TR201806912T4 - Tek zincirli traıl-reseptörü agonist proteinleri. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, tek zincirli TRAIL-reseptörü agonist proteinleri ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME TEK ZINCIRLI TRAIL-RESEPTORU AGONIST PROTEINLERI Mevcut basvuru, 23 Nisan 2014'de basvurusu yapilan U. 8. Geçici Patent Basvurusu No.61 /983,152 belgesinden dogan rüçhan hakki oldugunu iddia eder.

Bulusun Alani Mevcut bulus. üç çözünür TRAIL bölgesi ve bir Fc fragmani içeren spesifik TRAIL reseptör agonist proteinleri, TRAIL reseptörü agonist proteinlerini kodlayan nükleik asit molekülleri ve bunlarin kullanimini saglar. TRAlL reseptör agonist proteinleri, esasen agrega olusurmayan ve terapötik, tanisal ve/ veya arastirma uygulamalari için uygun olanlardir.

Bulusun Arka Plani Etkin reseptör baglanmasi ve aktivasyonu için TNF süper ailesi (TNFSF) sitokinlerinin trimerizasyonunun gerekli oldugu bilinmektedir. Bununla birlikte, TNF süper ailesinin sitokinlerinin trimerik komplekslerinin, rekombinant monomerik birimlerden hazirlanmalari zordur. bilesenini, özellikle C1 q protein familyasindan veya bir kolektinden gelen bir proteini içeren rekombinant füzyon proteinlerini açiklar. Bununla birlikte, bu füzyon proteinlerinin bir dezavantaji, trimerizasyon bölgesinin genellikle genis bir moleküler agirliga sahip olmasi ve/ veya trimerizasyonun oldukça verimsiz olmasidir.

N- ucunda konumlandirilmis stabilizasyon motifleri ile stabilize edildigini tarif eder.

CD95L'de, reseptör baglanma alani trimerinin stabilizasyonunun, sitoplazmik membrana yakin konumlandirilan N- uçlu amino asit bölgelerinden kaynaklandigi düsünülmektedir. reseptör baglanma bölgesinin, N- uçlu olarak yerlestirilmis yapay oi- sarmal, sarimli sarim (lösin fermuar) motifleri ile stabilize edilebilecegini tarif eder. Bununla birlikte, polipeptit zincirlerinin birbirlerine paralel olarak, örnegin paralel veya antiparalel yönelim yönünün, tahmin edilmesinin zor oldugu bulunmustur. Ayrica, sarimli sarim fermuar motifindeki heptad tekrarlarinin optimal sayisinin belirlenmesi zordur. Ayrica, sarmal bobin yapilari, pH ve/ veya iyonik mukavemet degistirildikten sonra makromoleküler agregatlar olusturma egilimindedir.

WO 01/2527? bir hücresel reseptörün hücre disi bir Iigand baglanma bölgesine baglanan tek zincirli oligomerik polipeptitlere iliskindir, burada polipeptit en az birinin hücresel reseptörün bir Iigand baglanma bölgesine baglanabildigi en az üç reseptör baglanma yeri içerir ve bunlardan en az biri, hücresel reseptörün bir Iigand bölgesine etkili bir sekilde baglanamaz, böylece tek zincirli oligomerik polipeptitler reseptöre baglanabilme yetenegine sahiptirler, fakat reseptörü aktive edemezler. Omegin, monomerler, TNF ailesinin sitokin ligandlarindan, özellikle de TNF- d'dan türetilmistir. ligand ailesi üyelerinin monomerlerini birbirine baglayan en az iki peptit baglayici içeren tek zincirli füzyon polipeptitlerini açiklar. Bununla birlikte, son deneyler, bu tek zincirli füzyon polipeptitlerinin istenmeyen agregasyon gösterdigini göstermistir. baglayiciyi içeren tek zincirli füzyon polipeptitlerini açiklar. Tarif edilen füzyon polipeptitleri büyük oranda agrega olusturmaz. asiri kümelenmesinin toksisiteye yol açabilecegini göstermistir.

Buna göre, teknikte yüksek biyolojik aktivite, yüksek stabilite, düsük toksisite sergileyen ve verimli rekombinant üretimi saglayan yeni TRAIL reseptör agonistlerine ihtiyaç vardir.

Mevcut bulus, düsük proteolitik parçalanma, uzun yari ömür ve in vivo (es zamanli toksisite ile birlikte) olarak düsük TRAlL reseptörü asiri kümelenmesi sergileyen spesifik TRAIL reseptör agonist proteinleri saglar.

Burada tarif edilen TRAIL reseptör agonist proteinleri genel olarak asagidakileri içerir: (i) bir birinci çözünür TRAIL sitokin bölgesi; (ii) bir birinci peptit baglayici; (iii) ikinci bir çözünür TRAIL bölgesi; (iv) ikinci bir peptit baglayici; (v) üçüncü bir çözünür TRAIL bölgesi; ve (vi) bir antikor Fc fragmani.

Bu tarifnamede, asagidakileri içeren tek zincirli füzyon polipeptidi açiklanmaktadir: (i) bir birinci çözünür TRAIL bölgesi, (ii) bir birinci peptit baglayici, (iii) ikinci bir çözünür TRAIL bölgesi, (iv) bir ikinci peptit baglayici, (v) üçüncü bir çözünür TRAIL bölgesi ve (vi) bir antikor Fc fragmani. Antikor Fc fragmani (vi) birinci TRAIL bölgesine göre N uçlu (i) ve/ veya üçüncü TRAIL bölgesine (v) göre C uçlu yerlestirebilir. Mevcut bulusa göre, antikor Fc fragmani, üçüncü TRAIL bölgesine (v) göre C uçlu olarak yerlestirilmistir. Bir düzenlemede, polipeptit büyük ölçüde topaklanma egilimde degildir. Ikinci ve/ veya üçüncü çözünür TRAIL bölgesi, istege bagli olarak amino asit dizisi mutasyonlarini içeren N ucunda kisaltilmis bir bölge olabilir. Çözünür TRAIL bölgelerinden en az biri, özellikle çözünür TRAIL bölgelerinin (iii) ve (v) en az biri, insan TRAIL'in Gln120 ve Val122 amino asitleri arasinda baslayan bir N- uçlu diziye sahip bir çözünür TRAIL bölgesi olabilir ve burada Arg121, bir nötr amino asit ile, ör. Ser veya Gly ile degistirilebilir. Çözünür TRAlL bölgelerinden en az biri, özellikle çözünür TRAIL bölgelerinden (iii) ve (v) en az biri, (a) Arg121- Val122- bir çözünür TRAIL bölgesi olabilir. Çözünür TRAlL bölgesi, insan TRAIL'inin Gly281 D269 konumlarinda veya belirtilen konumlarin iki veya daha fazlasinda bir mutasyon içerir. Mevcut bulusa göre, çözünebilir TRAIL bölgesi (i), SEK lD NO: 1'e göre insan TRAIL'inin Gln ve (v), SEK ID NO: 1'e göre insan TRAIL'inin Arg121- Gly281 amino asitlerinden Birinci ve ikinci peptit baglayicilar (ii) ve (iv) bagimsiz olarak 3- 8 amino asitlik bir uzunluga, özellikle 3, 4, 5, 6, 7 veya 8 amino asit uzunluguna sahip olabilir ve tercihen stege bagli olarak glikosile edilebilen bir asparagin kalintisi içeren glisin / serin baglayicilaridir. Mevcut bulusa göre, birinci ve ikinci peptit baglayicilar (il) ve (iv), SEK lD NO: 2'ye göre amino asit dizisinden olusur. Polipeptit ek olarak, ör., SEK bölgesi içerebilir ve/ veya ek olarak, ör. bir SEK ID NO: 13'e göre, bir Strep- etiketini içeren bir tanima / saflastirma bölgesini içerebilen ve/ veya baglayabilen bir C- uçlu elemani içerir.

Mevcut bulusa göre, antikor Fc fragmani (vi), SEK ID NO: 11'in bir mentese- baglayicisi araciligiyla çözünür TRAIL bölgesine (i) ve/ veya (v) kaynastirilir. Antikor FC fragmani (vi), SEK ID NO: 10 veya 17`de gösterildigi gibi amino asit dizisinden olusabilir. Mevcut bulusa göre, antikor Fc fragmani (vi), SEK lD. NO: 10'da gösterildigi gibi amino asit dizisinden olusur. Polipeptit, SEK ID NO: 14, 15 veya 18'in amino asit dizisini içerebilir.

Burada, SEK lD NO: 19, 20 veya 21'de belirtilen amino asit dizisine sahip olan bir polipeptidi içeren TRAlL reseptörü agonisti proteini tarif edilmektedir. sahip olan bir polipeptidi içeren TRAlL reseptörü agonisti proteini de tarif edilmektedir.

Bir yönde mevcut bulus, SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip bir polipeptidi içeren bir TRAIL reseptörü agonist proteini saglar.

Baska bir yönüyle bu bulus, SEK lD NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren bir TRAIL reseptör agonist proteini saglar. Bir düzenlemede, iki polipeptid, her bir polipeptidin sistein kalintilari 513, 519 ve 522 arasinda olusan üç zincir arasi disülfid bagi araciligiyla kovalent olarak baglanir.

Bir düzenlemede, polipeptit(ler)in 168 ve 337 konumlarindaki asparagin kalintilarindan biri veya daha fazlasi N- glikosile edilir. Baska bir düzenlemede, polipeptit(ler)in 168 ve 337 konumlarindaki asparagin kalintilarinin heri ikisi de N- glikosile edilir.

Baska bir düzenlemede, polipeptit(ler), translasyon sonrasi modifiye edilir. Baska bir düzenlemede, translasyon sonrasi modifikasyon, piroglutamat için modifiye edilmis N- uçlu glutamini içerir.

Baska bir yönüyle bu bulus, bulusun bir TRAIL reseptör agonist proteinini ve bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici, seyreltici, eksipiyan ve/ veya adjuvani içeren bir farmasötik bilesim saglar. Baska bir yönüyle bu bulus, bulusun TRAIL reseptörü agonist proteinini kodlayan bir nükleik asit molekülü saglar. Baska bir yönüyle bu bulus, bulusun nükleik asit molekülünü içeren bir ifade vektörü saglar.

Baska bir yönüyle bu bulus, bulusun nükleik asit molekülünü içeren bir hücre saglar.

Baska bir düzenlemede, bulusun hücresi bir ökaryotik hücredir. Baska bir düzenlemede, bulusun hücresi bir memeli hücresidir. Baska bir düzenlemede, bulusun hücresi bir Çin Hamster Yumurtalik (CHO) hücresidir. Baska düzeneklerde hücre, CHO- DBX11, CHO- DG44, CHO- S ve CHO- K1 hücrelerinden olusan gruptan seçilir. Hücre, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK- 293, NlH- 3T3, W138, Agl4 ve hibridoma hücrelerinden olusan gruptan seçilebilir.

Baska bir yönüyle bu bulus, TRAIL ile iliskili bir hastaliga veya bozukluga sahip bir denegin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanilmak üzere, bulusun bir TRAIL reseptörü agonist proteinini saglar. TRAIL reseptörü agonisti proteini tek basina uygulanabilir. TRAIL reseptörü agonisti proteini, ayni zamanda, ikinci bir ajanin tatbik edilmesinden önce veya sonra uygulanabilir. Baska bir düzenlemede, TRAIL iliskili hastalik veya bozukluk asagidakilerden olusan gruptan seçilir: tümörler, enfeksiyöz hastaliklar, enflamatuar hastaliklar, metabolik hastaliklar, otoimmün bozukluklar, dejeneratif hastaliklar, apoptoz ile iliskili hastaliklar ve transplant redleri. Bir düzenlemede, tümörler kati tümörlerdir. Bir düzenlemede, tümörler sarkom, özofagus kanseri ve mide kanserinden olusan kanser grubundan kaynaklanir. Baska bir düzenekte tümörler, Ewing sarkomu veya fibrosarkomdan kaynaklanir. Bir baska düzenlemede, tümörler, Küçük Hücreli Disi Akciger Kanseri (NSCLC), pankreatik kanser, kolorektal kanser, gögüs kanseri, yumurtalik kanseri, bas ve boyun kanserleri ve Küçük Hücreli Akciger Kanseri'ni (SCLC) içeren gruptan kaynaklanir. Baska bir düzenlemede, tümörler lenfatik tümörlerdir. Bir düzenlemede, tümörler hematolojik tümörlerdir. Baska bir düzenekte tümörler, non- Hodgkin lenfoma, lösemi, akut lenfoblastik lösemi (ALL), akut miyeloid lösemi (AML), B hücreli lenfoma, Burkitt lenfomasi, kronik miyelositik lösemi (KML), kronik Ienfositik lösemi (CLL), ya da tüylü hücreli Iösemiden kaynaklanir. Bir baska düzenlemede, otoimmün bozukluklar romatoid hastaliklar, artritik hastaliklar veya romatoid ve artritik hastaliklardir. Baska bir düzenlemede hastalik veya rahatsizlik romatoid artrittir. Baska bir düzenlemede, dejeneratif hastalik nörodejeneratif bir hastaliktir. Baska bir düzenekte nörodejeneratif hastalik, multipl sklerozdur.

Ikinci ajan, kemoterap'otik, radyoterapötik veya biyolojik bir ajan olabilir. Ikinci ajan, Duvelisib, lbrutinib, Navitoclax ve Venetoclax'dan olusan gruptan seçilebilir. Ikinci ajan, apoptotik bir ajan olabilir. Apoptotik ikinci ajan Bortezomib, Azasitidin, Dasatinib ve Gefitinib'den olusan gruptan seçilebilir. Burada açiklanan farmasötik bilesimler, bir hastaya intravenöz veya subkutan'oz uygulama ile uygulanabilir. Açiklanan farmasötik bilesimler, bir hastaya oral, parenteral, intramüsküler, intraartiküler, intrabronsiyal, intraabdominal, intrakapsüler, intrakartilajinöz, intrakaviter, intraselyal, intraserebellar, intraserebroventriküler, intrakolik, intraservikal, intragastrik, intrahepatik, intramiyokardiyal, intraosteal, intrapelvik, intraperikardiyak, intraperitonal, intraplevral, intraprostatik, intrapulmoner, intrarektal, intrarenal, intraretinal, intraspinal, intrasinovyal, intratorasik, intrauterin, intravezikal, bolus, vajinal, rektal, bukkal, sublingual, intranazal veya transdermal uygulama yoluyla verilebilir.

Bir düzenlemede TRAlL reseptörü agonist proteini, tek bir bolus olarak uygulanir.

Baska bir düzenlemede TRAIL reseptörü agonist proteini, birkaç bölünmüs doz üzerinde uygulanabilir. TRAIL reseptörü agonisti proteini, yaklasik 0.1- 100 mg / kg'da uygulanabilir. Bir düzenlemede TRAlL reseptörü agonist proteini, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir dozajda uygulanabilir: yaklasik 0.1- 0.5, reseptorü agonist proteini, farmasötik bilesimlerde yaklasik 0.1- 100 mg / ml arasinda bulunur. Bir düzenlemede TRAIL reseptörü agonist proteini, farmas'otik bilesimlerde asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir miktarda bulunur: yaklasik 0.1- 0.5, 0.1- 1, bir miktarda TRAIL reseptörü agonisti proteini bir denege uygulanabilir. Bir hastaya profilaktik olarak etkili bir miktarda TRAlL reseptörü agonisti proteini verilebilir.

Sekillerin Açiklamasi Sekil 1 Üç TRAlL bölgesi içeren tek zincirli bir füzyon polipeptidinin alan yapisi.

Sekil 2 TRAIL'in genel yapisini temsil eden sematik resim. i i i Hücre zari, hücre içerisinde N- uçlu olarak yerlesir, 1. reseptör baglayici bölgenin (RBD) anti- paralel ß katlanmasi, 2. RBD ve hücre zarinin arayüzü, 3. proteaz bölünme yeri.

Sekil 3 Yerel TRAIL trimerin yapisini temsil eden sematik resim. Silindirik yapilar RBD'leri temsil eder. Hücre zari ile RBD'Ierin N- uçlu baglantisi.

Sekil 4 Bir TRAlL'in reseptör baglayici bölgesini içeren üç çözünür bölgenin yapisini temsil eden sematik resim. I.,II.,III. çözünür TRAIL bölgeleri.

Sekil 5 TRAlL'in RBD'sini içeren çözünür alanlarin trimerizasyonu, üç çözünür bölgenin N ve C uçlarinin bir yüzey olusturmasiyla karakterize edilir.

Sekil 6 Bir sonraki çözünür bölgenin N- ucuna olan mesafeyi kompanse etmek için daha uzun baglayicilarin gerekliligini gösteren sap bölgesinin bütününü veya bir kismini içeren, tek zincirli TRAIL'in yapisini temsil eden sematik resim.

Sekil 7 Teknikten bilinen scFv- TRAlL füzyon proteini.

Sekil 8 Teknikte bilinen Fc- TRAlL füzyon proteini.

Sekil 9A Ilave bir Fab antikor fragmani içeren tek zincirli füzyon polipeptidi.

Sekil 98. Ilave bir scFv antikor fragmani içeren tek zincirli füzyon polipeptidi.

Sekil 10 Disülfid köprüleri araciligiyla iki N- ucu ile kaynastirilmis scFc füzyon polipeptidlerinin dimerizasyonu.

Sekil 11 Disülfid köprüleri araciligiyla iki 0- ucu ile kaynastirilmis scFc füzyon polipeptidlerinin dimerizasyonu.

Sekil 12 Tek zincirli füzyon polipeptitlerinin bir baglayici ile dimerizasyonu.

Sekil 13 Bir ikinci füzyon polipeptidine veya bir scFv füzyon polipeptidine daha fazla kaynasmis ilave bir Fab antikor fragmani içeren tek zincirli füzyon polipeptidi.

Sekil 14 Iki scFab füzyon polipeptidinin disülfid köprüleri araciligiyla dimerizasyonu.

Sekil 15 Bir Fv ve/ veya Fab antikor fragmani da içeren, N- ucu ile kaynastirilmis scFc füzyon polipeptitleri.

Sekil 16 Ayrica bir Fv ve/ veya Fab antikor fragmani içeren C- uçlu olarak kaynastirilan scFc füzyon polipeptitleri.

Sekil 17A N- uçlu sinyal peptit alani ile gösterildigi gibi örnek TRAlL reseptörü agonisti proteini, SEK ID. NO: 14'de gösterilir. Olgun protein (N- uçlu sinyal peptidi alanini içermez) SEK lD NO: 19'da gösterilir.

Sekil 17B Ornek bir TRAIL reseptör agonist proteininin genel yapisini ve ek açiklama dizisini gösteren sematik resim.

Sekil 18 Bir FC bölgesi içeren TRAIL- reseptör agonistlerinin miktar tayini için ELISA'nin test kurulumu.

Sekil 19 SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren bir TRAIL reseptörü agonist proteiniinsan tümör hücre dizilerinde in vitro olarak hücre ölümünü uyarir. SKM- 1, Col0205 ya da Jurkat hücreleri, 24 saat boyunca TRAIL reseptörü agonist proteininin artan konsantrasyonlariyla tedavi edilmis ve hücre canliligi degerlendirilmistir.

Sekiller 20 (A - C) SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren bir TRAIL reseptörü agonist proteinianti- tümörijenik ajanlarla in vitro olarak sinerji olusturur. SU- DHL- 4 hücreleri, TRAIL reseptör agonist proteininin artan konsantrasyonlari ile, 24 saat boyunca belirtilen venetoclax (Sekil 20A) veya navitoclax (Sekil 208) konsantrasyonlarinin varliginda veya yoklugunda inkübeedilmistir. Alternatif olarak, (Sekil 200) NCI- H596 hücreleri, 72 saat boyunca belirtilen dosetaksel (DTX) konsantrasyonlarinin varliginda veya yoklugunda, TRAIL reseptör agonist proteininin artan konsantrasyonlari ile tedavi edilmistir. Hücre canliligi degerlendirilmis ve sinerji Bliss toplami ile belirlenmistir.

Sekil 21 SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren TRAIL reseptör agonist proteinininColo205 kolorektal karsinom ksenogreft modelinde Sekil 22 SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren TRAIL reseptör agonist proteinininSKM- 1 akut miyeloid lösemi ksenogreft modelinde Sekil 23 SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren TRAIL reseptör agonist proteinininH460LM küçük hücreli disi akciger ksenogreft modelinde tümör büyümesi üzerine etkisi.

Sekiller 24 (A - G) SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren TRAIL reseptör agonist proteinininPDX modellerinde tümör büyümesi üzerine etkisi. Elmas sekilleri, tedavi edilen TRAIL reseptörü agonisti proteini; kareler, tedavi edilmeyenler. (A) CTG- CTG- CTG- 0485 için tümör hacimleri gösterilmistir.

Bulusun Detayli Açiklamasi Mevcut bulusa göre, tek zincirli bir TRAIL reseptörü baglayici bölgesinin bir Fc bölgesine kaynastirilmasinin, iyi stabilite ile birlestirilmis yüksek biyolojik aktivite saglayan bir alti degerlikli TRAIL reseptör agonisti ile sonuçlandigi bulunmustur.

Buna göre, iki peptit baglayici ve N- uçlu ve/ veya C- uçlu bir antikor Fc fragmani tarafindan baglanmis en az üç çözünür TRAIL bölgesi içeren bir tek zincirli füzyon polipeptidi saglanir.

Tercihen, tek zincirli füzyon polipeptidi agrega olusturmaz. "Agrega olusturmayan" terimi, bir preparatin 2 % 50, tercihen 2 % 70 ve daha tercihen 2 % 90'Iik bir monomer içerigini belirtir. Monomer içeriginin agregat içerigine orani, boyut dislama kromatografisi (SEC) kullanilarak agrega olusumu miktarinin incelenmesiyle belirlenebilir. Agregasyon ile ilgili stabilite, belirli zaman araliklarinda, örnegin bir ila birkaç gün arasinda, haftalar ve aylar sonra farkli depolama kosullarinda, örnegin 4 cC veya 25 “C'de, SEC ile belirlenebilir. Füzyon pr oteini için, esasen agrega olusturmayan olarak siniflandirilmak üzere, monomer içeriginin, birkaç günlük bir zaman periyodundan sonra örnegin 10 gün sonra, daha tercihen birkaç hafta sonra örnegin 2, 3 veya 4 hafta ve en çok tercihen birkaç ay sonra örnegin 2 veya 3 ay sonra, 4 °C veya 25 °C'de depolamanin ardindan yuka rida tanimlandigi gibi olmasi tercih edilir.

Tek zincirli füzyon polipeptidi, bunlarin N- ve/ veya C uçlarida bulunabilen ek bölgeler içerebilir. Ek füzyon bölgeleri için örnekler örnegin bir proteaz bölme yerini içerebilen bir N- uçlu sinyal peptidi bölgesi veya bir tanima / saflastirma bölgesini içerebilen ve/ veya baglayabilen bir C- uçlu elemanidir. Tercih edilen bir düzenlemeye göre, füzyon polipeptidi C- ucunda bir baglayici vasitasiyla birlestirilmis bir Strep- etiketini içerir. Kisa bir serin baglayici içeren örnek bir Strep- etiketi, SEK lD NO: 13'de gösterilir.

Mevcut bulusun TRAlL reseptör agonist proteini, TRAlL'den türetilen üç çözünür bölgeyi içerir. Tercihen, bu çözünür bölgeler, bir memeli, özellikle de allelik varyantlari ve/ veya bunlarin türevlerini içeren bir insan TRAlL'den türetilir. Çözünebilir bölgeler, zar bulunan bölgeler olmaksizin reseptör baglanma alani dahil TRAlL'in hücre disi kismini içerir. TNF süper ailesinin diger proteinleri gibi TRAIL, sap- bölgesi olarak adlandirilan 15- 30 amino asitlik bir N- ucuna sahip kismi yoluyla zara baglanir. Sap bölgesi, trimerizasyona katkida bulunur ve hücre zarina belirli bir mesafe saglar. Bununla birlikte, sap bölgesi, reseptör baglanma alaninin (RBD) bir parçasi degildir.

Onemli olarak, RBD, N ve C uçlu amino asitlerin belirli bir lokalizasyonu ile karakterize edilir. Bahsedilen amino asitler hemen bitisiktir ve trimerin eksenine merkezi olarak yerlestirilmistir. RBD'nin ilk N- uçlu amino asitleri RBD'nin C- terminal amino asitleri ile bir anti- paralel beta- iplik olustururlar (Sek.2 ve 3).

Bu nedenle, hücre zari içinde sap kisminin amino asitleri araciligiyla baglanan RBD formlarinin anti- paralel beta- zinciri hücre zari ile bir ara yüz olusturur. TRAIL reseptör agonist proteininin çözünebilir TRAIL bölgelerinin, sap bölgesinden herhangi bir amino asidi bulunmayan TRAlL'in bir reseptör baglanma bölgesini içermesi oldukça tercih edilir (Sek.4 and 5). Aksi halde, çözünür bölgelerden birinin C- ucunu bir sonraki çözünür alanin N ucuna baglayan uzun bir baglayici, bir sonraki çözünür bölgenin N- ucu sap bölgesini (Sekil 6) telafi etmek için gerekli olacaktir (Sekil 6), ki u kararsizlik ve/ veya agrega olusumu ile sonuçlanabilir.

Bu gibi çözünür bölgelerin bir baska avantaji, RBD'nin N ve C ucu amino asitlerinin herhangi bir anti- ilaç antikoru için erisilebilir olmamasidir. Tercihen, tek zincirli füzyon polipeptidi, ilgili TRAIL reseptörü için en az bir fonksiyonel baglama yeri içeren düzenli bir trimerik yapi olusturabilir.

TRAIL reseptör agonist proteini, üç fonksiyonel TRAIL reseptörü baglanma bölgesi. yani TRAIL reseptörü ile kompleks olusturabilen amino asit dizileri içerir. Böylelikle, çözünür bölgeler, karsilik gelen TRAIL reseptörüne baglanabilmektedir. Bir düzenlemede, çözünür bölgelerin en az biri, reseptör aktivasyonu yetenegine sahiptir, burada apoptotik ve/ veya proliferatif aktivite etkilenebilir. Baska bir düzenlemede, çözünebilir bölgelerin bir veya daha fazlasi, reseptör aktivasyonu yetenegine sahip olmadigi için seçilir. Çözünür TRAIL bölgesi, SEK lD NO: 1'de gösterildigi gibi insan TRAIL'inden türetilebilir.1. Tercihen çözünebilir TRAlL bölgeleri, özellikle 120 amino asitlerinden 281 amino asitlerini içerir.1. Istege bagli olarak, SEK ID NO: 1'in Arg121 amino asidiyüklü olmayan bir amino asit ile örnegin Ser veya Gly ile degistirilebilir.

Tablo 1: Insan TRAIL Protein sekansi SEK ID NO sekans 1 MAMMEVQGG PSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNE LK QMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQ LRQLVRKM lLRTSEETISTVQEKQQNlSPLVRERGPQRVAAHI TGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLH LRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIY KYTSYPDPI LLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFE LKEND RlFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG Yukarida belirtildigi gibi, çözünebilir TRAlL bölgeleri, SEK ID NO: 1'de gösterildigi gibi dogal tip dizileri içerebilir. Bununla birlikte, bu Çözünebilir bölgelerin bir veya daha fazlasinda mutasyonlarin örnegin çözünebilir alanlarin baglanma özelliklerini degistiren (örnegin arttiran veya azaltan) mutasyonlarin eklenmesinin mümkün olduguna dikkat edilmelidir. Bir düzenlemede, karsilik gelen sitokin reseptör'une baglanamayan çözünür bölgeler seçilebilir. Çözünür TRAIL bölgesi (i), TRAIL'in bir mutantini veya bunun TRAIL- reseptörü 1'i (TRAILR1) ve/ veya TRAlL- reseptör'u 2'sini (TRAlLR2) baglayan ve/ veya aktive eden bir reseptör baglama bölgesini içerebilir. Mutantin baglanmasi ve/ veya Mutant herhangi bir teknikle 'üretilebilir ve teknikte uzman kisilerce bilinir, ör. van der herhangi bir yapisal mutasyon türünü, örnegin bir amino asidin sübstitüsyonu, silinmesi, çogaltilmasi ve/ veya eklenmesini içerebilir. Tercih edilen bir uygulama, ikamelerin üretilmesidir. ikame, burada tarif edildigi gibi TRAIL'in en az bir amino asidini veya bunun bir reseptör baglanma alanini etkileyebilir. Tercih edilen bir düzenlemede, ikame TRAlL'in amino asitlerinden en az birini etkileyebilir, örnegin,insan TRAlL (örnegin, SEK ID NO: 1). Bu baglamda tercih edilen ikameler, SEK ID NO: 1'in insan TRAIL'inin asagidaki amino asitlerinden en az birini etkiler: D267, D269. SEK ID NO: 1'in insan TRAlL'inin tercih edilen amino asit ikameleri, Amino asit ikameleri, TRAlL'in örnegin insan TRAlL'in, TRAILR1'e veya TRAlLR2'ye baglanmasini ve/ veya bunlardan biri 'üzerindeki aktivitesini etkileyebilir. Alternatif olarak, amino asit ikameleri, TRAIL'in örnegin insan TRAIL'in, TRAlLR1'e veya TRAILR2'ye baglanmasini ve/ veya bunlarin her ikisi 'üzerindeki aktivitesini etkileyebilir. TRAILR1 ve/ veya TRAlLR2'nin baglanmasi ve/ veya aktivitesi olumlu etkilenebilir, yani reseptör daha güçlü, daha seçici veya daha spesifik baglanabili ve/ veya daha fazla aktivasyona sahip olabilir. Alternatif olarak, TRAILR1 ve/ veya TRAILR2'nin baglanmasi ve/ veya aktivitesi olumsuz etkilenebilir, yani reseptör daha zayif, daha az seçici veya daha az spesifik baglanabilir ve/ veya daha az aktiviteye sahip olabilir veya hiç aktif olmayabilir.

Hem TRAILR1 hem de TRAILR2'nin baglanma ve/ veya aktivasyonunu etkileyen amino asit ikame(ler)i olan TRAIL mutantlarinin örnekleri örnegin MacFarlane ve dig.

Tablo 1'inde bulunabilir (yukarida) ve SEK ID NO: 1'in iki amino asit ikamesine TRAILmutantiniiçerebilir.

TRAILRl'in baglanma ve/ veya aktivasyonunu etkileyen amino asit ikame(ler)i olan TRAIL'in mutantlarinin örnekleri, örnegin MacFarlane ve dig. Tablo 1'inde bulunabilir S215D) sahip bir insan TRAIL mutantini içerebilir veya Kelley ve dig. Tablo 2'sinde TRAILR2'nin baglanma ve/ veya aktivasyonunu etkileyen amino asit ikamesi (ler) i olan TRAlL mutantlarinin örnekleri örnegin MacFarlane ve dig. Tablo 1'inde (bkz. yukarida) veya Kelley ve dig. Tablo 2'sinde(yukarida) bulunabilir ve SEK ID NO: 1'in sahip bir insan TRAIL mutantini içerebilir ya da van der Sloot ve dig. Tablo 2'sindebulunabilir (yukarida) ve tek amino asit ikamesine (D269H) sahipveya bir insan TRAIL mutantini içerebilir.

Dolayisiyla, tercih edilen bir düzenleme, burada tarif edildigi gibi bir TRAIL reseptör'L'i agonist proteini olup, burada çözün'ur bölgelerin en az biri, TRAILR1 ve/ veya TRAILR2'ye baglanan ve/ veya bunlari aktive eden bir TRAIL mutantini veya bunun bir reseptör baglama bölgesini içerir.

TRAIL uyarimli indirgenmis reseptör agregasyonu sergileyen TRAIL mutantlarinin diger örnekleri, H.

Burada tarif edildigi gibi bir TRAIL mutantini veya bir reseptör baglanma bölgesini içeren bir TRAlL reseptör agonist proteininin tercih edilen bir düzenlemesi, bilesenin (i), özellikle asagida belirtildigi gibi en az bir amino asit ikamesini içerdigi bir TRAIL reseptör agonist proteinidir.

Böyle bir amino asit ikamesi, insan TRAIL'inin asagidaki amino asit pozisyonlarindan D269H, D269R veya D269K.

Tercih edilen bir TRAIL- R2 seçici bölgesi, amino asit ikameleri Y189Q, R191K, Tercih edilen bir TRAIL- R1 seçici bölgesi, amino asit ikameleri Y189A, @1938, Bu bulusun tek zincirli füzyon molekülü, üç çözünebilir TRAIL bölgesini, yani (i), (iii) ve (v) bilesenlerini içerir. Tek zincirli bir TRAlL füzyon polipeptidinin agregasyona karsi stabilitesi, eger ikinci ve/ veya üçüncü çözünür TRAIL bölgesi, istege bagli olarak amino asit dizisi mutasyonlarini içeren bir N- uçlu kisaltilmis alan ise, artar.

Dolayisiyla, tercihen, hem ikinci hem de üçüncü çözünür TRAIL bölgesi, N- ucu bölgelerinde, tercihen çözünür TRAlL bölgesinin N- ucunun ilk bes amino asidi içinde istege bagli olarak amino asit dizisi mutasyonlarini içeren N ucu kisaltilmis bölgelerdir. Bu mutasyonlar örnegin asidik veya bazik amino asitler, nötr amino asitler, özellikle serin veya glisin ile yükün degistirilmesini içerebilir.

Buna zit olarak, birinci çözünür TRAlL bölgesinin seçimi kritik degildir. Burada, tam uzunlukta bir N- uçlu diziye sahip bir çözünür alan kullanilabilir. Bununla birlikte, ayrica, birinci çözünür TRAIL bölgesinin, N ucu kisaltilmis ve istege bagli olarak mutasyona ugramis bir diziye sahip olabilecegi de belirtilmelidir.

Mevcut bulusta, çözünebilir TRAlL bölgeleri (i), (iii) ve (v), çözünebilir insan TRAIL bölgeleridir. Birinci çözünür TRAIL bölgesi (i) dogal, kisaltilmis ve/ veya mutasyona ugramis dizilerden seçilebilir. Bu nedenle, birinci çözünür TRAlL bölgesi (i), insan TRAIL'inin Glu116 ve Val122 amino asitleri arasinda baslayabilen bir N- uçlu diziye sahiptir ve burada Arg121 bir nötr amino asit ile Örnegin Ser veya Gly ile ikame edilebilir. Ikinci ve üçüncü çözünür TRAIL alanlari (iii) ve (v), tercihen insan TRAlL'in Gln120 ve Val122 amino asitleri arasinda baslayan kisaltilmis bir N- uçlu dizisine sahiptir ve burada Arg121, baska bir amino asit ile örnegin Ser veya Gly ile ikame edilebilir.

Tercihen, çözünür TRAIL bölgelerinin (iii) ve (v) N- uçlu dizisi, asagidakilerden seçilir: (b) (Gly / Ser) 121. Çözünür TRAlL bölgesi tercihen insan TRAlL'inin Gly281 amino asidi ile son bulur.

Bazi düzenlemelerde TRAIL bölgesi, yukarida tarif edildigi gibi dahili mutasyonlar içerebilir.

TRAIL reseptör agonist proteininin bilesenleri, (ii) ve (iv), sirasiyla (i) ve (iii) veya (iii) ve (v) bilesenleri arasinda bulunan peptit baglayici elemanlardir. Esnek baglayici elemanlar 3- 8 amino asit uzunlugunda, özellikle 3, 4, 5, 6, 7 veya 8 amino asit uzunlugundadir. Baglayici elemanlar tercihen glisin / serin baglayicilardir, yani büyük ölçüde amino asitler glisin ve serinden olusan peptit baglayicilardir. Çözünebilir sitokin alaninin 8 veya G (0- ucu) ile sonlandigi durumlarda, örnegin insan TRAlL'i, baglayici 8 veya G'den sonra baslar. çözünebilir sitokin alaninin 8 veya G (N- ucu) ile basladigi durumlarda, baglayici bu 8 veya G'den önce sona erer.

Baglayici (il) ve baglayici (iv)'ün ayni uzunlukta olmasi gerekmedigine dikkat edilmelidir. Potansiyel immünojenisiteyi azaltmak için daha kisa baglayicilarin kullanilmasi tercih edilebilir. Ek olarak, daha kisa baglayicilarin, agregat olusturma egilimi azalan tek zincirli moleküllere yol açtigi ortaya çikmistir. Oysa burada açiklananlardan önemli ölçüde daha uzun olan baglayicilar, uygun olmayan agregasyon özellikleri sergileyebilir. istenirse, baglayici, bir glikosilat Asn- Xaa- Ser olusturabilen bir asparagin kalintisi içerebilir. Bazi düzenlemelerde, baglayicilardan biri örnegin baglayici (ii) veya baglayici (iv) bir glikosilasyon bölgesini içerir. Baska düzeneklerde her iki baglayici (iv), glikosilasyon bölgelerini içerir. Sc TRAlL proteinlerinin çözünürlügünü arttirmak ve/ veya potansiyel immünojenisiteyi azaltmak için, baglayici (ii) veya baglayici (iv) veya her ikisinin bir glikosilasyon yeri içermesi tercih edilebilir.

Tercih edilen baglayici dizileri, GSGSGSGS (SEK ID NO: 3), GSGSGNGS (SEK lD (SEK ID NO: 9) ve GSGS'den (SEK ID NO: 23) seçilir.

En çok tercih edilen bir düzenlemeye göre, baglayici dizilerin her biri SEK ID NO: 2'ye göre GSGSGNGS'dir. Ornek baglayici dizileri, Tablo 2'de gösterilmektedir.

Tablo 2: Ornek Baglayici sekanslar SEK ID NO: sekans (OCXJNCDUT-IÄOJN TRAIL reseptörü agonist proteini, ek olarak, birinci TRAIL bölgesi (i) ve/ veya üçüncü TRAIL bölgesine (v) göre N ucundan yerlestirilebilen bir antikor Fc fragman bölgesi içerir. Tercihen, antikor Fc fragman bölgesi, DIZI ID NO: 10'da gösterildigi gibi bir amino asit dizisi içerir veya bundan olusur. Alternatif olarak, Fc fragman bölgesi, SEK fragman bölgeleri Tablo 3'te gösterilmistir.

Tablo 3: Ornek Fc Fragman Bölgeleri SEK ID NO Sekans PAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSH EDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDW LN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTlSKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMT KN QVS LTCLVKG FYPSDIAVEWES NGQPEN NYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 17 PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMlSRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LN GKEYKCKVSNKGLPSSlEKTlSKAKGQPREPQVYTLPPS RE EMT KN QVS LTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPEN NYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK Toplam glikozit sayisi ve karbonhidratlarin üç boyutlu olarak bireysel konumu, TRAIL reseptör agonist proteinlerinin in- vivo stabilitesini etkiler. Ayrica, karbonhidrat tanima, terminal sakkaritlerin yerel yogunluguna, karbonhidrat agacinin dallanmasina ve karbonhidrat maddesinin nispi pozisyonuna baglidir. asiri kümelenmesinden kaynakli toksisiteyi önlemek için CH2- alan karbonhidratlarin tükenmesi gereklidir. Ayrica, kismen bozulmus karbonhidratlar Iektinle yönlendirilen mekanizmalar araciligiyla TRAlL reseptör agonist proteinlerinin in vivo yari ömrünü azaltir. Molekül üzerindeki toplam glikosilasyon alani sayisi azaltilarak, elde edilen bilesik bu mekanizmalara daha az erisebilir ve yari ömrü artar. Buna göre, TRAIL reseptör agonist proteinleri üzerindeki genel glikozit sayisi, CH2 glikozitlerin tükenmesiyle azaltilmis, bu da aglikosil- CH2 bölgelerini olusturan N297S esdeger mutasyonlari (AB numaralandirma sistemine göre) içeren TRAIL reseptör agonist proteinleri ile sonuçlanmistir.

Iç yüzey alanlarinda bulunan CH2- glikozitler, normal olarak "açik Fc- konformasyon geçisleri" sirasinda proteazlardan alt alani korur, burada mentese- zincir arasi disülfür baglari azaltilir ve kovalent zincirleme baglantisi bozulur. Bu, CH2- ayrismasini ve iç yüzey alaninin proteazlara maruz kalmasini saglar. Bir aglikosil- CH2 meydana getiren bir N297S esdeger mutasyonunu (AB numaralandirma sistemine göre) içeren TRAIL reseptör agonist proteinlerinin, bu nedenle, dogal tip CH2 glikosilasyonuna sahip esdeger yapilardan proteolitik olarak daha az kararli olmasi muhtemeldir. Bu, konak hücre proteazlarinin mevcut oldugu ve yapiya uzun süreli erisime sahip oldugu USP / DSP / depolama sirasinda bilesigin stabilitesini etkileyecektir. Buna göre, bazi düzenlemelerde, TRAlL reseptörü agonisti CH2 glikozitlerinden yoksundur, fakat her bir polipeptid zincirinin baglayici dizilerinde glikozitler içerir (ör. SEK ID NO: 2'ye göre GSGSGNGS). Bazi örnek uygulamalarda, TRAIL reseptörü agonisti, toplam dört glikozit için polipeptit zinciri basina iki glikozit Mevcut bulusa göre, antikor Fc fragman bölgesi bir mentese- baglayici eleman vasitasiyla kaynastirilir. Mentese baglayici eleman 10- 30 amino asit uzunlugunda, özellikle 15- 25 amino asit uzunlugunda, örnegin 22 amino asit uzunlugundadir.

Mentese baglayici eleman tercihen, burada "lg mentese bölgesi" olarak adlandirilan bir immünoglobulinin mentese bölgesi dizisini içerir. "lg mentese bölgesi" terimi, disülfid baglarinin immünoglobulinin iki agir zincirini bagladigi sistein kalintilarini içeren, dogal olarak meydana gelen bir lg mentese bölgesi dizisinin bir kismi ile dizi özdesligini veya benzerligini paylasan bir amino asit dizisini içeren herhangi bir polipeptit anlamina gelir.

Mentese bölgesinin türevleri ve analoglari mutasyonlarla elde edilebilir. Burada atifta bulunulan bir türev ya da analog bir silme, ekleme ve/ veya ikameye atfedilebilir bir ya da daha fazla amino asit dizisi farkliligina sahip olmasi haricinde, dogal tipin (ya da dogal olarak meydana gelen proteinin) tam uzunluk dizisi ile dizi özdesligini ya da benzerligini paylasan bir amino asit dizisini içeren bir polipeptittir. Bununla birlikte, mevcut bulusa göre, "mentese- baglayici" terimi, bir lg mentese bölgesi veya bunun bir türevini içeren baglayicilarla sinirli degildir, ancak biyolojik olarak aktif bir dogrulaama elde etmek için mentese- baglayici elemanin baglandigi bölgelere erismeye yetecek kadar uzun olan herhangi bir baglayicidir.

Bir bireysel TRAIL reseptör agonisti proteinindeki açik Fc- konformasyonuna sahip moleküllerin sayisi, mentese bölgesinde bulunan zincirler arasi disülfid baglarinin sayisina baglidir. Buna göre, bir düzenlemede, CH2- glikozitlerin tüketilmesinin etkisini iyilestirmek amaciyla mevcut bulusa ait TRAIL reseptör agonist proteinlerinin mentese bölgesine bir üçüncü sistein sokulmustur.

Ayrica, bulusun TRAIL reseptör agonist proteinleri ek olarak, bu bölgedeki proteolitik islemi azaltmak için bir üst mentese Iisininin bir glisine mutasyonunu içerir.

Ozellikle tercih edilen bir mentese- baglayici eleman, SEK ID NO: 11'de gösterilen amino asit dizisini içerir veya bundan olusur (Tablo 4).

TRAIL reseptörü agonisti proteini ek olarak, uygun bir konak hücrede, örnegin hücre disi sekresyonun islenmesine izin veren bir N- uçlu sinyal peptid bölgesi içerebilir.

Tercihen, N- uçlu sinyal peptit bölgesi, bir sinyal peptidaz bölünme bölgesi gibi bir proteaz bölünme bölgesi içerir ve böylece olgun proteini elde etmek için ifadeden sonra ya da ifade sirasinda çikarilabilir. Ozellikle tercih edilen bir N- uçlu sinyal peptit bölgesi, SEK lD NO: 12'de gösterildigi gibi amino asit dizisini içerir(TabIo 4).

Ayrica, TRAIL reseptör agonist proteini ek olarak, örnegin 1- 50, tercihen 10- 30 amino asitlik bir uzunluga sahip bir C- terminal elemani içerebilir, bu da bir tanima / saflastirma bölgesi, örnegin bir FLAG alani, bir Strep- etiketi veya Strep- etiket Il bölgesi ve/ veya bir poli- His bölgesi içerebilir veya bunlara baglanabilir. Ozellikle tercih edilen bir düzenlemeye göre, füzyon polipeptidi SEK ID NO: 13'de gösterildigi gibi kisa bir serin baglayici vasitasiyla C- ucuna kaynasmis bir Strep- etiketini içerir(TabIo 4).

Ornek bir mentese baglayici eleman, N- uçlu sinyal peptidi bölgesi ve kisa serin baglayici Tablo 4'de gösterilmistir.

Tablo 4: Ornek bölgeler ve baglayicilar SEK ID NO Sekans 11 GPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPC 12 METDTLLVFVLLVWVPAGNG 13 SSSSSSAWSHPQFEK GPGSSSSSSGSCDKTHTCPPC Mevcut bulusa göre, füzyon polipeptidi SEK lD NO: 2'nin peptit baglayici elemanlari tarafindan kaynastirilan üç çözünür TRAlL alani içerir. Birinci çözünür TRAIL alani (i), SEO IID NO: 1'e göre insan TRAIL'inin 120- 281 amino asitlerinden olusurçözünür TRAIL bölgeleri (iii) ve (v), SEK ID NO: 1'e göre insan TRAIL'inin Arg121- Gly281 amino asitlerinden olusur. Ek olarak, füzyon polipeptidiSEK lD NO: 11'e göre bir mentese- baglayici vasitasiyla çözünür TRAIL bölgseine (v) C- ucundan kaynasan, SEQ NO: 10'a göre bir antikor Fc fragman bölgesi içerir. Bulus sahipleri sasirtici bir sekilde bu özel füzyon polipeptidinin gelismis biyolojik aktivite sagladigi ve özellikle kararli oldugunu bulmuslardir. Bulusa ait TRAIL reseptörü agonist proteininin amino asit dizisi SEK ID. NO: 19'da gösterilir.

Ayrica füzyon polipeptidi örnegin SEK lD NO: 12'ye göre bir N- uçlu sinyal peptidi alani içerebilir. Burada tarif edilen bir TRAlL reseptörü agonist proteininin spesifik bir örnegi, SEK ID NO: 14'de gösterilir.

Füzyon polipeptidi ek olarak, SEK ID NO: 13'de gösterildigi gibi kisa bir serin baglayici vasitasiyla bulusun polipeptidine kaynasmis bir C- uçlu Strep- etiketini içerebilir. Bu düzenlemede, Fc fragmani tercihen SEK lD. NO: 10 ya da 17'de gösterilen amino asit dizisinden olusur. Ayrica Fc fragmani, örnegin SEK ID NO: 1- 217 amino asitleri dahil olmak üzere daha kisa bir PC fragmanindan olusabilir. Bir C- uçlu Strep- etiketini içeren özellikle tercih edilen füzyon polipeptidlerinin örnekleri SEK ID NO: 15 ve 18'de gösterilir.

SEK ID NO 14, 15 ve 18'de gösterildigi gibi örnek TRAlL reseptörü agonisti proteinlerinin her biribir N- uçlu sinyal peptit bölgesi içerir. Sinyal peptit bölgesi 1- 20 amino asit içerir. Her durumda, olgun protein, amino asit 21 ile baslar. Burada tarif edilen olgun örnek TRAIL reseptörü agonisti proteinleri SEK ID NO: 19, 20, 21, 26, 27, 28, 29 ve 30'da gösterilir. Yukarida tarif edilen örnek TRAlL reseptörü agonisti proteinleri Tablo 5'te gösterilmistir.

SEK ID NO: 19'da belirtilen TRAIL reseptörü agonistitoplam sayisi azalan glikosilleme alanlarina (CH2 bölgesinde N297S mutasyonu, aglikosile edilmis bir CH2 bölgesi saglar), mentese bölgesinde artan sayida zincirler arasi disülfid baglarina ve bir üst mentese Iisininin bir glisinle mutasyonuna sahiptir. Bu degisiklikler, reseptör asiri k'ümelenmesinde (es zamanli toksisite ile) bir düsüs saglar. Bazi düzenlemelerde N- uçlu glutamin, piroglutamata modifiye edilir (Liu ve dig.2011, J. molekül'ün yari ömrünü uzatirken, potansiyel bozulma ve TRAIL Tablo 5: Ornek TRAIL Reseptör Agonist Proteinleri METDTLL' “FVLLV' 4'i' "IPAGNCGRMI 'AAHITS'RGRSVTL SSPVSKNEK ALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGEUJIHEKG'F-YV VSOTVFRF OEEIKENTKNDKQMVCYI YKVTSYPDP LLMKSÂRVSÜV SKDAEYG LYS VC'GGIFELKEKDRIFVSVTNEHL CMDdEASFFGAFL'V'GGSGS GNGSQ" 'AA-llTGTR iRShTl SSPNSKNFKAI GRKINS'i's'FSSRSGH SFLSKLHLRNGELVIHEKGCYV YSC'TVFRFOEEIKENT-(NDKCMUC' YI_YKVTS VDDP LL'dKSARNgCwI 'SKDAEY'BLVS IYS SGIFELKENDR GFYYIVSC'TYFRFOEE|KE"JT(NÜKClvl'v'OVIYKYTSYpDPILJJKSA QNSC'\^i'S'(DAEYGLYE-`i VOGG :EoKENCRIFVSVTNEHLBMCHEAS (JKL) [MISRI P:- 'v' 1 "`u^.i"'.i' WSHHJPP v'i."l* ÜRCEOYS STVIVYSVW'LHOIJ'i^J'_ MGK: YKCKVS N'(ALPA9 EKTl S ESN GOPEVNVKTTPÜVLDSDSSFFLYSKLTVCKSRW "OGNJFSCS lu".HHEALFNHYTOKSLS LSPGK f:":i'." ;2 Mr.: Dizi MI: [LI ' LLU'FVLL'~."u`.'\›"~JAGNGüR'i."AAH| T IS I RGRSN T LSSPNSKNE& AJSRK VSWESSRSGHSFLSNL-iLRNGELVIFEKGFYYIYSOTYFR= QEElKENTKNûfiûMVûYIYKYTSYPDPILL*.'KSARNSCWSI\'CAEVG LVSIYQGGIFELKENDRI:Ii'SÄ'TNEFLIDNDHEASFFGAFLVGGSGS GNGSRVAAHlTGTRGRSN'l SSDNSKNFKAI CRK NS`v`i'FSSRSGH SFLSNL'ÄLRNGCLVIt-EKGFYYI'YSO'YFRFOCE KENTKNDKONVO V VKYTSYFDPILLNKSAQNSCWSKDAEVGLYS "OGG FEkKENDRI FVSVTNEPi_lD?.'D'1EASC:GAFLVGGSGSG GSRVAAHITGTRGRS NTLSSPNSKNEKALGRKIRSWESSRSGHSFLSNLI'LRNGEL'v'lHE'( GFYYlVSQTYFRFOEEIKENT'QNC'KCIIA'V'OVIYKYTSYPDPILJAKSA RNSCWSKDAEYGLYS YOGG :E_KENDR|F"."SVTNEHL CMCHEAS FF'SAFJI'ZBGF'GS358883GSCDKTI'TCF'D'C;|3›”AF3='.-LLCSGFJSVFLCPÇJ KSKDTL Ml S RT Pî'v'T*C`v^u".i'3"v' S 4 E DPEVKFN'i^a"'^-,"DG`.I'E`\ "H `ilAKvK PQE EOYSSTVRWJS'IJ'LT`i.'L HOC'iN'LNGKEYKCK'u'E N'CAL PADI E KTl îS'KAKGOPREPCVY'LPPSREEMT«NOVELTCLVKGFYÜSÜIAMEW ESNSOPEVNVKTTPDVLUSDGS;FLYSKLTWCKS?“'ÜÜGNJ'FSCS . VVHEALFNHYIOKSLSLSPGSSSSSSAWSHPC'F-&K METC'LLK~':`ii'LL`u"v`i"v'°+`sGNGQR'u"AAHlTGTRGRSNTLSSPNSKNE( A-GRK NS'ini'ESSRSÜHSFLSNL'iLRNüâLVIi-'EKGl-YYIYSQTYf-RL OEElKENTKNDKOMVOYIYKYTSYPDPILLVKSARNSC'iW'SKCAEVG LVSIYOGGIFELKENDRICVSVTNEFLIDP.'DHEASFFGAFLVGGSGS GNGSRUÄAHITGTRGRSN'LSSDVSKNEKALGRK VS'WESSRSGH SLLSNL'iLRNGL-LVH'EKGFYYIYSIIJ ' Yi-RHÇIE: E K& N 1' KNDGQNVQ V VKYTSYPDPILLNKSAQNSCWSKÜAEVGLYS VOGG FE_KENÜRI FVSVTNEHFIDP.'D~1EAS::GAFLVGGSSSGNGSRVMHITG'RGRS 4 NTLSSPNSKNEKALGQKIkSWESSRSGHSFLSNLFLRNGELVIHEI( GFY'YIVSOTYFRFOEEIKEVTKNDKCMVOVIY'KYTSYPDPILJAKSA RNSC'~^IS'(DAFYGl YS YOGG :F` KFNCRIF”."S`JTNFH1 lDMCHFAS FFGAF-'»“GGPGSSSSSSSSSCB'(ThTCPDCPAPDVAGPSVCLFPP K DKDTL Ml S RT PE'~2'TC`v^v"."C`JS 4 E DPE`JKFN`i^a"°"i."DGVEVH `MK'K PREEOYVSTYR`."'~/S'v'LT\iL?!OD'A'LhGKEYKCK\i'S`~JKGLDSSIEKTI SQRKGC'PREPCVY'LPPSREEMT ESNGOPEüNVKTTPSVLÜSDGS'r-FLYSKLTVSKSRWDQGNIFSCS OR'v'VVH-|TGTRGRSNTLSSPNSI NLFLRNGEL'~."IHEKGFYVIYSOTYFQFOEEIKEV'KNOKOMVOYIYK VTSYDC'Pl--MKSARNSCWSKDAEYGLVSIYS `"-EIFELKENDR FVS VTNE?LIDMDHEASFFGAFL'u"GGSGSGNGSR`~."AAP*lTGTRGQSVTL QSPNSKNEKAJSR'( NS'i'x'ESSRSGHssLSNLHLRNGEJJIHEKGFV V VSOTVFRFOEElKENTKNDKÜfv1'*."üYIYKY'SYÜDP|LLMKSARVS A'7L“J'GGSGSGNGSQVAA-il'BTR-SRSNTLSSF'NSKNEKALGRKINS WESSRSGHSFLSNLHLRNGELVll-'EKGFYYIYSQTYFRFOEE KENT (WDKOMVOVIVKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIVOGG FELKEN3R|F`.~'S'I."T\JE*+L DMSHEASFFGACL“.IGGPGSSSSSSSGS VISHE'Iî'FP`~"K:'N"i'\'Y\ 'I.I|(_`›'~'I-VHNAI(TK›°Ri-E- UV: SSTVRK"'\'S`~.'I wi F ODWLNGKEYKCKVSNKÂLPAPIEKTISMKGCPREPÜVY*LPpSRE EV'TKNCNSLTCL"."- GSFFLYSK-T`|."DKSR'U`JOOG`WFSCS'V'IVHEALHNHYTC `KSLSL SPG QR'»“MFITGTRGRSNTL$PNS(NE(AL GRKI NS'i“i'ESSRSG"fS:LS NLFLRNGEL"."lHEKGFYVIYSQTYFRFCEEIKEVTKNOKOPvî'v"C'YlYK VTSYDZ'JIPI. . lv1KSARNSC'\\'SKUAFYG IVSIYTJ GGIFFI KFNDR FVS VThEHJDMDHEASFFGAFLVGGSGS GNGS RU'AAHITGTRGRS `N'L SSPNSKNEKALGR( NS“ ':SSRSGHS :LSNLHLQNGELVIHEKGFV V VSOTVFRFOEEIKENTKNÇJ'KOIv1`."C'YIYKY' &YUS'PlLJuRî-SARNS CWSKDAEYGLYSIYOG GIFELÄEN DR F\'S HifTVEi-LIDE C'HE ASFFG A:L`."GGSGSGNGSR`v'AA-1|'GTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINS (NDKOMVOVIVKYTSYPDPILLMK ARNSC' f`ISKDAEYGiLYSIVûGG FELKENSRIF`."S`IJT\JE°-+L DMCIHERSFFGA: L`."C›GPGSSS 888808 CEMTHTCPF'CF'ADELLGGPQJCL:PPKPKDTLP.'ISRTPE'I."TC'v"“.i".^'D VSHEC'PE`v'K5N"i'JY`ii'DGM'EVHNAKTKDREEOVSSTVWvN'S' . "`LT›' Lf- QUWLVGKEYKCKVSNKÂLPÂPIEKI ISIQAKGCFREl-'C'v'Y ' LP PSRE E`i'TKNOVSLTÇL'5"'(GFVF'SDIAVEWESNGÜPENNYKTTPDVLÜSÜ QSFFLYSK_T`~JDKSQM`IOQG`1`u"FSCS"."fu1°-+EALHNHYTCKSLSLSPG SSSSSSA'i“J'SHPO=EK QRVAAFI T G I RLSRSN ' LSSPNSKVEKALGRM NSWESSRSG4SLLS NLF'LRN4GEL"."|HEKGFYVIYSCITYFRFC'EEIKENTKNDKOMVCIYIYK VTSYDS'PI..-MKSARNSCWSKDAEYGLVSIYQGGIFELKENDR FVS VThEHJDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSR'I."AAHITGTRGRSNTL SSPNSKNFKK GR( NS'A'FSSRSGHSH SNl *il QNGE VIHFKGFV V VSC'TVFRFQEEIKENTKNS'KO'V'I'J'C'YIY*(szYDDPIL_r'J1KSARNS FELKENDNFVS'V'TVE-*L DMC'HEASFFGAFLVGGDGSSSSSSSGS CEMTHTCPPCFAPD'I."AGPS`U'FLFPPK`9KD`LMISRTPEM'TCZ'WVM'D'J S"IEDPEVKFN'i'u'\r^u"DG'*."E`v'OHNA'(TKD?EEOYNSTYR\"`I."S`v“L"v"L'-iC S:FLYSv(_T"."DKSRWQOGNVFSC8'»"MHEA_'-HNHY'QKSLS_SFGK C.)R'v"N\f*ITGTRGRSNTLKwPNSKN[KALGRKINS'iW'ESS-RSG'ßrLS VTSYQDPI_Jv1KS-ARNSC\'USKDAEYGLVSIYÜGGIFELKENDR FVS UThEH.IÜMDHEASFFG›`~FL'»"GGSGSGNGSR“.UXAHlTGTRGQSVTL SSPNSKNEKA..GRKL NSWESSRSGHS:LSNLHLQNGEJJIHEKGFV V VSOTVFRFOEEIKENTKNJKSlvW'OYIYKY'SYDDPlLJ'AKSARNS CWSKDAEYGLYSIYQGGlF-ELKENZJIR F-*e'SVI NH'LIDIIAZIIIEASF-F-G A:L"i"'~'3(3SGSGNGSQ'v'AA'iIvGTRSRSNTLSSPNSKNEKÄLGRKINS (NDKOMXI'OVIVKYTSY'P['PlLLMKSARNSCWSKDAEYGL'YSIVOGG FELKENDWF`."S`I.'“T`~JE'-+L DMCIHEASFFGAFLVGGDGSSSSSSGSD KTFTCPP C`,PAP~'1"'\."i\3~.(3PS'VFLFF"PKP'üVLhAISRTFH'E".i Ch"'v"`v'D'u"Sf* FII'PF`.1'KFN`v'i'Y\I'DO`u'FVHNAKTKPRFFQYNSTYQ'U'VSM'K TVl HOT.' TKNOVSLTCLVKGFYPSS A`."E'i'i'ESNGC|F-`ENNYKTTPPVLSSDGSF F: LYSKL'VDKSRWOOGNUFSCSVMH EALHVHVTÜKS-SLSDGSSS SSSAWSHPOF E K Titi." _I NU Dizi OR'JAAPI T GI RGRSN ' LSSPNSÄVEKÂLGH'( NS'~“J'I:SSRSG*18LLS NLFLRNSELVIHEKGFYVIYSOTYFQFOEEIKEVTKNDKOMVC'YlYK VTSYPDPlevîKSARNSCWSKDAEYGLVSIYQGGIFELKENDR FVS SSPNSKNEKAJSR'( NSWESSRSGHSzLSNL%LQNGEL'JIHEKGFV V VSOTVFRFOEEIKCNTKNC'KOfvî`l."C'YIYKY'SYDDPILLMKSÄRNS C'WSKDAEYGLYSIYOGGlFELKENC'R FVSVTVEFLlDf'AC'HEASFFS ACL`."GGSGSR`."AAHITGTRGQSNT..SSF'NSKNEKALGRKINEI'J'JESS 57 RSGHSF-SNLH-RNGEL\~` "1EKGFYYIVSOTY'TRFOEEIKENTKNDK QR'TVCYIYKVTSVPDP LLMKSARNSCV-'SKDAEYGLYSIYQGGIFELK ENDRIFVSVTNEHJDVDHEAS'TFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKT *QTCPPÇPAPELLGGF3`-":LFPDKPKDTLVlSRTDE`v"TC\"".""." "."SHE DP EV KF' ?x 'IÜ'YE'DG'U'CN' '1 NAKT (PR EEOVSSTVR“J`~."S'u"L"v"L r' C'D'N _ NGKEYKCKVSNKA_PAP|îKTISKA'(GOPREQO'I."YT`_FPSREEMTK VSKLTVD(SRW'OQGVVFSCSVMHEALHNHVTÜKSLSLSPGSSSSS QR'v'MHTGTRGRSNTL$pNS NLFLRNGELVIHEKGFYVIYSOTYFRFGEEIKENTKNUKÜN1'»"CIYIYK VTSYDC'P|..-MKSARNSCWSKDÂEYGLVSYC `G|FELKENDR FVS DVSKNEKALGRK i`lS'n"`i'ES~SRSG"iSFLSNL*-+LR?\U_`~›E_'V'lHE'\'GF"""'IY S'IJTYF-RF-'C-Jizf: KENIKVD'(C!P.1`.I'C_JYIVKYTSYPDPILLMKSARNSC'LN SKDAEVG_YSIYOGGISE-KENDRIPU'SVTNEHLlîifv13'HEASFF'13A:L 39 VGSSGSGSRVAAH TG'RGQSNT, SSPNSKNFKAl 'SRKINS'V'JFSS RSGHSF_SNLH_RNGELN "1EKGFYYIVSOTYSRFOEElKEhTKNDK Oh'î'u'CYIYKVTSVPDP LLMKSARNSCVJSKDAEYGLYSIYOGGIFELK ENDRIFVSVTNEHJDVDHEASCFGAFLVSGPGSSSSSSSGSCDKT HTCPPCPAPFl I SGPSVFI FPPKPKDTl MISRTDF'v"TC\I".""."Ü\"SHF DPEVKP&'o'\'Y"u"DG`u"E"v'HNAKTÄPREEOVSSTVR`.!"I."SVL"VLhC'DW'..

NGKEYKC "JSNKALPAPIîKTISKAKGOPREDO'M'YThppsîîEEMTK NCVSLvCL'uMGFYPSDIAVEW'ESNGQPENNIYKTTPPVL `ISDGSFFL VSKLT"J'UvâSR'iûi'QlÇ-JG`JVF-SSSVMH&ALHNHVTOKS..SLSPGSSSSS - Si'Üi's'SHpOFEK VLFLRNSELVIHEKGFYVIYSOTYFQFOEEIKEV'KNDKOMVOYWK VTSYDS'Pl._LMKSARNSC`\'\'SKDAEYGL"'SIYQGGIFELKENDR FVS VTYNEH-IDMDHEASFFGÂFLVGGSGSGNGSR'~."AAH|TGTRGRSNTL SSPNSKNEKAJSRI( NSWESSRSGHS:LSNL~iLRNGE-VIHEKGFV V "SÜTVFRFOEEIKENTKNZ'KQ!vWOYIYKY'SYDDPlL-M ACLM'GGSGS VAAHlTG'RGQSNT..SSF'NSKNEKALGRKIhSü'i'ESS RSGHSF_SN_H_RI\GEL\I "iEKGFYYIVSC'TYzRFOEEIKEhTKNDK QM'i/CYIYKYTSVPDP L_LMKSARNSCWSKC'ÂEYGLYSIYQGGIFELK ENDRIF`u'S"."T1\EH-|D`.'DH EASzFGÄFLVGGPGSSSSSSSGSCDKT i4TCF'PCPNF'ELLGGFEW:LF:F'33KF~`-'KDTDJISRT:JE'sfTC"i".i'\."IIJ`."SI>IE NGKI-YKCKVSNKA. ?API-KTlSKA-(GûpRf-”CWYT . FPSRE-Huîl K NC`v'SLTCLVKGFYPSDINICWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFL ORVNKF'ITGTRGRSNTLKJPNSKN[KALGRKINS`i^IESSRSGHSrLS NU-'LRNSELWHEKGFYVIYSÜTYFQFQEEIKEN'KNDKQMVOYWK VTSY°3PLLIV1KSARNSC"s'SKDAEYGLVSIYCGGIFELKENDR FVS VTNEHJDMDHEASFFGAFLVGGSGSGS 'v'AAhiVGTQGRSNTLSS DNSKNEKALGRK "JS'L"i'ESSRSG"1SCLSVLHLRNGELVIHEKGFVVIY SCJTYFRFQFF KFNTKND(Qh.î\i'QYlVKYTSYPDPIl l MKSARNSC'W S RSGHSF. SN- H- RhGFI `v **FKGFYYlVSEJTYCRFüî-FIKFNTKNDK OP.4`I."CYIYKYTSVPDP LLMKSARNSCWSKS'AEYGLYSIYCGGIFELK EVURIF'v'SVTPNEH_IDVDHEAS:FGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKP KDTLMISRTDEVTC v"."`."D`.v'SHE NCVSLTCLVKGFYPSE'IA`.I'E'i'\"ESNGOPENVYKTTPFVL DSDGSFFL VSKLTVD&SRWOOGNVFSCSVMI'iEALIlMiVT'L-JKSLSLSPGK Mevcut bulusun bir baska yönü, bulusun bir TRAIL reseptörü agonist proteinini kodlayan bir nükleik asit molekülü ile ilgilidir. Nükleik asit molekülü bir DNA molekülü, Örnegin çift iplikli veya tek iplikli bir DNA molekülü veya bir RNA molekülü olabilir.

Nükleik asit molekülü, TRAlL reseptörü agonist proteinini veya bunun bir öncüsünü, örnegin tercihen TRAlL reseptör agonist proteininin N- ve/ veya 0- ucunda konumlandirilmis olan bir sinyal dizisi veya sekresyon veya saflastirma için bir baska heterolog amino asit kisimlarini içerebilen bir TRAIL reseptör agonist proteinin pro- veya pre- proformunu kodlayabilir. Heterolog amino asit kisimlari, bir proteaz bölünme bölgesi araciligiyla birinci ve/ veya ikinci alana, örnegin bir Faktör X3, trombin veya IgA proteaz bölünme bölgesine baglanabilir. Burada tarif edilen bir nükleik asit dizisinin spesifik bir örnegi, Tablo 6'da SEK ID NO: 16 olarak gösterilir.

Bu nükleik asit molekülü, SEK ID NO: 14'ün füzyon polipeptidini kodlar.

Tablo 6: Ornek TRAIL Reseptör Agonist Proteininin Nükleik Asit Dizisi gala ni“ 109033023: gg aaascgai: ::ac ;Ltgrtgqlgtmgtgigi tcgîgtgggtgc: cggijaatgjacagaaagtovccg"tcatn'i"accagU cccr'gggcagaîctaacaicc sunulmus:::ixzaa::lcziaagaaczqagaagg::i:(::ggqczr.:ggaagalezaacîizctgggagl 1i::;igdl;i.3qr:: ;aiî.:1C;111i::'.q Cizaaic :tig;ai:.i::tgagaaacggiigagctgg[tatsiz-.3 rzgagaagggixtîrzta::taraltin-ir:.r:r:i::.'-ig'd~:3z:tairî"Haggtftrtaggaagagalrzaa;-igag aacacaaagaaizigacaagcagaggtgizagta atstac. Jagtai: 3:: cIizi:: ama:: gam:: catcctgctgatgaagir:rzgCmtggaaçttcctgctggtc.Cz-Laggaîgclgagtacggccîgtac aeg atcîaccagggcggcatc 110: agutgaaagamdco Cgat cttcgtglcc gtgac; gggaatutagcagaagugqma::agctnulgi-'igcaaicztgcalutgiriggaacggugaama gtgaîtcat3.39335]gggtmattaîatizîatagccagacatactttcgattizçagjgaiggaiaaîca aggaaaackicztzaaaaaîgata'di-i::agalgglutzagtatzatllz-ilaagtalaciu'dgtrt ::izctg aaîgagciatmcaîtgaîatggatcatga&chagtîtcücggggiiattcctizgtgggaggctûzg gtzli:lggiztaat:ggaltzîn'gaglizgizcgi:;+::'rii::'ri'.c:a(:agggmzcagaggizag.3agi:::-i.3tz«i ugaa eiaaggaltllaizîaizatlîa Lzagîi:;.:-iga alti-1d!!L:gll11t.;~igg &iagagdltaaggeida at . i~ir1rtaaa.=iai:gai:î.'-iagzzagaiggîtcragtar'alrzîala 'data ::aizziz'l::l1;«ilr:rt'._gai::-::i:a aîtrtt gcicatgaag agtgsccgcaaC' gctg:t-ggtctaaag-:iogozgaatacgggctgîattccan tamaas-;iggggaalltttgagctga ;ggaaaalgatcggatllllgtclclgiciairiaaazgaaca cctcatcgatatggatcacgaaigccmmcmggcg ccttcctggtqggaggCCiizlggctcgagt co: ::gaagtgacctgcgtggtgg'ggatgtglirztcairg.:aggaccctgaagtgaagllsaattg gtacglggacqgcgtggaa-;iîgüasa acgoiiaagsaiizcaagccriaç;agaçsgaatagîactß izîi:cai::tacizgggîggtgtiztglg:tgacizgtg:tgizaiziaaggacvtggctgBacggcaaaga gtacaagtgcaaggîglccaa-îaagg :cctg :algi::cnrzalcgaaaagacrtatntncaagg Ucaagaz-icmgglgtrzm"!gartntgm7.!ggtcaagggnttltaiîr oslsngair'attgncglgga atggga-gIccaacggccagcctg;gaacaa:tacaagaciçaDÜSCCCCîgtgctgga ctcc gtqnclcctgcim-gta atgcacgagp;i:::Ezgü-acaacciaiiîacasccagaagtucctgliizsct Nükleik asit molekülü, bir ifade kontrol dizisine örnegin istenen bir konakçi hücrede nükleik asit molekülünün ifadesine izin veren bir ifade kontrol dizisine islevsel olarak baglanabilir. Nükleik asit molekülü bir vektör örnegin bir plazmid, bir bakteriyofaj, bir viral vektör, bir kromozomal entegrasyon vektörü, vb. üzerinde bulunabilir. Uygun ifade kontrol dizilerinin ve vektörlerinin örnekleri, örnegin, Sambrook ve dig. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, veAusubel ve dig. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons veya daha yeni baskilari tarafindan açiklanir. Mevcut bulusun TRAIL reseptör agonist proteinlerini kodlayan nükleik asit dizilerini ifade etmek için çesitli ifade vektörü / konakçi hücre sistemleri kullanilabilir. Uygun konakçi hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, bakteriler gibi prokaryotik hücreleri, örnegin E. coli, maya hücreleri, böcek hücreleri, bitki hücreleri veya hayvan hücreleri, tercihen memeli hücreleri ve daha tercihen insan hücreleri gibi ökaryotik konakçi hücreleri içerir. Ayrica tarif edilen, yukarida tarif edildigi gibi bir nükleik asit molekülü ile transforme edilen veya transfekte edilen insan disi bir organizmadir. Bu tür transgenik organizmalar, homolog rekombinasyon dahil olmak üzere bilinen genetik transfer yöntemleri ile üretilebilir.

Mevcut bulusun bir baska yönü, etken madde olarak bu bulusun en az bir TRAIL reseptör agonist proteinini, bunu kodlayan ilgili bir nükleik asidi veya bu bulusun transforme veya transfekte edilmis bir hücresini içeren farmasötik veya diagnostik bir bilesim ile ilgilidir.

Burada kullanildigi sekliyle “TRAIL iliskili hastalik veya bozukluk" terimi, bir TRAIL reseptörü agonistinin eklenmesiyle iyilestirilebilen herhangi bir hastalik veya rahatsizliktir. En az bir TRAIL reseptör agonist proteini, bunu kodlayan ilgili nükleik asit veya dönüstürülmüs veya transfekte edilmis hücrenin tümü burada açiklandigi gibi terapide, örnegin TRAlL'in disfonksiyonu ile baglantili ve/ veya eslik ettigi, özellikle de tümör gibi proliferatif rahatsizliklarin neden oldugu bozukluklarin profilaksisinde ve/ veya tedavisinde, örnegin kati veya lenfatik tümörler; bulasici hastaliklar; enflamatuar hastaliklar; metabolik hastaliklar; otoimmün bozukluklar, örnegin romatoid ve/ veya artritik hastaliklar; dejeneratif hastaliklar, örnegin multipl skleroz gibi nörodejeneratif hastaliklar; apoptoz ile iliskili hastaliklar veya transplant reddinde kullanilabilir.

Burada kullanildigi sekliyle "TRAlL'in islev bozuklugu" terimi, TRAlL'in normal islevinden veya ifadesinden sapan TRAlL'in herhangi bir islevi veya ifadesi, örnegin TRAIL geninin veya proteininin asiri ifadesi, TRAIL geninin veya proteininin ifadesinin TRAlL'in normal fizyolojik ifade seviyesine azalmasi veya ortadan kalkmasi, TRAlL'in artmis aktivitesi, TRAlL'in azalan veya ortadan kalkan aktivitesi, TRAlL'in normal fizyolojik aktivitesi veya baglanmasi ile karsilastirildiginda TRAlL'in herhangi bir baglanma partnerine, örnegin bir reseptöre, özellikle bir TRAIL reseptörüne veya bir baska sitokin molekülüne artan baglanmasi, herhangi bir baglanma partnerine, örnegin bir reseptöre, özellikle bir TRAIL reseptörüne veya bir baska sitokin molekülüne azalan veya ortadan kalkan baglanmasi olarak anlasilacaktir.

Burada tarif edilen ve TRAIL reseptörlerinin hedeflenmesi yoluyla teshis edilebilen ve/ veya tedavi edilebilen bir hastaligin teshisi ve/ veya tedavisi için insan vücuduna burada açiklanan TRAlL reseptör agonist proteininin uygulanmasini içeren bir yöntem sunulur, öyle ki insan denekte hedef veya hedeflerin aktivitesi agonistiktir, bir veya daha fazla semptom hafifletilir ve/ veya tedavi saglanir. Burada saglanan TRAIL reseptör agonist proteinleri, gögüs, kolon, rektum, akciger karsinomlari (örnegin küçük hücreli akciger kanseri "SCLC" ve küçük hücreli disi akciger kanseri kesesi ve safra yollari, ince bagirsak, idrar yolu (böbrek, mesane ve ürotelyum dahil), kadin genital yolu (serviks, uterus ve yumurtaliklarin yani sira koriokarsinom ve gestasyonel trofoblastik hastalik dahil), erkek genital yolu (prostat, seminal veziküller, testis ve germ hücre tümörleri dahil), endokrin bezleri (tiroid, adrenal ve hipofiz bezleri dahil) ve deri ve bunlarin yani sira hemanjiyomlar, melanomlar, sarkomlar (kemik ve yumusak dokularin yani sira kaposi sarkomundan kaynaklananlar dahil), beyin, sinir, göz ve meninks (astrositomlar, gliomalar, glioblastomalar, retinoblastomalar, nöromlar, nöroblastomlar, Schwannomlar ve meningiomalar dahil) tümörleri, hematopoetik malignitelerden kaynaklanan tümörler, akut lösemi, akut lenfoblastik lösemi (ALL), akut miyeloid lösemi (AML), B hücreli Ienfoma, Burkitt lenfomasi, kronik myelositik lösemi (KML), kronik Ienfositik lösemi (KLL), tüylü hücreli lösemi, Hodgkin ve non- Hodgkin Ienfomalari, DLBCL, foliküler Ienfomalar, hematopoetik maligniteler, Kaposi sarkomu, malign Ienfoma, malign histiyositoz, malign melanom, multipl miyelom, paraneoplastik malignite sendromu / hiperkalsemi veya kati tümörler dahil olmak üzere primer ve metastatik kanserlerden muzdarip insanlari teshis etmek ve/ veya tedavi etmek için kullanilabilir.

Bulusun bir TRAlL reseptör agonist proteinini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içeren farmasötik bir bilesim, bu bulus tarafindan temin edilmektedir.

Farmasötik bilesim, bir bozuklugu tedavi etmek için en az bir ek terapötik ajan içerebilir. Ornegin, ek madde bir terapötik ajan, bir kemoterapötik ajan olabilir; bir görüntüleme ajani, bir sitotoksik ajan, bir anjiyogenez inhibitörü, bir kinaz inhibitörü (bunlarla sinirli olmamak üzere bir KDR ve bir TIE- 2 inhibitörü dahil ancak), bir oitak uyarim molekülü modülatörü veya bir bagisiklik kontrol noktasi inhibitörü (bunlarla B7RP1, CTLA4- lg, anti- CTLA- 4, anti- PD- 1, anti- PD- L1, anti- PD- L2, anti- lCOS, anti- LAG- 3, anti- Tim3, anti- VISTA, anti- HVEM, anti- BTLA, LIGHT füzyon proteini, GAL9, anti- A2AR, anti- KIR, anti- IDO- 1, anti- CD20 dahil), bir dendritik hücre / antijen sunan hücre modülatörü (bunlarla sinirli olmamak üzere anti- CD40 antikoru, anti- CD40 L, anti- DC- SlGN, anti- Dectin- 1, anti- CD301, anti- CDSOS, anti- CD123, anti- CD, ToII benzeri reseptörler için bir modülatör (bunlarla sinirli olmamak üzere anti- TLR- anti- TLR- 7, anti - TLR- 8, anti- TLR- 9 dahil), bir adezyon molekülü blokeri (bunlarla sinirli olmamak üzere bir anti- LFA- 1 antikoru, bir anti- E / L selektin antikoru, bir küçük molekül inhibitorü dahil), bir anti- sitokin antikoru ya da bunlarin fonksiyonel bir parçasi (bir anti- IL- 18, bir anti- TNF ya da bir anti- IL- 6 / sitokin reseptör antikoru dahil), bir bispesifik olarak yönlendirilmis T hücresi ya da NK hücre sitotoksisitesi (bunlarla sinirli olmamak üzere bir BiTE®), bir kimerik T hücresi reseptörü (CAR- T) bazli terapi, bir T hücresi reseptörü (TCR) bazli tedavi, bir terapötik kanser asisi, metotreksat, siklosporin, rapamisin, FK506, saptanabilir bir etiket veya haberci, bir TNF antagonisti, bir anti- romatik, bir kas gevsetici, bir narkotik, bir steroid olmayan anti- enflamatuar ilaç (NSAID), bir analjezik, bir anestetik, bir sedatif, bir lokal anestetik, bir nöromüsküler bloker, bir antimikrobiyal, bir antipsoriatik, bir kortikosteroid, bir anabolik steroid, bir eritropoietin, bir immünizasyon, bir immünoglobulin, bir immünosüpresif, bir büyüme hormonu, bir hormon replasman ilaci, bir radyofarmas'otik, bir antidepresan, bir antipsikotik, bir uyarici, bir astim ilaci, bir beta agonisti, bir inhale steroid, bir epinefrin veya analogu, bir sitokin veya bir sitokin antagonisti olabilir.

Bir kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde veya burada açiklanan tümörlerden metastazlarin önlenmesi veya inhibisyonunda, TRAIL reseptörü agonisti protein(ler) tek basina veya örnegin kemoterapotik, radyoterapi veya biyolojik ajan gibi bir veya daha fazla ek ajan ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Bazi düzenlemelerde, ajan asagidakileri içerebilir: 13- cis- Retinoik asit; 2- CdA; 2- Klorodeoksiadenozin; 5- Azasitidin; 5- Florourasil; 5- FU; 6- Merkaptopurin; 6- MP; 6- TG; 6- Tiyoguanin; Abraksan; Accutane®; Aktinomisin- D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala- Cort®; Aldeslökin; Alemtuzumab; ALIMTA; Alitretinoin; Alkaban- AQ®; Alkeran®; AII- transretinoik Asit; Alfa Interferon; Altretamin; Ametopterin; Amifostin; Aminoglutetimid; Anagrelid; Anandr0n®; Anastrozol; Arabinosilsitozin; Ara- C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; Arsenik Trioksit; ArzerraTM; Asparaginaz; ATRA; Avastin®; Azasitidin; BCG; BCNU; Bendamustin; Bevacizumab; Beksaroten; BEXXAR®; Bikalutamid; BiCNU; Blenoxane®; Bleomisin; Bortezomib; Busulfan; Busulfex®; C225; Kalsiyum Lökovorin; Campath®; Camptosar®; Kamptotesin- 11; Kapesitabin CaracTM; Karboplatin; Karmustin; Karmustin Wafer; Casodex®; 00- 5013; CCI- 779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; Setuksimab; Klorambusil; Sisplatin; Sitrovorum Faktör; Kladribin; Kortizon; Cosmegen®; CPT- 11; Siklofosfamid; Cytadren®; Sitarabin; Sitarabin Lipozomal; Cytosar- U®; Cytoxan®; Dakarbazin; Dakogen; Daktinomisin; Darbepoetin Alfa; Dasatinib; Daunomisin; Daunorubisin; Daunorubisin Hidroklor'L'ir; Daunorubisin Lipozomal; DaunoXome®; Dekadron; Desitabin; Delta- Cortef®; Deltasone®; Denilökin; Diftitoks; DepoCytTM; Deksametazon; Deksametazon Asetat; Deksametazon Sodyum Fosfat; Deksazon; Deksrazoksan; DHAD; DIC; Diodeks; Dosetaksel; Doxil®; Doksorubisin; Doksorubisin Lipozomal; DroxiaT'V'; DTlC; DTlC- Dome®; Duralone®; Duvelisib; Efudex®; EligardT'V'; EllenceTM; EloxatinTM; Elspar®; Emcyt®; Epirubisin; Epoetin Alfa; Erbituks; Erlotinib; Erwinia L- asparaginaz; Estramustin; Etiyol Etopophos®; Etoposid; Etoposid Fosfat; Eulexin®; Everolimus; Evista®; Eksemestan; Fareston®; Faslodex®; Femara®; Filgrastim; Floksuridin; Fludara®; Fludarabin; Fluoroplex®; Florourasil; Florourasil (krem); Fluoksimesteron; Flutamid; Folinik Asit; FUDR®; Fulvestrant; Gefitinib; Gemsitabin; Gemtuzumab ozogamisin; Gemzar; GleevecT'V'; Gliadel® Wafer; GM- CSF; Goserelin; Gran'ülosit- Koloni Uyarici Faktör (G- CSF); Granülosit Makrofaj Koloni Uyarici Faktör (G- MCSF); Halotestin®; Herceptin®; Heksadrol; Hexalen®; Heksametilmelamin; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; Hidrokortizon; Hidrokortizon Sodyum Fosfat; Hidrokortizon Sodyum Süksinat; Hidrokorton Fosfat; Hidroksiüre; lbrutinib; Ibritumomab; Ibritumomab Tiuksetan; Idamycin®; Idarubisin lfex®; lnterferon- alfa; lnterferon- alfa- 2b (PEG K0njugat); Ifosfamid; lnterlökin- 11 (lL- 11); lnterlökin- 2 (lL- 2); lmatinib mesilat; lmidazol Karboksamid; lntron A®; ipilimumab, lressa®; Irinotekan; lsotretinoin; lksabepilon; lxempraT'V'; KADCYCLA®; Kidrolase (t) Lanacort®; Lapatinib; L- asparaginaz; LCR; Lenalidomid; Letrozol; Lökovorin; Lökeran; LeukineT'V'; Löprolid; Lörokristin; LeustatinTM; Lirilumab; Lipozomal Ara- C; Liquid Pred®; Lomustin; L- PAM; L- Sarkolizin; Lupron®; Lupron Depot@; Matulane®; Maksideks; Mekloretamin; Mekloretamin Hidroklorür; Medralone®; Medrol®; Megace®; Megestrol; Megestrol Asetat; MEK inhibitörleri; Melfalan; Merkaptopurin; Mesna; MesnexTM; Metotreksat; Methotreksat Sodyum; Metilprednisolon; Meticorten®; Mitomisin; Mitomisin- C; Mitoxantrone M- Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; Mustin; Mutamycin®; Myleran®; MylocelTM; Mylotarg®; Navitoclax; Navelbine®; Nelarabin; Neosar®; NeulastaT'V'; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; Nilotinib; Nilutamid; Nipent®; Nitrogen Mustard Novaldex®; Nivolumab; Novantrone®; Nplat; Octreotid; Octreotid Asetat; Ofatumumab; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; OnxalT'V'; Oprelvekin; Orapred®; Orasone®; Oksaliplatin; Paklitaksel; Paklitaksel Protein- bagli; Pamidronat; Panitumumab; Panretin®; Paraplatin®; Pazopanib; Pediapred®; PEG Interferon; Pegaspargaz; Pegfilgrastim; PEG- lNTRONTM; PEG- L- asparaginaz; PEMETREXED; Pembrolizumab; Pentostatin; Pertuzumab; Fenilalanin Hardal; Pidilizumab; Platinol®; Platinol- AQ®; Prednisolon; Prednison; Prelone®; Procarbazine; PROCRIT®; Proleukin®; Karmustin implanti ile Prolifeprospan 20; Purinethol®; BRAF inhibitörleri; Raloksifen; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; Rituksimab; Roferon- A®; Romiplostim; Rubex®; Rubidomisin Hidroklor'ür; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; Sargramostim; Solu- Cortef®; Solu- Medrol®; Sorafenib; SPRYCELTM; STI- 571; STIVAGRATM, Streptozocin; SU11248; Sunitinib; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; Temozolomid Temsirolimus; Teniposid; TESPA; Talidomid; Thalomid®; TheraCys®; Tiyoguanin; Tiyoguanin Tabloid®; Tiyofosfoamid; Thioplex®; Tiyotepa; TICE®; Toposar®; Topotekan; Toremifen; T0risel®; Tositumomab; Trastuzumab; Treanda®; Tremelimumab; Tretinoin; TrexallTM; Trisen0x®; TSPA; TYKERB®; Urelumab; VCR; VectibixTM; Velban®; Velcade®; Venetoclax; VePesid®; Vesanoid®; ViadurT'V'; Vidaza®; Vinblastin; Vinblastin Sülfat; Vincasar Pfs®; Vinkristin; Vinorelbin; Vinorelbin tartrat; VLB; VM- 26; Vorinostat; Votrient; VP- 16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; ZevalinT'V'; Zinecard®; Zoladex®; Zoledronik asit; Zolinza; veya Zometa®, ve/ veya benzer yolaklari hedefleyen, burada spesifik olarak listelenmeyen diger ajanlar.

Kombine bir tedavi rejiminin bir parçasi olarak iki veya daha fazla madde veya prensip kullanilacaksa, bunlar ayni uygulama yolu ile veya farkli uygulama yollari ile, esasen ayni zamanda veya farkli zamanlarda (örnegin esasen es zamanli olarak, ardisik veya alternatif bir rejime göre) verilebilirler. Maddeler veya prensipler, ayni uygulama yolu ile es zamanli olarak uygulanacagi zaman, uzman kisilerce açikça anlasilacagi gibi, farkli farmasötik formülasyonlar veya bilesimler veya birlesik farmasötik formülasyon veya bilesimin bir parçasi olarak uygulanabilirler.

Ayrica, iki veya daha fazla aktif madde veya prensip, kombine bir tedavi rejiminin parçasi olarak kullanilacaksa, her bir madde veya prensip, madde veya prensip tek basina kullanildigi zaman ile ayni miktarda ve ayni rejime göre uygulanabilir ve böyle bir kombine kullanim sinerjik bir etkiye yol açabilir veya açmayabilir. Bununla birlikte, iki veya daha fazla aktif maddenin veya prensiplerin kombine kullanimi sinerjik bir etkiye yol açtigi zaman, istenen terapötik etkiye hala ulasarak, yine de uygulanacak olan maddelerin veya prensiplerin bir tanesinin veya birden fazlasinin miktarini azaltmak da mümkündür. Bu, örnegin istenilen farmasötik veya terapötik etkiyi elde ederken, normal miktarlarda kullanildiginda bir veya daha fazla maddenin veya ilkelerin kullanimiyla iliskili istenmeyen yan etkilerin önlenmesi, sinirlandirilmasi veya azaltilmasi için faydali olabilir.

Burada tarif edildigi gibi kullanilan tedavi rejiminin etkinligi, hastaligin veya bozuklugun kendisi için bilinen herhangi bir sekilde, klinisyen tarafindan açik bir sekilde anlasilabilecegi gibi belirlenebilir ve/ veya takip edilebilir. Klinisyen ayrica, uygun oldugunda ve duruma göre, arzu edilen terapötik etkiyi elde etmek, istenmeyen yan etkileri önlemek, sinirlamak veya azaltmak için. ve/ veya bir yandan istenen terapötik etkiyi elde etmek ile istenmeyen yan etkileri önlemek, sinirlandirmak veya azaltmak arasinda uygun bir dengeyi saglamak için belirli bir tedavi rejimini degistirebilecek veya modifiye edebilecektir.

Genel olarak, tedavi rejimi istenen terapötik etki elde edilinceye kadar ve/ veya arzu edilen terapötik etki korunacagi sürece takip edilecektir. Yine, bu klinisyen tarafindan belirlenebilir. Çesitli düzenlemelerde, tek basina veya profilaktik maddeler, terapötik maddeler ve/ veya farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ile kombinasyon halinde bir veya daha fazla TRAIL reseptörü agonisti proteinini içeren farmasötik bilesimler burada saglanmistir. çesitli düzenlemelerde, burada açiklanan farmasötik bilesimlerin kullanimlarinin sinirlayici olmayan örnekleri, bir bozuklugu teshis etme, saptama ve/ veya izleme, bir bozuklugu veya bunun bir veya daha fazla semptomunu önleme, tedavi etme, yönetme ve/ veya iyilestirme ve/ veya arastirmayi içerir. Farmasötik bilesimlerin tek basina ya da profilaktik maddeler, terapötik maddeler ve/ veya farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ile kombinasyon halinde formülasyonu, Çesitli düzenlemelerde farmasötik bir formülasyon, sinirlar dahil olmak üzere, yaklasik 0.1 ve 100 mg / ml arasinda bir konsantrasyonda mevcut olan bir veya daha fazla amino asit, bir veya daha fazla polisakarit ve/ veya polisorbat ve bir TRAIL yaklasik 15 mM'Iik bir konsantrasyonda bulunur. Bir düzenlemede, formülasyondaki en az bir polisakkarit sakkarozdur ve agirlikca yaklasik % O- 80'lik bir konsantrasyonda bulunur (agirlik / hacim). Bir düzenlemede, formülasyondaki polisorbat, polisorbat 80'dir ve ag / hac % 0- 0.06'lik bir konsantrasyondadir. Bir düzenlemede, formülasyondaki en az bir amino asit arginindir ve yaklasik ag / hac % Bir düzenlemede TRAIL reseptörü agonist proteini, formülasyonda yaklasik 0.1- 100 mg / ml'lik bir konsantrasyonda, (Örnegin yaklasik 1- 100 mg / ml veya yaklasik 1- 15 mg /ml veya yaklasik 1- 7.5 mg I ml veya yaklasik 2.5- 7.5 mg /ml veya yaklasik 5- yaklasik 25- 50 mg / ml veya yaklasik 25 mg / ml veya yaklasik 50 mg / ml veya mg / mI veya yaklasik 1- 5 mg / mI veya yaklasik 1- 7.5 mg / ml veya yaklasik 1- 15 mg / ml veya yaklasik 0.5 mg I ml veya yaklasik 1.0 mg / m) bulunur.

Burada kullanildigi sekliyle "etkili miktar" ifadesi, TRAIL agonist proteininin, TRAlL'in disfonksiyonuna veya TRAlL ile iliskili bir hastalik veya bozukluga bagli bir veya daha fazla parametrede saptanabilir bir iyilesme ile sonuçlanan bir miktari anlamina gelir Çesitli düzenlemelerde farmasötik formülasyon, bir sulu formülasyon, liyofilize bir formülasyon veya liyofilize edilmis ve tekrar hidratlanmis bir formülasyondur. Bir düzenlemede, hidratlama çözeltisi, dekstroz ve/ veya tuzlu su çözeltisidir (örnegin, ag / hac yaklasik % 5 konsantrasyonda dekstroz ve/ veya ag / hac yaklasik % 0.9'luk bir konsantrasyonda tuzlu su çözeltisi). Bir düzenlemede, farmasötik formülasyon yaklasik 15 mM histidin, yaklasik % 0.03 (agirlik / hacim) polisorbat 80, yaklasik % 4 (agirlik / hacim) sakkaroz ve yaklasik 0.1 - 25 mg / ml TRAlL reseptör agonist proteini veya yaklasik 1- 15 mg / ml TRAIL reseptör agonist proteini içerir ve yaklasik 6 pH'tir. Bir düzenlemede, formülasyon ayrica en az bir ek ajan içerir. Çesitli düzenlemelerde, yaklasik 25 mg / ml TRAIL reseptörü agonisti proteini, yaklasik 15 mM histidin,% 0.03 polisorbat 80 (agirlik / hacim), % 4.0 sakkaroz (agirlik / hacim) içeren ve bir pH'i yaklasik 6.0 olan bir formülasyon kullanilir. Bazi düzenlemelerde, formülasyon arginin içermez. Bazi düzenlemelerde, formülasyon, diger bilesenler veya konsantrasyonlari içeren diger formülasyonlarla karsilastirildiginda beklenmedik biçimde gelistirilmis donma- çözülme stabilitesi, sivi formülasyon stabilitesi ve/ veya liyofilize formülasyon stabilitesi sergiler.

Burada saglanan terapötik bir maddenin uygulanmasina yönelik yöntemler, bunlarla sinirli olmamak üzere, oral uygulama, parenteral uygulama (örnegin, intradermal, intramüsküler, intraperitoneal, intravenöz ve subkütanöz), epidural uygulama, intratümöral uygulama, mukozal uygulama (örnegin, burun içi ve agiz yollari) ve pulmoner uygulamayi (örnegin bir inhaler veya nebulizer ile uygulanan aerosol haline getirilmis bilesikler) içerir. Spesifik uygulama yollarina yönelik farmasötik bilesimlerin formülasyonu ve çesitli uygulama yöntemleri için gerekli olan materyaller ve teknikler, Çesitli düzenlemelerde, dozaj rejimleri, optimum bir arzu edilen yaniti (örnegin bir terapötik veya profilaktik cevaptir) saglayacak sekilde ayarlanabilir. Ornegin, tek bir bolus uygulanabilir, zaman içinde birkaç bölünmüs doz uygulanabilir veya doz, terapötik durumun gereklilikleri ile gösterildigi gibi orantili olarak azaltilabilir veya arttirilabilir. Bazi düzenlemelerde parenteral bilesimler, uygulama kolayligi ve dozajin es dagilimli olmalsi için dozaj birimi formunda formüle edilir. "Dozaj birim formu" terimi, tedavi edilecek memeli hastalar için üniter dozajlar olarak uygun, fiziksel olarak ayri birimleri belirtir; her bir birim, gerekli farmasötik tasiyici ile birlikte istenen terapötik etkiyi üretmek için hesaplanan, önceden belirlenmis miktarda aktif bilesik ihtiva eder.

Burada saglanan bir TRAIL reseptörü agonist proteininin terapötik veya profilaktik olarak etkili bir miktari için örnek teskil eden, sinirlayici olmayan bir aralik yaklasik - 100 mg / kg arasinda veya herhangi bir konsantrasyonda). Bazi düzenlemelerde TRAIL reseptör agonist proteini, farmas'otik bir bilesim içinde, terapötik olarak etkili bir konsantrasyonda, 'Örnegin yaklasik 0.1- 100 mg / ml'Iik bir konsantrasyonda (örnegin veya arasinda herhangi bir konsantrasyon) bulunur. Doz degerlerinin, hafifletilecek durumun tipi ve/ veya siddetiyle degisebilecegini unutmayin. Özel bir hasta için, spesifik dozaj rejimlerinin, bireysel ihtiyaçlara ve/ veya bilesimlerin uygulanmasini yöneten veya denetleyen kisinin mesleki yargisina göre zaman içinde ayarlanabilecegi ve burada belirtilen dozaj araliklarinin sadece örnek teskil ettigi ve hak iddiasinda bulunulan bilesimin kapsamini veya uygulamasini sinirlandirmasinin amaçlanmadigi anlasilmalidir.

Ornekler 1. TRAIL reseptör agonist proteininin 'üretimi (sc TRAIL wt) 1.1 Polipeptit yapisi B) Gln21 - GIy182 Amino asitleri Insan TRAIL Iigandinin birinci çözün'ur sitokin alani (TRAlL, SEK lD NO: 1'in 120 - 281 amino asitleri).

C) Gly 183 - Ser 190 Amino Asitleri DIZI ID NO: 'nun ilk peptit baglayici elemani: 2.

D) Arg191 - Gly351 Amino asitleri Insan TRAIL Iigandinin ikinci çözünür sitokin alani (TRAIL, SEK ID NO: 1'in 121- 281 amino asitleri).

E) Gly352 - Ser359 Amino asitleri SEK ID NO: 2'nin ikinci peptit baglayici elemani.

F) Arg360 - Gly520 Amino asitleri Insan TRAIL Iigandinin ikinci çözünür sitokin alani (TRAIL, SEK ID NO: 1'in 121- 281 amino asitleri).

G) Gly521 - Cys542 Amino asitleri SEK ID NO: 1'in mentese- baglayici elemani.

H) Pro543 - Lys760 Amino asitleri SEK ID NO: 10'un antikor Fc fragman bölgesi.

Yukaridaki TRAIL reseptörü agonisti proteini, SEK lD NO: 14'de gösterilmistir.

Belirtilen baglayicilar, tercih edilen diger baglayicilarla örnegin SEK ID NO: 3- 9'da gösterildigi gibidegistirilebilir.

Birinci ve ikinci peptit baglayicilarin ayni olmasi gerekmedigi belirtilmelidir.

Sinyal peptit dizisi (A) herhangi bir baska uygun örnegin memeli sinyal peptit dizisi ile degistirilebilir. 1.2 Polipeptidi kodlayan gen kaseti Sentetik gen, uygun konakçi hücrelerde örnegin böcek hücreleri veya memeli hücrelerinde ifade için kodon kullanimi göz önüne alinarak optimize edilebilir. Tercih edilen bir nükleik asit dizisi SEK ID NO: 16'da gösterilir. 2. Ifade ve Saflastirma Füzyon polipeptitlerinin klonlanmasi, ifadesi ve saflastirilmasi Yukarida adi geçen füzyon proteinleri, iki farkli ökaryotik konakçi hücrede rekombinant olarak ifade edilmistir: Yukarida belirtilen TRAIL reseptör agonisti füzyon proteinlerinin ilk analizi için,% 10 FBS, 100 birim / ml Penisilin ve 100 [mu]g / ml Streptomisin ile takviye edilen DMEM + GlutaMAX (GibCo) içinde büyütülmüs Hek293T hücreleri, bir füzyon polipeptidi ve uygun bir seçim markörü için bir ifade kaseti, örnegin bir blastikidin, puromisin veya higromisin direnç genini içeren bir fonksiyonel ifade kaseti içeren bir plazmid ile geçici olarak transfekte edilmistir. Son ürünü elde etmek için çok sayida polipeptit zincirinin gerekli oldugu durumlarda, ifade kasetleri ya bir plazmid üzerinde birlestirilmis ya da transfeksiyon sirasinda farkli plazmidler üzerine yerlestirilmistir. Rekombinant füzyon polipeptidi ihtiva eden hücre kültürü üst fazi, transfeksiyondan üç gün sonra toplanmis ve 300 x g'de santrifüjleme ile berraklastirilmis, ardindan 0.22 pm steril bir filtreden süzülmüstür. ölçekli ifadesi için yukarida belirtilen proteinleri kodlayan sentetik DNA kasetleri, uygun seçim markörleri (örnegin bir blastikidin, puromisin veya higromisin direnç genini içeren bir fonksiyonel ifade kaseti) ve konakçi hücreler genomu içindeki transkripsiyonel olarak aktif ekleme alanlarinin sayisini arttirmak için uygun genetik elemanlar içeren ökaryotik ifade vektörlerine eklenmistir. Dizisi dogrulanmis ifade vektörleri, elektroporasyon ile süspansiyona adapte edilmis Çin Hamster Yumurtalik hücreleri (CHO- S, Invitrogen) içine sokulmustur. Transfekte edilmis hücrelere transfeksiyondan üç gün sonra uygun seçim basinci uygulanmistir. Vektörden türetilmis direnç gen(ler)i tasiyan sag kalan hücreler, seçim baskisi altinda sonraki ekim ile geri kazanilmistir. Seçilen hücre havuzlarinin kimyasal olarak tanimlanmis ortamda (PowerCHOZ- CD, Lonza) 37 cC'de ve % 7 002 atmosferinde bir orbital çalkalayici inkübatörde (100 rpm, 50 mm çalkalama (shaking throw)) kararli bir sekilde büyümesi üzerine, ayri ayri üst fazlar yukarida belirtilen proteinleri algilayacak sekilde ELISA- ile analiz edilmis ve en yüksek spesifik üretkenlige sahip hücre havuzlari protein üretiminden önce çalkalama siselerinde genisletilmistir (orbital çalkalayici, 100 rpm, 50 mm çalkalama (shaking throw)).

Laboratuvar ölçekli protein üretimi için, bireysel hücre havuzlari, kimyasal olarak tanimlanmis ortamda (PowerCHOZ- CD, Lonza) 37 cC'de ve % 7 COZ atmosferinde, bir dalga biyoreaktöründe , 7- 12 gün boyunca kültürlenmistir. Bazal ortam, 4 mM Glutamax ile takviye edilmis PowerCHOZ- CD'dir.

Dalga kültürü, 0.3 ila 0.4 x 10 e6 hücre / ml'lik bir canli hücre konsantrasyonu ve asagidaki ayarlar (bes veya on litrelik bir torba için) ile baslatilmistir: çalkalama Dalga çalismasi sirasinda hücre kültürü, genellikle 2. günde (% 20 besleme) ve 5. günde (% 30 besleme) PowerFeed A (Lonza) ile iki kez beslenmistir. Ikinci beslemeden sonra çalkalama frekansi 22 rpm'ye, çalkalama açisi 8°ye çikarilmi stir.

Hücre canliligi % 80'in altina düstügünde biyoreakt'or genellikle 7 ila 12. gün arasinda hasat edilmistir. Ilk olarak, kültür üst fazi bir manuel derinlik filtreleme sistemi (Millipore Millistak Pod, MCOHC 0.054m)2) kullanilarak berraklastirilmistir. Strep- etiketli proteinler için Avidin, 0.5mg / L'Iik bir son konsantrasyona eklenmistir. Son olarak, TRAIL reseptörü agonisti füzyon proteinini ihtiva eden kültür üst fazi, bir sise üstü filtresi ( kullanilarak steril olarak filtrelenmistir ve ileri isleme kadar 2- 8 °C'de saklanmi stir.

Afinite saflastirmasi için Streptaktin Sepharose, 15 ml tampon W (100 mM Tris- HCI, doldurulmus ve hücre kültürü üst fazi 4 ml / dak akis hizina sahip kolona uygulanmistir. Ardindan, kolon 15 ml W tamponu ile yikanmis ve baglanmis Destiobiotin, pH 8.0) eklenerek adim adim ayrilmistir. Alternatif olarak, bu adimda 2.5 mM Destiobiotin içeren PBS pH 7.4 kullanilabilir.

Streptactin Sepharose bazli yönteme alternatif olarak, afinite saflastirmasi, afinite ligandi olarak bir hareketsiz Protein- A ve bir Akta kromatografi sistemi (GE- Healthcare) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Füzyon proteininin FC bölgesi için yüksek afiniteye sahip bir kati faz malzemesi seçilmistir: MABSeIect Sure TM (GE Healthcare). Kisaca, berraklastirilmis hücre kültürü üst fazi, mI kolon yatagi basina mg füzyon proteini yükünü asmayan yikama tamponu- 1 (20 mM Pi, 95 mM NaCI, pH7.2) içinde dengelenmis bir HiTrap MabSelectSure kolonuna (CV = 5 mi) yüklenmistir. Kolon, yukarida belirtilen dengeleme tamponuyla on kolon- hacmi (10 CV) ve akabinde kona hücre proteinini ve konak hücre DNA'sini tüketmek üzere dört kolon- hacmi (4 CV) yikama tamponu- 2 (20mM Pi, 95mM NaCl, pH 8.0) ile yikanmistir. Kolon daha sonra elüsyon tamponu (20mM Pi, 95mM NaCl, pH 3.5) ile elüe edilmis ve elüat, her bir fraksiyon kolon- yatak hacmine (5 mi) esit bir hacme sahip olacak sekilde on fraksiyona kadar toplanmistir. Her fraksiyon, daha önce bahsedilen yikama tamponu- 2'nin esit bir hacmi ile nötralize edilmistir. Dogrusal hiz 150 cm / saate ayarlanmis ve yukarida belirtilen afinite kromatografisi yöntemi boyunca sabit tutulmustur. Elüat fraksiyonlarinin protein miktari tayin edilmis ve pik fraksiyonlar ultrafiltrasyon ile konsantre edilmis ve ayrica boyut dislama kromatografisi (SEC) ile saflastirilmistir.

SEC, bir Akta kromatografi sistemi (GE- Healthcare) kullanilarak Superdex 200 /300 GL veya HiLoad 26/60 kolonlarinda gerçeklestirilmistir. Kolonlar, fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi ile dengelenmis ve konsantre, afinite ile saflastirilan polipeptit, kolon hacminin °/o 2'sini asmayan örnek hacimle (hacim / hacim) SEC kolonuna yüklenmistir. Superdex200 kullanildigi durumda, dakikada 05 ml'lik bir akis hizi uygulanmistir. HiLoad 26/60 Superdex200 kolonlarinin kullanildigi durumda, dakikada 2.5 ml akis hizi uygulanmistir. Polipeptidin elüsyon profili 280 nm'de absorbans ile izlenmistir.

Dogal kosullar altinda saflastirilmis füzyon polipeptidinin görünür molekül agirliginin belirlenmesi için, bir Superdex 200 kolonu, bilinen bir moleküler agirliga sahip standart proteinlerle yüklenmistir. Standart proteinlerin elüsyon hacmine dayanarak bir kalibrasyon egrisi çizilmis ve saflastirilmis füzyon polipeptidinin görünür moleküler agirligi belirlenmistir. TRAIL reseptörü agonisti füzyon proteinlerini içeren FC- bölgesi, tipik olarak, homodimer için yaklasik 160- 180 kDa'lik görünür bir molekül agirligiyla birlikte Supoerdex200 kolonlarindan elüe edilmistir. 3. Apoptoz Analizi TRAIL- reseptör agonist füzyon proteinlerinin apoptoz indükleyici aktivitesini belirlemek için bir Jurkat A3 kalici T- hücre hattina sahip bir hücresel analiz kullanilmistir. Jurkat hücreleri,% 10 FBS, 100 birim / ml Penisilin ve 100 ug / ml Streptomisin ile takviye edilmis RPMl ile siselerde büyütülmüstür. Testten önce, 100,000 hücre 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasina ekilmistir. Farkli konsantrasyonlarda füzyon peptidlerinin kuyucuklara eklenmesini, 37 oC'de 3 saatlik bir inkübasyon taki p etmistir. Hücreler Iiziz tamponu mM AEBSF, pH 7.5) ilave edilerek lize edilmis ve plakalar 30 dakika ila 2 saat arasinda buz üzerine konulmustur. Apoptoz, kaspazlarin, ör. Kaspaz- 3'ün artan aktivitesi ile paraleldir. Bu nedenle, apoptoz derecesini belirlemek için spesifik kaspaz substrati Ac- DEVD- AFC'nin (Biomol) bölünmesi kullanilmistir. Aslinda, Kaspaz aktivitesi, propidyum iyodür ve Hoechst- 33342 ile hücrelerin boyanmasindan sonra morfolojik olarak belirlenen apoptotik hücrelerin yüzdesi ile iliskilidir. Kaspaz aktivitesi analizi için, 20 pl hücre lizati siyah 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasina aktarilmistir.50 mM HEPES,% 1 Sakkaroz,% 0.1 CHAPS, 50 uM Ac- DEVD- AFC ve mM DTT, pH 7.5 içeren 80 pl tamponu eklendikten sonra, plaka bir Tecan lnfinite 500 mikrotitrasyon plakasi okuyucusuna aktarilmis ve floresan yogunlugunda artis izlenmistir (uyarma dalga boyu 400 nm, emisyon dalga boyu 505 nm). 3.1 Hücre ölüm analizi HT1080 fibrosarkom hücrelerinde hücre ölümünün belirlenmesi için 15,000 hücre,% FBS (Biokrom) ile takviye edilmis RPM içinde gece boyunca 96 kuyucuklu plakalara kaplanmistir. Hücreler, 2.5 9 / ml'lik bir son konsantrasyonda sikloheksimid (Sigma) ile birlikte inkübe edilmistir. Hücre ölümü, KV tamponu (% 0.5 kristal menekse,% 20 metanol) ile boyanarak tayin edilmistir.

Boyama isleminden sonra, kuyucuklar su ile yikanmis ve hava ile kurutulmustur.

Boya metanol ile elüe edilmis ve 595 nm'de optik yogunluk bir ELlSA okuyucu ile ölçülmüstür. 4. Stabilite I Agregasyon Testi 4.1 Agregasyon analizinin prensibi (Çözünebilir protein tanimi) Monomerlerin içerigi (TRAIL reseptör baglanma modüllerinin tanimlanmis trimerik düzenegi) ve agregalar, Ornek 2'de tarif edildigi gibi analitik SEC ile belirlenir. Bu özel amaç için analiz fizyolojik pH'da fizyolojik tuz konsantrasyonlari içeren tamponlarda (örnegin % gerçeklestirilir. Bir Superdex200 kolonunda (GE Healthcare) tipik bir agregasyon analizi yapilir. Bu kolon, proteinleri ila 800 kDa arasinda ayirir.

Dogal kosullar altinda saflastirilmis füzyon polipeptidinin görünür molekül agirliginin belirlenmesi için, bir Superdex 200 kolonu, bilinen bir moleküler agirliga sahip standart proteinlerle yüklenir. Standart proteinlerin elüsyon hacmine dayanarak bir kalibrasyon egrisi çizilir ve saflastirilmis füzyon polipeptidinin görünür moleküler agirligi elüsyon hacmine göre hesaplanir. Çözünebilir, agregat olusturmayan proteinlerin SEC analizi, örnegin trimerik TRAIL, tipik olarak, tanimlanmis bir elüsyon hacminde ayri bir tek protein pikini gösterir. Bu elüsyon hacmi, belirli proteinin görünen dogal moleküler agirligina tekabül eder ve yaklasik olarak birincil amino asit dizisi bazinda hesaplanan teorik moleküler agirligina uygundur.

Protein agregasyonu meydana gelirse, SEC analizi daha düsük alikonma hacimlerine sahip ek protein pik noktalarini gösterir. TRAIL için, çözünebilir proteinlerin agregasyonu karakteristik bir sekilde gerçeklesir. Proteinler, "trimerlerin" oligomerlerini olusturma egilimindedirler, bunlar nonamerleri (3 x 3) ve 27 merleri (3 x 9) olusturur. Bu oligomerler agregasyon tohumu olarak görev yapar ve yüksek bir oligomer içerigi potansiyel olarak proteinin agregasyonuna yol açar.

Büyük moleküler agirlikli oligomerler ve agregatlar, Superdex200 kolonunun bosluk hacminde elüe edilir ve dogal moleküler agirliklarina göre SEC ile analiz edilemezler.

(Tam) agregasyonun indüksiyonuna bagli olarak, TRAIL- SF füzyon proteinlerinin saflastirilmis preparatlari tercihen sadece tanimlanmis trimerik proteinleri ve sadece çok düsük miktarda oligomerize protein içermelidir. Belirli bir TRAlL- SF protein preparatinin agregasyon / oligomerizasyon derecesi, sirasiyla tanimlanan trimerik ve oligomer / agregat fraksiyonu için OD280 diyagraminin pik alanlarinin hesaplanmasiyla SEC analizine dayanarak belirlenir. Toplam pik alanina göre, tanimlanan trimerik proteinin yüzdesi asagidaki gibi hesaplanir: Bu metinde kullanilan çözünebilir protein tanimi, 0.2 ila 10.0 mg /ml arasinda tipik bir protein konsantrasyonu içinde tipik olarak > % 90'lik bir tanimlanmis çözünebilir protein (TRAIL bölgelerinin trimerik toplulugu) içeren fizyolojik pH'ta fizyolojik tuz konsantrasyonlarinin bir tamponunda saflastirilmis TRAIL proteininin bir protein preparatini tarif eder.

. Yari 'Omür Tayini Moleküller AD'nin her biri, zincirler arasi disülfür baglari ile kovalent olarak baglanan iki polipeptitten olusur. Glikozitlerin ve mentese sisteinlerinin sayisi (proteinler arasindaki zincirler arasi disülfür baglari ile sonuçlanir), bu 'özelliklerin degistirilmesinin, bu bilesiklerin yari Ömrü üzerindeki etkisini belirlemek için test edilmistir.

Kadin NMRI fareleri, tek bir intravenöz bolus enjeksiyonu olarak 1.2 mg / kg bw ve/ veya belirtilen bilesiklerin 4 mg / kg bw'si ile tedavi edilmistir. Tam kan, uygulamadan önce (öndoz) ve test ögesinin uygulamasindan sonra 168 saate kadar toplanmistir.

Serum hazirlanmis ve numuneler, serum konsantrasyonlarinin saptanmasina kadar - 80 cC'de saklanmistir. Farmakokinetik parametreler, ortalama serum konsantrasyonlari ve kompartmantal olmayan farmakokinetik veri analizi için PK Solutions Version 2.0 farmakokinetik degerlendirme programi (Summit Research Services, Montrose, CO) kullanilarak hesaplanmistir. PK Solutions, örnegin intravenöz veya ekstra vasküler uygulama yollarini takiben biyolojik örneklerin analizinden elde edilen konsantrasyon- zaman verilerinden gelen farmakokinetik parametreleri hesaplayan otomatik, Excel tabanli bir uygulamadir. PK Solutions, herhangi bir belirli kompartmantal modeli varsaymaksizin sonuçlari hesaplar.

Test maddelerinin serumdaki miktar tayini, moleküllerin bir parçasi olan bir Strep- etiketinden bagimsiz olarak Tablo 7'de gösterilen ayri TRAIL- reseptör agonistlerini tespit eden bir ELlSA- analizi ile gerçeklestirilmistir. Genel düzen Sekil 18'de gösterilmistir. Sonuçlar Tablo 7'de özetlenmistir.

Molekül A (SEK ID NO: 26'nin iki polipeptidinden olusur), iki adet mentese sisteinine (iki zincir arasi disülfur bagi olusturan) ve F0 bölgesinin 297 pozisyonunda (AB indeksine göre) bir N kalintisina sahiptir ve bu da dogal tip CH2 glikosilasyonu ile sonuçlanir. Molekül A ayrica 168 ve 337 pozisyonlarinda glikozitlere sahiptir. Molekül B (SEK ID NO: 19'un iki polipeptidinden olusur)19), üç mentese sisteinine (zincirler 297 pozisyonunda (AB endeksine göre) bir N297S mutasyonuna sahiptir, bu da CH2 bölgesinin aglikosile edilmesine yol açar. Molekül B ayrica 168 ve 337 pozisyonlarinda glikozitlere sahiptir. Molekül C (SEK lD NO: 27'nin iki polipeptidinden olusur)üç mentese sisteinine (zincirler arasi üç disülfid bagi olusturan) (513, 519 ve 522 pozisyonlarinda) ve F0 bölgesinin 297 pozisyonunda (AB endeksine göre) bir N297S mutasyonuna sahiptir, bu da CH2 bölgesinin aglikosile edilmesine yol açar.

Ayrica, 337 konumunda degil (baglayici 2), ancak 168 konumunda (baglayici 1) bir glikozit vardir. Molekül D (SEK lD NO: 28'in iki polipeptidinden olusur), üç mentese sisteinine (zincirler arasi üç disülfid bagi olusturur) ve F0 bölgesinin 297 pozisyonunda (AB endeksine göre) bir N297S mutasyonuna sahiptir, bu da CH2 bölgesinin aglikosilasyonuna neden olur. Ayrica, her iki baglayici 1 ve baglayici 2 üzerindeki glikozitler (sirasiyla pozisyonlar 168 ve 337) Molekül D'de tükenmistir.

Molekül B'nin in vivo (her iki baglayici glikosile edilmistir, CH2 glikozitleri tükenmis ve üçüncü bir mentese sisteini eklenmistir) stabilitesi (bilesik yari ömrü ile degerlendirildigi üzere) Molekül A'ya kiyasla arttirilmistir. Ayrica. bilesikten (Molekül D) tüm glikozitlerin tükenmesi geçici ifade sirasinda azalan in vivo stabilite ve düsük verimlilikle sonuçlanmistir. Molekül C (ilk baglayici glikosile edilmis, ikinci baglayici aglikosile edilmis, CH2 glikozitleri tükenmistir) Molekül B ve D ile karsilastirildiginda orta derecede in vivo stabilite sergilemistir (Tablo 7'deki sonuçlara bakiniz).

Tablo 7: NMRI- Farelerde Bilesik Yari Omrü Test Sonuçlari Molekül Glikosilasyon Mentese Terminal Yari Terminal yerlerinin sayisi sistein Omür 4mg / Yarim Omür sayisi kg i. v. (saat) 1.2 mg / kg i.

A 6 2 23.1 17.7 C 2 3 21.03 - D 0 3 8.81 - Bu deneysel sonuçlar, baglayici glikosilasyonun (her iki baglayici 1 ve 2'de) bir üçüncü zincirler arasi disülfid bagi (bir mentese sisteinin ilavesiyle) ve Pc bölgesindeki CH2 bölgesinin deglikosilasyonu ile birlestirilmesinin, bu bulusun moleküllerinde daha iyi iri vivo kararlilikla sonuçlandigini göstermektedir. 6.1 SEK ID NO: 19'un TRAIL reseptörü agonist proteiniinsan hematolojik ve kati tümör hücresi sag kalimini in vitro olarak inhibe eder.

Tümör hücreleri,% 10 FBS içeren önerilen ortam içinde 96 kuyucuklu plakalarda ,000 hücre / kuyucuk olarak tohumlanmis ve SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAlL reseptör agonist proteini ilenemlendirilmis bir % 5'lik COz atmosferinde 37 °C'de 24 saat boyunca tedavi edilmistir. Hücre canliligi daha sonra üreticinin talimatlari (Promega; Madison, WI) ile tarif edildigi gibi CellTiter- Glo® reaktifi kullanilarak degerlendirilmistir. IC50 degerleri, tedavi edilmemis kontrol hücreleri için normalize edilmis konsantrasyon yaniti verilerinin dogrusal olmayan regresyon analizi ile belirlenmistir. SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan TRAlL reseptör agonist proteinine yanit olarak hücre canliliginda bir kayip gösteren CoI0205, Jurkat ve SKM- 1 hücreleri için ortaya çikan konsantrasyon yaniti egrileri örnekleriSekil 19'da gösterilmistir. Tablo 8, hematolojik (A; (n = 40; Hodgkin- disi Lenfoma, NHL; Akut Myeloid Lenfoma, AML; Akut Lenfoblastik Lösemi, ALL) ve kati tümör (B: (n = 44; Küçük Hücreli Disi Akciger Karsinomu, NSCLC; Pankreatik; Kolorektal Kanser, CRC; Meme Kanseri, BrCa; Yumurtalik, Fibrosarkom; Bas ve Boyun, H & N; Küçük Hücreli Akciger Kanseri, SCLC) hücre hatlari SEK ID NO: 19'da gösterilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAlL reseptör agonist proteini ile24 saat tedavi edilmistir ve canlilik CellTiter- Glo® ile degerlendirilmistir. Hücre canliligi üzerinde, SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan TRAlL reseptör agonist proteini için meydana gelen ICso aracili etkilersunulmaktadir.

SEK lD NO: 19run TRAlL reseptör agonist proteininin insan tümör kanser hücre hatlarinda in vitro etkinligi Tümör hücre hatti Tümör tipi SEK lD NO:19 leo(ng/ml) SU- DHL- 8 NHL 1.36 OCI- Ly8 NHL 7.49 OCI- Ly2 NHL 18.98 OCI- LY19 NHL 26.34 WSU- NHL NHL 31.60 OCI- Ly7 NHL 63.76 SU- DHL- 5 NHL 82.07 OCI- Ly18 NHL 196.20 OCI- Ly1 NHL 416.95 SU- DHL- 16 NHL 545.55 SU- DHL- 2 NHL 1000.00 WSU- DLCL2 NHL 1000.00 Toledo NHL 1000.00 OCI- LY3 NHL 1000.00 SU- DHL- 4 NHL 1000.00 RC- K8 NHL 1000.00 OCI- AML2 AML 124.32 UKE- 1 AML 205.35 MV4- 11 AML 312.55 SET- 2 AML 384.80 OCI- AML5 AML 1032.60 Kasumi- 1 AML 1000.00 OCI- AML3 AML 1000.00 SHI-1 AML 1000.00 SKNO- 1 AML 1000.00 THP-1 AML 1000.00 Jurkat ALL 3.08 NCI- H847 NSCLC 14.53 NCI- H647 NSCLC 24.75 NCI- H2444 NSCLC 27.75 NCI- H2170 NSCLC 30.16 NCI- H460 NSCLC 36.85 NCI- H838 NSCLC 44.48 NCI- H1792 NSCLC 61.09 NCI- H2347 NSCLC 81.06 NCI- H1373 NSCLC 125.15 NCI- H522 NSCLC 259.87 NCI- H2110 NSCLC 314.20 NCI- H596 NSCLC 397.80 NCI- H2122 NSCLC 480.55 NCI- H1299 NSCLC 716.00 NCI- H1975 NSCLC 741.50 NCI- H727 NSCLC 3178.00 Calu- 6 NSCLC 4757.00 A549 NSCLC 5000.00 Calu- 1 NSCLC 5000.00 NCl- H441 NSCLC 5000.00 NCI- H23 NSCLC 5000.00 NCI- H661 NSCLC 5000.00 NCI- H1650- GFP NSCLC >3 BxPC3 Pan kreatik 16.00 Capan- 1 Pankreatik 393.00 MlA PaCa- 2 Pankreatik 158.00 PANC- 1 Pankreatik >1000 SW48 CRC 6.10 SW480 CRC 132.00 HCT 116- GFP CRC 337.00 MCF7 BrCa >3000 MDA- MB- 231 BRCa 235.00 HeyA8- GFP Yumurtalik 141.00 Fadu- GFP H&N >3 HT- 1080 Fibrosarkom 377.00 NCI- H211 SCLC 72.58 6.2 SEK ID NO: 19'un TRAIL resept'örü agonist proteinitümbr hücresi ölümünü uyarmak için anti- tüm'örijenik ajanlarla Sinerji olusturur.

Tümör hücreleri,% 10 FBS içeren önerilen ortam içinde 96 kuyucuklu plakalarda ,000 hücre / kuyucuk olarak tohumlanmis ve SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAIL reseptör agonist proteini,ve venetoclax (ABT- ile 24 saat boyunca 37 °C'de nemlendirilmis % 5'Iik C02 atmosferinde tedavi edilmistir. Hücre canliligi daha sonra üreticinin talimatlari ile tarif edildigi gibi CeIlTiter- Gl0® reaktifi kullanilarak degerlendirilmistir. Bliss bagimsizlik modeli (Wong ve dig.2012; Mol. aktivitesini degerlendirmek için, antagonizmi gösteren negatif tamsayilarla, ilave aktiviteyi gösteren bir sifir degeriyle ve sinerjiyi gösteren pozitif tamsayilarla birlikte kullanilmistir. Bliss skorlari, doz matrisindeki her kombinasyon için hesaplanmis ve bir "Bliss toplami" degeri vermek üzere toplanmistir. SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAIL reseptör agonist proteini ile birlikte ve venetoclax, navitoclax veya DTX ile insan tümör hücrelerinin tedavi edilmesiyle uyarilan sinerjik tümör hücresi ölümünün bir örnegi Sekil 20'de (AC) gösterilmistir. Bu kombinasyonlar için belirlenen bir dizi tümör hücre hattinda bliss toplamlari Tablo 9'da gösterilmistir.

SEK ID NO: 19'un TRAlL reseptör agonist proteininin in vitro olarak NSCLC hücre hatlarinda (A) DTX ile ve NHL & AML hücre hatlarinda (B) venetoclax veya navitoclax ile kombinasyon halinde hücre öldürmesinin Bliss sinerji degerlendirmesi.

Tümör Bliss Tümör Bliss Toplami Bliss Toplami hücre hatti Toplami hücre (SEK ID NO:19+ (SEK ID NO:19 (SEK ID hatti venitoclax) + navitoclax) H1373 NCl- 154 oci- 309.8 8.3 H2347 Ly18 H2444 H2170 16 H1395 Ly19 H1944 H1693 H2172 2 Kasumi- 1 - 356.4 - 241.2 7. SEK ID NO: 19'un TRAIL resept'ör agonist proteini tedavisi, in vivo olarak SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAIL reseptbrü agonist proteininin tümör büyümesi üzerindeki etkisi SCID disi farelere (Charles Rivers Laboratories; Wilmington, MA) implante edilen subkütan Col0205 (kolorektal), SKM- 1 (akut miyeloid lösemi) ve H460LM (küçük hücreli disi akciger kanseri) ksenogreft tümörlerinde degerlendirilmistir. Kisaca, insan kanser hücreleri, O. çalisma gününde disi SCID farelerinin sag arka tarafina deri altindan asilanmistir.

SEK ID NO: 19'un TRAlL reseptör agonist proteininin (belirtildigi gibi 0.3, 1 veya 3 mkd dozlu IV, QDx5 veya IP, QZDXS) uygulanmasi, boyut eslesmesi sirasinda baslatilmistir. Tümör hacmi, her bir gruptaki ortalama tümör hacmi Colo205 ve SKM- kadar, deney süresince ölçülmüstür. Sonuçlar, Sekil 21- 23'te gösterilmistir. SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAIL reseptör agonist proteininin uygulanmasi, Col0205, SKM- 1 ve H460LM ksenogreft tümör modellerinde önemli tümör büyümesi Inhibisyonuna uyarmistir.

SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptitten olusan bir TRAIL reseptör agonist proteininin tümör büyümesi üzerindeki etkisi ayni zamanda, NSG disi farelere (Sampiyonlar Onkoloji; NJ) implante edilen, hastadan türetilen ksenogref modelleri CTG- , CTG- ve CTG- 0785'de (Ewing sarkomasi) degerlendirilmistir. Kisaca, tümör fragmanlari, 0. çalisma gününde disi NSG farelerinin sag arka tarafina deri altindan verilmistir. SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren bir TRAIL reseptörü agonist proteininin uygulanmasi(3 mkd dozlanmis IP, Q2Dx5) boyut eslesmesi sirasinda baslatilmistir. Tümör hacmi, her bir gruptaki ortalama tümör hacmi> 2000 mm3 'lük bir son noktaya ulasana kadar, deney süresince ya da 60 gün ölçülmüstür. Sonuçlar, Sekil 24'te (A- G) gösterilmistir. SEK lD NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içeren bir TRAlL reseptörü agonist proteininin uygulanmasiCTG- 0069 (kolorektal), CTG- , CTG- PDX modellerinde anlamli ölçüde tümör büyümesi inhibisyonuna uyarmistir.

Claims (1)

1. ISTEMLER . Bir TRAIL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip bir polipeptidi içermesidir. . Bir TRAIL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; SEK ID NO: 19'da belirtilen amino asit dizisine sahip iki polipeptit içermesidir. . Istem 2'ye göre TRAIL reseptör agonist proteini olup, özelligi; iki polipeptidin, her bir polipeptidin 513, 519 ve 522 sistein kalintilari arasinda olusan üç zincirler arasi disülfid bagi araciligiyla kovalent olarak baglanmasidir. . Istem 1, 2 veya 3'e göre TRAIL reseptör agonist proteini olup, özelligi; polipeptit(ler)in 168 ve 337 pozisyonlarindaki asparagin kalintilarinin bir veya daha fazlasinin N- glikosile edilmesidir. . Istem 1, 2 veya 3'e ait TRAlL reseptör agonist proteini olup, özelligi; polipeptit(ler)in 168 ve 337 pozisyonlarindaki asparagin kalintilarinin her ikisinin de N- glikosile edilmesidir. . istem 1- 5'in TRAIL reseptör agonist proteini olup, özelligi; polipeptit(ler)in ayrica translasyon sonrasi modifiye edilmesidir. . Istem 6'ya göre TRAIL reseptör agonist proteini olup, özelligi; translasyon sonrasi modifikasyonun N- uçlu glutaminin piroglutamata modifikasyonunu içermesidir. . Farmasötik bir bilesim olup, özelligi; istem 1- 7'den herhangi birine ait TRAIL reseptör'ü agonist proteinini ve bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici, seyreltici, eksipiyan ve/ veya adjuvani içermesidir. . istem 1'in TRAlL reseptör'L'i agonist proteinini kodlayan bir nükleik asit molekül'ü veya adi geçen nükleik asit molekülünü içeren bir ifade vektör'L'i veya hücresi. 10. Istem 9'un hücresi olup, özelligi; bir ökaryotik hücre, tercihen bir memeli hücresi olmasidir. 11.Istem 9'un hücresi olup, özelligi; hücrenin bir Çin Hamsteri Yumurtalik (CHO) hücresi olmasidir. 12.Istem 1 - 7'den herhangi birine ait bir TRAlL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; TRAIL ile iliskili bir hastaliga veya bozukluga sahip bir denegin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanim için olmasidir. 13.Istem 12'ye göre kullanim için bir TRAIL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; hastalik veya rahatsizligin tümörler, enfeksiyöz hastaliklar, enflamatuar hastaliklar, metabolik hastaliklar, otoimmün bozukluklar, dejeneratif hastaliklar, apoptoz ile iliskili hastaliklar ve transplant redlerinden seçilmesidir. 14.Istem 13'e göre kullanim için bir TRAIL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; tümörlerin kati tümörler veya Ienfatik tümörler olmasi; otoimmün bozukluklarin romatoid hastaliklar, artritik hastaliklar veya romatoid ve artritik hastaliklar olmasi veya dejeneratif hastaligin nörodejeneratif bir hastalik olmasidir. 15.Istem 13'e göre kullanim için bir TRAIL reseptörü agonist proteini olup, özelligi; hastalik veya rahatsizligin romatoid artrit veya multipl skleroz olmasidir.