CN117752617A - 两亲性阳离子物质修饰的mPEG-PCL纳米颗粒在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子化合物技术领域，具体涉及两亲性阳离子物质修饰的mPEG‑PCL纳米颗粒在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。本发明要解决的技术问题是视网膜疾病的治疗中尚缺少纳米药物。本发明的技术方案是两亲性阳离子物质修饰mPEG‑PCL的纳米颗粒在制备治疗眼疾的药物中的应用。本发明纳米颗粒的具有较低的细胞毒性；可有效地抑制脉络膜新生血管的发展；也可以作为载体负载其他眼疾相关药物，实现联合用药，治疗多种眼部疾病。
Description
技术领域
本发明属于高分子化合物技术领域，具体涉及两亲性阳离子物质修饰的mPEG-PCL纳米颗粒在制备治疗视网膜疾病的药物中的应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种好发于中老年人的常见视网膜疾病，是世界范围内，尤其是经济发达地区造成视力损害乃至失明的主要原因之一。随着我国的经济发展与人民生活水平的提高，AMD的患病人数日益增长，也带来了日益增长的医疗需求。临床上，AMD分为早期(玻璃膜疣形成、视网膜色素改变)和晚期(脉络膜新生血管形成、萎缩)阶段，其中以脉络膜新生血管形成(ChoroidalNeovascularization，CNV)为特征的晚期AMD又被称为湿性AMD，相比于以萎缩为特征的晚期AMD(干性AMD)进展更快，在几个月甚至几周内视力即可能严重恶化。
湿性AMD的治疗主要针对CNV，目前最有效的手段主要是玻璃体腔内注射VEGF的抑制剂如阿柏西普、雷尼单抗等。针对干性AMD则尚无治疗手段获批。值得提出的是，抗VEGF相关制剂费用极高，需重复用药，且目前尚无明确的停药标准，无论对患者个体还是国家医保均是极大负担，因此临床上仍然对其他可供选择的治疗方案仍有较大需求。
纳米技术在各种疾病的治疗中变得越来越重要。目前纳米制剂用于治疗的形式主要是纳米颗粒，根据其所带电性主要分为以下几类：阳离子纳米颗粒、阴离子纳米颗粒以及中性纳米颗粒。通过共价连接、静电吸附或者包裹，可对纳米颗粒修饰，从而靶向性或非靶向性的对疾病进行治疗。纳米颗粒广泛作为药物的递送载体，然而其本身的电荷性质所带来的免疫原性一定程度上限制了纳米制剂的潜力。利用纳米颗粒的免疫调节作用可作为疾病治疗的新策略。
目前纳米药物的研究大部分集中在癌症治疗，然而利用纳米颗粒在视网膜疾病中的治疗少有被报道，因此纳米药物在视网膜疾病如CNV治疗中具有巨大的潜力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是视网膜疾病的治疗中尚缺少纳米药物。
本发明的技术方案是两亲性阳离子物质修饰mPEG-PCL的纳米颗粒在制备治疗眼疾的药物中的应用。
其中，所述两亲性阳离子物质为DOTAP((2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵)。
其中，mPEG-PCL中mPEG和PCL的分子量比为1︰1，mPEG-PCL的总分子量范围为4000Da～8000Da。
具体的，所述两亲性阳离子物质与mPEG-PCL的质量比为1～30︰70～99。
优选的，两亲性阳离子物质与mPEG-PCL的质量比为5︰45。
其中，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷中的至少一种。
具体的，所述水化溶液为双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水。
具体的，所述纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：将两亲性阳离子物质与mPEG-PCL溶于溶剂中，然后将溶剂蒸发，加水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即为纳米颗粒溶液，干燥即得纳米颗粒；两亲性阳离子物质与mPEG-PCL(甲氧基聚乙二醇-聚乳酸)的质量比为1～30︰70～99。
其中，上述应用中的眼疾为眼睑和泪器疾病、结膜与巩膜疾病、角膜疾病、晶状体疾病、青光眼、葡萄膜疾病、玻璃体疾病或视网膜疾病。
进一步的，所述视网膜疾病为年龄相关性黄斑变性。
特别的，所述年龄相关性黄斑变性为玻璃膜疣形成、视网膜色素改变、脉络膜新生血管形成或脉络膜新生血管萎缩等原因形成的年龄相关性黄斑变性。
进一步的，上述应用中的药物的剂型为注射剂、片剂或滴剂。
特别的，上述应用中的药物的主要成分为两亲性阳离子物质修饰mPEG-PCL的纳米颗粒。
进一步的，所述两亲性阳离子物质修饰的mPEG-PCL纳米颗粒上还负载有其他治疗眼疾的药物和/或其他药学上可接受的辅助成分。
本发明的有益效果：本发明两亲性阳离子物质修饰的mPEG-PCL纳米颗粒的平均粒径为86.48nm，平均电位为+42.57mV。在体外实验中，与金标转染材料PEI 25K相比，具有较低的细胞毒性。在体内中，建立脉络膜新生血管模型，通过玻璃体注射治疗，比较各组脉络膜新生血管以及血管渗漏情况；发现本发明纳米颗粒可以显著地减少小鼠脉络膜新生血管的生成及炎症的发生。因此，本发明纳米颗粒可应用于体外和体内治疗眼疾(尤其是CNV)。该纳米颗粒可有效地抑制脉络膜新生血管的发展，在眼科黄斑病研究及其临床应用中有很好的应用前景；为治疗脉络膜血管新生提供了一种新的思路和潜在的选择。更进一步的，本发明纳米颗粒既可以单独使用治疗CNV；也可以作为载体负载其他治疗CNV的药物，进一步提升治疗效果；还可以负载其他眼疾相关药物，实现联合用药，治疗多种眼部疾病。此外，本发明的纳米颗粒制备方法简单(自组装即可)，还可降解，安全可靠。
附图说明
图1、DOTAP结构式。
图2、mPEG-PCL结构式，x、y为正整数。
图3、纳米颗粒的粒径分布图。
图4、纳米颗粒的电位分布。
图5、制备好的DMP纳米颗粒在扫描透射电镜下观察形态学。
图6、DMP纳米颗粒与金标准转染材料PEI 25K的细胞毒性比较。
图7、对大鼠进行FFA的检查以评估新生血管。
图8、对大鼠新生血管面积的观察和统计。
具体实施方式
为了解决本发明的技术问题，本发明中所采用的两亲性阳离子物质和mPEG-PCL，利用自组装的方法制备了纳米颗粒。在本发明的一个实施例中两亲性阳离子物质选择了DOTAP。所采用的mPEG-PCL(甲氧基聚乙二醇-聚己内酯)具有两亲性、生物相容性、增加了药物在血液中的循环时间和生物利用度，持续释放和靶向传递从而增加了药效、减小了副作用。制备得到纳米颗粒具有均一的粒度，稳定的正电荷特性，具有较低的细胞毒性。
在体外实验中，发明人发现该纳米颗粒细胞毒性小，可以作为传递药物的载体。而且，发明人在实验过程中发现，该纳米颗粒在不负载药物的情况下也可以治疗CNV引发的血管渗漏。发明人分析，阳离子纳米材料特有的电荷特性可吸附炎症部位相关的炎症因子等阴电荷特性的物质(蛋白类分子)，具有抑制炎症发生的效果。进一步的，发明人通过大鼠模型实验验证了发现本发明纳米颗粒可以显著地减少小鼠脉络膜新生血管的生成及炎症的发生。以上实验结果也为本发明纳米颗粒的应用奠定了基础，既可以单独治疗CNV，也可以作为载体负载其他治疗CNV的药物，进一步提升治疗效果；还可以负载其他眼疾相关药物，实现联合用药，治疗多种眼部疾病。
以下用实施例对本发明进行进一步的具体说明。
主要试剂及其来源：
DOTAP，厂家Sigma-Aldrich，货号D6182；
mPEG-PCL，厂家西安瑞禧生物技术有限公司，分子量4000Da，R-PL1103-4K；
PEI25K，厂家Sigma-Aldrich，900743。
实施例1DMP纳米颗粒的制备方法
DMP纳米颗粒通过自组装的方法制备而成：首先将5mg DOTAP(结构式见图1)和45mg mPEG-PCL(结构式见图2)共聚物分别溶于二氯甲烷溶液中，再转入烧瓶中混匀；连接旋蒸器，将混合溶液置于60℃水浴锅中，真空条件下旋蒸45分钟，待二氯甲烷蒸发完全，在圆底烧瓶底部形成一层透明薄膜。加适量纯水水化成所需浓度，在60℃水浴锅中轻轻振荡，直到完全溶解，所得溶液即为DMP纳米颗粒水溶液，并置于4℃冰箱保存备用。
实施例2DMP纳米颗粒的粒径、电位及形貌特征研究
DMP纳米颗粒的粒径及电位：使用Zetasizer Nano ZS马尔文粒度仪(MalvernInstruments，Worcestershire，英国)对DMP纳米颗粒的粒径和电位大小进行检测，检测温度为25℃，检测前平衡2分钟。结果取3次测量的平均值。DMP纳米颗粒的平均粒径为86.48nm，平均电位为+42.57mV。纳米颗粒的粒径分布(图3)和电位分布(图4)。
DMP纳米颗粒的形貌特征通过扫描透射电子显微镜(scanning transmissionelectron microsope,STEM)来观察。用毛细管吸取部分DMP，引流于铜网上，并将铜网覆盖完全，两分钟后用滤膜吸干水分，加入一滴磷钨酸染色30秒，吸干染色液，然后将铜膜置于扫描透射电子显微镜下进行观察形态，并摄取照片。如图5所示，在扫描透射电镜下，DMP纳米颗粒是大小较为均一的球型颗粒，直径大小约86.48nm。
实施例3DMP纳米颗粒的细胞毒性检测
将DMP纳米颗粒与金标准转染材料PEI 25K的细胞毒性进行比较，通过细胞活力分析来检测，操作如下：
(1)加药前一天，取对数期生长的Muller细胞，用胰酶消化，制得细胞悬液，通过细胞计数，以4×103个细胞/孔的密度接种于96孔板，每孔加样100μL细胞悬浮液，放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中孵育24小时。
(2)以DMEM培养基为溶剂，分别配制100μL一系列浓度(0μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1200μg/mL)的DMP纳米颗粒溶液和PEI25K溶液，加入到96孔板中，每个浓度设6个复孔。加药完成后在37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中继续孵育48小时。
(3)孵育完成后，每孔加入20μL MTT试剂(5mg/mL)，将细胞放入37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中避光孵育4小时，取出细胞，在倒置显微镜下观察细胞内紫蓝色结晶紫，颜色越深细胞活力越大。
(4)最后弃掉培养基后，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，将96孔板置于摇床上振荡15分钟，振荡完成后将96孔板于酶标仪上在570nm波长处读取光吸收值(OD＝570)。
结果见图6，在Muller细胞中，PEI 25K对细胞的毒性很大，IC50<150mg/mL；而DMP纳米载体对这细胞的毒性要小很多，IC50>300mg/mL。
实施例4体内实验
(1)大鼠CNV模型建立：购买6～8周龄的雄性Brown-Norway(BN)大鼠10只，饲养于四川大学华西医院动物实验中心。使用戊巴比妥钠生理盐水溶液(2％)对大鼠进行腹腔注射(30mg/kg体重)，大鼠全身麻醉后，使用复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)进行充分散瞳。每只大鼠右眼作为建模眼：盖玻片涂人工泪液(潇莱威，羧甲基纤维素钠滴眼液)后覆盖于大鼠角膜表面，在裂隙灯下可见视盘与视网膜血管。使用532nm眼底激光机(迈达，天津迈达医学科技有限公司)，于视盘周围、距离视盘中心约3个视盘直径，均匀地在避开血管的位置分别进行5～6个点的激光处理，光斑大小50μm，能量250mw，时间100ms，裂隙灯下可见激光部位短暂起泡，提示大鼠Bruch膜破坏，可刺激CNV形成。在后续的分析中仅纳入造模成功的激光点。左眼不做处理。激光术后于大鼠双眼角膜表面应用盐酸左氧氟沙星眼用凝胶(杰奇)抗感染并保持角膜湿润，于保温毯上苏醒后放回动物实验中心维持饲养。
(2)随机分组：大鼠随机分为2组，每组5只，分别为生理盐水组和DMP治疗组。
(3)大鼠玻璃体腔内注射DMP：CNV模型建立一天后，相同麻醉方式麻醉大鼠、美多丽充分散瞳后，使用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)对大鼠眼表进行麻醉。在体式显微镜下，使用32G显微针头在大鼠右眼睑裂鼻侧、距离角巩膜缘约1mm处刺破巩膜，做预切口。汉密尔顿微量注射器吸取2μL生理盐水或DMP水溶液(10mg/mL)，从预切口向视盘方向进针，透过瞳孔见注射器针头于玻璃体腔内，缓慢推入注射器内容物，并静置20秒后，拔出针头。此时切口应无或仅有少量渗液。
(4)眼底红外照相(IR)及荧光血管造影(FFA)图像采集：使用海德堡高分辨率眼底光学相干断层扫描(HRA-OCT)进行图像采集。CNV建模后一周，大鼠全身麻醉、散瞳如前，双眼点潇莱威保持角膜湿润，在操作台上呈俯卧位，右眼对准设备镜头，首先在光斑清晰的距离下采集IR图像。准备10％浓度的荧光素钠造影剂(历设得)，按照每kg体重1mL的剂量对进行大鼠腹腔注射，注射完毕后即刻开始计时，分别在2min以内和5～10min采集FFA早期及晚期图像。FFA图像评分标准如下：0，“无渗漏”，极弱的荧光增强或斑驳状的荧光增强；1，“可疑渗漏”，有荧光增强病灶，但大小和强度不进行性增加；2，“渗漏”，强度进行性增加但大小不变的强荧光；3，“病理性明显渗漏”，大小和强度均进行性增加的强荧光。图像采集完毕后双眼补潇莱威，于保温毯上苏醒后放回动物实验中心维持饲养。
(5)脉络膜新生血管染色及采图：历设得注射24小时后，使用过量麻醉(腹腔注射戊巴比妥钠200mg/kg体重)处死大鼠，解剖获取大鼠眼球，在体式显微镜下剥离巩膜外的眼外肌、脂肪等多余结缔组织，于角巩膜缘处使用24G针头做切口，使用眼科剪沿角巩膜缘做环形切口，去除角膜、虹膜及玻璃体，并在眼科镊的辅助下小心剥离神经视网膜，仅保留视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体。该复合体浸泡于4％多聚甲醛溶液中室温固定30min。固定完成后PBS清洗3次，每次5分钟。使用含0.5％Triton-X100的PBS溶液1︰200稀释耦合FITC的内皮细胞染料Isolectin B4，于4℃避光孵育视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体过夜。次日使用PBS清洗3次，每次5分钟。转移组织至载玻片上，于体式显微镜下沿组织周围做4～6条放射状切口，避开光斑位置，使组织呈花瓣样平铺于载玻片上。在组织上滴加抗荧光淬灭封片剂，使用盖玻片进行封片，稍干燥后在盖玻片周围涂抹指甲油以进一步封存。使用Leica全电动荧光显微镜进行图像采集，LAS X进行新生血管区域量化计算。
在大鼠眼底激光建模后，经玻璃体腔内注射DMP进行治疗，在CNV形成过程中，对大鼠进行FFA的检查以评估新生血管，IR的检查以确定激光斑位置。结果见图7，在IR提示的激光斑所在位置，生理盐水对照组晚期FFA图像相比于早期FFA图像荧光素渗漏明显加重，而DMP治疗组的晚期荧光素渗漏则弱于生理盐水对照组，生理盐水对照组和DMP治疗组的荧光渗漏评分分别为2.043、1.125，DMP组评级显著低于生理盐水组(P＜0.0001)。两周后处死大鼠，对脉络膜铺片进行血管内皮染色，生理盐水对照组与DMP治疗组的新生血管面积分别为169537μm2、79700μm2，DMP治疗组显著低于生理盐水组(P＜0.05)，结果见图8。
Claims (13)
1.两亲性阳离子物质修饰的mPEG-PCL纳米颗粒在制备治疗眼疾的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述两亲性阳离子物质为DOTAP((2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵)。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述两亲性阳离子物质与mPEG-PCL的质量比为1～30︰70～99；优选的，两亲性阳离子物质与mPEG-PCL的质量比为5︰45。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述mPEG-PCL的分子量为4000Da～8000Da，mPEG-PCL中mPEG嵌段和PCL嵌段的分子量比为1︰1。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：将两亲性阳离子物质与mPEG-PCL溶于溶剂中，然后将溶剂蒸发，加水化溶液水化直到完全溶解，所得溶液即为纳米颗粒溶液，干燥即得纳米颗粒；两亲性阳离子物质与mPEG-PCL(甲氧基聚乙二醇-聚己内酯)的质量比为1～30︰70～99。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氯甲烷、乙醇、甲醇、乙醚、戊烷、乙酸乙酯、环己烷中的至少一种。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述水化溶液为双蒸水、去离子水、纯水或生理盐水。
8.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述眼疾为眼睑和泪器疾病、结膜与巩膜疾病、角膜疾病、晶状体疾病、青光眼、葡萄膜疾病、玻璃体疾病或视网膜疾病。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于：所述视网膜疾病为年龄相关性黄斑变性。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述年龄相关性黄斑变性为玻璃膜疣形成、视网膜色素改变、脉络膜新生血管形成或脉络膜新生血管萎缩等原因形成的年龄相关性黄斑变性。
11.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述药物的剂型为注射剂、片剂或滴剂。
12.根据权利要求1所述应用，其特征在于：上述应用中药物的主要成分为两亲性阳离子物质修饰mPEG-PCL的纳米颗粒。
13.根据权利要求1-12任意一项所述应用，其特征在于：所述纳米颗粒上还负载有其他治疗眼疾的药物和/或其他药学上可接受的辅助成分。
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