RS57153B1 - Jednolančani proteini agonisti trail-receptora - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetna prijava ima prioritet SAD privremene patentne prijave br. 61/983,152, podnete 23 aprila 2014.

Oblast pronalaska

[0002] Predmetni pronalazak obezbeđuje specifične proteine agoniste TRAIL receptora koji sadrže tri rastvorljiva TRAIL domena i Fc fragment, molekule nukleinske kiseline koji kodiraju proteine agoniste TRAIL receptora, i njihove upotrebe. Proteini agonisti TRAIL receptora su suštinski ne-agregirajući i pogodni za terapeutske, dijagnostičke i/ili istraživačke primene.

Osnova pronalaska

[0003] Poznato je da je trimerizacija TNF superfamilije (TNFSF) citokina neophodna za efikasno vezivanje i aktivaciju receptora. Trimerni kompleksi TNF superfamilije citokina su, međutim, teški za pripremu iz rekombinantnih monomernih jedinica.

[0004] WO 01/49866 i WO 02/09055 opisuju rekombinantne fuzione proteine koji sadrže TNF citokin i multimerizacionu komponentu, naročito protein iz C1 q familije proteina ili kolektin. Nedostatak ovih fuzionih proteina je, međutim, da trimerizacioni domen obično ima veliku molekulsku težinu i/ili da je trimerizacija prilično neefikasna.

[0005] Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) opisuju da su trimeri TNF citokina stabilizovani sa N-terminalno pozicioniranim stabilizacionim motivima. Kod CD95L, stabilizacija trimera vezujućeg domena receptora verovatno je izazvana sa N-terminalnim aminokiselinskim domenima koji se nalaze blizu citoplazmatske membrane.

[0006] Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) opisuju da vezujući domen receptora CD95L može biti stabilizovan sa N-terminalno pozicioniranim veštačkim motivima sa α-helikoidno uvijenom-zavojnicom (leucinski zatvarač). Nađeno je, međutim, da se teško može predvideti međusobna orijentacija polipeptidnih lanaca, npr. paralelna ili antiparalelna orijentacija. Dodatno, teško je odrediti optimalni broj heptadponovaka u motivu zavojnice zatvarača. Dodatno, strukture zavojnice imaju tendenciju da formiraju makromolekularne agregate nakon izmene pH i/ili jonske snage.

[0007] WO 01/25277 se odnosi na jednolančane oligomerne polipeptide koji se vezuju za ekstracelularni domen ćelijskog receptora za vezivanje liganda, naznačeno time da polipeptid sadrži najmanje tri vezujuća mesta receptora od kojih je najmanje jedno sposobno da se veže za ligand vezujući domen ćelijskog receptora i najmanje jedan nije sposoban za efikasno vezivanje za ligand vezujući domen ćelijskog receptora, pri čemu su jednolančani oligomerni polipeptdi sposobni da se vezuju za receptor, ali nisu sposobni da aktiviraju receptor. Na primer, monomeri su izvedeni iz citokinskih liganada TNF familije, naročito od TNF-α.

[0008] WO 2005/103077 opisuje jednolančane fuzione polipeptide koji sadrže najmanje tri monomera članova TNF familije liganada i najmanje dva peptidna linkera koji međusobno povezuju monomere članove TNF familije liganada. Nedavni eksperimenti, međutim, pokazali su da ovi jednolančani fuzioni polipeptidi pokazuju neželjenu agregaciju.

[0009] WO 2010/010051 opisuje jednolančane fuzione polipeptide koji sadrže tri rastvorljiva citokinska domena TNF familije i najmanje dva peptidna linkera. Opisani fuzioni polipeptidi su suštinski ne-agregirajući.

[0010] Dodatno, prethodni rad, uključujući onaj od Papadopoulos et al. (Cancer Chemother Pharmacol, 2015, DOI 10.1007/s00280-015-2712-0), pokazao je da superklasteri TRAIL receptora mogu rezultovati u toksičnosti.

[0011] Shodno tome, postoji potreba u tehnici za novim agonistima TRAIL receptora koji pokazuju visoku biološku aktivnost, visoku stabilnost, nisku toksičnost, i omogućavaju efikasnu rekombinantnu proizvodnju.

Rezime pronalaska

[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje specifične proteine agoniste TRAIL receptora koji pokazuju nisku proteolitičku degradaciju, dugačak polu-život, i nisko superklasterovanje TRAIL receptora in vivo (zajedno sa istovremenom toksičnošću).

[0013] Proteini agonisti TRAIL receptora opisani ovde generalno sadrže: (i) prvi rastvorljivi TRAIL citokin domen; (ii) prvi peptid linker; (iii) drugi rastvorljivi TRAIL domen; (iv) drugi peptid linker; (v) treći rastvorljivi TRAIL domen; i (vi) Fc fragment antitela.

[0014] Ovde je opisan jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži: (i) prvi rastvorljivi TRAIL domen, (ii) prvi peptid linker, (iii) drugi rastvorljivi TRAIL domen, (iv) drugi peptid linker, (v) treći rastvorljivi TRAIL domen, i (vi) Fc fragment antitela. Fc fragment antitela (vi) može se nalaziti N terminalno u odnosu na prvi TRAIL domen (i) i/ili C-terminalno u odnosu na treći TRAIL domen (v). Prema predmetnom pronalasku, Fc fragment antitela nalazi se C terminalno u odnosu na treći TRAIL domen (v). U jednom primeru izvođenja, polipeptid je suštinski ne-agregirajući. Drugi i/ili treći rastvorljivi TRAIL domen može biti N-terminalno skraćen domen koji izborno sadrži mutacije aminokiselinske sekvence.

[0015] Najmanje jedan od rastvorljivih TRAIL domena, naročito najmanje jedan od rastvorljivih TRAIL domena (iii) i (v), može biti rastvorljivi TRAIL domen sa N-terminalnom sekvencom koja počinje između aminokiseline Gln120 i Val122 humanog TRAIL i gde Arg121 može biti zamenjen sa neutralnom aminokiselinom, npr., Ser ili Gly. Najmanje jedan od rastvorljivih TRAIL domena, naročito najmanje jedan od rastvorljivih TRAIL domena (iii) i (v), može biti rastvorljivi TRAIL domen sa N-terminalnim sekvencom izabranom od (a) Arg121 - Val122 - Ala123 i (b) (Gly/Ser)121 - Val122 - Ala123. Rastvorljivi TRAIL domen može se završavati sa aminokiselinom Gly281 humanog TRAIL i/ili izborno sadrži mutaciju na položajima R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191 , Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267 ili D269 ili na dva ili više pomenutih položaja. Prema predmetnom pronalasku, rastvorljivi TRAIL domen (i) sastoji se od aminokiselina Gln120 -Gly281 humanog TRAIL prema SEQ ID NO: 1 i rastvorljivi TRAIL domeni (iii) i (v) sastoje se od aminokiselina Arg121 - Gly281 humanog TRAIL prema SEQ ID NO: 1.

[0016] Prvi i drugi peptidni linkeri (ii) i (iv) mogu nezavisno imati dužinu od 3-8 aminokiselina, naročito dužinu od 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselina, i poželjno su glicin/serin linkeri, koji izborno sadrže asparaginski ostatak koji može biti glikozilovan. Prema predmetnom pronalasku, prvi i drugi peptidni linkeri (ii) i (iv) sastoje se od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2. Polipeptid može dodatno sadržati N-terminalni domen signalnog peptida, npr., od SEQ ID NO: 12, koji može sadržati mesto za cepanje proteazom, i/ili koji dodatno sadrži C-terminalni element koji može sadržati i/ili se vezivati sa domenom za prepoznavanje/prečišćavanje, npr., Strep-tag prema SEQ ID NO: 13.

[0017] Prema predmetnom pronalasku, Fc fragment antitela (vi) je fuzionisan sa rastvorljivim TRAIL domenom (i) i/ili (v) preko zglobnog-linkera od SEQ ID NO: 11. Fc fragment antitela (vi) se može sastojati od aminokiselinske sekvence kao što je prikazano prema SEQ ID NO: 10 ili 17. Prema predmetnom pronalasku Fc fragment antitela (vi) se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazana prema SEQ ID NO: 10. Polipeptid može sadržati aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 14, 15 ili 18.

[0018] Ovde je opisan protein agonist TRAIL receptora koji sadrži polipeptid koji ima aminoksielinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19, 20 ili 21.

[0019] Ovde je takođe opisan protein agonist TRAIL receptora koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, ili 30.

[0020] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein agonist TRAIL receptora koji sadrži polipeptid koji ima aminoksielinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19.

[0021] U sledećem apsektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein agonist TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminoksielinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19. U jednom primeru izvođenja, dva polipeptida su kovalentno vezana preko tri interlančane disulfidne veze formirane između cisteinskih ostataka 513, 519, i 522 svakog polipeptida.

[0022] U jednom primeru izvođenja, jedan ili više asparaginskih ostataka na položajima 168 i 337 polipeptida (ili više njih) su N-glikozilovani. U sledećem primeru izvođenja, asparaginski ostaci na položajima 168 i 337 polipeptida (ili više njih) su oba N-glikozilovana.

[0023] U sledećem primeru izvođenja, polipeptidi (ili više njih) su dodatno post-translaciono modifikovani. U sledećem primeru izvođenja, post-translaciona modifikacija sadrži N-terminalni glutamin modifikovan u piroglutamat.

[0024] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenasa, i/ili ađuvanasa. U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku. U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku. U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku. U sledećem primeru izvođenja, ćelija prema pronalasku je eukariotska ćelija. U sledećem primeru izvođenja, ćelija prema pronalasku je sisarska ćelija. U sledećem primeru izvođenja, ćelija prema pronalasku je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). U drugim primerima izvođenja, ćelija je izabrana iz grupe koja se sastoji od CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, i CHO-K1 ćelija. Ćelija može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4, i hibridoma ćelija.

[0025] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku za upotrebu u postupku tretiranja subjekta koji ima TRAIL-povezanu bolest ili poremećaj. Protein agonist TRAIL receptora može se primeniti zasebno. Protein agonist TRAIL receptora može se primeniti pre, istovremeno, ili nakon primene drugog sredstva. U sledećem primeru izvođenja, TRAIL-povezana bolest ili poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji od: tumora, infektivnih bolesti, inflamatornih bolesti, metaboličkih bolesti, autoimunih poremećaja, degenerativnih bolesti, bolesti povezanih sa apoptozom, i odbacivanja transplanta. U jednom primeru izvođenja, tumori su solidni tumori. U jednom primeru izvođenja, tumori nastaju iz grupe kancera koji se sastoje od sarkoma, kancera jednjaka, i kancera želudca. U sledećem primeru izvođenja, tumori nastaju od Ewingovog sarkoma ili fibrosarkoma. U sledećem primeru izvođenja, tumori nastaju od grupe kancera koja se sastoji do nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera jajnika, kancera glave i vrata, i sitnoćelijskog kancera pluća (SCLC). U sledećem primeru izvođenja, tumori su limfatični tumori. U jednom primeru izvođenja, tumori su hematološki tumori. U sledećem primeru izvođenja, tumori nastaju od ne-Hodgkin-ovog limfoma, leukemije, akutne limfoblastične leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), B ćelijskog limfoma, Burkitt-ovog limfoma, hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), ili triholeukemije. U sledećem primeru izvođenja, autoimuni poremećaji su reumatoidne bolesti, artritične bolesti, ili reumatoidne i artritične bolesti. U sledećem primeru izvođenja, bolest ili poremećaj je reumatoidni artritis. U sledećem primeru izvođenja, degenerativna bolest je neurodegenerativna bolest. U sledećem primeru izvođenja, neurodegenerativna bolest je multipla skleroza.

[0026] Drugo sredstvo može biti hemoterapeutik, radioterapeutik, ili biološko sredstvo. Drugo sredstvo može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od Duvelisib, Ibrutinib, Navitoclax, i Venetoclax. Drugo sredstvo može biti apoptotsko sredstvo. Apoptotsko drugo sredstvo može biti izabrano iz grupe koja se sastoji od Bortezomib, Azacitidine, Dasatinib, i Gefitinib. Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu se primeniti na pacijenta intravenskom ili potkožnom primenom. Opisane farmaceutske kompozicije mogu se primeniti na pacijenta oralnom, parenteralom, intramuskularnom, intrartikularnom, intrabronhijalnom, intraabdominalnom, intrakapsularnom, intrakartilaginom, intrakavitarnom, intracelijalnom, intracerebelarnom, intracerebroventrikularnom, intrakoličnom, intracervikalnom, intragastričnom, intrahepatičkom, intramiokardijalnom, intraostealnom, intrapelvičnom, intraperikardijalnom, intraperitonealnom, intrapleuralnom, intraprostatičkom, intrapulmonarnom, intrarektalnom, intrarenalnom, intraretinalnom, intraspinalnom, intrasinovijalnom, intratorakalnom, intrauterinom, intravezikalnom, bolus, vaginalnom, rektalnom, bukalnom, sublingvalnom, intranazalnom, ili transdermalnom primenom.

[0027] U jednom primeru izvođenja, protein agonist TRAIL receptora primenjen je kao pojedinačni bolus. U sledećem primeru izvođenja, protein agonist TRAIL receptora može se primeniti u nekoliko podeljenih doza. Protein agonist TRAIL receptora se može primeniti sa oko 0.1-100 mg/kg. U jednom primeru izvođenja, protein agonist TRAIL receptora se može primeniti u dozi izabranoj iz grupe koja se sastoji od: oko 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-15, 1-7.5, 1.25-15, 1.25-7.5, 2.5-7.5, 2.5-15, 5-15, 5-7.5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, i 10-100 mg/kg. U drugim primerima izvođenja, protein agonist TRAIL receptora je prisutan u farmaceutskim kompozicijama sa oko 0.1-100 mg/ml. U jednom primeru izvođenja, protein agonist TRAIL receptora je prisutan u farmaceutskim kompozicijama u količini izabranoj iz grupe koja se sastoji od: oko 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, ili 10-100 mg/ml. Terapeutski efikasna količina proteina agonista TRAIL receptora može se primeniti na subjekta. Profilaktički efikasna količina proteina agonista TRAIL receptora može se primeniti na subjekta.

Opis slika

[0028]

Slika 1 Struktura domena jednolančanog fuzionog polipeptida koji sadrži tri TRAIL domena. I., II., III. Rastvorljivi TRAIL domeni.

Slika 2 Šematski prikaz koji predstavlja opštu strukturu TRAIL. ■ ■ ■ Ćelijska membrana, N-terminus lociran unutar ćelije,

1. anti-paralelna β-nabrana ploča receptor-vezujućeg domena (RBD),

2. interfejs RBD i ćelijske membrane,

3. mesto cepanja sa proteazom.

Slika 3 Šematski prikaz koji predstavlja strukturu nativnog TRAIL trimera. Cilindrične strukture predstavljaju RBD. N-terminusi spajaju RBD sa ćelijskom membranom.

Slika 4 Šematski prikaz koji predstavlja strukturu tri rastvorljiva domena koji sadrže vezujući domen receptora TRAIL. I., II., III. rastvorljivi TRAIL domeni.

Slika 5 Trimerizacija rastvorljivih domena koji sadrže RBD TRAIL, naznačeni time da N- i C-terminusi tri rastvorljiva domena formiraju površinu.

Slika 6 Šematski prikaz koji predstavlja strukturu jednolančanog TRAIL koji sadrži ceo ili deo regiona u obliku stabljike koji ilustruje neophodnost dužih linkera za kompenzaciju udaljenostii do N-terminusa sledećeg rastvorljivog domena.

Slika 7 scFv-TRAIL fuzioni protein poznat iz tehnike.

Slika 8 Fc-TRAIL fuzioni protein poznat iz tehnike.

Slika 9A Jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži dodatni Fab fragment antitela.

Slika 9B Jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži dodatni scFv fragment antitela.

Slika 10 Dimerizacija dva N-terminalno fuzionisana scFc fuziona polipeptida preko disulfidnih mostova.

Slika 11 Dimerizacija dva C-terminalno fuzionisana scFc fuziona polipeptida preko disulfidnih mostova.

Slika 12 Dimerizacija jednolančanih fuzionih polipeptida preko linkera.

Slika 13 Jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži dodatni Fab fragment antitela koji je dodatno fuzionisan sa drugim fuzionim polipeptidom ili sa scFv fuzionim polipeptidom. Slika 14 Dimerizacija dva scFab fuziona polipeptida preko disulfidnih mostova.

Slika 15 N-terminalno fuzionisani scFc fuzioni polipeptidi koji dodatno sadrže Fv i/ili Fab fragment antitela.

Slika 16 C-terminalno fuzionisani scFc fuzioni polipeptidi koji dodatno sadrže Fv i/ili Fab fragment antitela.

Slika 17A Primer proteina agonista TRAIL receptora kao što je prikazano sa N-terminalnim domenom sa signalnim peptidom dat je prema SEQ ID NO: 14. Zreli protein (koji ne uključuje N-terminalni domen sa signalnim peptidom) dat je prema SEQ ID NO: 19.

Slika 17B Šematski prikaz koji predstavlja ukupnu strukturu i obeleženu sekvencu primera proteina agonista TRAIL receptora.

Slika 18 Postavka ELISA analize za kvantifikaciju TRAIL-receptor agonista koji sadrže FCdomen.

Slika 19 Protein agonist TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 indukuje ćelijsku smrt kod humanih ćelijskih linija tumora in vitro. SKM-1, Colo205 ili Jurkat ćelije su tretirane sa rastućim koncentracijama proteina agonista TRAIL receptora 24 časa i i procenjena je vijabilnost ćelija.

Slike 20(A-C) Protein agonist TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 deluje sinergistički sa anti-tumorogenim sredstvima in vitro. SU-DHL-4 ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama proteina agonista TRAIL receptora u prisustvu ili odsustvu naznačenih koncentracija venetoclax (Slika 20A) ili navitoclax (Slika 20B) 24 časa. Alternativno, (Slika 20C) NCI-H596 ćelije su tretirane sa rastućim koncentracijama proteina agonista TRAIL receptora u prisustvu ili odsustvu naznačenih koncentracija docetaxel (DTX) 72 časa. Vijabilnost ćelija je procenjena i sinergističko dejstvo je određeno sa Bliss zbirom.

Slika 21 Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 na rast tumora u Colo205 ksenograft modelu kolorektalnog karcinoma.

Slika 22 Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 na rast tumora u SKM-1 ksenograft modelu akutne mijeloidne leukemije.

Slika 23 Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 na rast tumora u H460LM ksenograft modelu nesitnoćelijskog kancera pluća.

Slike 24(A-G) Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 na rast tumora u PDX modelima. Dijamanti, tretirani sa proteinom agonistom TRAIL receptora; Kvadrati, netretirani. Zapremine tumora su prikazane za (A) CTG-0069, (B) CTG-0167, (C) CTG-0293, (D) CTG-0785, (E) CTG-0714, (F) CTG-0136, i (G) CTG-0485.

Detaljan opis pronalaska

[0029] Prema predmetnom pronalasku, nađeno je da fuzionisanje jednolančanog TRAIL receptor-vezujućeg domena sa Fc domenom rezultuje u heksavalentnom agonistu TRAIL receptora koji obezbeđuje visoku biološku aktivnost sa dobrom stabilnošću. Shodno tome, obezbeđen je jednolančani fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje tri rastvorljiva TRAIL domena povezana sa dva peptidna linkera i N-terminalno i/ili C-terminalno Fc fragment antitela.

[0030] Poželjno, jednolančani fuzioni polipeptid je neagregirajući. Termin "ne-agregirajući" odnosi se na monomerni sadržaj preparata od ≥ 50%, poželjno ≥ 70% i poželjnije ≥ 90%. Odnos monomernog sadržaja prema sadržaju agregata može se odrediti ispitivanjem količine formiranog agregata korišćenjem ekskluzione hromatografije (SEC). Stabilnost u pogledu agregacije može se odrediti sa SEC nakon definisanih vremenskih perioda, npr. od par do nekoliko dana, do nedelja i meseci pod različitim uslovima skladištenja, npr. na 4°C ili 25°C. Da bi se fuzioni protein klasifikovao kao suštinski ne-agregirajući, poželjno je da je monomerni sadržaj kao što je prethodno definisano nakon perioda od nekoliko dana, npr. 10 dana, poželjnije nakon nekoliko nedelja, npr. 2, 3 ili 4 nedelje, i najpoželjnije nakon nekoliko meseci, npr.2 ili 3 meseca skladištenja na 4°C, ili 25°C.

[0031] Jednolančani fuzioni polipeptid može sadržati dodatne domene koji mogu biti locirani na njihovim N- i/ili C-terminusima. Primeri dodatnih fuzionih domena su npr. N-terminalni domen signalnog peptida koji može sadržati mesto isecanja sa proteazom ili C-terminalni element koji može sadržati i/ili se vezivati sa domenom za prepoznavanje/prečišćavanje. Prema poželjnom primeru izvođenja, fuzioni polipeptid sadrži Strep-tag na svom C-terminusu koji je fuzionisan preko linkera. Primer Strep-taga koji uključuje kratak serinski linker je prikazan u SEQ ID NO: 13.

[0032] Protein agonist TRAIL receptora prema predmetnom pronalasku sadrži tri rastvorljiva domena izvedena iz TRAIL. Poželjno, ovi rastvorljivi domeni su izvedeni iz sisara, naročito humanog TRAIL uključujući njegove alelne varijante i/ili derivate. Rastvorljivi domeni sadrže ekstracelularni deo TRAIL uključujući receptor vezujući domen bez domena koji se nalaze na membrani. Kao drugi proteini TNF superfamilije, TRAIL je usidren na membrani preko N -terminalnog dela od 15-30 aminokiselina, takozvani region stabljike. Region stabljike doprinosi trimerizaciji i obezbeđuje određenu distancu do ćelijske membrane. Međutim, region stabljike nije deo receptor vezujućeg domena (RBD).

[0033] Važno je da se RBD karakteriše određenom lokalizacijom njegovih N- i C-terminal aminokiselina. Pomenute aminokiseline su neposredno susedne i nalaze se centralno od ose trimera. Prva N-terminalna aminokiselina RBD formira anti-paralelni beta-lanac sa C-terminalnom aminokiselinom RBD (Sl. 2 i 3).

[0034] Stoga, anti-paralelni beta-lanac RBD formira interfejs sa ćelijskom membranom, koja je povezana sa i usidrena unutar ćelijske membrane preko aminokiselina regiona stabljike. Veoma je poželjno da rastvorljivi TRAIL domeni proteina agonista TRAIL receptora sadrže receptor vezujući domen TRAIL bez bilo kojih aminokiselina iz regiona stabljike (Sl. 4 i 5). Inače, dugački linker koji vezuje C-terminus jednog od rastvorljivih domena sa N – terminusom sledećeg rastvorljivog domena bi bio neophodan da bi se kompenzovao N-terminalni region stabljike sledećeg rastvorljivog domena (Slika 6), što bi moglo rezultovati u nestabilnosti i/ili formiranju agregata.

[0035] Dodatna prednost takvih rastvorljivih domena je ta da N- i C-terminalne aminokiseline RBD nisu pristupačne za bilo koja antitela protiv leka. Poželjno, jednolančani fuzioni polipeptid je sposoban da formira uređenu trimernu strukturu koja sadrži najmanje jedno funkcionalno vezujuće mesto za respektivni TRAIL receptor.

[0036] Protein agonist TRAIL receptora sadrži tri funkcionalna TRAIL receptor vezujuća mesta, tj. aminokiselinske sekvence koje su sposobne da formiraju kompleks sa TRAIL receptorom. Stoga, rastvorljivi domeni su sposobni da se vezuju za odgovarajući TRAIL receptor. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od rastvorljivih domena je sposoban za aktivaciju receptora, čime se može uticati na apoptotsku i/ili proliferativnu aktivnost. U sledećem primeru izvođenja, jedan ili više od rastvorljivih domena je izabrano kao nesposobni za aktivaciju receptora.

[0037] Rastvorljivi TRAIL domen se može izvesti iz humanog TRAIL kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1. Poželjno, rastvorljivi TRAIL domeni su izvedeni iz humanog TRAIL, naročito počinjući od aminokiselina 120-122 i sadrže naročito aminokiseline 120-281, 121-281 ili 122-281 of SEQ ID NO: 1. Izborno, aminokiselina Arg121 iz SEQ ID NO: 1 može se zameniti sa ne-naelektrisanom aminokiselinom, npr. Ser ili Gly.

Tabela 1: Sekvenca humanog TRAIL proteina

[0038] Kao što je prethodno naznačeno, rastvorljivi TRAIL domeni mogu sadržati sekvence divljeg tipa kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 1. Treba napomenuti, međutim, da je moguće uvesti mutacije u jedan ili više od ovih rastvorljivih domena, npr. mutacije koje menjaju (npr. povećavaju ili smanjuju) osobine vezivanja rastvorljivih domena. U jednom primeru izvođenja, mogu biti izabrani rastvorljivi domeni koji se ne mogu vezati za odgovarajući citokinski receptor.

[0039] Rastvorljivi TRAIL domen (i) može sadržati mutant TRAIL ili njegov vezujući domen receptora koji vezuje i/ili aktivira TRAIL-receptor 1 (TRAILR1) i/ili TRAIL-receptor 2 (TRAILR2). Vezivanje i/ili aktivnost mutanta može biti, npr., određena testovima kao što je opisano u van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), ili MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270).

[0040] Mutant može biti generisan bilo kojom tehnikom i poznate su stručnjaku, npr., tehnike opisane u van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), ili MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270) i mogu sadržati bilo koji tip strukturnih mutacija, npr., supstituciju, deleciju, duplikaciju i/ili inserciju aminokiseline. Poželjan primer izvođenja je generisanje supstitucija. Supstitucija može pogoditi najmanje jednu aminokiselinu TRAIL ili njen vezujući domen receptora kao što je ovde opisano. U poželjnom primeru izvođenja, supstitucija može pogoditi najmanje jednu od aminokiselina TRAIL, npr., humani TRAIL (npr., SEQ ID NO: 1). Poželjne supstitucije u ovom smislu pogađaju najmanje jednu od sledećeih aminokiselina humanog TRAIL prema SEQ ID NO: 1: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269. Poželjne aminokiselinske supstitucije humanog TRAIL prema SEQ ID NO:1 su najmanje jedna od sledećih supstitucija: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, ili D269K.

[0041] Supstitucija (supstitucije) aminokiselina mogu uticati na vezivanje i/ili aktivnost TRAIL, npr., humanog TRAIL, sa ili na ili TRAILR1 ili TRAILR2. Alternativno, aminokiselinska supstitucija (supstitucije) mogu uticati na vezivanje i/ili aktivnost TRAIL, npr., humanog TRAIL, sa ili na oba, TRAILR1 i TRAILR2. Na vezivanje i/ili aktivnost TRAILR1 i/ili TRAILR2 može uticati pozitivno, tj., jače, selektivnije ili specifičnije vezivanje i/ili veća aktivacija receptora. Alternativno, na vezivanje i/ili aktivnost TRAILR1 i/ili TRAILR2 može uticati negativno, tj., slabije, manje selektivno ili manje specifično vezivanje i/ili manja ili nedostatak aktivacije receptora.

[0042] Primeri mutanata TRAIL sa aminokiselinskom supstitucijom (supstitucijama) koji utiču na vezivanje i/ili aktivaciju i TRAILR1 i TRAILR2 mogu se naći, npr., u Tabeli 1 MacFarlane et al. (cf. prethodno) i mogu sadržati humani TRAIL mutant sa sledeće dve aminokiselinske supstitucije SEQ ID NO: 1 Y213W i S215D ili sa sledećom jednom aminokiselinskom supstitucijom: Y189A.

[0043] Primeri mutanata TRAIL sa aminokiselinskom supstitucijom (supstitucijama) koje utiču na vezivanje i/ili aktivaciju TRAILR1 mogu se naći, npr., u Tabeli 1 MacFarlane et al. (cf. prethodno) i mogu sadržati humani TRAIL mutant sa sledeće četiri aminokiselinske supstitucije SEQ ID NO: 1 N 199V, K201R, Y213W i S215D ili sa sledećih pet aminokiselinskih supstitucija: Q193S, N199V, K201R, Y213W i S215D, ili se može naći u Tabeli 2 Kelley et al. (cf. prethodno) i može sadržati humani TRAIL mutant sa sledećih šest aminokiselinskih supstitucija: Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, i K201R, ili sa Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R, i K201R.

[0044] Primeri mutanata TRAIL sa aminokiselinskom supstitucijom (supstitucijama) koje utiču na vezivanje i/ili aktivaciju TRAILR2 mogu se naći, npr., u Tabeli 1 MacFarlane et al. (cf. prethodno) ili u Tabeli 2 Kelley et al. (cf. prethodno) i može sadržati humani TRAIL mutant sa sledećih šest aminokiselinskih supstitucija SEQ ID NO: 1: Y189Q, R191 K, Q193R, H264R, I266L, i D267Q , ili se može naći u Tabeli 2 van der Sloot et al. (cf. prethodno) i može sadržati humani TRAIL mutant sa sledećom jednom aminokiselinskom supstitucijom: D269H, ili sa sledeće dve aminokiselinske supstitucije: D269H i E195R ili D269H i T214R.

[0045] Stoga je jedan poželjan primer izvođenja protein agonist TRAIL receptora kao što je ovde opisano naznačeno time da najmanje jedan od rastvorljivih domena sadrži mutant TRAIL ili njegovog vezujućeg domena receptora koji se vezuje i/ili aktivira TRAILR1 i/ili TRAILR2.

[0046] Dodatni primeri mutanata TRAIL, koji pokazuju smanjenu agregaciju receptora izazvanu sa TRAIL su H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q) i H177 (S, T).

[0047] Jedan poželjan primer proteina agonista TRAIL receptora sadrži mutant TRAIL ili vezujući domen receptora kao što je ovde opisano je protein agonist TRAIL receptora naznačen time da komponenta (i) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, naročito kao što je naznačeno u nastavku.

[0048] Takva aminokiselinska supstitucija pogađa najmanje jedan od sledećih aminokiselinskih položaja humanog TRAIL (SEQ ID NO: 1): R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269.

[0049] Takva aminokikselinska supstitucija je najmanje jedna od sledećih: R13OE, G16OM, H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q), H177 (SJ)1 Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, ili D269K.

[0050] Poželjan TRAIL-R2 selektivan domen sadrži aminokiselinske supstitucije Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L i D267Q.

[0051] Poželjan TRAIL-R1 selektivan domen sadrži aminokiselinske supstitucije Y189A, Q193S, N199V, K201R, Y213W i S215D.

[0052] Jednolančani fuzioni molekul predmetnog pronalaska sadrži tri rastvorljiva TRAIL domena, i to komponente (i), (iii) i (v). Stabilnost jednolančanog TRAIL fuzionog polipeptida protiv agregacije je pojačana, ako je drugi i/ili treći rastvorljivi TRAIL domen N-terminalno skraćen domen koji izborno sadrži mutacije aminokiselinske sekvence. Na taj način, poželjno, i drugi i treći rastvorljivi TRAIL domen su N-terminalno skraćeni domeni koji izborno sadrže mutacije aminokiselinske sekvence u N-terminalnim regionima, poželjno unutar prvih pet aminokiselina N-terminusa rastvorljivog TRAIL domena. Ove mutacije mogu da sadrže zamenu naelektrisane, npr. kisele ili bazne aminokiseline, neutralnom aminokiselinom, naročito serinom ili glicinom.

[0053] Nasuprot tome, izbor prvog rastvorljivog TRAIL domena nije kritičan. Ovde, može biti korišćen rastvorljivi domen koji ima N-terminalnu sekvncu pune dužine. Trebalo bi naglasiti, međutim, da takođe prvi rastvorljivi TRAIL domen može imati N-terminalno skraćenu i izborno mutiranu sekvencu.

[0054] U predmetnom pronalasku, rastvorljivi TRAIL domeni (i), (iii) i (v) su rastvorljivi humani TRAIL domeni. Prvi rastvorljivi TRAIL domen (i) može biti izabran od nativnih, skraćenih i/ili mutiranih sekvenci. Na taj način, prvi rastvorljivi TRAIL domen (i) ima N-terminalnu sekvencu koja može da počne između aminokiseline Glu116 i Val122 humanog TRAIL, i pri čemu Arg121 može biti zamenjen neutralnom aminokiselinom, npr. sa Ser ili Gly. Drugi i treći rastvorljivi TRAIL domeni (iii) i (v) imaju skraćenu N-terminalnu sekvencu koja poželjno počinje između aminokiseline Gln120 i Val122 humanog TRAIL i pri čemu Arg121 može biti zamenjen drugom aminokiselinom, npr. Ser ili Gly.

[0055] Poželjno, N-terminalna sekvenca rastvorljivih TRAIL domena (iii) i (v) je izabrana od: (a) Arg121 - Val122 - Ala123 i

(b) (Gly/Ser) 121.

[0056] Rastvorljivi TRAIL domen se poželjno završava aminokiselinom Gly281 ili humanim TRAIL. U određenim primerima izvođenja, TRAIL domen može da sadrži unutrašnje mutacije kao što su opisane u prethodnom tekstu.

[0057] Komponente (ii) i (iv) proteinskog agonista TRAIL receptora su peptidni linker elementi locirani između komponenti (i) i (iii) ili (iii) i (v), respektivno. Fleksibilni linker elementi imaju dužinu od 3-8 aminokiselina, naročito dužinu od 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselina. Linker elementi su poželjno glicin/serin linkeri, tj. peptidni linkeri koji se značajno sastoje od aminokiseline glicin i serin. U slučajevima u kojima se rastvorljivi domen citokina završava sa S ili G (C-terminus), npr. humani TRAIL, linker počinje posle S ili G. U slučajevima u kojima rastvorljivi domen citokina počinje sa S ili G (N-terminus), linker se završava pre ovog S ili G.

[0058] Trebalo bi naglasiti da linker (ii) i linker (iv) ne moraju biti iste dužine. U cilju smanjenja potencijalne imunogenosti, može biti poželjno koristiti kraće linkere. Pored toga izlazi da kraći linkeri dovode do jednolančanih molekula sa smanjenom tendencijom da formiraju agregate. Dok linkeri koji su značajno duži od onih koji su ovde navedeni mogu da ispoljavaju nepovoljne osobine agregata.

[0059] Ako je poželjno, linker može da sadrži asparaginski ostatak koji može da formira glikozilatno mesto Asn-Xaa-Ser. U određenim primerima izvođenja, jedan od linkera, npr. linker (ii) ili linker (iv) sadrži glikozilaciono mesto. U drugim primerima izvođenja, oba linkera (iv) sadrže glikozilaciona mesta. U cilju povećanja rastvorljivosti sc TRAIL proteina i/ili u cilju smanjenja potencijalne imunogenosti, može biti poželjno da linker (ii) ili linker (iv) ili oba sadrže glikozilaciono mesto.

[0060] Poželjne linker sekvence su izabrane od GSGSGSGS (SEQ ID NO: 3), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 2), GGSGSGSG (SEQ ID NO: 4), GGSGSG (SEQ ID NO: 5), GGSG (SEQ ID NO: 6), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 7), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 8), GGNGSG (SEQ ID NO: 9), i GSGS (SEQ ID NO: 23).

[0061] Prema najpoželjnijem primeru izvođenja, linker sekvence su svaka GSGSGNGS prema SEQ ID NO: 2. Primeri linkerskih sekvenci su prikazani u Tabeli 2.

Tabela 2: Primeri linker sekvenci

[0062] Protein agonist TRAIL receptora dodatno sadrži domen Fc fragmenta antitela koji može biti lociran N-terminalno prema prvom TRAIL domenu (i) i/ili C-terminalno prema trećem TRAIL domenu (v). Poželjno, domen Fc fragmenta antitela sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 10. Alternativno, domen Fc fragmenta sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 17. Primeri domena Fc fragmenta su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3: Primeri domena Fc fragmenta

[0063] Ukupan broj glikozita i pojedinačni položaj ugljenih hidrata u tri dimenzije utiče na in vivo stabilnost proteina agonista TRAIL receptora. Pored toga, prepoznavanje ugljenih hidrata zavisi od lokalne gustine terminalnih saharida, grananja ugljenohidratnog stabla i relativnog položaja ugljenohidratne materije.

[0064] Deplecija ugljenih hidrata CH2-domena je neophodna u cilju izbegavanja unakrsnog vezivanja baziranog na Fc-receptoru in vivo i potencijalne toksičnosti bazirane na superklasterovanju TRAIL-receptora. Pored toga, delimično razloženi ugljeni hidrati smanjuju in vivo polu-život proteina agonista TRAIL receptora preko mehanizama vođenih preko lectina. Smanjenjem ukupnog broja glikozilacionih mesta na molekulu, rezultujuće jedinjenje je manje dostupno za ove mehanizme, povećavajući polu-život. Prema tome, ukupan broj glikozita na proteinu agonistu TRAIL receptora je smanjen preko deplecije CH2 glikozita, rezultujući u proteinu agonistu TRAIL receptora koji sadrži N297S ekvivalentne mutacije (prema EU sistemu numeracije) stvarajući aglikozil-CH2 domene.

[0065] CH2-glikoziti prisutni u oblastima na unutrašnjoj površini normalno štite subdomen od proteaza u toku "otvorenih Fc-konformacionih prelaza" pri čemu su zglobne-interlančane disulfidne veze redukovane i kovalentna interlančana veza je prekinuta. Ovo omogućava CH2-disocijaciju i izlaganje oblasti unutrašnje površine proteazama. Proteini agonisti TRAIL receptora koji sadrže N297S ekvivalentnu mutaciju (prema EU sistemu numeracije) stvarajući aglikozil-CH2 prema tome verovatno su manje proteolitički stabilni od ekvivalentnih struktura sa CH2 glikozilacijom divljeg tipa. Ovo bi uticalo na stabilnost jedinjenja u toku USP/DSP/čuvanja, gde su prisutne proteaze ćelije domaćina i imaju dugotrajan pristup strukturi. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, agonist TRAIL receptora nema CH2 glikozite, ali sadrži glikozite u linkerskim sekvencama svakog polipeptidnog lanca (npr., GSGSGNGS prema SEQ ID NO: 2). U određenim ilustrativnim primerima izvođenja, agonist TRAIL receptora sadrži dva glikozita po polipeptidnom lancu, za ukupno četiri glikozita. Prema predmetnom pronalasku, domen Fc fragmenta antitela je fuzionisan preko zglobnoglinker elementa. Zglobni-linker element ima dužinu od 10-30 aminokiselina, naročito dužinu od 15-25 aminokiselina, npr. 22 aminokiselina. Zglobni-linker element poželjno sadrži sekvencu zglobnog-regiona imunoglobulina, ovde označen kao "Ig zglobni-region". Termin "Ig zglobni-region" označava bilo koji polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja deli identičnost ili sličnost sekvence sa delom prirodne sekvence Ig zglobnog-regiona koja obuhvata cisteinske ostatke na kojima disulfidne veze vezuju dva teška lanca imunoglobulina.

[0066] Derivati i analozi zglobnog-regiona mogu biti dobijeni pomoću mutacija. Derivat ili analog kao što je ovde označen je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja deli identičnost ili sličnost sekvence sa sekvencom pune dužine divljeg tipa (ili prirodnim proteinom) osim što ima jednu ili više razlika u aminokiselinskoj sekvenci koje se mogu pripisati deleciji, inserciji i/ili supstituciji. Prema predmetnom pronalasku, međutim, termin "zglobni-linker" nije ograničen na one linkere koji sadrže Ig zglobni-region ili njegov derivat, već bilo koji linkeri koji su dovoljno dugi da omoguće da domeni vezani zglobnim-linkerskim elementom postignu biološki aktivnu konformaciju.

[0067] Broj molekula sa otvorenom Fc-konformacijom u pojedinačnom proteinskom agonistu TRAIL receptora zavisi od određenog broja interlančanih-disulfidnih veza prisutnih u zglobnom regionu. Prema tome, u jednom primeru izvođenja treći cistein je uveden u zglobni region proteinskog agonista TRAIL receptora ovog pronalaska u cilju poboljšanja efekta deplecije CH2-glikozita.

[0068] Pored toga, proteinski agonist TRAIL receptora prema pronalasku dodatno sadrži mutaciju gornjeg-zglobnog lizina u glicin da bi se smanjila proteolitička obrada na ovom mestu.

[0069] Naročito poželjan zglobni-linkerski element sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 11 (Tabela 4).

[0070] Protein agonist TRAIL receptora može dodatno da sadrži N-terminalni domen signalnog peptida, koji omogućava obradu, npr. ekstracelularnu sekreciju, u pogodnoj ćeliji domaćinu. Poželjno, N-terminalni domen signalnog peptida sadrži mesto cepanja proteazom, npr. mesto cepanja signalnom peptidazom i na taj način može biti uklonjeno posle ili u toku ekspresije da bi se dobio zreo protein. Naročito poželjan N-terminalni domen signalnog peptida sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 12 (Tabela 4).

[0071] Pored toga, protein agonist TRAIL receptora može dodatno da sadrži C-terminalni element, koji ima dužinu od npr. 1-50, poželjno 10-30 aminokiselina koji može da obuhvata ili da se veže za domen za prepoznavanje/prečišćavanje, npr. FLAG domen, Strep-tag ili Strep-tag II domen i/ili a poli-His domen. Prema naročito poželjnom primeru izvođenja, fuzioni polipeptid sadrži Strep-tag fuzionisan za C-terminus preko kratkog serinskog linkera kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 (Tabela 4).

[0072] Ilustrativni zglobni-linker element, N-terminalni domen signalnog peptida i kratak serinski linker prikazani su u Tabeli 4.

Tabela 4: Primeri domena i linkera

[0073] Prema predmetnom pronalasku, fuzioni polipeptid sadrži tri rastvorljiva TRAIL domena fuzionisana sa peptidnim linkerskim elementima od SEQ ID NO: 2. Prvi rastvorljivi TRAIL domen (i) sastoji se od aminokiselina 120-281 humanog TRAIL prema SEQ ID NO: 1 i rastvorljivi TRAIL domeni (iii) i (v) sastoje se od aminokiselina 121-281 humanog TRAIL prema SEQ ID NO: 1. Dodatno, fuzioni polipeptid sadrži domen Fc fragmenta antitela prema SEQ ID NO: 10 koji je fuzionisan C-terminalno za rastvorljivi TRAIL domen (v) preko zglobnog-linkera prema SEQ ID NO: 11. Pronalazači su iznenađujuće našli da ovaj određeni fuzioni polipeptid obezbeđuje poboljšanu biološku aktivnost i naročito je stabilan. Aminokiselinska sekvenca proteina agonista TRAIL receptora prema pronalasku je navedena u SEQ ID NO: 19.

[0074] Pored toga, fuzioni polipeptid može da sadrži N-terminalni domen signalnog peptida npr. prema SEQ ID NO: 12. Specifičan primer proteina agonista TRAIL receptora koji je ovde opisan je prikazan u SEQ ID NO: 14.

[0075] Fuzioni polipeptid može dodatno da sadrži C-terminalni Strep-tag koji je fuzionisan za polipeptid prema pronalasko preko kratkog serinskog linkera kao što je prikazan u SEQ ID NO: 13. U ovom aranžmanu, Fc fragment se poželjno sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 10 ili 17. Pored toga, Fc fragment može da se sastoji od kraćeg Fc fragmenta, na primer uključujući aminokiselinu 1-217 od SEQ ID NO: 10. Naročito poželjni primeri fuzionih polipeptida koji sadrže C-terminalni Strep-tag prikazani su u SEQ ID NOs: 15 i 18.

[0076] Ilustrativni protein agonist TRAIL receptora kao što je prikazan u SEQ ID NOs: 14, 15 i 18 svaki sadrži N-terminalni domen signalnog peptida. Domen signalnog peptida obuhvata aminokiselinu 1-20. U svakom slučaju, zreli protein počinje aminokiselinom 21. Zreli ilustrativni protein agonisti TRAIL receptora koji su ovde opisani navedeni su u SEQ ID NO: 19, 20, 21, 26, 27, 28, 29, i 30. Ilustrativni protein agonist TRAIL receptora koji su ovde opisani prikazani su u Tabeli 5.

[0077] Agonist TRAIL receptora kao što je naveden u SEQ ID NO: 19 ima smanjen ukupan broj glikozilacionih mesta (N297S mutacija u CH2 regionu obezbeđujući aglikozilovani CH2 domen), povećani broj interlančanih disulfidnih veza u zglobnom regionu, i mutaciju gornjegzglobnog lizina u glicin. Ove promene obezbeđuju smanjenje u potencijalnom razlaganju i superklasterovanje TRAIL receptora (zajedno sa istovremenom toksičnošću) uz povećanje polu-života molekula. U nekim primerima izvođenja, N-terminalni glutamin je modifikovan u piroglutamat (Liu et al.2011, J. Biol. Chem.286:11211-11217).

Tabela 5: Primeri proteina agonista TRAIL receptora

[0078] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji kodira protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku. Molekul nukleinske kiseline može biti molekul DNK, npr. dvolančani ili jednolančani molekul DNK ili molekul RNK. Molekul nukleinske kiseline može da kodira protein agonist TRAIL receptora ili njegov prekursor, npr. pro- ili pre-proformu proteina agonista TRAIL receptora koji može da sadrži signalnu sekvencu ili druge heterologne aminokiselinske delove za izlučivanje ili prečišćavanje koji su poželjno locirani na N- i/ili C-terminusu proteina agonista TRAIL receptora. Heterologni aminokiselinski delovi mogu biti vezani za prvi i/ili drugi domen preko mesta cepanja proteazom, npr. faktor X3, trombin ili mesto cepanja IgA proteazom. Specifičan primer sekvence nukleinske kiseline koji je ovde opisan je prikazan u Tabeli 6 kao SEQ ID NO: 16. Ovaj molekul nukleinske kiseline kodira fuzioni polipeptid od SEQ ID NO: 14.

Tabela 6: Sekvenca nukleinske kiseline primera proteina agonista TRAIL receptora

[0079] Molekul nukleinske kiseline može biti operativno vezan za ekspresionu kontrolnu sekvencu, npr. ekspresionu kontrolnu sekvencu koja omogućava ekspresiju molekula nukleinske kiseline u željenoj ćeliji domaćinu. Molekul nukleinske kiseline može biti lociran na vektoru, npr. plazmidu, bakteriofagu, virusnom vektoru, hromozomskom integracionom vektoru, itd. Primeri pogodnih ekspresionih kontrolnih sekvenci i vektora su opisani na primer od strane Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, i Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons ili njegova novija izdanja. Različiti sistemi ekspresionog vektora/ćelije domaćina mogu biti korišćeni za ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju protein agonist TRAIL receptora prema predmetnom pronalasku. Pogodne ćelije domaćini obuhvataju, ali bez ograničenja na, prokariotske ćelije kao što su bakterije, npr. E.coli, eukariotske ćelije domaćini kao što su ćelije kvasca, ćelije insekata, biljne ćelije ili životinjske ćelije, poželjno sisarske ćelije i, poželjnije, humane ćelije. Dalje je opisan ne-humani organizam transformisan ili transficiran sa molekulom nukleinske kiseline kao što je opisan u prethodnom tekstu. Takvi transgeni organizmi mogu biti generisani pomoću poznatih postupaka genetičkog transfera uključujući homologu rekombinaciju.

[0080] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži kao aktivno sredstvo najmanje jedan protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku, odgovarajuću nukleinsku kiselinu koja ga kodira ili transformisanu ili transfektovanu ćeliju predmetnog pronalaska.

[0081] Termin "bolest ili poremećaj povezan sa TRAIL" kao što je ovde korišćen je bilo koja bolest ili poremećaj koji može biti poboljšan dodavanjem agonista TRAIL receptora. Najmanje jedan protein agonist TRAIL receptora, odgovarajuća nukleinska kiselina koja ga kodira ili transformisana ili transfektovana ćelija, svi kao što su opisani ovde mogu biti korišćeni u terapiji, npr., u profilaksi i/ili lečenju poremećaja uzrokovanih sa, povezanih sa i/ili praćenih sa disfunkcijom TRAIL, naročito proliferativnih poremećaja, kao što su tumori, npr. solidni ili limfatični tumori; infektivne bolesti; inflamatorne bolesti; metaboličke bolesti; autoimuni poremećaji, npr. reumatoidne i/ili artritične bolesti; degenerativne bolesti, npr. neurodegenerativne bolesti kao što je multipla skleroza; bolesti povezane sa apoptozom ili odbacivanja transplanta.

[0082] Termin "disfunkcija TRAIL" kao što je ovde korišćena treba razumeti kao bilo koju funkciju ili ekspresiju TRAIL koja odstupa od normalne funkcije ili ekspresije TRAIL, npr., prekomerna ekspresija TRAIL gena ili proteina, redukovana ili poništena ekspresija TRAIL gena ili proteina u poređenju sa normalnim fiziološkim ekspresionim nivoom TRAIL, povećana aktivnost TRAIL, smanjena ili poništena aktivnost TRAIL, povećano vezivanje TRAIL za bilo koji od vezujućih partnera, npr., za receptor, naročito TRAIL receptor ili drugi molekul citokina, redukovano ili poništeno vezivanje za bilo kog vezujućeg partnera, npr. za receptor, naročito TRAIL receptor ili drugi molekul citokina, u poređenju sa normalnom fiziološkom aktivnošću ili vezivanjem za TRAIL.

[0083] Ovde je opisan postupak za dijagnozu i/ili lečenje humanog subjekta koji pati od poremećaja koji može biti dijagnostifikovan i/ili lečen ciljanim delovanjem na TRAIL receptore koje sadrži primenu na humanog subjekta proteina agonista TRAIL receptora koji je ovde otkriven tako da je efekat na aktivnost ciljnog mesta ili ciljnih mesta u humanom subjektu agonistički, jedan ili više simptoma su ublaženi i/ili postignuto je lečenje. Proteini agonisti TRAIL receptora koji su ovde obezbeđeni mogu biti korišćeni za dijagnozu i/ili lečenje ljudi koji pate od primarnih i metastatičkih kancera, uključujući karcinome dojke, debelog creva, rektuma, pluća (npr., sitnoćelijski kancer "SCLC" i nesitnoćelijski kancer pluća "NSCLC"), orofarinksa, hipofarinksa, jednjaka, želudca, pankreasa, jetre, žučne kese i žučnih kanala, tankog creva, urinarnog trakta (uključujući bubrega, bešike i urotelijuma), ženskog genitalnog trakta (uključujući grlića materice, materice i jajnika kao i horiokarcinom i gestacionu trofoblastičnu bolest), muškog genitalnog trakta (uključujući prostate, seminalnih vezikula, testisa i tumori germinativnih ćelija), endokrinih žlezda (uključujući tireoidee, nadbubrežne žlezde i hipofize), i kože, kao i hemangiome, melanome, sarkome (uključujući one koji nastaju iz kosti i mekih tkiva kao i Kaposi-ev sarkom), tumore mozga, nerava, očiju i meningi (uključujući astrocitome, gliome, glioblastome, retinoblastome, neurome, neuroblastome, Švanome i meningiome), tumore koji nastaju iz hematopoetičkih maligniteta, akutne leukemije, akutne limfoblastične leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), limfoma B ćelija, Burkitt-ovog limfoma, hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), triholeukemije, Hodgkin-ovih i ne-Hodgkin-ovih limfoma, DLBCL, folikularnih limfoma, hematopoetskih maligniteta, Kaposi-evog sarkoma, malignog limfoma, maligne histiocitoze, malignog melanoma, multiplog mijeloma, paraneoplastičnog sindroma/hiperkalcemije maligniteta ili solidnih tumora.

[0084] Farmaceutka kompozicija koja sadrži protein agonist TRAIL receptora prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač su obezbeđeni predmetnim pronalaskom. Farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo za lečenje poremećaja. Na primer, dodatno sredstvo može biti terapeutsko sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo; sredstvo za vizuelizaciju, citotoksično sredstvo, inhibitor angiogeneze, inhibitor kinaze (uključujući, ali bez ograničenja na inhibitor KDR i TIE-2), kostimulacioni molekul modulator ili inhibitor imune kontrolne tačke (uključujući, ali bez ograničenja na anti-B7.1, anti-B7.2, anti-B7.3, anti-B7.4, anti-CD28, anti-B7RP1, CTLA4-Ig, anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-PD-L2, anti-ICOS, anti-LAG-3, anti-Tim3, anti-VISTA, anti-HVEM, anti-BTLA, LIGHT fuzioni protein, anti-CD137, anti-CD137L, anti-OX40, anti-OX40L, anti-CD70, anti-CD27, anti-GAL9, anti-A2AR, anti-KIR, anti-IDO-1, anti-CD20), modulator dendritske ćelije/antigen-prikazujuće ćelije (uključujući, ali bez ograničenja na anti-CD40 antitelo, anti-CD40 L, anti-DC-SIGN, anti-Dectin-1, anti-CD301, anti-CD303, anti-CD123, anti-CD207, anti-DNGR1, anti-CD205, anti-DCIR, anti-CD206, anti-ILT7), modulator za Toll-slične receptore (uključujući, ali bez ograničenja na anti-TLR-1, anti-TLR-2, anti-TLR-3, anti-TLR-4, anti-TLR-4, anti-TLR-5, anti-TLR-6, anti-TLR-7, anti-TLR-8, anti-TLR-9), blokator adhezionog molekula (uključujući, ali bez ograničenja na anti-LFA-1 antitelo, anti-E/L selektin antitelo, mali molekul inhibitor), anti-citokinsko antitelo ili njegov funkcionalni fragment (uključujući, ali bez ograničenja na anti-IL-18, anti-TNF, ili antitelo anti-IL-6/citokinski receptor), bispecifična preusmerena T ćelijska ili NK ćelijska citotoksičnost (uključujući, ali bez ograničenja na BiTE®), terapija na bazi himernog T ćelijskog receptora (CAR-T), terapija na bazi T ćelijskog receptora (TCR), terapeutska vakcina protiv kancera, metotreksat, ciklosporin, rapamicin, FK506, detektabilni obeleživač ili reporter, antagonist TNF, anti-reumatik, relaksant mišića, narkotik, ne-steroidni antiinflamatorni lek (NSAID), analgetik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobijalno sredstvo, antipsorijatik, kortikosteroid, anabolički steroid, eritropoetin, imunizacija, imunoglobulin, imunosupresiv, hormon rasta, lek za zamenu hormona, radiofarmaceutik, antidepresiv, antipsihotik, stimulant, lek za astmu, beta agonist, streroid za inhalaciju, epinefrin ili analog, citokin ili antagonist citokina.

[0085] U postupku za lečenje kancera ili u prevenciji ili inhibiciji metastaza iz tumora opisanih ovde, protein agonist TRAIL receptora (jednog ili više) može biti korišćen pojedinačno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih sredstava, npr., hemoterapeutikom, radioterapijom ili biološkim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, sredstvo može da obuhvata sledeće: 13-cis-retinoinsku kiselinu; 2-CdA; 2-hlorodeoksiadenozin; 5-Azacitidin; 5-Fluorouracil; 5-FU; 6-Merkaptopurin; 6-MP; 6-TG; 6-tioguanin; abraksan; Accutane®; aktinomicin-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; aldesleukin; alemtuzumab; ALIMTA; alitretinoin; Alkaban-AQ®; Alkeran®; sve-transretinoinska kiselina; alfa interferon; altretamin; ametopterin; amifostin; aminoglutetimid; anagrelid; Anandron®; anastrozol; arabinozilcitozin; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; arsen trioksid; Arzerra™; asparaginaza; ATRA; Avastin®; azacitidin; BCG; BCNU; bendamustin; bevacizumab; beksaroten; BEXXAR®; bicalutamid; BiCNU; Blenoxane®; bleomicin; bortezomib; busulfan; Busulfex®; C225; kalcijum leukovorin; Campath®; Camptosar®; kamptotecin-11; kapecitabin Carac™; karboplatin; karmustin; karmustin Wafer; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; cetuksimab; hlorambucil; cisplatin; citrovorum faktor; kladribin; kortizon; Cosmegen®; CPT-11; ciklofosfamid; Cytadren®; citarabin; citarabin lipozomal; Cytosar-U®; Cytoxan®; dakarbazin; dacogen; daktinomicin; darbepoetin alfa; dasatinib; daunomicin; daunorubicin; daunorubicin hidrohlorid; daunorubicin lipozomal; DaunoXome®; dekadron; decitabin; Delta-Cortef®; Deltasone®; denileukin; diftitoks; DepoCyt™; deksametazon; deksametazon acetat; deksametazon natrijum fosfat; deksazon; deksrazoksan; DHAD; DIC; diodeks; docetaksel; Doxil®; doksorubicin; doksorubicin lipozomal; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; duvelisib; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; epirubicin; epoetin alfa; erbituks; erlotinib; Ervinija L-asparaginaza; estramustin; Ethyol Etopophos®; etoposid; etoposid fosfat; Eulexin®; everolimus; Evista®; eksemestan; Fareston®; Faslodex®; Femara®; filgrastim; floksuridin; Fludara®; fludarabin; Fluoroplex®; fluorouracil; fluorouracil (krema); fluoksimesteron; flutamid; folinska kiselina; FUDR®; fulvestrant; gefitinib; gemcitabin; gemtuzumab ozogamicin; gemzar; Gleevec™; Gliadel® Wafer; GM-CSF; goserelin; faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF); faktor stimulacije kolonije makrofaga/granulocita (G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; heksadrol; Hexalen®; heksametilmelamin; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; hidrokortizon; hidrokortizon natrijum fosfat; hidrokortizon natrijum sukcinat; hidrokorton fosfat; hidroksiurea; ibrutinib; ibritumomab; ibritumomab tiuksetan; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; interferon-alfa; interferon-alfa-2b (PEG konjugat); ifosfamid; interleukin-11 (IL-11); interleukin-2 (IL-2); imatinib mezilat; imidazol karboksamid; Intron A®; ipilimumab, Iressa®; irinotekan; isotretinoin; iksabepilon; Ixempra™; KADCYCLA®; Kidrolase (t) Lanacort®; lapatinib; L-asparaginaza; LCR; lenalidomid; letrozol; leukovorin; leukeran; Leukine™; leuprolid; leurokristin; Leustatin™; lirilumab; lipozomal Ara-C; Liquid Pred®; lomustin; L-PAM; L-sarkolizin; Lupron®; Lupron Depot@; Matulane®; maksideks; mehloretamin; mehloretamin hidrohlorid; Medralone®; Medrol®; Megace®; megestrol; megestrol acetat; inhibitori MEK; melfalan; merkaptopurin; mesna; Mesnex™; metotreksat; metotreksat natrijum; metilprednizolon; Meticorten®; mitomicin; mitomicin-C; mitoksantron M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; mustin; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; navitoklaks; Navelbine®; nelarabin; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; nilotinib; nilutamid; Nipent®; azotni iperit Novaldex®; nivolumab; Novantrone®; Nplate; oktreotid; oktreotid acetat; ofatumumab; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; oprelvekin; Orapred®; Orasone®; oksaliplatin; paklitaksel; paklitaksel protein-vezan; pamidronat; panitumumab; Panretin®; Paraplatin®; pazopanib; Pediapred®; PEG interferon; pegaspargaza; pegfilgrastim; PEG-INTRON™; PEG-L-asparaginaa; PEMETREKSED; pembrolizumab; pentostatin; pertuzumab; fenilalanin iperit; pidilizumab; Platinol®; Platinol-AQ®; prednizolon; prednizon; Prelone®; prokarbazin; PROCRIT®; Proleukin®; prolifeprospan 20 sa karmustin implantom; Purinethol®; inhibitori BRAF; raloksifen; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; rituksimab; Roferon-A®; romiplostim; Rubex®; rubidomicin hidrohlorid; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; sargramostim; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; sorafenib; SPRYCEL™; STI-571; STIVAGRA™, streptozocin; SU11248; sunitinib; Sutent®; tamoksifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; temozolomid temsirolimus; teniposid; TESPA; talidomid; Thalomid®; TheraCys®; tioguanin; tioguanin Tabloid®; tiofosfamid; Thioplex®; tiotepa; TICE®; Toposar®; topotekan; toremifen; Torisel®; tositumomab; trastuzumab; Treanda®; tremelimumab; tretinoin; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; urelumab; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; venetoklaks; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; vinblastin; vinblastin sulfat; Vincasar Pfs®; vinkristin; vinorelbin; vinorelbin tartrat; VLB; VM-26; vorinostat; votrient; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; zolendronska kiselina; zolinza; ili Zometa®, i/ili bilo koje drugo sredstvo koje nije specifično ovde navedeno koje ciljno deluje na slične puteve.

[0086] Kada su dve ili više supstanci ili principa korišćeni kao deo kombinovanog režima lečenja, one mogu biti primenjivane preko istog puta primene ili preko različitih puteva primene, u uglavnom isto vreme ili u različita vremena (npr. uglavnom istovremeno, uzastopno ili prema naizmeničnom režimu). Kada se supstance ili principi primenjuju istovremeno preko istog puta primene, oni se mogu primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili kompozicije ili deo kombinovane farnaceutske formulacije ili kompozicije, kao što će biti jasno stručnjaku iz date oblasti tehnike.

[0087] Takođe, kada su dve ili više supstanci ili principa korišćeni kao deo kombinovanog režima lečenja, svaka od supstanci ili principa može se primeniti u istoj količini i u skaldu sa istim režimom kao što je korišćena kada je jedinjenje ili princip korišćen zasebno, i takva kombinovana upotreba može ili ne mora voditi do sinergističkog efekta. Međutim, kada kombinovana upotreba dve ili više aktivnih supstanci ili principa vodi do sinergističkog efekta, takođe je moguće smanjiti količinu jedne, više od jedne, ili svih supstanci ili principa koji će se primeniti, još uvek uz postizanje željene terapeutske aktivnosti. Ovo može, npr., biti korisno za izbegavanje, ograničavanje ili smanjivanje bilo kojih neželjenih sporednih efekata koji su povezani sa upotrebom jedne ili više supstanci ili principa kada su korišćeni u njihovim uobičajenim količinama, još uvek uz dobijanje željenog farmaceutskog ili terapeutskog efekta.

[0088] Efikasnost korišćenog režima tretmana kao što je ovde opisano može biti određena i/ili praćena na bilo koji način poznat per se za uključenu bolest ili poremećaj, kao što će biti jasno kliničkom licu. Kliničko lice će takođe biti u stanju, gde je odgovarajuće i na osnovu određenog slučaja, da promeni ili modifikuje naročiti režim tretmana, da bi se postigao željeni terapeutski efekat, da se izbegnu, ograniče ili smanje neželjeni sporedni efekti, i/ili da bi se postigla odgovarajuća ravnoteža između postizanja željenog terapeutskog efekta sa jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja neželjenih sporednih efekata sa druge strane.

[0089] Generalno, režim tretmana će se pratiti do postizanja željenog terapeutskog efekta i/ili dokle god se održava željeni terapeutski efekat. Ponovo, ovo može biti određeno od strane kliničkog lica.

[0090] U različitim primerima izvođenja, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili više proteina agonista TRAIL receptora, bilo zasebno ili u kombinaciji sa profilaktičkim sredstvima, terapeutskim agensima, i/ili farmaceutski prihvatljviim nosačima. U različitim primerima izvođenja, neograničavajući primeri korišćenja ovde opisanih farmaceutskih kompozicija uključuju dijagnozu, detekciju, i/ili monitoring poremećaja, sprečavanje, tretiranje, upravljanje, i/ili ublažavanje poremećaja ili njegovog jednog ili više simptoma, i/ili u istraživanju. Formulacija farmaceutskih kompozicija, bilo zasebno ili u kombinaciji sa profilaktičkim sredstvima, terapeutskim sredstvima, i/ili farmaceutski prihvatljivim nosačima, poznata je stručnjaku (SAD patentna objava br.20090311253 A1).

[0091] U različitim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija može sadržati jednu ili više aminokiselina, jedan ili više polisaharida i/ili polisorbata, i protein agonist TRAIL receptora prisutan u koncentraciji od između oko 0.1 i 100 mg/ml, uključujući krajnje tačke (npr., 0.1-10, 1-10, .01-50, 1-50, 1-100, 10-100, 25-100, 25-50, ili 50-100 mg/ml), gde je formulacija na pH između oko 5.0 i 7.0 uključujući krajnje tačke (npr., pH od oko 5.0-6.0, 5.5-6.0, 5.0-6.5, 5.5-6.5, ili 6.0-7.0). U jednom primeru izvođenja, najmanje jedna aminokiselina u formulaciji je histidin i prisutna je u koncentraciji od oko 10-20 mM, 10-15mM, 15-20mM, ili oko 15mM. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan polisaharid u formulaciji je saharoza i prisutna je u koncentraciji od oko 0-8.0% težina/zapremina (tež/zapr). U jednom primeru izvođenja, polisorbat u formulaciji je polisorbat 80 i u koncentraciji je od oko 0-0.06% tež/zapr. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedna aminokiselina u formulaciji je arginin i prisutna je u koncentraciji od oko 0-1.5% tež/zapr (npr., 0.5-1.5, 1.0-1.5, ili 0.5-1.0 tež/zapr). U jednom primeru izvođenja, protein agonist TRAIL receptora je prisutan u formulaciji u koncentraciji od oko 0.1-100 mg/ml, (npr., oko 1-100 mg/ml, ili oko 1-15 mg/ml, ili oko 1-7.5 mg/ml, ili oko 2.5-7.5 mg/ml, ili oko 5-7.5 mg/ml, ili oko 25-100 mg/ml, ili oko 20-60 mg/ml, ili oko 25-50 mg/ml, ili oko 25 mg/ml, ili oko 50 mg/ml, ili oko 0.1-60 mg/ml, ili oko 0.1-25 mg/ml, ili oko 1.0-60 mg/ml, ili oko 0.5-60 mg/ml, ili oko 0.1-2.0 mg/ml, ili oko 0.5-2.0 mg/ml, ili oko 1-5 mg/ml, ili oko 1-7.5 mg/ml, ili oko 1-15 mg/ml, ili oko 0.5 mg/ml, ili oko 1.0 mg/m).

[0092] Kao što je ovde korišćeno, izraz "efikasna količina" označava količinu TRAIL agonist proteina koji rezultuje u detektabilnom poboljšanju (npr., najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili više od osnovne vrednosti) u jednom ili više parametara povezanih sa disfunkcijom TRAIL ili sa TRAIL povezanom bolešću ili poremećajem.

[0093] U različitim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija je vodena formulacija, liofilizovana formulacija, ili liofilizovana i rehidrirana formulacija. U jednom primeru izvođenja, hidrirajući rastvor je dekstroza i/ili fiziološki rastvor (npr., dekstroza sa koncentracijom od oko 5% tež/zapr i/ili fiziološki rastvor sa koncentracijom od oko 0.9% tež/zapr). U jednom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži oko 15 mM histidina, oko 0.03% (tež/zapr) polisorbata 80, oko 4% (tež/zapr) saharoze, i oko 0.1 - 25 mg/ml proteina agonista TRAIL receptora, ili oko 1-15 mg/ml proteina agonista TRAIL receptora, i na pH od oko 6. U jednom primeru izvođenja, formulacija dodatno sadrži najmanje jedno dodatno sredstvo.

[0094] U različitim primerima izvođenja, korišćena je formualcija koja sadrži oko 25 mg/ml proteina agonista TRAIL receptora, oko 15 mM histidina, 0.03% polisorbata 80 (težina/zapremina, tež/zapr), 4.0% saharoze (tež/zapr), i pH od oko 6.0. U nekim primerima izvođenja, formulacija ne sadrži arginin. U nekim primerima izvođenja, formulacija pokazuje neočekivano poboljšanu stabilnost na zamrzavanje i odmrzavanje, stabilnost tečne formulacije, i/ili stabilnost liofilizovane formulacije, u poređenju sa drugim formulacijama koje sadrže druge komponente ili koncentracije.

[0095] Postupci za primenu terapeutskog sredstva obezbeđenog ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, oralnu primenu, parenteralnu primenu (npr., intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravensku i potkožnu), epiduralnu primenu, intratumoralnu primenu, mukozalnu primenu (npr., intranazalne i oralne puteve) i pulmonalnu primenu (npr., aerosolizovana jedinjenja primenjena sa inhaler ili nebulizer). Formulacija farmaceutskih kompozicija za specifične puteve primene, i materijali i tehnike neophodne za različite postupke primene su dostupne i poznate stručnjaku (SAD patentna prijava br. 20090311253 A1).

[0096] U različitim primerima izvođenja, dozni režimi se mogu podesiti da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, nekoliko podeljenih doza se može primeniti tokom određenog vremenskog perioda ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. U nekim primerima izvođenja, parenteralne kompozicije su formulisane u jediničnom doznom obliku za lakšu primenu i uniformnu dozu. Termin "jedinični dozni oblik" odnosi se na fizički zasebne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za sisarske subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da se proizvede željeni terapeutski efekat zajedno sa zahtevanim farmaceutskim nosačem.

[0097] Primer neograničavajućeg opsega za terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu proteina agonista TRAIL receptora obezbeđenu ovde je oko 0.1-100 mg/kg, (npr., oko 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1-50, 0.1-75, 1-10, 1-15, 1-7.5, 1.25-15, 1.25-7.5, 2.5-7.5, 2.5-15, 5-15, 5-7.5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, ili 10-100 mg/kg, ili bilo koja koncentracija između). U nekim primerima izvođenja, protein agonist TRAIL receptora je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji u terapeutski efikasnoj koncentraciji, npr., koncentraciji oko 0.1-100 mg/ml (npr., oko 0.1-0.5, 0.1-1, 0.1-10, 0.1-20, 0.1 - 50, 0.1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, ili 10-100 mg/ml, ili bilo koja koncentracija između). Treba uočiti da vrednosti doze mogu varirati u odnosu na tip i/ili težinu stanja koje treba ublažiti. Dodatno treba shvatiti da za bilo kog određenog subjekta, specifični dozni režimi mogu se podesiti tokom vremena u skladu sa individualnom potrebom i/ili profesionalnom procenom osobe koja primenjuje ili nadgleda primenu kompozicija, i da su dozni opsezi dati ovde samo kao primer i nije nameravano da ograničavaju obim ili izvođenje kompozicije za koju se traži zaštita.

Primeri

1. Proizvodnja proteina agonista TRAIL receptora (sc TRAIL wt)

1.1 Struktura polipeptida

A) Aminokiseline Met1 - Gly20

[0098] Ig-Kapa-signalni peptid, pretpostavljeno mesto isecanja sa peptidazom nakon aminokiseline Gly 20.

B) Aminokiseline Gln21 - Gly182

[0099] Prvi rastvorljivi citokin domen humanog TRAIL liganda (TRAIL, aminokiselina 120 -281 prema SEQ ID NO: 1).

C) Aminokiseline Gly 183 - Ser 190

[0100] Prvi peptidni linker element prema SEQ ID NO: 2.

D) Aminokiseline Arg191 - Gly351

[0101] Drugi rastvorljivi citokin domen humanog TRAIL liganda (TRAIL, aminokiselina 121 - 281 prema SEQ ID NO: 1).

E) Aminokiseline Gly352 - Ser359.

[0102] Drugi peptidni linker element prema SEQ ID NO: 2.

F) Aminokiseline Arg360 - Gly520

[0103] Treći rastvorljivi citokin domen humanog TRAIL liganda (TRAIL, aminokiselina 121 - 281 prema SEQ ID NO: 1).

G) Aminokiseline Gly521 - Cys542

[0104] Zglobni-linker element prema SEQ ID NO: 11.

H) Aminokiseline Pro543 - Lys760

[0105] Domen Fc fragmenta antitela prema SEQ ID NO: 10.

[0106] Prethodni protein agonist TRAIL receptora je prikazan u SEQ ID NO: 14.

[0107] Naznačeni linkeri mogu biti zamenjeni sa drugim poželjnim linkerima, npr. kao što je prikazano u SEQ ID NOs: 3-9.

[0108] Treba napomenuti da prvi i drugi peptidni linker ne moraju biti identični.

[0109] Sekvenca signalnog peptida (A) može se zameniti bilo kojom drugom pogodnom, npr.

sekvencom sisarskog signalnog peptida.

1.2 Genska kaseta koja kodira polipeptid

[0110] Sintetički gen može biti optimizovan u odnosu na korišćenje kodona za ekspresiju u pogodnim ćelijama domaćinima, npr. ćelijama insekata ili sisarskim ćelijama. Poželjna sekvenca nukleinske kiseline je prikazana u SEQ ID NO: 16.

2. Ekspresija i prečišćavanje

Kloniranje, ekspresija i prečišćavanje fuzionih polipeptida

[0111] Prethodno pomenuti fuzioni proteini su rekombinantno eksprimirani u dve različite eukariotske ćelije domaćine:

Za inicijalnu analizu prethodno pomenutog fuzionih proteina agonista TRAIL receptora, Hek293T ćelije uzgajane u DMEM GlutaMAX (GibCo) sa dodatkom 10% FBS, 100 jedinica/ml Penicilina i 100 [mu]g/ml Streptomicina su prolazno transfektovane sa plazmidom koji sadrži ekspresionu kasetu za fuzioni polipeptid i odgovarajući marker za selekciju, npr. funkcionalana ekspresiona kaseta koja sadrži gen za rezistenciju na blasticidin, puromicin ili higromicin. U tim slučajevima, gde je mnoštvo polipeptidnih lanaca neophodno da bi se postigao finalni proizvod, ekspresione kasete su ili kombinovane na jedanom plazmidu ili su postavljene na različite plazmide tokom transfekcije. Supernatant ćelijske kulture koji sadrži rekombinantni fuzioni polipeptid je sakupljen tri dana nakon transfekcije i razbistren centrifugiranjem na 300 x g nakon čega je filtriran kroz 0.22 µm sterile filter.

[0112] Za masovniju ekspresiju fuzionih proteina agonista TRAIL receptora za in vivo upotrebu, sintetičke DNK kasete koje kodiraju prethodno pomenute proteine ubačene su u eukariotske ekspresione vektore koji sadrže odgovarajuće markere za selekciju (npr. funkcionalna ekspresiona kaseta koja sadrži gen za rezistenciju na blasticidin, puromicin ili higromicin) i genetičke elemente pogodne da povećaju broj transkripciono aktivnih insercionih mesta unutar genoma ćelija domaćina. Ekspresioni vektori sa verifikovanom sekvencom introdukovani su elektroporacijom u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO-S, Invitrogen) prilagođene na suspenziju. Tri dana post-transfektovanja odgovarajući selekcioni pritisak je primenjen na transfektovane ćelije. Preživele ćelije koje nose gen(e) za rezistenciju izvedene iz vektora rekuperovane su naknadnom kultivacijom pod selekcionim pritiskom. Nakon stabilnog rasta pulova selektovanih ćelija u hemijski definisanom medijumu (PowerCHO2-CD, Lonza) na 37°C i 7% CO2atmosferom u orbitalnom šejker inkubatoru (100 rpm, 50mm shaking throw), pojedinačni supernatanti su analizirani sa ELISA-tetovima za detekciju prethodno pomenutih proteina i pulovi ćelija sa najvećom specifičnom proizvodnjom su rašireni u bocama za šejkiranje pre proizvodnje proteina (orbitalni šejker, 100 rpm, shaking throw 50mm).

[0113] Za proizvodnju proteina u laboratorijskoj razmeri, individualni pulovi ćelija su kultivisani 7-12 dana u hemijski definisanom medijumu (PowerCHO2-CD, Lonza) na 37°C i 7% CO2atmosferom u Wave bioreactor 20/50 EHT (GE-Healthcare). Osnovni medijum bio je PowerCHO2-CD sa dodatkom 4mM Glutamax. Wave kultura je startovana started sa koncentracijom vijabilnih ćelija od 0.3 do 0.4 x 10e6 ćelija/ml i sledećim podešavanjima (za kese od pet- ili deset litra): frekvencija šejkiranja 18rpm, ugao šejkiranja 7°, struja gasa 0.2-0.3 L/min, 7% CO2, 36.5°C. Tokom Wave izvođenja, ćelijske kulture su dva puta hranjene sa PowerFeed A (Lonza), obično na dan 2 (20% ishrane) i dan 5 (30% ishrane). Nakon drugog hranjenja, frekvencija šejkiranja je povećana na 22rpm, kao i ugao šejkiranja na 8°.

[0114] Bioreactor je obično sakupljan između dana 7 do dana 12 kad je vijabilnost ćelija pala ispod 80%. Prvo, supernatant kulture je razbistren korišćenjem filtracionog sistema sa manuelnom dubinom (Millipore Millistak Pod, MC0HC 0.054m<2>). Za Streptagged proteine, dodat je Avidin do finalne koncentracije od 0.5mg/L. Konačno, supernatant kulture koji sadrži fuzioni protein agonist TRAIL receptora je sterilno filtriran korišćenjem filtera na vrhu boce (0.22µm, PES, Corning) i uskladišten na 2-8°C do dalje obrade.

[0115] Za prečišćavanje prema afinitetu Streptactin Sepharose je pakovan na kolonu (sloj gela 1 ml), ekvilibrisan sa 15 ml pufera W (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0) ili PBS pH 7.4 i supernatant ćelijske kulture je primenjen na kolonu sa stopom protoka od 4 ml/min. Naknadno, kolona je isprana sa 15 ml pufera W i vezani polipeptid je eluiran u koracima dodavanjem 7 x 1 ml pufera E (100 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 2.5 mM Desthiobiotin, pH 8.0). Alternativno, za ovaj korak se može koristiti PBS pH 7.4 koji sadrži 2.5 mM Desthiobiotin.

[0116] Alternativno Streptactin Sepharose zasnovanom modelu, prečišćavanje prema afinitetu je izvedeno upotrebom kolone sa imobilisanim Proteinom-A kao afinitetnim ligandom i Akta hromatografskim sistemom (GE-Healthcare). Materijal čvrste faze sa visokim afinitetom za FC-domen fuzionog proteina je izabran: MABSelect Sure™ (GE Healthcare). Ukratko, razbistreni supernatant ćelijske kulture je napunjen u HiTrap MabSelectSure kolonu (CV=5ml) ekvilibrisan sa puferom za ispiranje 1 (20 mM Pi, 95 mM NaCl, pH7.2) ne prelazeći napunjenost od 10 mg fuzionog proteina po ml sloja kolone. Kolona je isprana sa deset zapremina kolone (10CV) prethodno pomenutog ekvilibracionog pufera što je praćeno sa (4CV) pufera za ispiranje 2 (20mM Pi, 95mM NaCl, pH 8.0) da bi se istrošio protein ćelije domaćina i DNK ćelije domaćina. Kolona je zatim eluirana sa puferom za eluiranje (20mM Pi, 95mM NaCl, pH 3.5) i eluat je sakupljen u do deset frakcija pri čemu je svaka frakcija imala zapreminu jednaku zapremimi sloja kolone (5ml). Svaka frakcija je neutralizovana sa jednakom zapreminom prethodno pomenutog pufera za ispiranje 2. Linearno ubrzanje je podešeno na 150 cm/č i održavano konstantnim tokom prethodno pomenutog postupka afinitetne hromatografije. Količina proteina frakcija eluata je kvantifikovana i vršne frakcije su koncentrovane ultrafiltracijom i dodatno prečišćene ekskluzionom hromatografijom (SEC).

[0117] SEC je izvedena na Superdex 20010/300 GL ili HiLoad 26/60 kolonama korišćenjem Akta hromatografskog sistema (GE-Healthcare). Kolone su ekvilibrisane sa fosfatno puferovanim fiziološkim rastvorom i koncentrovane, afinitetno prečišćen polipeptid je napunjen u SEC kolonu sa zapreminom uzorka koja ne prelazi 2 % (zapr/zapr) zapremine kolone. U slučaju Superdex200 10/300 GL kolona (GE Healthcare), primenjena je stopa protoka od 0.5ml po minutu. U slučaju HiLoad 26/60 Superdex200 kolona, primenjena je stopa protoka od 2.5 ml po minutu. Elucioni profil polipeptida je praćen apsorbancom na 280 nm.

[0118] Za određivanje moguće molekulske težine prečišćenog fuzionog polipeptida pod nativnim uslovima Superdex 200 kolona je napunjena sa standardnim proteinima poznate molekulske težine. Na osnovu elucione zapremine standardnih proteina plotovana je kalibraciona kriva i moguća molekulska težina prečišćenog fuzionog polipeptida je određena. Fuzioni proteini agonisti TRAIL receptora koji sadrže FC-domen tipično su eluirali sa Supoerdex200 kolonom sa mogućom molekulskom težinom homodimera od približno 160-180 kDa.

3. Test apoptoze

[0119] Ćelijski test sa Jurkat A3 permanetnom T-ćelijskom linijom je korišćen za određivanje aktivnosti u indukciji apoptoze fuzionih proteina agonista TRAIL-receptora. Jurkat ćelije su uzgajane u bocama sa RPMI 1640-medijumom GlutaMAX (GibCo) sa dodatkom 10% FBS, 100 jedinica/ml Penicilina i 100 mg/ml Streptomicina. Pre testa, 100,000 ćelija je zasejano po bunarčiću u mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića. Dodavanje različitih koncentracija fuzionih peptida bunarčićima praćeno je sa 3 časa inkubacije na 37°C. Ćelije su lizirane dodavanjem pufera za lizu (250 mM HEPES, 50 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 5% Triton-X-100, 100 mM DTT, 10 mM AEBSF, pH 7.5) i ploče su stavljene na led 30 minuta do 2 časa. Apoptoza se odvija paralelno sa povećanom aktivnošću kaspaza, npr. Kaspaze-3. Stoga, razlaganje specifičnog supstrata kaspaze Ac-DEVD-AFC (Biomol) je korišćeno da se odredi stepen apoptoze. Zapravo, aktivnost kaspaze je u korelaciji sa procentom apoptotskih ćelija određenih morfološki nakon bojenja ćelija sa propidijum jodidom i Hoechst-33342. Za test aktivnosti kaspaze, 20 µl ćelijskog lizata je preneto na crnu mikrotitarsku ploča sa 96 bunarčića. Nakon dodavanja 80 µl pufera koji sadrži 50 mM HEPES, 1% saharoze, 0.1% CHAPS, 50 mM Ac-DEVD-AFC, i 25 mM DTT, pH 7.5, ploča je preneta na Tecan Infinite 500 čitač mikroploča i povećanje u intenzitetu fluorescencije je praćeno (ekscitaciona talasna dužina 400 nm, emisiona talasna dužina 505 nm).

3.1 Test ćelijske smrti

[0120] Za određivanje ćelijske smrti 15,000 HT1080 ćelija fibrosarkoma je postavljeno na ploče sa 96 bunarčića preko noći u RPM1 1640-medijumu GlutaMAX (GibCo) sa dodatkom 10 % FBS (Biochrom). Ćelije su ko-inkubirane sa cikloheksimidom (Sigma) na finalnoj koncentraciji od 2.5 g/ml. Ćelijska smrt je kvantifikovana bojenjem sa KV puferom (0.5% kristal violet, 20% metanol). Nakon bojenja, bunarčići su isprani sa vodom i osušeni na vazduhu. Boja je eluirana sa metanolom i merena je optička gustina na 595 nm sa ELISA čitačem.

4. Test stabilnosti/agregacije

4.1 Princip analize agregacije (definicija za rastvorljivi protein)

[0121] Sadržaj monomera (definisani trimerni skup vezujućih modula TRAIL receptora) i agregata je određen analitičkom SEC kao što je opisano u Primeru 2. Za ovu naročitu svrhu analiza je izvedena u puferima koji sadrže fiziološku koncentraciju soli na fiziološkom pH (npr. 0.9% NaCl, pH 7.4; PBS pH 7.4). Tipična analiza agregacije je izvedena na Superdex200 koloni (GE Healthcare). Ova kolona razdvaja proteine u opsegu između 10 do 800 kDa.

[0122] Za određivanje moguće molekulske težine prečišćenog fuzionog polipeptida pod nativnim uslovima Superdex 200 kolona je napunjena sa standardnim proteinima poznate molekulske težine. Na osnovu elucione zapremine standardnih proteina plotovana je kalibraciona kriva i moguća molekulska težina prečišćenog fuzionog polipeptida je izračunata na osnovu elucione zapremine.

[0123] SEC analiza rastvorljivih, ne-agregiranih proteina, npr. trimernog TRAIL, tipično pokazuje izdvojene pikove pojedinačnog proteina na definisanoj elucionoj zapremini. Ova eluciona zapremina odgovara očiglednoj nativnoj molekulskoj težini određenog proteina i približno je saglasna sa teoretskom molekulskom težinom izračunatom na osnovu primarne aminokiselinske sekvence.

[0124] Ukoliko se dogodi agregacija SEC analiza pokazuje dodatne proteinske pikove sa nižim retencionim zapreminama. Za TRAIL, agregacija rastvorljivih proteina dešava se na karakterističan način. Proteini imaju tendenciju da formiraju oligomere "trimera", formirajući nonamere (3 x 3) i 27mere (3 x 9). Ovi oligomeri služe kao agregacione klice i visok sadržaj oligomera potencijalno vodi agregaciji proteina.

[0125] Oligomeri velike molekulske težine i agregati eluiraju u nevažećoj zapremini Superdex200 kolone i ne mogu biti analizirani sa SEC u odnosu na njihovu nativnu molekulsku težinu.

[0126] Usled indukcije (kompletne) agregacije, prečišćeni preparati TRAIL-SF fuzionih proteina treba da poželjno sadrže samo definisane trimerne proteine i samo veoma nisku količinu oligomernog proteina. Stepen agregacije/oligomerizacije određenog preparta TRAIL-SF proteina je određen na osnovu SEC analize izračunavanjem površina pikova OD280 dijagrama za definisanu trimernu i oligomernu/agregatnu frakciju, respektivno. Na osnovu ukupne površine pika procenat definisanog trimernog proteina je izračunat kao što sledi:

(% sadržaj trimera = [površina pika trimera]/[ukupna površina pika]x100)

[0127] Definicija za rastvorljivi protein kao što je korišćeno u ovom tekstu, opisuje proteinski preparat prečišćenom TRAIL proteina u puferu fiziološke koncentracije soli na fiziološkom pH koji sadrži definisani rastvorljivi proteinski (trimerni skup TRAIL domena) sadržaj od > 90% unutar tipičnog opsega koncentracije proteina od 0.2 do 10.0 mg/ml.

5. Određivanje polu-života

[0128] Svaki od molekula A-D napravljen je od dva polipeptida kovalentno vezana sa interlančanim disulfidnim vezama. Broj glikozita i zglobnih cisteina (koji rezultuju u interlančanim disulfidnim vezama između proteina) testirani su da bi se odredio efekat koji izmena ovih karakteristika ima na polu-život ovih jedinjenja.

[0129] Ženke NMRI miševa su tretirane sa 1.2 mg/kg bw i/ili sa 4 mg/kg bw specifikovanih jedinjenja kao jedne intravenske bolus injekcije. Cela krv je sakupljena pre primene (predoza), i do 168 časova nakon primene stavki testa. Serum je pripremljen i uzorci su uskladišteni na -80 °C do određivanja koncentracija u serumu. Farmakokinetički parametri su izračunati korišćenjem srednjih vrednosti koncentracija u serumu i farmakokinetičkog evaluacionog programa PK Solutions verzija 2.0 za ne-kompartmentalnu farmakokinetičku analizu podataka (Summit Research Services, Montrose, CO). PK Solutions je automatizovan, program zasnovan na Excel-u, koji izračunava farmakokinetičke parametre iz podataka o koncentraciji-vremenu dobijenih iz analize npr. bioloških uzoraka nakon intravenskog ili ekstravaskularnog puta primene. PK Solutions izračunava rezultate bez podrazumevanja bilo kog specifičnog kompartmentalnog modela.

[0130] Kvantifikacija stavki testa u serumu je izvršena sa ELISA-testom koji detektuje individualne agoniste TRAIL receptora prikazane u Tabeli 7 nezavisno od toga što je Strep-Tag deo molekula. Opšti raspored je prikazan na Slici 18. Rezultati su rezimirani u Tabeli 7.

[0131] Molekul A (koji sadrži od dva polipeptida sa SEQ ID NO:26) ima dva zglobna cisteina (koji formiraju dve interlančane disulfidne veze) i N ostatak na položaju 297 Fc regiona (prema EU indeksu), što rezultuje u CH2glikozilaciji divljeg tipa. Molekul A takođe ima glikozite na položajima 168 i 337. Molekul B (sastavljen od dva polipeptida sa SEQ ID NO: 19) ima tri zglobna cisteina (koji formiraju tri interlančane disulfidne veze) (na položajima 513, 519, i 522) i N297S mutaciju na položaju 297 Fc regiona (prema EU indeksu), što rezultuje u aglikozilaciji CH2domena. Molekul B talkođe ima glikozite na položajima 168 i 337. Molekul C (sastavljen od dva polipeptida sa SEQ ID NO: 27) ima tri zglobna cisteina (koji formiraju tri interlančane disulfidne veze) i N297S mutaciju na položaju 297 Fc regiona (prema EU indeksu), što rezultuje u aglikozilaciji CH2domena. Dodatno, postoji glikozit na položaju 168 (linker 1), ali ne na položaju 337 (linker 2). Molekul D (sastavljen od dva polipeptida sa SEQ ID NO:28) ima tri zglobna cisteina (koji formiraju tri interlančane disulfidne veze) i N297S mutaciju na položaju 297 Fc regiona (prema EU indeksu), što rezultuje u aglikozilaciji CH2domenu. Dodatno, glikoziti i na linkeru 1 i linkeru 2 (položaji 168 i 337, respektivno) su depletirani u Molekulu D.

[0132] In vivo stabilnost (procenjena u odnosu na polu-život jedinjenja) Molekula B (oba linkera glikozilovana, CH2glikoziti depletirani, i dodatak trećeg zglobnog cisteina) je poboljšan u odnosu na Molekul A. Dodatno, deplecija svih glikozita kod jedinjenja (Molekul D) rezultovala je u smanjenoj in vivo stabilnosti i niskoj produktivnosti tokom prelazne ekspresije. Molekul C (prvi linker glikozilovan, drugi linker aglikozilovan, CH2glikoziti depletirani) pokazao je srednju in vivo stabilnost u poređenju sa Molekulima B i D (videti rezultate u Tabeli 7).

Tabela 7: Rezultati testiranja polu-života jedinjenja kod NMRI-miševa

[0133] Ovi eksperimentalni rezultati pokazuju da kombinovanje linker glikozilacije (u oba linkera 1 i 2) sa trećom interlančanom disulfidnom vezom (preko dodavanja zglobnog cisteina) i deglikozilacije CH2domena u Fc regionu rezultuje u većoj in vivo stabilnosti u molekulima predmetnog pronalaska.

6. Demonstracija efikasnosti in vitro

6.1 Protein agonist TRAIL receptora sa SEQ ID NO: 19 inhibira in vitro preživljavanje ćelija humanih hematoloških i solidnih tumora

[0134] Tumorske ćelije su zasejane sa 10,000 ćelija/bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića u preporučenom medijumu koji sadrži 10% FBS i tretirane sa proteinom agonistom TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 19 24 časa na 37°C u vlažnoj, 5% CO2atmosferi. Vijabilnost ćelija je nakon toga procenjena korišćenjem CellTiter-Glo® reagensa kako je opisano u uputstvu proizvođača (Promega; Madison, WI). IC50vrednosti su određene nelinearnom regresionom analizom podataka o odgovoru na koncentraciju normalizovanim u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Primeri rezultujućih krivih odgovora na koncentraciju za Colo205, Jurkat i SKM-1 ćelije koji pokazuju gubitak vijabilnosti ćelija kao odgovor na tretman sa proteinom agonistom TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19 prikazani su na Slici 19. Tabela 8 prikazuje rezultate ćelijskih linija hematološkog (A; (n=40; ne-Hodgkin-ov limfom, NHL; akutni mijeloidni limfom, AML; akutna limfoblastična leukemija, ALL) i solidnog tumora (B; (n=44; nesitnoćelijski karcinom pluća, NSCLC; pankreasni; kolorektalni kancer, CRC; kancer dojke, BrCa; jajnika, fibrosarkom; glave i vrata, H&N; sitnoćelijski kancer pluća, SCLC) tretiranih sa proteinom agonistom TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminoksielinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 1924 časa i vijabilnost je procenjena sa CellTiter-Glo®. Predstavljene su rezultujuće IC50za protein agonist TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 19-posredovane efekte na vijabilnost tumorskih ćelija.

Tabela 8

Potencija proteina agonista TRAIL receptora sa SEQ ID NO: 19 u kancerskim ćelijskim linijama humanog tumora in vitro

Tumorska ćelijska linija Tip tumora SEQ ID NO:19 IC50(ng/ml)

A

SU-DHL-8 NHL 1.36

NUDHL-1 NHL 6.50

OCI-Ly8 NHL 7.49

ULA NHL 8.44

OCI-Ly2 NHL 18.98

OCI-LY19 NHL 26.34

WSU-NHL NHL 31.60

OCI-Ly7 NHL 63.76

SU-DHL-5 NHL 82.07

OCI-Ly18 NHL 196.20

OCI-Ly1 NHL 416.95

SU-DHL-16 NHL 545.55

SU-DHL-2 NHL 1000.00

WSU-DLCL2 NHL 1000.00

Toledo NHL 1000.00

OCI-LY3 NHL 1000.00

RL NHL 1000.00

SU-DHL-4 NHL 1000.00

U2932 NHL 1000.00

HT NHL 1000.00

RC-K8 NHL 1000.00

SKM-1 AML 0.95

PL-21 AML 10.67

EOL-1 AML 18.31

Tumorska ćelijska linija Tip tumora SEQ ID NO:19 IC50(ng/ml)

HL-60 AML 76.62

OCI-AML2 AML 124.32

UKE-1 AML 205.35

MV4-11 AML 312.55

SET-2 AML 384.80

MOLM-13 AML 722.10 OCI-AML5 AML 1032.60 Kasumi-1 AML 1000.00

KG-1 AML 1000.00

OCI-AML3 AML 1000.00

SHI-1 AML 1000.00

SKNO-1 AML 1000.00

TF-1 AML 1000.00

THP-1 AML 1000.00

HEL AML 1000.00

Jurkat ALL 3.08 B NCI-H847 NSCLC 14.53 NCI-H647 NSCLC 24.75 NCI-H2444 NSCLC 27.75 NCI-H2170 NSCLC 30.16 NCI-H460 NSCLC 36.85 NCI-H838 NSCLC 44.48 NCI-H1792 NSCLC 61.09 NCI-H2347 NSCLC 81.06 NCI-H1373 NSCLC 125.15 NCI-H522 NSCLC 259.87 NCI-H2110 NSCLC 314.20 NCI-H596 NSCLC 397.80 HCC4006 NSCLC 407.24 NCI-H2122 NSCLC 480.55 NCI-H1299 NSCLC 716.00 NCI-H1975 NSCLC 741.50 Tumorska ćelijska linija Tip tumora SEQ ID NO:19 IC50(ng/ml)

HCC827 NSCLC 2824.50

NCI-H727 NSCLC 3178.00

NCI-H1944 NSCLC 4068.75

NCI-H1299 NSCLC 4214.87

Calu-6 NSCLC 4757.00

NCI-H1693 NSCLC 5000.00

HCC2935 NSCLC 5000.00

A549 NSCLC 5000.00

NCI-H1395 NSCLC 5000.00

NCI-H2172 NSCLC 5000.00

Calu-1 NSCLC 5000.00

NCI-H441 NSCLC 5000.00

NCI-H23 NSCLC 5000.00

NCI-H661 NSCLC 5000.00

NCI-H1650-GFP NSCLC >3

BxPC3 Pankreasni 16.00

Capan-1<Pankreasni>393.00

MIA PaCa-2<Pankreasni>158.00

PANC-1<Pankreasni>>1000

SW48 CRC 6.10

Colo205 CRC 1.30

SW480 CRC 132.00

HCT 116-GFP CRC 337.00

HCC38 BrCa 3.00

HCC1569 BrCa 219.00

MCF7 BrCa >3000

MDA-MB-231 BRCa 235.00

HeyA8-GFP Jajnika 141.00

Fadu-GFP H&N >3

HT-1080 Fibrosarkom 377.00

NCI-H211 SCLC 72.58

otein agonist TRAIL receptora sa SEQ ID NO: 19 sinergistički deluje sa antitumorogenim sredstvima u indukciji smrti tumorske ćelije

[0135] Tumorske ćelije su zasejane sa 10,000 ćelija/bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića u preporučenom medijumu koji sadrži 10% FBS i ko-tretirani sa proteinom agonistom TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 19 i venetoclax (ABT-199), navitoclax (ABT-263) ili docetaxel (DTX) 24 časa na 37°C u vlažnoj, 5% CO2atmosferi. Vijabilnost ćelija je nakon toga procenjena korišćenjem CellTiter-Glo® reagensa kako je opisano u uputstvu proizvođača. Model Bliss nezavisnosti (Wong et al., 2012; Mol. Cancer Ther. 11:1026-1035; Bernebaum, 1981 Adv. Cancer Res. 35:269-335; Borisy et al., 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7977-7982) upotrebljen je da bi se procenila aktivnost kombinacije, sa negativnom celobrojnom vrednošću koja ukazuje na antagonizam, vrednost od nula koja ukazuje na aditivnu aktivnost, i pozitivnom celobrojnom vrednošću koja ukazuje na sinergiju. Bliss skorovi su izračunati za svaku kombinaciju u doznoj matrici i sabrani da bi se dobila "Bliss zbir" vrednost. Primer sinergističke smrti tumorske ćelije indukovane ko-tretmanom ćelija humanog tumora sa proteinom agonistom TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 i venetoclax, navitoclax ili DTX, sa povezanim Bliss zbirom prikazano je na Slikama 20(A-C). Bliss zbirovi određeni za ove kombinacije u više tumorskih ćelijskih linija su prikazani u Tabeli 9.

Tabela 9

Procena Bliss sinergističkog delovanja ubijanja ćelija sa proteinom agonistom TRAIL receptora sa SEQ ID NO:19 u kombinaciji sa DTX u NSCLC ćelijskim linijama (A) i venetoclax ili navitoclax u NHL & AML ćelijskim linijama (B) in vitro.

)

7. Tretman sa proteinom agonistom TRAIL receptora sa SEQ ID NO:19 inhibira rast tumora in vivo

[0136] Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 na rast tumora procenjena je potkožnom Colo205 (kolorektalnom), SKM-1 (akutna mijeloidna leukemija), i H460LM (nesitnoželijski pluća) ksenograftima tumora implantiranim u SCID ženke miševa (Charles Rivers Laboratories; Wilmington, MA). Ukratko, ćelije humanog kancera su inokulisane potkožno u desni zadnji bok ženke SCID miševa na dan 0 studije. Primena proteina agonista TRAIL receptora sa SEQ ID NO:19 (0.3, 1, ili 3 mkd doziran IV, QDx5 ili IP, Q2Dx5 kao što je naznačeno) je započeta u trenutku poklapanja veličine. Zapremina tumora je merena za vreme trajanja eksperimenta dok srednja vrednost zapremine tumora u svakoj grupi nije dostigla krajnju tačku od >2000 mm<3>za Colo205 i SKM-1 ili >2500 mm<3>za H460LM. Rezultati su prikazani na Slikama 21-23. Primena proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 indukovala je značajnu inhibiciju rasta tumora kod Colo205, SKM-1, i H460LM modelima ksenograftnih tumora.

[0137] Efekat proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 na rast tumora takođe je procenjena u ksenograftima tumora izvedenim iz pacijenata CTG-0069 (kolorektalni), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (pankreasni), CTG-0714 (sarkom), CTG-0136 (ezofagijalni), CTG-485 (želudačni), i CTG-0785 (Ewing-ov sarkom) implantiranim u NSG ženke miševa (Champions Oncology; Hackensack, NJ). Ukratko, fragmenti tumora su potkožno propagirani u desni zadnji bok ženki NSG miševa na dan 0 studije. Primena proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 (3 mkd dozirano IP, Q2Dx5) inicirana je u trenutku poklapanja veličine. Zapremina tumora je merena u vreme trajanja eksperimenta dok srednja vrednost zapremine tumora u svakoj grupi nije dostigla krajnju tačku od >2000 mm<3>ili 60 dana. Rezultati su prikazani na Slikama 24(A-G). Primena proteina agonista TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO:19 indukovala je značajnu inhibiciju rasta tumora kod CTG-0069 (kolorektalnog), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (pankreasnog), CTG-0714 (sarkoma), CTG-0136 (ezofagijalnog), CTG-485 (želudačnog), i CTG-0785 (Ewing-ovog sarkoma) PDX modela.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Protein agonist TRAIL receptora koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19.

2. Protein agonist TRAIL receptora koji sadrži dva polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 19.

3. Protein agonist TRAIL receptora prema patentnom zahtevu 2, naznačen time da su dva polipeptida kovalentno povezana preko tri interlančane disulfidne veze formirane između cisteinskih ostataka 513, 519, i 522 svakog polipeptida.

4. Protein agonist TRAIL receptora prema patentnom zahtevu 1, 2 ili 3, naznačen time da jedan ili više asparaginskih ostataka na položajima 168 i 337 polipeptida (ili više njih) su N-glikozilovani.

5. Protein agonist TRAIL receptora prema patentnom zahtevu 1, 2 ili 3, naznačen time da asparaginski ostaci na položajima 168 i 337 polipeptida (ili više njih) su oba N-glikozilovani.

6. Protein agonist TRAIL receptora prema patentnim zahtevima 1-5, naznačen time da su polipeptid(i) dodatno post-translaciono modifikovani.

7. Protein agonist TRAIL receptora prema patentnom zahtevu 6, naznačen time da posttranslacione modifikacije sadrže modifikacije N-terminalnog glutamina u piroglutamat.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein agonist TRAIL receptora prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača, ekscipijenasa, i/ili ađuvanasa.

9. Molekul nukleinske kiseline koji kodira protein agonist TRAIL receptora prema patentnom zahtevu 1, ili ekspresioni vektor ili ćeliju koja sadrži pomenuti molekul nukleinske kiseline.

10. Ćelija prema patentnom zahtevu 9, koja je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara.

11. Ćelija prema patentnom zahtevu 9, naznačena time da ćelija je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).

12. Protein agonist TRAIL receptora prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u postupku tretiranja subjekta koji ima TRAIL povezanu bolest ili poremećaj.

13. Protein agonist TRAIL receptora za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačeno time da je bolest ili poremećaj izabran od tumora, infektivnih bolesti, inflamatornih bolesti, metaboličkih bolesti, autoimunih bolesti, degenerativnih bolesti, apoptoza-povezanih bolesti, i odbacivanja transplanta.

14. Protein agonist TRAIL receptora za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da tumori su solidni tumori, ili limfatični tumori; autoimuni poremećaji su reumatoidne bolesti, artritične bolesti, ili reumatoidne i artritične bolesti; ili naznačeno time da je degenerativna bolest neurodegenerativna bolest.

15. Protein agonist TRAIL receptora za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da je bolest ili poremećaj reumatoidni artritis, ili multipla skleroza.