H8的半氟化烷烃。在更优选的实施方案中，用于根据本发明的用途的药物组合物包含浓度为从0.01％至0.05％w/v的他克莫司和1-全氟丁基戊烷。

用于根据本发明的用途的药物组合物可以包含从0.01％至0.05％(w/v)的他克莫司、0.5％至1.5％(w/w)的乙醇和选自F4H5(1-全氟丁基-戊烷)和F6H8(1-全氟己基-辛烷)的半氟化烷烃。优选地，用于根据本发明的用途的药物组合物包含从0.01％至0.05％(w/v)的他克莫司、从1.0％至1.5％(w/w)的乙醇并且所述半氟化烷烃是F4H5；更优选从0.01％至0.03％(w/v)的他克莫司、从1.0％至1.5％(w/w)的乙醇并且所述半氟化烷烃是F4H5；最优选从0.02％w/v的他克莫司、1.4％(w/w)的乙醇并且半氟化烷烃是F4H5(1-全氟丁基-戊烷)。

根据本发明的药物组合物尤其可用作眼用组合物，并且可以优选地局部施用于患者的眼睛、眼睑、眼囊、眼表面和/或眼组织。然而，优选地，本发明的药物组合物可以局部施用至患者的眼睛的外表面或施用至眼组织，所述眼组织是通过患者或通过将药物组合物施用至有需要的患者的眼睛的其他人而易于可接近的。

用于本发明用途的药物组合物可以局部施用或通过玻璃体内注射至眼睛。优选地，向有需要的患者的眼睛局部施用用于本发明用途的药物组合物。

根据疾病的程度或是否影响要治疗的患者的双眼，本发明的药物组合物可以仅施用于患者的一只眼睛或两只眼睛。优选地，根据本发明的药物组合物以约5至30μl/剂/只眼睛的体积、优选用约8至15μl/剂/只眼睛的体积、更优选用约8至12μl/剂/只眼睛的体积施用。在优选的实施方案中，以从8至12μl的体积向眼睛局部施用用于本发明用途的药物组合物。

用于本发明用途的药物组合物可以以0.5至10微克他克莫司/剂/只眼睛、优选从1至6微克、更优选从1至3微克他克莫司/剂/只眼睛的量施用。

用于本发明用途的药物组合物可以每日一次至每日四次、优选每日一次或两次、更优选每日两次施用。

如本文所用，术语“血管生成性眼部疾病”是指在广泛的眼部障碍中发生的异常眼部血管生成，所述眼部障碍包括视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变(ROP)、糖尿病性视网膜病变(DR)、新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、和继发于化学损伤或感染或炎症过程的角膜新生血管。血管生成是现有血管中的内皮细胞在众多血管生成刺激剂和抑制剂的引导和平衡下萌发并且形成新血管的过程。血管生成在生理发育和病理事件中都起着重要作用。异常血管生成与许多疾病相关，包括例如癌症、心血管疾病、神经退行性变和增生性视网膜病变。

眼睛内的新生血管形成在几种眼部疾病中导致失明，其中最常见的眼部疾病是增生性糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关性黄斑变性和早产儿视网膜病变。在糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变中，新血管形成从视网膜血管系统出现并且延伸到玻璃体腔内。年龄相关性黄斑变性与源自脉络膜脉管系统并且延伸到视网膜下空间内的新生血管形成相关(K.Neely等人,Ocular neovascularisation,American Journal ofPathology,第153卷,第3期,1998年9月)

在本发明中，所述眼部新生血管形成可以是视网膜或脉络膜新生血管形成，优选脉络膜新生血管形成。在优选的实施方案中，所述眼部新生血管形成与年龄相关性黄斑变性和/或视网膜病变相关或由其引起。在更优选的实施方案中，所述眼部新生血管形成与年龄相关性黄斑变性、优选湿性年龄相关性黄斑变性相关或由其引起。

视网膜和脉络膜血管生成模型(包括氧诱导的视网膜病变、激光诱导的脉络膜新生血管形成和具有缺陷或自发性视网膜/脉络膜新生血管形成的转基因小鼠模型)以及具有诱导的角膜血管生成的模型被广泛用于研究血管生成机制的分子和细胞基础。

在第二方面，本发明提供了一种治疗眼部新生血管形成的方法，所述方法包括向有需要的受试者的眼睛施用包含他克莫司和半氟化烷烃的药物组合物。

应当注意，对于根据本发明的此方面的方法，以上结合本发明的其他方面所述的所有实施方案和优选实施方案分别适用。

根据本发明的此方面的方法的优选实施方案是：

1.一种治疗眼部新生血管形成的方法，所述方法包括向有需要的受试者的眼睛施用包含他克莫司和半氟化烷烃的药物组合物。

2.根据项目1所述的方法，其中所述眼部新生血管形成是视网膜和/或脉络膜新生血管形成。

3.根据项目1或2中任一项所述的方法，其中所述眼部新生血管形成是由选自以下的疾病引起的或与之相关：年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、中央视网膜静脉阻塞、视网膜病变、分支视网膜静脉阻塞。

4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述半氟化烷烃是式(I)的半氟化烷烃

CF₃(CF₂)n(CH₂)mCH₃ (I)

其中n是选自从2至10的整数，并且m是选自从2至10的整数。

5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中n是3并且m是4，或其中n是5并且m是7。

6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中他克莫司以相对于所述组合物的总体积至少0.01％w/v的浓度存在。

7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中他克莫司以相对于所述组合物的总体积的从约0.01％w/v至0.1％w/v的浓度存在。

8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含乙醇。

9.根据项目8所述的方法，其中包含相对于所述组合物的总重量从约0.5％至2％w/w的浓度的乙醇。

10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将所述组合物局部应用或玻璃体内注射至眼睛。

11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述眼部新生血管形成是由于炎症细胞不受控制地表达促血管生成因子引起的。

12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中施用至眼睛的他克莫司的剂量是从约0.5至10微克/剂/只眼睛。

13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述组合物呈溶液的形式。

14.根据项目1至12中任一项所述的方法，其中所述组合物呈悬浮液的形式。

15.根据项目14所述的方法，其中所述半氟化烷烃是F6H8。

16.根据第1至13项中任一项所述的方法，其中所述半氟化烷烃是1-全氟丁基戊烷。

17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中他克莫司以从0.01％至0.05％w/v、优选0.01％至0.03％w/v、更优选0.02％w/v的浓度存在。

18.根据项目17所述的方法，其中所述组合物进一步包含乙醇，优选浓度为相对于所述组合物的总重量从1.0％至1.5％w/w，更优选浓度为1.4％w/w。

在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于容纳用于本发明用途的药物组合物的容器和数据载体，其中所述容器适于将所述组合物局部应用或璃体内注射至眼睛，并且其中，所述数据载体包括将所述组合物用于治疗眼部新血管形成的方法中的说明。

进一步提供了根据本发明的第三方面的试剂盒在治疗眼部新生血管形成的方法中的用途。

应当注意，对于根据本发明的此方面的试剂盒及其用途，以上结合本发明的其他方面所述的所有实施方案和优选实施方案分别适用。

在根据本发明的试剂盒中，所述容器可以容纳单剂量或多个剂量的包含如上所述的他克莫司和半氟化烷烃的药物组合物。

此外，根据本发明的此方面的试剂盒可以进一步包含使用所述容器用于将所述组合物逐滴局部施用至患者的眼睛表面或用于玻璃体内注射的说明。优选地由根据本发明的此方面的试剂盒包含的使用说明或指导可以呈适于指导使用者如何对向患者或受试者的受影响的眼睛进行局部施用或玻璃体内注射的任何形式。它可以呈任何可读或有形的形式，优选呈印刷形式或呈任何机器或计算机可读形式，优选呈机器可读光学标签的形式，例如像条形码或QR码。在特别优选的实施方案中，使用指导以说明书单页、产品或包装插页的形式或作为封闭标签提供。

在进一步的方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含他克莫司和半氟化烷烃，所述药物组合物用于制造用于治疗眼部新生血管形成的药剂。

应当注意，还对于本发明的此方面，以上结合本发明的其他方面所述的所有实施方案和优选实施方案分别适用。

诸位发明人还使用BMDM(骨髓来源的巨噬细胞的培养)进行体外研究，所述研究表明他克莫司和地塞米松具有不同的抗血管生成特征。他克莫司可以降低促血管生成生长因子的表达，并且地塞米松可以增加抗血管生成生长因子的表达。他克莫司在与炎症细胞不受控制地表达促血管生成因子相关的疾病中可能更有效，而地塞米松在与免疫细胞表达抗血管生成因子降低相关的疾病中可能更有效。

附图说明

图1：眼底图像和FA图像中的CNV病变。使10只CNV诱导后的小鼠经受使用MicronIV系统的眼底检查和FA。显示的图像是来自每组中三只小鼠的代表。

图2：不同的处理对CNV形成的影响。基于同工凝集素B4染色对病变区域进行定量。代表性RPE平铺片(flatmount)图像显示出每组中的CNV。

图3：每组的平均CNV尺寸表示为与对照非治疗组相比的绝对面积或减少的百分比。呈现的数据是平均值±SEM。*p<0.05，非配对Student t检验。将抗VEGF地塞米松0.1％和他克莫司/PBS组与空白对照比较；将0.02％他克莫司/F4H5与F4H5媒介物对照比较。

实施例

材料

用于制备以下列出的他克莫司配制品的材料是：他克莫司(Euticals；纯度98.2％)、乙醇(Merk，

干燥的0.01％H₂O)、1-全氟丁基-戊烷F4H5(Novaliq)、磷酸盐缓冲盐水(VWR，生物技术级)

配制品

实验中使用以下配制品：

通过将他克莫司溶解于乙醇和1-全氟丁基-戊烷中制备0.02％w/v(0.2mg/ml)他克莫司在1.4％w/w乙醇在1-全氟丁基-戊烷中的溶液(此配制品在表1、表2和图中也称为他克莫司/SFA)。

制备他克莫司0.02％w/v在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的悬浮液(此配制品在表1、表2和图中也称为他克莫司/PBS)。

购买地塞米松眼用悬浮液

0.1％(Novartis Pharmaceuticals UKLtd.)。

抗小鼠VEGF抗体购自R&D systems。

他克莫司在F6H8中的悬浮液的制备

称重所需量的他克莫司(纯度100.5％；水含量2.35％)并且然后转移到研磨罐中。将所需体积的F6H8添加到罐中，然后将所述罐置于以150rpm和10分钟间隔的球磨机(BM01)中持续一小时。然后借助移液管将悬浮液与球分离。

实施例1

在激光诱导的脉络膜新生血管形成(CNV)的小鼠模型中测试他克莫司0.02％w/v在乙醇1.4％w/w和F4H5中的滴眼液的治疗效果并且分别与0.1％地塞米松滴眼液的治疗效果和抗小鼠VEGF的玻璃体内注射进行比较。

研究设计

36只雌性C57BL/6小鼠(12周龄)购自Harland Laboratories UK。将所有小鼠进行圈养并且饲养在正常的实验房间内并且暴露于12小时黑暗12小时光照周期中。关于在此研究中动物的使用的所有程序是根据视觉和眼科研究协会(Association for Research inVision and Ophthalmology，ARVO)关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明并且在1986年英国动物许可证法(United Kingdom Animal License Act 1986)(英国)的规定下进行的。

激光诱导的脉络膜新生血管形成(CNV)

在C57BL/6小鼠中进行激光诱导的CNV。简言之，将小鼠用腹膜内注射75mg/kg氯胺酮和7.5mg/kg赛拉嗪进行麻醉。将瞳孔用1％托品酰胺(Chauvin Pharmaceuticals Ltd，英国埃塞克斯)放大。使用粘弹性材料Microvisc(Vision Matrix Ltd，英国哈罗盖特)和盖玻片作为接触透镜，将三个532nm二极管激光点(200mV，100ms，100μm)施加到每个眼底。将病变置于距视盘2至3个视盘直径的视网膜血管之间。在激光施加部位形成气泡(这表明Bruch膜破裂)是获得CNV的重要因素，因此本研究仅包括产生气泡的烧伤。CNV病变在激光治疗后2-3天发展，在第7-12天达到峰值，并且在14-20天后消退。

应用的激光诱导的脉络膜新生血管形成方案也描述于1)Tobe,T.,S.Ortega,J.D.Luna,H.Ozaki,N.Okamoto,N.L.Derevjanik,S.A.Vinores,C.Basilico,和P.A.Campochiaro.1998.Targeted disruption of the FGF2 gene does not preventchoroidal neovascularization in a murine model.Am.J.Pathol.153:1641-1646；2)Toma,H.S.,J.M.Barnett,J.S.Penn,和S.J.Kim.2010.Improved assessment of laser-induced choroidal neovascularization.Microvasc.Res.80:295-302中。

治疗方案

此研究包括六个实验组。每组使用六只小鼠(表1)。将小鼠从第0天到第10天每天两次用滴眼液处理，或在CNV诱导后立即玻璃体内注射1μL浓度为1ng/μL的抗VEGF。在滴眼液施用期间，每只眼睛接受5μl滴眼液。

表1.体内治疗组和给药详细信息

临床检查

在CNV诱导后第10天，使用Micron IV(Phoenix Research Labs)系统进行彩色眼底图像和荧光素血管造影对CNV病变进行临床检查。

样品收集

在CNV诱导后第10天，将所有小鼠通过吸入CO₂处死，并且将眼睛小心移除。使用以下程序制备眼部组织整体铺片。在室温下将所有眼睛固定在2％多聚甲醛(AgarScientific Ltd，英国剑桥)中2h，并且然后用PBS洗涤。为了制备视网膜色素上皮(RPE)-脉络膜整体铺片，将眼睛的前段(包括角膜、睫状体、虹膜和晶状体)移除。在眼杯中进行五次垂直切割，并且然后从RPE/脉络膜上切下视网膜组织。将外眼部组织(包括结膜和眼部肌肉)小心地移除。然后对RPE/脉络膜整体铺片进行进一步处理以进行免疫染色。

RPE平铺片的免疫染色

将RPE/脉络膜整体铺片在室温下用0.3％triton X-100透化1h。然后将样品用6％BSA封闭另外的一个小时，并且与兔抗小鼠胶原IV(1:100，AbD Serotec，英国基德灵顿)和生物素化的同工凝集素B4(1:100，Vector Laboratories Ltd，英国)在4℃下孵育过夜。彻底洗涤(10分钟x 3)后，将样品与FITC缀合的链霉亲和素(Dako，丹麦)和四甲基罗丹明山羊抗兔IgG(Invitrogen，英国)在室温下在黑暗中孵育4h。最终，将样品洗涤并且用Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories Ltd，Peterborough，UK)平铺片在载玻片上，并且通过共聚焦显微术观察。将样品平铺片在载玻片上，并且通过荧光显微术(Leica DMI8)检查。

图像和数据分析

使用成像软件ImageJ系统对图像进行分析。分别分析绿色和红色通道。为了测量CNV的尺寸，手动描画CNV的边界的轮廓，并且自动计算尺寸。各组中CNV的平均尺寸表示为平均值±SEM。使用Student's t检验(非配对，双尾)来检测他克莫司/地塞米松治疗组与相关对照组之间的差异。此外，还使用单向方差分析(ANOVA)土耳其多重比较检验(Turkey’sMultiple Comparison Test)来检测不同组之间的差异。

临床观察

在CNV诱导后第10天，对来自每组的三只小鼠进行眼底检查和荧光血管造影(FA)。在眼底图像中检测到呈白色斑点的CNV病变，并且在FA中检测到超荧光斑点(图1)。所有小鼠均产生CNV病变。

免疫组织学结果

在72只眼睛(36只小鼠)中总共施加216次激光烧伤。所有激光烧伤均显示出气泡并且诱导CNV。表2和图2和3示出了同工凝集素B4标记的结果。结果显示0.02％他克莫司/SFA滴眼液和0.1％地塞米松滴眼液治疗显著抑制CNV。

表2.每组中CNV的平均尺寸由同工凝集素B4染色确定。

动物的	处理	CNV数量	平均CNV(μm<sup>2</sup>)	SEM
					1	无	22	55394	14930
2	0.02％他克莫司/SFA	31	26421	2919
					3	0.02％他克莫司/PBS	27	33837	4323
4	媒介物(SFA)	27	55618	12391
					5	抗小鼠VEGF	27	36008	5208
6	0.1％地塞米松	28	25336	3658

0.02％他克莫司/F4H5滴眼液在激光诱导的CNV的小鼠模型中显示出抗血管生成作用。当一天应用两次时，0.02％他克莫司/F4H5的抗血管生成作用与0.1％地塞米松滴眼液相似。

实施例2

也在脉络膜血管生成的体外模型中进行测试他克莫司的抗血管生成作用，并且与地塞米松进行比较。此测试的结果显示浓度为100ng/mL、20ng/mL和4ng/mL的他克莫司抑制了脉络膜血管生成，但是其作用不是剂量依赖性的。抑制作用与1μM地塞米松的作用相似。

Claims (15)

1.一种用于治疗眼部新生血管形成的方法中的药物组合物，所述药物组合物包含他克莫司和半氟化烷烃。

2.根据权利要求1所述的用于所述用途的组合物，其中所述眼部新生血管形成是视网膜和/或脉络膜新生血管形成。

3.根据权利要求1或2所述的用于所述用途的组合物，其中所述眼部新生血管形成是由选自以下的疾病引起的或与之相关：年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、中央视网膜静脉阻塞、视网膜病变、分支视网膜静脉阻塞。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中所述半氟化烷烃是式(I)的半氟化烷烃

CF₃(CF₂)n(CH₂)mCH₃ (I)

其中n是选自从2至10的整数，并且m是选自从2至10的整数。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中n是3并且m是4，或其中n是5并且m是7。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中他克莫司以相对于所述组合物的总体积至少0.01％w/v的浓度存在。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中他克莫司以相对于所述组合物的总体积在约0.01％w/v与0.1％w/v之间的浓度存在。

8.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其进一步包含乙醇。

9.根据权利要求8所述的用于所述用途的组合物，其中包含相对于所述组合物的总重量从约0.5％至2％w/w的浓度的乙醇。

10.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中将所述组合物局部应用或玻璃体内注射至眼睛，优选局部应用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中所述眼部新生血管形成是由于炎症细胞不受控制地表达促血管生成因子引起的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中施用至眼睛的他克莫司的剂量是从约0.5至10微克/剂/只眼睛。

13.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中所述组合物呈溶液的形式。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的用于所述用途的组合物，其中将他克莫司悬浮于所述半氟化烷烃中，优选其中将他克莫司悬浮于1-全氟己基辛烷中。

15.一种试剂盒，其包含用于容纳根据权利要求1至14中任一项所述的用于所述用途的组合物的容器和数据载体，其中所述容器适于将所述组合物局部应用或玻璃体内注射至眼睛，并且其中所述数据载体包括使用根据权利要求1至14中任一项所述的组合物的说明。

Images