CN106999543B - 包含环孢霉素和海藻糖的眼用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含环孢霉素和海藻糖作为有效成分的眼用组合物、其制备方法、通过将其给药来预防、改善或治疗由干眼症引起的疾病的方法及其用途。根据本发明的眼用组合物具有对于由诸如干燥空气、炎症、防腐剂等的各种因素引起并且处于各种状态或条件下的干眼症具有多种优异效果。

Description

包含环孢霉素和海藻糖的眼用组合物
技术领域
本公开涉及一种眼用组合物、其制备方法以及用于预防或治疗眼病的方法。
本申请要求于2014年10月17日在韩国提交的申请号为10-2014-0141089的韩国专利申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
背景技术
眼泪由三层即油层、水层和粘蛋白层组成，泪膜具有三层结构。干眼综合征或干眼病(以下简称“干眼”)概念范围广泛，并且在许多情况下，其原因尚不清楚，因此将干眼定义为由泪液量或质量下降或变化以及泪膜比正常情况下破裂更快而引起的泪膜不稳定所导致的眼睛异常状况，而不是疾病。
根据定义，干眼的类别包括诸如干燥性角膜结膜炎、角膜结膜上皮疾病、泪液分泌减少、Stevens-Johnson综合征、干眼综合症、
Figure BDA0001271392950000011
综合征、泪液不足、眼睛充血、泪膜不稳定或眼水肿的疾病。此外，干眼的类别包括过敏性结膜炎、病毒性结膜炎或白内障手术后的干眼症。此外，近来随着隐形眼镜佩戴者的数量、在人造空气控制的环境下度日、以及广泛使用电视和电脑的视觉显示终端(VDT)的机率的增加，促进干眼的因素急剧增加，因此，干眼的种类包括与隐形眼镜佩戴相关的干眼或与VDT操作相关的干眼。
此外，干眼患者在许多情况下也会出现干燥性角膜结膜炎下的疾病。具体地，当粘液层出现泪液不足时，角膜损伤严重，导致角膜结膜上皮疾病，并且角膜结膜上皮疾病的种类包括干眼、角膜上皮缺损、结膜上皮缺损、角膜上皮糜烂、角膜厚度减少、角膜渗透、角膜穿孔或角膜上皮剥脱，并且角膜结膜上皮疾病导致角膜溃疡、角膜炎、结膜炎、浅表性点状角膜病变、干燥性角膜结膜炎、上方角膜缘角结膜炎、丝状角膜炎、角膜溃疡以及角膜和结膜上皮感染性眼病。角膜结膜上皮疾病可由眼睛损伤、显微外科手术或硬性隐形眼镜佩戴引起。
干眼的治疗集中在通过保守方法维持至少预定体积的泪液，例如补充人造泪液滴眼剂或临时或永久地阻塞泪道，但近来随着治疗理念的扩大，干眼治疗趋向于使用促进泪液分泌的药物(即使对于轻度干眼)的有效治疗，而不是为了缓解综合症的目的而进行被动治疗。与这一趋势相一致，使用免疫抑制剂治疗干眼变得更加频繁。免疫抑制剂包括环孢霉素、西罗莫司、他克莫司及其衍生物。其中，市售的药物之一是环孢霉素A0.05％乳液型滴眼剂
Figure BDA0001271392950000021
已知其有效地治疗干眼综合征及其相关性角膜结膜上皮疾病，但同时已知引起许多副作用，并且已经报道在一些患者中最常见的异常反应是眼睛烧灼感、结膜充血、眼睛有分泌物、溢泪、眼睛疼痛、异物感、瘙痒、剧痛(sharp)、刺痛感、视力障碍(通常视力模糊)。根据作者Ji Eun Lee等人的文章，作为与0.05％环孢霉素接触10分钟的结果，观察到细胞凋亡增加且细胞活力降低，并且为了使用而不会对角膜上皮细胞有毒性作用，暴露于0.05％环孢霉素的持续时间应少于10分钟(J Korean Ophthalmol Soc 48(10):1399-1409,2007)，并且在0.05％(5μg/mL)或更多的环孢霉素下细胞存活率显著减少(Graefe'sArch Clin Exp Ophthalmol(2006)244:382-389)。
除了环孢霉素外，使用过量的免疫抑制剂还会引起副作用，例如贫血、白细胞减少症、血小板减少症和脱发。然而，与最近的趋势相一致，对于严重干眼的治疗以及即使在轻度情况下不适的临床症状，免疫抑制剂积极地用于治疗干眼。此外，通常，干眼患者具有许多药物类型和频繁的剂量，并且已知这些因素降低了药物依从性和治疗效果。
另一方面，海藻糖是二糖，其中两个葡萄糖分子在其还原性残基处连接在一起，并且具有三种光学异构体α,α-海藻糖、α,β-海藻糖和β,β-海藻糖。在自然界中，海藻糖广泛存在于细菌、植物和动物中，并且在食品工业中，由于优异的特性，例如相对低的甜度、淀粉的抗老化性和在冷冻/干燥过程中防止蛋白质降解，海藻糖具有广泛的应用范围。此外，公开号为10-2002-0021320(2002年3月20日公开)的韩国专利公开了其中含有海藻糖作为唯一活性成分的组合物对治疗
Figure BDA0001271392950000031
综合征具有效果。
然而，直到现在还没有报道关于包含两种成分(环孢霉素和海藻糖)的眼用组合物的效果，特别是对预防、减轻和进一步治疗大范围的干眼症的效果，此外，还没有关于当两种成分组合时的协同效应以及显示协同效应的重量比或重量％范围的综述。
发明内容
技术问题
本公开要解决的问题是提供一种眼用组合物，其用减少量的环孢霉素发挥出相当或优异的效果，并且对可能通过各种渠道发生并处于各种状态或条件的干眼(而不是单一疾病)具有优异的组合效果。
技术方案
为了实现该目的，本公开提供了一种含有环孢霉素和海藻糖的眼用组合物，其中两种成分以预定比例或重量％范围混合。本公开人发现，这种眼用组合物用减少量的环孢霉素发挥出相当或优异的效果，并且具有使用含有单独的环孢霉素或单独的海藻糖作为活性成分的组合物不能发挥的效果，例如，对可能通过诸如干燥空气、眼睛炎症或防腐剂的各种渠道发生并处于各种状态或条件的干眼均具有优异的效果，并且通过将其制备为环孢霉素-海藻糖复合物获得本公开。
因此，本公开提供了一种包含环孢霉素和海藻糖作为活性成分的眼用组合物、其制备方法以及使用其预防、减轻或治疗眼病(优选为干眼)的方法。
更特别地，本公开提供了一种眼用组合物，其包含环孢霉素和海藻糖作为活性成分，并且优选为一种用于预防、减轻或治疗干眼的眼用组合物。
此外，本公开提供了通过向哺乳动物(优选为人)施用包含药学有效量的环孢霉素和海藻糖的眼用组合物来预防、减轻或治疗眼病(优选为干眼)的方法。
此外，本公开提供了环孢霉素和海藻糖用于制备眼用组合物(优选为用于预防、减轻或治疗干眼的眼用组合物)的用途。
在根据本公开的眼用组合物中，当以预定比例混合两种活性成分时，产生协同效应并进一步最大化，并且环孢霉素：海藻糖的重量比优选为1：20-200、1：20-190、1：20-180、1：20-170、1：20-160、1：20-150、1：20-140、1：20-130、1：20-120、1：20-110、1：20-100、1：20-90、1：20-80、1：20-70、1：20-60、1：20-50、1：20-40、1：20-30、1：20、1：30-200、1：30-190、1：30-180、1：30-170、1：30-160、1：30-150、1：30-140、1：30-130、1：30-120、1：30-110、1：30-100、1：30-90、1：30-80、1：30-70、1：30-60、1：30-50、1：30-40、1：30、1：40-200、1：40-190、1：40-180、1：40-170、1：40-160、1：40-150、1：40-140、1：40-130、1：40-120、1：40-110、1：40-100、1：40-90、1：40-80、1：40-70、1：40-60、1：40-50、1：40、1：50-200、1：50-190、1：50-180、1：50-170、1：50-160、1：50-150。当重量比小于1：20时，不能预期对处于各种状态或条件的干眼的组合效果，当重量比超过1：200时，不可能保持滴眼剂的有效渗透压(约230～320mOsmol/kg)，并且不可能保持透明的纳米乳液。
此外，当两种活性成分以特定重量％范围混合时，产生协同效应并进一步最大化，并且基于眼用组合物的总重量，环孢霉素以大于0.01重量％存在。然而，环孢霉素优选地以小于0.1重量％存在，而当环孢霉素以大于0.1重量％存在时，存在副作用，例如灼烧感和视力模糊。优选地，基于眼用组合物的总重量，环孢霉素以大于0.01重量％且小于或等于0.05重量％、大于0.01重量％且小于0.05重量％、大于或等于0.02重量％且小于或等于0.05重量％、大于或等于0.02重量％且小于0.05重量％、大于或等于0.02重量％且小于或等于0.05重量％、大于0.01重量％且小于或等于0.04重量％、大于或等于0.02重量％且小于或等于0.04重量％、大于0.01重量％且小于或等于0.03重量％、大于或等于0.02重量％且小于或等于0.03重量％，或以0.02重量％存在。
此外，基于眼用组合物的总重量，海藻糖可以以大于或等于0.5重量％存在。例如，基于眼用组合物的总重量，海藻糖可以以0.5重量％以上、0.6重量％以上、0.7重量％以上、0.8重量％以上、0.9重量％以上、1重量％以上、1.1重量％以上、1.2重量％以上、1.3重量％以上、1.4重量％以上、1.5重量％以上、1.6重量％以上、1.7重量％以上、1.8重量％以上、1.9重量％以上、2重量％以上、2.1重量％以上、2.2重量％以上、2.3重量％以上、2.4重量％以上、2.5重量％以上、2.6重量％以上、2.7重量％以上、2.8重量％以上、2.9重量％以上、3重量％以上、3.1重量％以上、3.2重量％以上、3.3重量％以上、3.4重量％以上、3.5重量％以上、3.6重量％以上、3.7重量％以上、3.8重量％以上、3.9重量％以上、4重量％以上、4.1重量％以上、4.2重量％以上、4.3重量％以上、4.4重量％以上、4.5重量％以上、4.6重量％以上、4.7重量％以上、4.8重量％以上、4.8重量％以上、4.9重量％以上、5重量％以上、7.5重量％以下、0.5-7.5重量％、0.5-7重量％、0.5-6.5重量％、0.5-6重量％、0.5-5.5重量％、0.5-5重量％、0.5-4.5重量％、0.5-4重量％、0.5-3.5重量％、0.5-3重量％、0.6-7.5重量％、0.6-7重量％、0.6-6.5重量％、0.6-6重量％、0.6-5.5重量％、0.6-5重量％、0.6-4.5重量％、0.6-4重量％、0.6-3.5重量％、0.6-3重量％、0.7-7.5重量％、0.7-7重量％、0.7-6.5重量％、0.7-6重量％、0.7-5.5重量％、0.7-5重量％、0.7-4.5重量％、0.7-4重量％、0.7-3.5重量％、0.7-3重量％、0.8-7.5重量％、0.8-7重量％、0.8-6.5重量％、0.8-6重量％、0.8-5.5重量％、0.8-5重量％、0.8-4.5重量％、0.8-4重量％、0.8-3.5重量％、0.8-3重量％、0.9-7.5重量％、0.9-7重量％、0.9-6.5重量％、0.9-6重量％、0.9-5.5重量％、0.9-5重量％、0.9-4.5重量％、0.9-4重量％、0.9-3.5重量％、0.9-3重量％、1-7.5重量％、1-7重量％、1-6.5重量％、1-6重量％、1-5.5重量％、1-5重量％、1-4.5重量％、1-4重量％、1-3.5重量％、1-3重量％存在。当海藻糖以小于0.5重量％存在时，不能预期对处于各种状态或条件的干眼的组合效果，而当海藻糖以超过7.5重量％存在时，不可能保持滴眼剂的有效渗透压(约230～320mOsmol/kg)，并且不可能保持透明的纳米乳液。
例如，眼用组合物可以包含大于0.01重量％且小于0.1重量％的环孢霉素和0.5-7.5重量％的海藻糖、大于0.01重量％-小于0.05重量％的环孢霉素和0.5-5重量％的海藻糖、大于0.01重量％-小于0.05重量％的环孢霉素和0.5-3.5重量％的海藻糖、0.02重量％以上-小于0.05重量％的环孢霉素和0.5-5重量％的海藻糖、0.02重量％以上-小于0.05重量％的环孢霉素和0.5-3.5重量％的海藻糖、0.02重量％以上-小于0.05重量％的环孢霉素和1-3重量％的海藻糖、0.02重量％的环孢霉素和1-3重量％的海藻糖。
优选地，为了环孢霉素和海藻糖的协同效应，根据本公开的眼用组合物优选地包括在上述重量比或/和重量％范围内的环孢霉素和海藻糖。
在本公开中，在与包含单独的环孢霉素或单独的海藻糖的眼用组合物相比在所述眼用组合物中包含基于总组合物的重量％的相同％的活性成分的的前提下，术语“协同效应”可以包括相比于包含单独的环孢霉素或单独的海藻糖作为活性成分的眼用组合物关于相同疾病发挥的增强的或改善的效果、出现的由包含单独的环孢霉素或单独的海藻糖作为活性成分的眼用组合物对疾病所不能发挥的效果、或者对包含单独的环孢霉素或单独的海藻糖作为活性成分的眼用组合物所涉及的副作用或不利之处有所缓解。例如，协同效应可以包括与给药单独的环孢霉素或单独的海藻糖相比的明显增加的治疗效果、以及减轻角膜损伤、恢复泪液分泌量、减轻眼睛炎症、改善泪液质量、减轻眼睛刺激(红斑、水肿和结膜分泌物增加)、对泪膜的维持、润滑和保湿的效果、以及在所有干燥空气诱导的干眼类型、炎症诱导的干眼类型和防腐剂诱导的干眼类型中由于杯状细胞活性增加而引起的粘蛋白分泌量增加的效果，其中杯状细胞负责粘蛋白的分泌。
在本公开中，只要不妨碍本公开的目的，可以使用“环孢霉素”或“海藻糖”，而不管其制备方法和来源如何。
此外，环孢霉素可以包括环孢霉素A、环孢霉素A衍生物、环孢霉素B、环孢霉素C、环孢霉素D及其混合物作为其活性物质，并优选地可以包括环孢霉素A。海藻糖可以包括三种光学异构体作为其活性物质，即α,α-海藻糖、α,β-海藻糖、β,β-海藻糖及其混合物。
此外，在本公开中，术语“环孢霉素”或“海藻糖”定义为包括其药学上可接受的衍生物，并且所述药学上可接受的衍生物将被认为具有或提供与环孢霉素或海藻糖相同的生物学功能和/或活性，并且可以包括环孢霉素或海藻糖的前药、其溶剂合物及其共晶体，只要不妨碍本公开的目的。
术语“前药”是指以通过给药后的代谢在预定时间段内能够实验检测的量形成的环孢菌素或海藻糖。
术语“溶剂化物”是指还包括化学计量或非化学计量的量的由非共价分子力保持的溶剂的化合物。在溶剂为水的情况下，溶剂化物是水合物。
术语“共晶体”是指在晶格中包括至少一种化合物的结晶形式。共晶体包括通过非离子相互作用在晶格中保持在一起的至少两种非挥发性化合物的结晶分子复合物。在本公开中，共晶体包括药物共晶体，其是包含环孢霉素或海藻糖以及至少一种另外的非挥发性化合物(以下称为配位分子)的结晶分子复合物。在药物共晶体中，配位分子可以是无毒的药学上可接受的分子，例如食品添加剂、防腐剂、医用赋形剂或其它API。在一些实施方式中，药物共晶体改善了药物的一些物理性质(例如溶解度、溶解速率、生物利用度/稳定性)，同时不会降低API的化学结构完整度。
包括其药学上可接受的衍生物的环孢霉素和包括其药学上可接受的衍生物的海藻糖可以通过本领域已知的各种化学方法或酶法制备，或可从市售产品获得。
根据本公开的眼用组合物可以通过将活性成分、环孢霉素和海藻糖混合来制备。
根据本公开的眼用组合物可以制备为药物组合物、准药物组合物和保健食品组合物。
根据本公开的眼用组合物可以包括添加剂，例如药学上(或营养学上)可接受的载体、赋形剂或稀释剂，并且对于添加剂必须考虑到的特征包括但不限于与环孢霉素和海藻糖的相容性、生物相容性和处理温度。
根据本公开的眼用组合物可以制备为非口服制剂例如眼用溶液、眼膏、注射液和洗眼液，或口服制剂例如丸剂、胶囊剂和颗粒剂，并且优选的给药类型是眼用溶液，并且最优选的给药类型是滴眼剂。
在制备为眼用溶液的情况下，眼用溶液可以以用于眼用溶液的任何给药类型提供，例如，水性眼用溶液例如水性眼用溶液、水性乳液眼用溶液、粘稠性眼用溶液和溶解性眼用溶液；或非水性眼用溶液例如非水性眼用溶液和非水性乳液眼用溶液。
在制备为水性乳液眼用溶液的情况下，眼用溶液可以包括本领域已知的各种添加剂，例如张力调节剂、缓冲剂、稳定剂、pH调节剂、增稠剂、防腐剂、螯合剂、增溶剂和溶剂，只要不妨碍本公开的目的。缓冲剂可以选自由磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂(例如乙酸钠)氨丁三醇和氨基酸所组成的组，但不限于此。优选地，可以使用磷酸盐缓冲剂。张力调节剂可以选自由诸如山梨糖醇、葡萄糖、赤藓糖醇和甘露醇的糖、诸如甘油、聚乙二醇和聚丙二醇的多元醇以及诸如氯化钠的盐所组成的组，但不限于此。防腐剂可以选自由苯扎氯铵、苄索氯铵、诸如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲醇、苯乙醇、山梨酸及其盐、硫柳汞、聚季铵盐、苯扎溴铵(benzododecinium bromide)、氧氯复合物和氯丁醇所组成的组，但不限于此。稳定剂可以选自由环糊精及其衍生物、诸如聚(乙烯基吡咯烷酮)的水溶性聚合物以及诸如聚山梨醇酯80(吐温
Figure BDA0001271392950000081
)、聚山梨醇酯20和泰洛沙泊的表面活性剂所组成的组，但不限于此。pH调节剂可以选自由盐酸、乙酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、单乙醇胺、氨水和氢氧化铵所组成的组，但不限于此。增稠剂可以选自由羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素、聚乙烯醇、卡波姆胶、聚维酮、泊洛沙姆、聚卡波非及其盐所组成的组，但不限于此。螯合剂可以选自由依地酸钠、柠檬酸钠和缩合磷酸钠所组成的组，但不限于此。增溶剂或溶剂可以选自由甘油、DMSO、DMA、N-甲基吡咯烷酮、乙醇、苄醇、异丙醇、各种分子量的聚乙二醇或丙二醇所组成的组，但不限于此。可用于溶剂或增溶剂的物质之间可能存在一些重叠，并且任何物质都可用于溶剂和增溶剂中的任何一种，然后如果该物质作为制剂中的溶剂，则它是作为溶剂，如果该物质不作为溶剂，则将其视为增溶剂。或者，增溶剂在一些变型中可以是表面活性剂。可以使用包括各种类型的表面活性剂的表面活性剂组合物。例如，可以使用非离子、阴离子表面活性剂(即肥皂、磺酸盐)、阳离子表面活性剂(即CTAB)、两性离子表面活性剂、聚合物表面活性剂、两性表面活性剂。例如，可用的表面活性剂包括但不限于具有10、11、12、13或14或更高HLB的那些。表面活性剂的实例包括氢化植物油的聚氧乙烯产品、聚乙氧基化蓖麻油或聚乙氧基化氢化蓖麻油、聚乙二醇(polyoxyl)蓖麻油或其衍生物、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯和聚氧乙烯蓖麻油衍生物，但不限于此。根据一个具体实施方式，基于组合物的总重量，本公开的眼用组合物可以包含大于0.01重量％且小于0.1重量％的环孢霉素、0.5重量％-7.5重量％的海藻糖、1重量％-10重量％的增溶剂、0.01重量％-2溶剂的重量％、剩余量的缓冲剂和张力调节剂。
水性乳液眼用溶液可以优选地以纳米乳液型制备，并且在这种情况下，可以包括本领域已知的各种添加剂，例如油和表面活性剂，只要不妨碍本公开的目的。所述油包括选自由丙二醇单辛酸酯、丙二醇月桂酸酯、中链(C8～C10)甘油三酯、甘油-1,3-二油酸酯、单油酸甘油酯和亚油酸甘油酯所组成的组中的至少一种。表面活性剂包括选自由油酰基聚乙二醇甘油酯、亚油酰基聚乙二醇甘油酯、辛酰己酰基聚乙二醇甘油酯、聚乙二醇35蓖麻油、聚乙二醇35氢化蓖麻油、聚乙二醇40氢化蓖麻油、聚乙二醇40氢化蓖麻油、环氧乙烷与12-羟基硬脂酸的缩合产物和聚山梨醇酯80(Croda，UK)所组成的组中的至少一种。
最优选地，水性乳液眼用溶液可以制备为透明纳米乳液型滴眼剂，并且为了制备，可以参考例如注册号为10-0938500的韩国专利，但不限于此。
根据本公开的眼用组合物可用于减轻、预防或治疗眼疾病，并且优选地用于减轻、预防或治疗由干眼引起的疾病。
“由干眼引起的疾病”可以包括干燥性角膜结膜炎、角膜结膜上皮疾病、泪液分泌减少、Stevens-Johnson综合征、干眼综合症、
Figure BDA0001271392950000101
综合征、泪液不足、眼睛充血、泪膜不稳定或眼水肿；白内障手术后的过敏性结膜炎、病毒性结膜炎或干眼症；以及与隐形眼镜佩戴相关的干眼症或与VDT操作相关的干眼症。
此外，“角膜结膜上皮疾病”可以包括干眼、角膜上皮缺损、结膜上皮缺损、角膜上皮糜烂、角膜厚度减少、角膜渗透、角膜穿孔或角膜上皮脱落；角膜溃疡、角膜炎、结膜炎、浅表性点状角膜病变、干燥性角膜结膜炎、上方角膜缘角结膜炎、丝状角膜炎、角膜溃疡以及角膜和结膜上皮感染性眼病；与眼睛损伤、显微外科手术或硬性隐形眼镜佩戴相关的角膜结膜上皮疾病。
在哺乳动物，特别是人的治疗和/或预防中，根据本公开的眼用组合物的剂量通常可由在医疗行业中的工作人员或具有相关技术的人员的剂量来确定。例如，当根据本公开的组合物用作具有干眼的成年患者的滴眼剂时，包括环孢霉素和海藻糖作为活性成分的眼用组合物的优选剂量可以是例如以1～4滴(约0.025～0.1mL)每天1～10次来给药包括0.02重量％的环孢霉素和1-3重量％的海藻糖滴眼剂，但不限于此，并且在医疗行业中的工作人员或具有相关技术的人员可以不仅基于待治疗患者的年龄、体重、性别和反应而且还可以根据该治疗所预期的状况来确定最佳实际剂量。
根据本公开的眼用组合物可以填充并提供在无菌容器中，并且可以提供以关于其使用的说明书，并且说明书可以机械地附接到装有眼用组合物的容器或包装容器的第二容器，或者可以一起包装在第二容器中。
有益效果
根据本公开的含有环孢霉素和海藻糖的眼用组合物，其中两种成分以预定比例和/或预定量混合，对可能通过各种渠道(例如干燥空气诱导、炎症诱导和防腐剂诱导)产生并处于各种状态或条件的干眼可以具有优异的组合效果。更具体地，眼用组合物以减少量的环孢霉素发挥出等效或优异的效果。此外，相比于单独的环孢霉素或单独的海藻糖，眼用组合物当给药时产生明显更好的协同治疗效果，并且具有减轻角膜损伤、恢复泪液分泌量、减轻眼睛炎症、改善泪液质量、减轻眼睛刺激(红斑、水肿和结膜增加)、对泪膜的维持、润滑和保湿的效果、以及特别地，在所有干燥空气诱导的干眼类型、炎症诱导的干眼类型和防腐剂诱导的干眼类型中由于杯状细胞活性增加而引起的粘蛋白分泌量增加的效果，其中杯状细胞负责粘蛋白的分泌。
附图说明
图1示出了用复合物治疗的干燥空气诱导的干眼类型中角膜损伤抑制的变化。
图2示出了用复合物治疗的伴刀豆球蛋白A诱导的干眼类型中泪液分泌抑制的变化。
图3示出了用复合物治疗的伴刀豆球蛋白A诱导的干眼类型中角膜炎症减轻的变化。
图4示出了用复合物治疗的苯扎氯铵诱导的干眼类型中Schirmer试验变化(上)和TBUT变化(下)。
图5示出了用复合物治疗的苯扎氯铵诱导的干眼类型中杯状细胞的数量。
图6示出了用复合物治疗的苯扎氯铵诱导的干眼类型中炎症(上)和眼睛刺激程度(下)的变化。
图7示出了用复合物治疗的干眼类型中的细胞存活率。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。这些实施例旨在更详细地描述本公开，并且对于本领域技术人员显而易见的是，本公开的范围不限于这些实施例所公开的范围。
<实施例1、试验物质的制备>
根据下表1(包含不同浓度的环孢霉素A和海藻糖的组合物)中的A～J的各成分比例，通过将环孢霉素与增溶剂聚乙二醇35蓖麻油混合来将其溶解。根据各比例将甘油与pH设定为7.2的磷酸盐缓冲溶液混合，并且将溶解的环孢霉素溶液分散以制备乳液。在所制备的环孢霉素乳液溶液中，使用海藻糖和张力调节剂将渗透压调节至约300mOsmol/kg。
[表1]
Figure BDA0001271392950000121
<试验例1、干燥空气诱导的干眼类型中的治疗效果>
试验物质
在实验中使用根据上述实施例1制备的组合物A、C、D、E、F、I、J作为试验物质。
实验动物
将实验动物(来自Dae Han Bio Link Co.Ltd.(Eumseong，Chungbuk)的6周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠)放在用于大鼠的笼中，每只笼子装有四只大鼠。在将动物驯化约1周后在实验中使用。将动物实验室环境控制为温度23±2℃、相对湿度55±10％、通风频率12次/小时、照明周期12小时、照度150-300Lux。喂养来自Purina Rat
Figure BDA0001271392950000132
Biopia Co.,Ltd.(Gunpo，Gyeonggi)的实验动物的托盘固体饮食，并允许大鼠自由饮用无菌净化水。
诱导干眼和用试验物质治疗
在暴露于鼓风机风前30分钟将20μl的试验物质施用于实验动物的两只眼睛中。在施用于眼睛30分钟后，将20mg/kg的阿托品(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)给药至腹腔以抑制泪液分泌，并通过将
Figure BDA0001271392950000131
(Virbac Korea,Seoul,Korea)注射入肌肉来将动物置于麻醉下，以保持统一的姿势并控制眨眼。将麻醉后的动物固定在鼓风机前面，以将两只眼睛正视向风，并控制距离以将眼睛暴露于2米/秒风速的相对湿度为25-35％的空气中。从暴露于干燥空气的时间(0分钟)开始，在3小时内以20分钟的间隔将试验物质重复施用总共10次，施用于眼睛后，将眼睑闭合约10秒以使物质在眼睛上扩散，并然后将眼睛暴露在空气中。在实验期间，观察实验动物以防止其失去其姿势或闭眼，并频繁更正其姿势。
测量角膜损伤的程度
通过“Kim等人，(2010)Comparative effectiveness of distilled water andisotonic saline in a rat model of dry eyes.Journal of Biomedical Research 11(4):211-218”的方法评价角膜损伤的程度。将在1％平衡的盐水溶液(平衡的钠溶液)中制备的5μL荧光素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)施用于经诱导干眼并施用试验物质的动物的结膜囊，并且使用绷带将动物保持闭上眼睛1小时。将未渗透的残留染料用盐水洗涤，并将眼睛去核。在经去核的眼睛中，在钨灯下观察渗透到角膜中的荧光素的绿色荧光渗透区域(面积)，并拍摄其照片。通过使用Image J1.38×program分析照片而对荧光素渗透区域进行数值表示。为了定量渗透到角膜中的荧光素，将切除的角膜储存在钾缓冲盐水(1ml)中并洗脱24小时，并然后通过使用荧光光度计测量激发485nm、发射538nm的荧光评价绿色荧光发射水平(强度)。当荧光素的角膜渗透和发射水平高时，这意味着角膜已经失去了屏障功能，因此，随着渗透和发射水平的降低，试验物质的效果被确定为更高。
病理试验
试验结束后，使所有实验动物在二氧化碳气体下窒息死亡。将经去核的眼睛固定在Davidson溶液中7～24小时，并在10％中性福尔马林中固定至少24小时以制备组织切片，随后进行苏木精-伊红染色，并在放大倍率为×100的光学显微镜下测定角膜上皮损伤和角膜厚度。将尸体解剖时切除的结膜组织固定于10％中性福尔马林溶液中以制备组织切片，随后进行过碘酸-Schiff染色(以下称为PAS染色)，并在放大倍率为×100的光学显微镜下对含有或分泌粘蛋白样糖蛋白的杯状细胞数进行计数。
结果
根据实验条件，通过与由空调或干燥室内空气引起的干眼相似的原理诱导干眼。对于对照组，使用根据实施例1制备的组合物A治疗的组。在将对照组的荧光染色角膜的渗透区域(面积)(％)和发射水平(强度)(％)均设定为100％时，计算荧光染色角膜的渗透区域(面积)(％)和发射水平(强度)(％)作为相对值。
渗透区域(面积)(％)或发射水平(强度)(％)＝[1-(对照组-试验组)/对照组]*100
通过如下等式从角膜渗透区域(面积)(％)和发射水平(强度)(％)的平均值之和计算角膜损伤抑制(％)。
角膜损伤抑制(％)＝[(对照组-试验组)/对照组]*100
由干燥空气诱导3小时的干眼大大增加了角膜表面的荧光强度，并发现荧光物质的渗透深。结果示于图1，可以看出对应于根据本公开的复合物的组合物J的角膜损伤抑制(％)为约40％。相比之下，可以看出包括单独的环孢霉素A作为活性成分的组合物(组合物C和D)对角膜损伤治疗几乎没有作用，并且组合物D对角膜损伤具有恶化作用。而且，包含单独的海藻糖作为活性成分的组合物(组合物E、F)显示出对角膜损伤的有效作用，但与对应于根据本公开的复合物的组合物J相比显示出对角膜损伤的更低的预防效果。此外，在以环孢霉素A：海藻糖重量比为1：300的包括环孢霉素A和海藻糖两者的组合物I的情况下，对角膜损伤的预防效果低于包括单独的海藻糖的组合物的预防效果。此外，作为用根据实施例1制备的试验物质治疗由干燥空气引起的干眼的结果，可以看出，用本公开的复合物(组合物J)治疗的组的含有或分泌粘蛋白样糖蛋白的杯状细胞的数量显著增加。
<试验例2、对伴刀豆球蛋白A诱导的干眼类型的治疗效果>
试验物质
在实验中使用根据上述实施例1制备的组合物A、B、C、D、E、F、G、H、J作为试验物质。
实验动物
将实验动物(来自Samtako Bio Korea(Osan，Gyeonggi)的重量为1.8kg-2.0kg的雌性新西兰白(NZW)兔)放在用于兔子的笼子中，每个笼子内含一只兔子。在将动物驯化约1周后在实验中使用。
将动物实验室环境控制在23±2℃、相对湿度55±10％、通风频率12次/小时、照明周期12小时、和照度150-300Lux。对来自Samtako Bio Korea的兔NIH#32M的喂养托盘固体饮食，并允许兔子自由饮用无菌净化水。在开始试验前24小时检查兔子的两只眼睛，并且仅使用没有眼睛损伤(例如角膜损伤)的动物。
伴刀豆球蛋白A和用试验物质治疗
在通过将50mg/kg的
Figure BDA0001271392950000161
和6mg/kg的甲苯噻嗪注射到肌肉中而使实验动物置于麻醉下之后，使用胰岛素注射器(31规格针头)将在生理盐水溶液中以10mg/ml浓度制备的50μg伴刀豆球蛋白A(以下称为Con A)注射到两只眼睛的上眼睑的主泪腺和辅泪腺中。注射ConA24小时后，将各试验物质每天施用于眼睛3天，每天4次，并且在施用于眼睛后，将眼睑闭合约10秒，使得物质均匀地分布在眼睛上。每天进行一次一般症状观察和眼睛成像。
测定泪液分泌量(Schirmer试验)
为了评价泪液分泌量的减少，将氯化钴纸(Schirmer纸)的一侧端部放置在下眼睑的外眦处，使泪液流下以保持其湿润30秒。当泪液分泌量减少时，干眼得以加剧，因此确定试验物质的效果随着分泌量的增加而增加。将用根据实施例1制备的组合物A治疗的组用作对照组。
泪液分泌抑制(％)＝[1-(试验组-对照组)/对照组]*100
测定角膜染色和炎症程度
角膜染色和炎症程度通过“Pauly等人，(2007)New tools for the evaluationof toxic ocular surface changes in the rat.Investigative Ophthalmology&VisualScience.”的方法测定。
在将试验物质施用于眼睛后的第4天，将角膜的损伤部分用荧光素染色，并且按照以下标准对角膜上部、中部和下部各部分的荧光素染色程度进行评分，并计算每个部分的总和的平均值。
(确定标准)
0：未染色
1：稀薄染色，每个染色点彼此分开。
2：以中等密度染色，一些染色点彼此靠近。
3：密集染色，每个染色点彼此靠近。
将用根据实施例1制备的组合物A治疗的组用作对照组。通过将根据确定标准获得的每个部分(角膜的上部，中部和下部)的总和的平均值代入以下等式来计算角膜炎症缓解(％)：
角膜炎症缓解(％)＝(对照组-试验组)/对照组*100
病理检查
在给药试验物质后的第10天，进行干眼评价和眼睛刺激评价，并在二氧化碳气体下窒息杀死兔子。将在尸体解剖中切除的角膜和结膜组织在10％中性福尔马林溶液中固定以制备组织切片，随后进行PAS染色，并且在放大倍率为×100的光学显微镜下对含有或分泌粘蛋白样糖蛋白的杯状细胞数进行计数。
结果
将ConA(炎症诱导物质)给药于兔的泪腺，导致由于炎症引起的泪液分泌量减少和角膜损伤，以及眼睛炎症例如泪腺炎症。作为用根据实施例1制备的试验物质治疗Con A诱导的眼睛炎症的结果，泪液分泌抑制(％)和角膜炎症缓解(％)分别显示在图2和图3中。
与单独用环孢霉素治疗的组和单独用海藻糖治疗的组(组合物B、C、D、E、F)相比，用复合物(组合物G、H、J)治疗的组被发现显著增加泪液分泌。与干燥空气诱导的干眼类型相反，单独用海藻糖治疗的组(组合物E，F)没有显示出对由眼睛炎症引起的泪液体积减少的抑制，并且对缓解角膜炎症没有效果。此外，单独用环孢霉素治疗的组(组合物B，C，D)对缓解角膜炎症具有效果，但没有显示出对泪液体积减少的抑制。相反地，作为本公开的复合物(组合物G、H、J)的治疗结果，可以看出在炎症缓解方面存在协同效应。
而且，作为用根据实施例1制备的试验物质治疗Con A诱导的眼睛炎症的结果，可以看出在用本发明的复合物(组合物G、H、J)治疗的组中含有或分泌粘蛋白样糖蛋白的杯状细胞数量显著增加。
<试验例3、对苯扎氯铵诱导的干眼类型的治疗效果>
试验物质
在实验中使用根据上述实施例1制备的组合物A、D、J作为试验物质。
实验动物
将实验动物(来自Samtako Bio Korea(Osan，Gyeonggi)的重量为1.8-2.0kg的雌性新西兰白(NZW)兔放在用于兔子的笼子中，每个笼子内含一只兔子。在将动物驯化约1周后在实验中使用。
将动物实验室环境控制在23±2℃、相对湿度55±10％、通风频率12次/小时、照明周期12小时和照度150-300Lux。对来自Samtako Bio Korea的兔NIH#32M喂养托盘固体饮食，并允许兔子自由饮用无菌净化水。在开始试验前24小时检查兔子的两只眼睛，并且仅使用没有眼睛损伤(例如角膜损伤)的动物。
苯扎氯铵和用试验物质治疗
为了诱导干眼，每天两次(上午9点和下午9点)将100μl 0.1％苯扎氯铵(以下称为BAK)给药于结膜囊中共15天。
在给药BAK后第5天，通过检查泪液中断时间(以下称为TBUT)、泪液分泌量、荧光染色和刺激程度来确定是否干眼得以诱导，并且将经干眼诱导的兔子通过随机化分组。从给药BAK后第5天起每天两次(上午9点和下午9点)给药试验物质共10天。
每天一次观察眼睛的一般症状和异常反应。
对干眼的评价
在给药试验物质前(给药BAK后第5天)以及在给药试验物质后的5天(相当于给药BAK后第10天)和10天(对应于给药BAK后第15天)进行对干眼的评价(TBUT、泪液分泌量、荧光染色)。
对于TBUT，在裂隙灯显微镜下测量通过将以0.1％制备的5μl荧光素施加到结膜囊之后由荧光素形成的荧光层开始破裂的时间。对于TBUT，在三次测量后获得平均值。
对于泪液分泌量，将氯化钴纸(Schirmer纸)的一侧端部放置在下眼睑的外眦中，使泪液流下以保持其湿润30秒，并测量长度。
在荧光染色中，角膜损伤的程度通过根据以下标准对角膜上部、中部和下部荧光染色程度进行评分来确定，并且角膜损伤的程度通过每个部分的总分的平均值来计算。
(确定标准)
0：未染色
1：稀薄染色，每个染色点彼此分开。
2：以中等密度染色，一些染色点彼此靠近。
3：密集染色，每个染色点彼此靠近。
对眼睛刺激的评价
在给药试验物质(给药BAK后第5天)前和给药试验物质后第5天和第10天，通过如下测量红斑、水肿和结膜分泌物，来评价给药试验物质引起的眼睛病变。根据以下确定标准，对眼睛刺激结果(红斑、结膜水肿和分泌物)进行评分，并使用其平均值计算眼睛刺激(％)。基于将组合物A的平均眼睛刺激评分设定为100％，计算眼睛刺激(％)。
眼睛刺激(％)＝(组合物A刺激性-试验物质刺激性)/组合物刺激性*100
-红斑(仅睑结膜和眼结膜)
0：正常血管
1：一些血管出现明显的眼睛充血症状
2：宽范围的绯红色，不容易观察到各血管
3：苍白的猩红色
-结膜水肿
0：不肿胀
1：肿胀比正常多一点(包括瞬膜)
2：明显肿胀，伴有眼睑部分向外移动
3：眼睑肿胀样眼睛半闭
4：眼睑肿胀样眼睛闭合超过一半
-眼睛分泌物
0：无分泌物
1：少量分泌物(眼睛内角观察到的少量除外)
2：足以湿润睫毛和眼睑的量的分泌物
3：足够以湿润眼睛周围的周边区域、睫毛和眼睑的量的分泌物
病理检查
给药试验物质后第10天，进行干眼评价和眼睛刺激评价，并然后在二氧化碳气体下通过窒息杀死它们。将在尸体解剖中切除的角膜和结膜组织在10％中性福尔马林溶液中固定以制备组织切片，随后进行PAS染色，并且在放大倍率为×100的光学显微镜下对含有或分泌粘蛋白样糖蛋白的杯状细胞数进行计数。
结果
BAK是广泛用作防腐剂的材料，并用作液体滴眼剂的防腐剂，但是当过量用于眼睛时已知为引起干眼的物质。其特征在于：干眼由与ConA和干空气诱导的干眼类型不同的作用机制发生以及病变持续相对较长时间。不同于其它类型，随着症状的发展，由于泪液量增加或粘蛋白样糖蛋白分泌减少引起泪膜发生不稳定性和过早崩裂，并且角膜表面的潜在损伤伴随着眼球表面的综合因素，以促进了干眼。可以看出，与单独用环孢霉素A(组合物D)治疗的组相比，用复合物(组合物J)治疗的组显示出对由BAK诱导的过量泪液分泌的抑制(图4上图)，并且抑制泪膜崩解时间缩短。众所周知，缩短的TBUT是泪液中粘蛋白物质减少和泪液分泌量降低的结果(图4下图)。也就是说，在该实验中，预期用复合物的治疗通过抑制眼泪量的过度增加，以维持泪液渗透压，并增加粘蛋白释放量(图5)，从而导致TBUT增加(图4下图)，因此提高了泪液的质量。
此外，作为通过荧光染色检测角膜损伤程度的结果，可以看出，与单独用环孢霉素A治疗的组(组合物D)相比，用复合物(组合物J)治疗的组在治愈角膜损伤中具有显著效果(图6上图)。
此外，复合物减少了由BAK治疗引起的炎症，并且对减轻由BAK引起的眼睛刺激(结膜注射和水肿、增加的分泌物)有效(图6下图)。
<实施例2和试验例4、对干眼类型中角膜上皮细胞的作用>
试验物质
将根据上述实施例1制备的组合物A、D、E、F、G、H、I、J作为实验中的试验物质。此外，在实验中，根据实施例1制备并使用包含0.05％环孢霉素和1％或3％海藻糖的组合物。
细胞培养和治疗
将角膜上皮细胞在37℃培养基中培养，并且将具有10％胎牛血清、表皮生长因子和抗生素添加至Dulbecco's Modified Eagle's培养基(DMEM，GibcoBRL，USA)的细胞培养基以2～3天的间隔更换，并当细胞呈汇合生长时，将培养基完全除去并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理以分裂用于实验的细胞。
细胞存活率测量
为了评价干燥环境中角膜上皮细胞的细胞存活率，用PBS洗涤角膜上皮细胞一次，并与试验物质接触10分钟以除去药物，并将角膜上皮细胞置于干燥环境下15分钟。服药后，培养18～24h，并通过MTT法计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝各孔的吸光度/对照组孔的吸光度×100，每个浓度进行3次。
检测结果
将所有试验物质均暴露于角膜上皮细胞10分钟，并在干燥环境下暴露15分钟。
作为结果，与单独用海藻糖治疗的组和单独用环孢霉素治疗的组相比，用环孢霉素和海藻糖一起治疗在角膜细胞的存活率方面具有优异的结果，并且基于环孢霉素浓度显示出明确的增加趋势。(p<0.05)

Claims (9)

1.一种眼用组合物，包含环孢霉素和海藻糖作为活性成分，其中，环孢霉素：海藻糖的重量比为1：20-1：200，并且基于总组合物，所述环孢霉素以大于0.01重量％-小于或等于0.05重量％存在，所述海藻糖以0.5重量％-7.5重量％存在，并且
其中所述环孢霉素是环孢霉素A。
2.根据权利要求1所述的眼用组合物，其中，所述环孢霉素以0.02重量％-0.05重量％存在，并且所述海藻糖以1重量％-3重量％存在。
3.根据权利要求1所述的眼用组合物，其中，环孢霉素：海藻糖的所述重量比为1：50-1：150。
4.根据权利要求1所述的眼用组合物，其中，所述眼用组合物用于减轻、治疗或预防由干眼引起的疾病。
5.根据权利要求4所述的眼用组合物，其中由干眼引起的疾病选自由干燥性角膜结膜炎、角膜结膜上皮疾病、泪液分泌减少、Stevens-Johnson综合征、干眼综合征、
Figure FDA0002544308310000011
综合征、泪液不足、眼睛充血、泪膜不稳定或眼睛水肿；白内障手术后的过敏性结膜炎、病毒性结膜炎或干眼；以及与隐形眼镜佩戴相关的干眼或与视觉显示终端VDT操作相关的干眼所组成的组。
6.根据权利要求5所述的眼用组合物，其中，所述角膜结膜上皮疾病选自由干眼、角膜上皮缺损、结膜上皮缺损、角膜上皮糜烂、角膜厚度减少、角膜渗透、角膜穿孔或角膜上皮剥脱；角膜溃疡、角膜炎、结膜炎、浅表性点状角膜病变、干燥性角膜结膜炎、上方角膜缘角结膜炎、丝状角膜炎、角膜溃疡以及角膜和结膜上皮感染性眼病；眼部损伤，与显微外科手术或硬性隐形眼镜佩戴相关的角膜结膜上皮疾病所组成的组。
7.根据权利要求1所述的眼用组合物，其中，所述眼用组合物被配制成滴眼剂。
8.根据权利要求7所述的眼用组合物，其中，所述眼用组合物为透明纳米乳液型滴眼剂。
9.环孢霉素和海藻糖用于制备用于预防、减轻或治疗由干眼引起的疾病的眼用组合物的用途，
其中，环孢霉素：海藻糖的重量比为1：20-1：200，并且基于总组合物，所述环孢霉素以大于0.01重量％-小于或等于0.05重量％存在，所述海藻糖以0.5重量％-7.5重量％存在，并且
其中所述环孢霉素是环孢霉素A。
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