JP2011528562A - Ｔｎｆｓｆ一本鎖分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、３つの可溶性ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカインドメインを含む一本鎖融合タンパク質と、これらの融合タンパク質をコードする核酸分子とに関する。これらの融合タンパク質は実質的に非凝集性であり、治療用、診断用および／または研究用の適用に適している。本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子と、本明細書に記載の核酸分子で形質転換または形質移入された細胞または非ヒト生物とにも関する。

Description

本発明は、３つの可溶性ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカインドメインを含む一本鎖融合タンパク質と、これらの融合タンパク質をコードする核酸分子とに関する。これらの融合タンパク質は実質的に非凝集性であり、治療用、診断用および／または研究用の適用に適している。

ＴＮＦＳＦサイトカインの三量体化（例えば、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ））は、効率的な受容体結合および活性化に必要であることが公知である。しかし、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの三量体複合体は、組換え体モノマー単位から調製するのが困難である。

特許文献１および特許文献２は、ＴＮＦサイトカインおよび多量体化コンポーネント、とりわけＣ１ｑタンパク質ファミリーのタンパク質またはコレクチンを含む組換え体融合タンパク質を開示する。しかし、これらの融合タンパク質の不利な点は、三量体化ドメインが通常、大きな分子量を有すること、および／または三量体化がかなり効率が悪いことである。

非特許文献１は、ＴＮＦサイトカインの三量体が、Ｎ末端に位置する安定化モチーフによって安定化されると記載している。ＣＤ９５Ｌでは、おそらく、細胞質膜の近くに位置するＮ末端アミノ酸ドメインによって、受容体結合ドメイン三量体の安定化が引き起こされる。

特許文献２は、Ｎ末端に位置する人工のαヘリックスコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフによって、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインが安定化されうると記載している。しかし、ポリペプチド鎖の相互に対する方向性（例えば、並列方向または逆平行方向）はほとんど予測できないことが見出された。さらに、コイルドコイルジッパーモチーフにおける、７アミノ酸繰り返しの最適な数は決定が困難である。加えて、コイルドコイル構造は、ｐＨおよび／またはイオン強度の変化の後に高分子凝集体を形成する傾向を有する。

特許文献３は、細胞性受容体の細胞外リガンド結合ドメインに結合する一本鎖オリゴマーポリペプチドであって、少なくとも３つの受容体結合部位を含み、該結合部位のうち、少なくとも１つが細胞性受容体のリガンド結合ドメインに結合でき、少なくとも１つが細胞性受容体のリガンド結合ドメインに効果的に結合できず、それによって、一本鎖オリゴマーポリペプチドが受容体に結合できるが、受容体を活性化できない、ポリペプチドに関する。例えば、単量体は、ＴＮＦファミリー、とりわけＴＮＦ−αのサイトカインリガンドに由来するものである。

特許文献４は、ＴＮＦファミリーリガンドメンバーのうち少なくとも３つの単量体と、該ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの単量体を相互に連結する少なくとも２つのペプチドリンカーとを含む一本鎖融合ポリペプチドを開示する。しかし、最近の実験は、これらの一本鎖融合ポリペプチドが望ましくない凝集を示すことを示した。

国際公開第０１／４９８６６号 国際公開第０２／０９０５５号 国際公開第０１／２５２７７号 国際公開第２００５／１０３０７７号

Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８７巻（１９８９年）、１２０５〜１２１３頁 Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、３２２巻（２００４年）、１９７〜２０２頁

本発明の目的は、凝集に関する良好な安定性を併せもつ効率的な組換え製造を可能にする、少なくとも３つのＴＮＦサイトカインドメインを含む一本鎖融合タンパク質を提供することであった。

本発明は、
（ｉ）第１の可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン、
（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン、
（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、および
（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン
を含み、実質的に非凝集性である、一本鎖融合ポリペプチドに関する。

本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子と、本明細書に記載の核酸分子で形質転換または形質移入された細胞または非ヒト生物とにも関する。

本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸分子、または細胞を活性薬として含む医薬組成物または診断用組成物にも関する。

本発明は、治療における使用のため、例えば、ＴＮＦＳＦサイトカインの機能障害によって引き起こされる、これに関連する、および／またはこれに伴う障害、とりわけ、腫瘍、例えば固形もしくはリンパ腫瘍などの増殖性障害；感染症；炎症性疾患；代謝病；自己免疫障害、例えば、リウマチ様および／もしくは関節炎疾患；変性疾患、例えば、多発性硬化症などの神経変性疾患；アポトーシス関連疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療における医薬組成物を調製するための、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸分子、または細胞の使用のための、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸分子、または細胞にも関する。

図１は、本発明の一本鎖融合ポリペプチドのドメイン構造を示す図である。Ｉ．、ＩＩ．、ＩＩＩ．可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン。 図２は、ＴＮＦ−ＳＦタンパク質の一般構造を表す模式図である。■■■細胞膜、Ｎ末端は細胞内に位置する。１．逆平行βフォールディングされた受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、２．ＲＢＤと細胞膜との境界面、３．プロテアーゼ切断部位。 図３は、非変性ＴＮＦ−ＳＦ三量体の構造を表す模式図である。円柱構造はＲＢＤを表し、Ｎ末端がＲＢＤを細胞膜に連結している。 図４は、ＴＮＦサイトカインの受容体結合ドメインを含む３つの可溶性ドメインの構造を表す模式図である。Ｉ．、ＩＩ．、ＩＩＩ．可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン。 図５は、３つの可溶性ドメインのＮおよびＣ末端が表面を形成することを特徴とする、ＴＮＦサイトカインのＲＢＤを含む可溶性ドメインの三量体化を示す図である。 図６は、ストーク領域のすべてまたは一部を含む一本鎖ＴＮＦ−ＳＦの構造を表す模式図である。この図は、次の可溶性ドメインのＮ末端までの距離を埋め合わせるのに、より長いリンカーが必要であることを示す。 図７は、当技術分野で公知のｓｃＦｖ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質を示す図である。 図８は、当技術分野で公知のＦｃ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質を示す図である。 図９Ａは、追加のＦａｂ抗体断片を含む一本鎖融合ポリペプチドを示す図であり、図９Ｂは、追加のｓｃＦｖ抗体断片を含む一本鎖融合ポリペプチドを示す図である。 図１０は、ジスルフィド架橋を介した、２つのＮ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチドの二量体化を示す図である。 図１１は、ジスルフィド架橋を介した、２つのＣ末端融合ｓｃＦｃ融合ポリペプチドの二量体化を示す図である。 図１２は、リンカーを介した一本鎖融合ポリペプチドの二量体化を示す図である。 図１３は、第２の融合ポリペプチドに、またはｓｃＦｖ融合ポリペプチドにさらに融合している追加Ｆａｂ抗体断片を含む一本鎖融合ポリペプチドを示す図である。 図１４は、ジスルフィド架橋を介した２つのｓｃＦａｂ融合ポリペプチドの二量体化を示す図である。 図１５は、Ｆｖおよび／またはＦａｂ抗体断片をさらに含む、Ｎ末端融合したｓｃＦｃ融合ポリペプチドを示す図である。 図１６は、Ｆｖおよび／またはＦａｂ抗体断片をさらに含む、Ｃ末端融合したｓｃＦｃ融合ポリペプチドを示す図である。 図１７は、組換え発現および精製されたＴＮＦ−ＳＦメンバーの非変性条件下でのＳＥＣ分析を示す図である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにおける、精製ＴＮＦ−ＳＦメンバーの非変性条件下（例えば：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）での２通りのＳＥＣ分析が例として示されている。図は、溶離容積（ｍｌ）に対してプロットした２８０ｎｍ（ｍＡＵ）の吸光度を示す。黒塗りの矢は、規定の可溶性三量体ＴＮＦ−ＳＦタンパク質を含有する画分の溶離ピークを示す。三角形は、オリゴマー化ＴＮＦ−ＳＦの溶離ピークを示す。白抜きの矢は、分離するには大き過ぎる（＞８００ｋＤａ）タンパク質−凝集体を含有する、ＳＥＣカラムのボイド容積を示す。図１７Ａ：ＴＮＦ−ＳＦタンパク質凝集。図Ａは、多量のオリゴマー化／凝集タンパク質を含有する（ボイド容積における多量のタンパク質の溶出および多量のオリゴマータンパク質によって示される）ＴＮＦ−ＳＦタンパク質調製物の分析を例として示す。図１７Ｂ：ＴＮＦ−ＳＦタンパク質規定可溶性タンパク質。図Ｂは、規定の可溶性タンパク質をほとんど専ら含有する（ボイド容積で溶出するタンパク質の不在およびオリゴマーとして溶出するタンパク質が極めて限定的な量であることによって示される）ＴＮＦ−ＳＦタンパク質調製物の分析を例として示す。 図１８は、組換え発現およびアフィニティー精製されたＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＳＳＳのＳＥＣ分析を示す図である。

ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いた、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＳＳＳのＳＥＣ分析。図は、溶離容積（ｍｌ）に対してプロットした２８０ｎｍ（ｍＡＵ）の吸光度を示す。タンパク質は、６８ｋＤａの見かけのＭＷに対応する１４．５６ｍｌの溶離容積で明確なピークとして溶出する。オリゴマー化／凝集タンパク質を示す、保持容積がより小さい追加のタンパク質ピークは観察できなかった。
図１９は、組換え発現およびアフィニティー精製されたＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＮＳＮのＳＥＣ分析を示す図である。

ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いた、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＮＳＮのＳＥＣ分析。図は、溶離容積（ｍｌ）に対してプロットした２８０ｎｍ（ｍＡＵ）の吸光度を示す。タンパク質は、８７ｋＤａの見かけのＭＷに対応する１４．１２ｍｌの溶離容積で明確なピークとして溶出する。オリゴマー化／凝集タンパク質を示す、保持容積がより小さい追加のタンパク質ピークは観察できなかった。
図２０は、組換え発現およびアフィニティー精製されたＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮのＳＥＣ分析を示す図である。

ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いた、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮのＳＥＣ分析。図は、溶離容積（ｍｌ）に対してプロットした２８０ｎｍ（ｍＡＵ）の吸光度を示す。タンパク質は、９４ｋＤａの見かけのＭＷに対応する１３．９９ｍｌの溶離容積で明確なピークとして溶出する。１２．００ｍｌにおける小さな追加のタンパク質ピークを観察することができた。このピークの見かけのＭｗは約２７０ｋＤａに対応しており、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮの規定の三量体化を示す。１２．００ｍｌにおけるピークの総タンパク質量は、総タンパク質の＜３％に相当する。分析されたＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮの９７％超は、規定の可溶性状態（３つの受容体結合モジュールの正しいアセンブリ）にある。２８ｋＤａのＭＷに対応する１６．１２ｍｌのピークはＦａｂ軽鎖ポリペプチドを含有し、ピーク面積の分析には含まれなかった。
図２１は、ヒトｓｃＴＲＡＩＬリンカーグリコシル化を示す図である。

図２１Ａ。一本鎖ＴＲＡＩＬコンストラクトの受容体結合モジュールを連結するのに使用されたリンカー（複数可）のアミノ酸配列。Ｇｌｙ２８１はそれぞれの受容体結合モジュールの最後のアミノ酸をコードし、配列ＧＳＧＮ／ＳＧＮ／ＳＧＳはリンカー配列をコードし、Ａｒｇ１２１は後続のＴＲＡＩＬ受容体結合ドメインの最初のアミノ酸をコードする。設計されたリンカー配列は、示されている１または２の位置に、２カ所の推定上のＮ結合型グリコシル化部位を含有する。これらの位置で、示されているように配列を変えた（バージョンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）。

図２１Ｂ。リンカー位置の組合せ：ｓｃＴＲＡＩＬ分子は、示されているようにリンカー１およびリンカー２で連結された３つの相同体モジュール（灰色の円筒）を含有する。２つのリンカーのそれぞれが、「Ａ」に記載の通り、Ｎ結合型グリコシル化用に設計できる。リンカーのすべての可能な組合せを含有する９つの異なったタンパク質の完全なセットを、リンカー１および２についてＢに示されている配列に基づいて設計できる（これらのうち６つのタンパク質が発現された−「Ｃ」を参照）。

図２１Ｃ。グリコシル化への様々なリンカー配列の影響をテストするために発現されたｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトの用語体系。
図２２は、組換え体ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトのウェスタンブロット分析を示す図である。

様々なリンカー配列を有する一本鎖ＴＲＡＩＬタンパク質を組換え発現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。結合したタンパク質は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇを認識するマウスモノクローナル抗体と、それに続くペルオキシダーゼ結合二次抗マウス抗体とで検出した。示されているように様々なＴＲＡＩＬ変異体を添加した。ｓｃＴＲＡＩＬ−リンカー変異体の異なったグリコシル化を示すＭＷシフトに留意されたい。
図２３は、ｓｃＣＤ９５Ｌ（配列番号２７）を一時発現しているＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の収集、および様々な濃度におけるＪｕｒｋａｔ細胞の刺激への使用を示す図である。上清は、さらなる改変なしに直接用いるか、ｓｃＣＤ９５Ｌタンパク質を架橋するために抗Ｓｔｒｅｐｔａｇ抗体（２μｇ／ｍｌ）が添加された。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨＥＫ２９３細胞培養上清と共に３７°で３時間インキュベートし、溶解し、カスパーゼ活性について分析した。架橋されたｓｃＣＤ９５−Ｓｔを含有した細胞上清のみがＪｕｒｋａｔ細胞内のカスパーゼ活性を増大させた。これは、ｓｃＣＤ９５Ｌ単独では、アポトーシス促進性となりうる高次の凝集体を形成しないことを示す。 図２４は、ＨＥＫ２９３細胞の一時形質移入、他の真核細胞の安定的形質移入、または原核細胞を用いた発現によって、タンパク質ｓｃＣＤ９５Ｌ（配列番号２７）を産生できることを示す図である。組換え体タンパク質は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎセファロースマトリックスを用いることによってアフィニティー精製できる。結合したタンパク質は、デスチオビオチンを含有するバッファーで溶出できる。図２は、アフィニティー精製の溶出分画（レーン１〜５；分画２は陽性である）の銀染されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ｓｃＣＤ９５Ｌを含有する溶出分画をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に添加することができた。タンパク質はわずかな凝集体含有量しか示さないことが期待される。 図２５は、様々なリンカー（配列番号２８に由来する）を有する一本鎖ＴＲＡＩＬタンパク質を一時発現するＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清の収集、および様々な希釈率でのＪｕｒｋａｔ細胞の刺激（例として、この図では１：８希釈が示されている）を示す図である。上清は、さらなる改変なしに直接用いるか、ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質を架橋するために抗Ｓｔｒｅｐｔａｇ抗体（２μｇ／ｍｌ Ｓｔｒｅｐ ＭＡＢ Ｉｍｍｏ）が添加された。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨＥＫ２９３細胞培養上清と共に３７°で３時間インキュベートし、溶解し、カスパーゼ活性について分析した。架橋されたｓｃＴＲＡＩＬｗｔタンパク質を含有した細胞培養上清は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるカスパーゼ活性の増大を誘導した。これは、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔタンパク質単独では、アポトーシス促進性でありうる高次の凝集体を低量しか形成しないことを示す。 図２６は、ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトコンポーネントのモジュール継承が与える、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のそれらの発現速度への影響を示す図である。一時発現実験からのＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清のウェスタンブロット。Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質の形成に必要なポリペプチド鎖を別々に発現させたか（レーン１〜１０）、代わりに、共発現実験を行った（レーン１１〜１３）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、一次ＡＢとして抗Ｓｔｒｅｐｔａｇ特異ｍＡＢを用いて、Ｓｔｒｅｐｔａｇを含有するタンパク質を検出した。軽鎖−ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）タンパク質は、付属の重鎖の非存在下でさえ分泌された（レーン１〜４）。対照的に、重鎖−ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）融合タンパク質は、付属の軽鎖の非存在下では分泌されなかった（レーン５〜８）。レーン１３で例示されるように、重鎖−ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）融合タンパク質は、軽鎖の存在下でのみ分泌された。 図２７は、様々なリンカーを有するｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−Ｆｃ融合タンパク質を一時発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞培養上清の収集、および様々な希釈率でのＪｕｒｋａｔ細胞の刺激への使用を示す図である。上清はさらなる改変なしに直接用いた（図ＸＸ−Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清と共に３７°で３時間インキュベートし、溶解し、カスパーゼ活性について分析した。ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−Ｆｃ含有上清には、顕著なアポトーシス促進能が既に存在していた。これは、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−Ｆｃ融合タンパク質単独で、アポトーシス促進性となりうる二量体アセンブリを形成することを示す。 図２８は、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトがＦａｂ断片を介してＨＴ１０８０細胞に結合し、それによって、ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性生理活性を増強することを示す図である。ＴＮＦスーパーファミリーの人工架橋されたリガンドまたは膜結合リガンドの使用は、可溶性のホモ三量体リガンドと比較して優れた生理活性を有することが周知である。したがって、一本鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）コンストラクトを、これらのｓｃＴＲＡＩＬタンパク質に融合したＨｅｒ２選択的Ｆａｂ断片（「パーツズマブ」）を介して、抗原Ｈｅｒ２を発現する細胞上に局所濃縮することによって、それらの細胞傷害性生理活性が増強されるはずである。同様に、Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂ断片（パーツズマブ−Ｆａｂ）とのプレインキュベーションによる細胞上のＨｅｒ２結合部位のブロッキングは、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の細胞傷害性生理活性を減少させるのみであるはずである。図２８Ａに示すように、タンパク質濃度の増大に従って生存率が低減するので、ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトはＨＴ１０８０細胞の死を誘導する。これと一致して、ＨＴ１０８０細胞をＦａｂ断片（パーツズマブ−Ｆａｂ）と共にプレインキュベーションし、続いてＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクト（Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＮＳＮまたはＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮ）と共に一終夜インキュベーションすると、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトの細胞傷害性活性を低減させ（図２８Ｂ）、一方Ｆａｂのみでは細胞死を誘導しない（パーツズマブ−Ｆａｂ）。これは、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトがＦａｂ断片を介してＨＴ１０８０細胞に結合し、それによって、ｓｃＴＲＡＩＬの細胞傷害性生理活性を増強することを意味する。

本発明によれば、２つのペプチドリンカーによって連結された少なくとも３つの可溶性ＴＮＦファミリーリガンドドメインを含む実質的に非凝集性の融合ポリペプチドが提供される。

「非凝集性」という用語は、調製物中の単量体含有量が≧５０％、好ましくは、≧７０％、より好ましくは、≧９０％であることを指す。単量体含有量と凝集体含有量との比率は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて凝集体形成の量を検査することによって決定できる。凝集に関する安定性は、様々な貯蔵条件下、例えば、４℃または２５℃で、例えば、数日間から何日間か（ａ ｆｅｗ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｄａｙｓ）、何週間、何カ月間か（ｗｅｅｋｓ ａｎｄ ｍｏｎｔｈｓ）までの特定の期間の後に、ＳＥＣによって決定できる。融合タンパク質について、実質的に非凝集性と分類されるためには、４℃または２５℃で、何日間か、例えば、１０日間の期間の貯蔵の後に、単量体含有量が上記に特定した通りであることが好ましく、より好ましくは、この期間は、数週間、例えば、２、３、または４週間、最も好ましくは、数カ月間、例えば、２または３カ月間である。

ヒトＪｕｒｋａｔ細胞上のｓｃＣＤ９５Ｌの場合、例えばアポトーシス誘導能の増大はその凝集状態と相関するので、凝集に関する融合ポリペプチドの安定性も、融合ポリペプチドの生物活性を検査することによって決定できる。

一本鎖融合ポリペプチドは、そのＮおよび／またはＣ末端に位置してもよい追加のドメインを含みうる。追加の融合ドメインの例は、例えば、一本鎖抗体もしくは抗体断片もしくは他のターゲティング分子、またはさらに別のサイトカインドメイン（例えば、インターロイキン）である。

一本鎖融合タンパク質は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインに由来する３つの可溶性ドメインを含む。それらの可溶性ドメインは、対立遺伝子変種および／またはその誘導体を含めた、哺乳動物、とりわけヒトのサイトカインに由来することが好ましい。可溶性ドメインは、膜局在ドメインの無い受容体結合ドメインを含めた、ＴＮＦＳＦサイトカインの細胞外部分を含む。ＴＮＦスーパーファミリーのタンパク質は、１５〜３０アミノ酸のＮ末端部分、いわゆるストーク領域を介して膜にアンカリングされている。ストーク領域は、三量体化に寄与し、細胞膜までの特定の距離をもたらす。しかし、ストーク領域は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部ではない。

重要なことに、ＲＢＤは、そのＮおよびＣ末端アミノ酸の特定の局在を特徴とする。前記アミノ酸は、すぐに側に隣接しており、三量体の軸に中心に位置している。ＲＢＤの最初のＮ末端アミノ酸は、ＲＢＤのＣ末端アミノ酸と逆平行β鎖を形成する（図２および３）。

したがって、ＲＢＤの逆平行β鎖は、ストーク領域のアミノ酸を介して細胞膜中に連結およびアンカリングされている、細胞膜との境界面を形成する。一本鎖融合タンパク質の可溶性ドメインは、ストーク領域由来のいかなるアミノ酸も欠失しているＴＮＦ−ＳＦサイトカインの受容体結合ドメインを含むことが極めて好ましい（図４および５）。さもなければ、１つの可溶性ドメインのＣ末端を次の可溶性ドメインのＮ末端に連結する長いリンカーが、次の可溶性ドメインのＮ末端ストーク領域を埋め合わせるのに必要であろう（図６）。これは、不安定性および／または凝集体の形成をもたらしうるであろう。

そのような可溶性ドメインのさらに別の利点は、いかなる抗薬物抗体もＲＢＤのＮおよびＣ末端アミノ酸に接近できないことである。

一本鎖融合ポリペプチドは、それぞれのサイトカイン受容体のための少なくとも１つの機能的結合部位を含む規則的三量体構造を形成できることが好ましい。

融合ポリペプチドは、１、２または３つの機能的なサイトカイン受容体結合部位、すなわち、サイトカイン受容体と複合体を形成できるアミノ酸配列を含みうる。したがって、可溶性ドメインの少なくとも１つは、対応するサイトカイン受容体に結合できる。一実施形態では、可溶性ドメインの少なくとも１つは受容体を活性化でき、それによって、アポトーシス活性および／または増殖活性が作用されうる。さらに別の実施形態では、可溶性ドメインの１つまたは複数が受容体活性化できないものとして選択される。

可溶性ドメインは、表１に示すように、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、例えば、ヒトＴＮＦＳＦ−１から−１８およびＥＤＡ−Ａ１から−Ａ２、好ましくは、ＬＴＡ（配列番号１）、ＴＮＦα（配列番号２）、ＬＴＢ（配列番号３）、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号５）、ＣＤ９５Ｌ（配列番号６）、ＣＤ２７Ｌ（配列番号７）、ＣＤ３０Ｌ（配列番号８）、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号９）、ＴＲＡＩＬ（配列番号１０）、ＲＡＮＫＬ（配列番号１１）、ＴＷＥＡＫ（配列番号１２）、ＡＰＲＩＬ１（配列番号１３）、ＡＰＲＩＬ２（配列番号１４）、ＢＡＦＦ（配列番号１５）、ＬＩＧＨＴ（配列番号１６）、ＴＬ１Ａ（配列番号１７）、ＧＩＴＲＬ（配列番号１８）、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号１９）およびＥＤＡ−Ａ２（配列番号２０）に由来するものでありうる。それぞれのタンパク質の好ましい可溶性ドメインは、表１（ＮＨ_２−ａａからＣＯＯＨ−ａａ）に示されており、例えば、ＬＴＡ（配列番号１）のアミノ酸５９〜２０５、６０〜２０５または６４〜２０５、ＴＮＦα（配列番号２）のアミノ酸８６〜２３３、ＬＴＢ（配列番号３）のアミノ酸８２〜２４４または８６〜２４４、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）のアミノ酸５２〜１８３または５５〜１８３、ＣＤ４０Ｌ（配列番号５）のアミノ酸１１２〜２６１、１１７〜２６１または１２１〜２６１、ＣＤ２７Ｌ（配列番号７）のアミノ酸５１〜１９３または５６〜１９３、ＣＤ３０Ｌ（配列番号８）のアミノ酸９７〜２３４、９８〜２３４または１０２〜２３４、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号９）のアミノ酸８６〜２５４、ＲＡＮＫＬ（配列番号１１）のアミノ酸１６１〜３１７、ＴＷＥＡＫ（配列番号１２）のアミノ酸１０３〜２４９、１０４〜２４９、１０５〜２４９または１０６〜２４９、ＡＰＲＩＬ１（配列番号１３）のアミノ酸１１２〜２４７、ＡＰＲＩＬ２（配列番号１４）のアミノ酸１１２〜２５０、ＢＡＦＦ（配列番号１５）のアミノ酸１４０〜２８５、ＴＬ１Ａ（配列番号１７）のアミノ酸９１〜２５１、９３〜２５１または９７〜２５１、ＧＩＴＲＬ（配列番号１８）のアミノ酸５２〜１７７、ＥＤＡ−Ａ１（配列番号１９）のアミノ酸２４５〜３９１、ＥＤＡ−Ａ２（配列番号２０）のアミノ酸２４５〜３８９を含む。

可溶性ドメインは、ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬまたはＬＩＧＨＴ由来であることがより好ましい。特に好ましい実施形態では、可溶性ドメインは、ヒトＣＤ９５Ｌ、とりわけ配列番号６のアミノ酸１４４、１４５または１４６に始まり、とりわけアミノ酸１４４〜２８１、１４５〜２８１または１４６〜２８１を含むもの、またはヒトＴＲＡＩＬ、とりわけ、配列番号１０のアミノ酸１２０〜１２２から始まり、とりわけアミノ酸１２０〜２８１、１２１〜２８１または１２２〜２８１を含むものから選択される。場合によって、配列番号６のアミノ酸Ｌｙｓ１４５が非荷電アミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。場合によって、配列番号１０のアミノ酸Ａｒｇ１２１が非荷電アミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。さらに別の好ましい実施形態では、可溶性ドメインは、ヒトＬＩＧＨＴ、とりわけ配列番号１６のアミノ酸９３、９４または９５から始まり、とりわけ配列番号１６のアミノ酸９３〜２４０、９４〜２４０または９５〜２４０を含むものから選択される。

上述のように、可溶性ドメインは、配列番号１〜２０に示す野生型配列を含みうる。しかし、これらの可溶性ドメインの１つまたは複数への突然変異、例えば、可溶性ドメインの結合特性を改変する（例えば、増大または低減する）突然変異の導入が可能であることに留意するべきである。一実施形態では、対応するサイトカイン受容体に結合できない可溶性ドメインを選択できる。そのような突然変異の例は、ヒトＣＤ９５Ｌ（配列番号６）のアミノ酸Ｙ２１８の、別のアミノ酸、例えば、Ｒ、Ｋ、ＳまたはＤによる置き換えである。さらに、他の細胞および／または細胞外コンポーネント、例えば、細胞外マトリックスへの結合を改変する突然変異を導入できる。そのような突然変異の例は、ＣＤ９５Ｌ（配列番号６）のアミノ酸Ｋ１７７の、別のアミノ酸、例えば、Ｅ、ＤまたはＳによる置き換えである。

本発明のさらに別の好ましい実施形態では、可溶性サイトカインドメイン（ｉ）が、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１）および／またはＴＲＡＩＬ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ２）を結合および／または活性化するＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの突然変異体またはその受容体結合ドメインを含む。突然変異体の結合および／または活性は、例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻、８６３４〜８６３９頁）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００５年、２８０巻、２２０５〜２２１５頁）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５年、６５巻、１１２６５〜１１２７０頁）に記載のアッセイによって測定できる。

突然変異体は、当業者に公知の任意の技法、例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻、８６３４〜８６３９頁）、Ｋｅｌｌｅｙら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００５年、２８０巻、２２０５〜２２１５頁）、またはＭａｃＦａｒｌａｎｅら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５年、６５巻、１１２６５〜１１２７０頁）に記載の技法によって生成でき、任意のタイプの構造突然変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失、複製および／または挿入を含みうる。好ましい実施形態は、置換の生成である。置換は、本明細書に記載のＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインまたはその受容体結合ドメインの少なくとも１つアミノ酸に作用しうる。好ましい実施形態では、置換は、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬ（例えば、配列番号１０）のアミノ酸の少なくとも１つに作用しうる。この関連で好ましい置換は、配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの以下のアミノ酸、すなわち、Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９のうちの少なくとも１つに作用する。配列番号１０のヒトＴＲＡＩＬの好ましいアミノ酸置換は、以下の置換、すなわち、Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋのうちの少なくとも１つである。

アミノ酸置換（複数可）は、ＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２のいずれかへの、またはこれらのいずれかにおける、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬの結合および／または活性に作用しうる。代わりに、アミノ酸置換（複数可）は、ＴＲＡＩＬＲ１およびＴＲＡＩＬＲ２の両方への、またはこれら両方における、ＴＲＡＩＬ、例えばヒトＴＲＡＩＬの結合および／または活性に作用しうる。ＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、正の作用、すなわち、受容体の、より強い、より選択的、もしくはより特異的な結合および／またはより大きな活性化を受けうる。代わりに、ＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性は、負の作用、すなわち、受容体の、より弱い、より非選択的、もしくはより非特異的な結合および／またはより小さな活性化を受けうるもしくはまったく活性化を受け得ない。

ＴＲＡＩＬＲ１およびＴＲＡＩＬＲ２の両方の結合および／または活性化に作用する本発明のアミノ酸置換（複数可）を有するＴＲＡＩＬ突然変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記参照）の表１に見出されうるものであり、配列番号１０の次の２アミノ酸置換：Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄ、または１アミノ酸置換：Ｙ１８９Ａを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含みうる。

ＴＲＡＩＬＲ１の結合および／または活性化に作用する本発明のアミノ酸置換（複数可）を有するＴＲＡＩＬ突然変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記参照）の表１に見出されうるものであり、配列番号１０の次の４アミノ酸置換：Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、およびＳ２１５Ｄ、もしくは次の５アミノ酸置換：Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、およびＳ２１５Ｄを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含みうる、またはＫｅｌｌｅｙら（上記参照）の表２に見出されうるものであり、次の６アミノ酸置換：Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、およびＫ２０１Ｒ、もしくはＹ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含みうる。

ＴＲＡＩＬＲ２の結合および／または活性化に作用する本発明のアミノ酸置換（複数可）を有するＴＲＡＩＬ突然変異体の例は、例えば、ＭａｃＦａｒｌａｎｅら（上記参照）の表１もしくはＫｅｌｌｅｙら（上記参照）の表２に見出されうるものであり、配列番号１０の次の６アミノ酸置換：Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、およびＤ２６７Ｑを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含みうる、またはｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｏｏｔら（上記参照）の表２に見出されうるものであり、次の１アミノ酸置換：Ｄ２６９Ｈ、または次の２アミノ酸置換：Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５ＲもしくはＤ２６９ＨおよびＴ２１４Ｒを有するヒトＴＲＡＩＬ突然変異体を含みうる。

したがって、好ましい一実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質であって、可溶性ドメインの少なくとも１つが、ＴＲＡＩＬＲ１および／またはＴＲＡＩＬＲ２を結合および／または活性化する、ＴＲＡＩＬまたはその受容体結合ドメインの変異体を含む融合タンパク質である。

ＴＲＡＩＬ誘発性受容体凝集の低減を示すＴＲＡＩＬ突然変異体のさらに別の例は、Ｈ１６８（Ｓ、Ｔ、Ｑ）、Ｒ１７０（Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｑ）、およびＨ１７７（Ｓ、Ｔ）である。

本明細書に記載のＴＲＡＩＬまたは受容体結合ドメインの突然変異体を含む融合タンパク質の好ましい一実施形態は、コンポーネント（ｉ）が少なくとも１つのアミノ酸置換、とりわけ下記に示すものを含む融合タンパク質である。

そのようなアミノ酸置換は、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）の次のアミノ酸位置：Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｈ１６８、Ｒ１７０、Ｈ１７７、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７、Ｄ２６９のうちの少なくとも１つに作用する。

そのようなアミノ酸置換は、次のもの：Ｒ１３０Ｅ、Ｇ１６０Ｍ、Ｈ１６８（Ｓ、Ｔ、Ｑ）、Ｒ１７０（Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｑ）、Ｈ１７７（Ｓ、Ｔ）、Ｙ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｓ、Ｑ１９３Ｒ、Ｅ１９５Ｒ、Ｎ１９９Ｖ、Ｎ１９９Ｒ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、Ｔ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｄ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、Ｄ２６７Ｑ、Ｄ２６９Ｈ、Ｄ２６９Ｒ、またはＤ２６９Ｋの少なくとも１つである。

好ましいＴＲＡＩＬ−Ｒ２選択的ドメインは、アミノ酸置換Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、およびＤ２６７Ｑを含む。

好ましいＴＲＡＩＬ−Ｒ１選択的ドメインは、アミノ酸置換Ｙ１８９Ａ、Ｑ１９３Ｓ、Ｎ１９９Ｖ、Ｋ２０１Ｒ、Ｙ２１３Ｗ、およびＳ２１５Ｄを含む。

本発明の一本鎖融合分子は、３つの可溶性のサイトカインドメイン、すなわち、コンポーネント（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）を含む。本発明によれば、第２および／または第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインが、アミノ酸配列突然変異を場合によって含むＮ末端短縮されたドメインである場合、驚いたことに、凝集に対する一本鎖ＴＮＦファミリーサイトカイン融合ポリペプチドの安定性が増強されることが見出された。したがって、第２および第３の可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメインの両方が、Ｎ末端領域のアミノ酸配列突然変異を好ましくは可溶性サイトカインドメインのＮ末端の最初の５アミノ酸以内に場合によって含むＮ末端短縮されたドメインであることが好ましい。これらの突然変異は、中性アミノ酸、とりわけセリンまたはグリシンによる、荷電アミノ酸、例えば酸性または塩基性アミノ酸の置き換えを含みうる。

それとは対照的に、第１の可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメインの選択はそれほど重要ではない。ここでは、完全長Ｎ末端配列を有する可溶性ドメインを使用できる。しかし、第１の可溶性のサイトカインドメインもまた、Ｎ末端短縮され、場合によって突然変異導入された配列を有してもよいことに留意するべきである。

本発明の好ましい実施形態では、可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）は、可溶性ＣＤ９５Ｌドメイン、とりわけ可溶性ヒトＣＤ９５Ｌドメインである。第１の可溶性ＣＤ９５Ｌドメイン（ｉ）は、天然、短縮および／または突然変異導入配列から選択できる。第１のドメイン（ｉ）のＮ末端配列は、例えば、ヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸Ｇｌｕ１４２とＶａｌ１４６との間で始まるものでありえ、Ａｒｇ１４４および／またはＬｙｓ１４５が中性アミノ酸によって、例えば、ＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。しかし、第２および第３の可溶性のＣＤ９５Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）は、短縮および／または突然変異導入配列から選択される。可溶性ＣＤ９５Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）のうち少なくとも１つは、ヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸Ａｒｇ１４４とＶａｌ１４６との間で始まるＮ末端配列を有することが好ましく、ここで、Ａｒｇ１４４および／またはＬｙｓ１４５が中性アミノ酸によって、例えばＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。特に好ましい実施形態では、第２および第３の可溶性ＣＤ９５Ｌドメインが、
（ａ）Ａｒｇ１４４−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４５−Ｖａｌ（１４６）
（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４４−Ｌｙｓ１４５−Ｖａｌ（１４６）、および
（ｃ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４４−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４５−Ｖａｌ（１４６）
から選択されるＮ末端配列で始まる。

さらに、ＣＤ９５ＬドメインがヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸Ｌｅｕ２８１で終わることが好ましい。

可溶性ＣＤ９５Ｌドメインは、哺乳動物、例えばヒト野生型の配列を含みうる。しかし、特定の実施形態では、ＣＤ９５Ｌ配列は、細胞外マトリックスへの結合の低減もしくは完全阻害をもたらす突然変異、例えば、位置Ｌｙｓ１７７における突然変異、例えば、Ｌｙｓ１７７→Ｇｌｕ、Ａｓｐ、もしくはＳｅｒ、ならびに／またはＣＤ９５Ｌ受容体への結合を低減および／もしくは阻害する突然変異、例えば、位置Ｔｙｒ２１８における突然変異、例えば、Ｔｙｒ２１８→Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｐを含みうる。本発明の特定の実施形態では、３つの可溶性ＣＤ９５Ｌモジュールの１つが、受容体結合の低減を有する配列変異体である。他の実施形態では、モジュールのうち２つが、受容体結合の低減をもたらす突然変異を含有する。

本発明のさらに別の好ましい実施形態では、可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）が可溶性ＴＲＡＩＬドメイン、とりわけ可溶性ヒトＴＲＡＩＬドメインである。第１の可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は、天然、短縮および／または突然変異導入配列から選択できる。したがって、第１の可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉ）は、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｕ１１６とＶａｌ１２２との間で始まりうるＮ末端配列を有し、Ａｒｇ１２１が中性アミノ酸、例えば、ＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。第２および第３の可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）は、好ましくはヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｙ１２０とＶａｌ１２２との間で始まる短縮Ｎ末端配列を有し、Ａｒｇ１２１が別のアミノ酸、例えば、ＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい。

可溶性ＴＲＡＩＬドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）のＮ末端配列は、
（ａ）Ａｒｇ１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３、および
（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３
から選択されることが好ましい。

可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｙ２８１で終わることが好ましい。特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、上述の通りの内部突然変異を含みうる。

本発明のさらに別の好ましい実施形態では、可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）が、可溶性ＬＩＧＨＴドメイン、とりわけ可溶性ヒトＬＩＧＨＴドメインである。第１の可溶性ＬＩＧＨＴドメイン（ｉ）は、天然、短縮および／または突然変異導入配列から選択できる。したがって、第１の可溶性のＬＩＧＨＴドメイン（ｉ）は、ヒトＬＩＧＨＴのアミノ酸Ｇｌｕ９１とＡｌａ９５との間で始まりうるＮ末端配列を有する。第２および第３の可溶性ＬＩＧＨＴドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）は、好ましくはヒトＬＩＧＨＴのアミノ酸Ｐｒｏ９４とＡｌａ９５との間で始まる短縮Ｎ末端配列を有する。可溶性ＬＩＧＨＴドメインは、アミノ酸Ｖａｌ２４０で終わることが好ましい。

一本鎖融合ポリペプチドのコンポーネント（ｉｉ）および（ｉｖ）は、コンポーネント（ｉ）と（ｉｉｉ）の間または（ｉｉｉ）と（ｖ）の間にそれぞれ位置するペプチドリンカーエレメントである。柔軟なリンカーエレメントは、３〜８アミノ酸の長さ、とりわけ、３、４、５、６、７または８アミノ酸の長さを有する。リンカーエレメントは、グリシン／セリンリンカー、すなわち、アミノ酸グリシンおよびセリンから実質的になるペプチドリンカーであることが好ましい。可溶性サイトカインドメインがＳまたはＧで終わる（Ｃ末端）場合、例えばヒトＴＲＡＩＬの場合、リンカーは、ＳまたはＧの後で始まる。可溶性サイトカインドメインがＳまたはＧから始まる（Ｎ末端）場合、リンカーはこのＳまたはＧの前で終わる。

リンカー（ｉｉ）およびリンカー（ｉｖ）が同じ長さのものである必要はないことに留意するべきである。潜在的な免疫原性を低減させるために、より短いリンカーの使用が好まれうる。加えて、より短いリンカーによって、凝集体を形成する傾向が低減している一本鎖分子がもたらされることが明らかになった。一方、本明細書に開示のものより実質的に長いリンカーは、好ましくない凝集特性を示しうる。

望ましい場合には、リンカーは、グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒを形成しうるアスパラギン残基を含みうる。特定の実施形態では、リンカーの１つ、例えば、リンカー（ｉｉ）またはリンカー（ｉｖ）がグリコシル化部位を含む。他の実施形態では、両方のリンカー（ｉｖ）がグリコシル化部位を含む。ｓｃＴＮＦ−ＳＦタンパク質の可溶性を増大させるため、および／または潜在的免疫原性を低減させるために、リンカー（ｉｉ）もしくはリンカー（ｉｖ）または両方がグリコシル化部位を含むことが好ましいことがありうる。

好ましいリンカー配列は、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５２）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５３）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号２１）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号２２）、ＧＧＳＧ（配列番号２３）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号２４）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号２５）、およびＧＧＮＧＳＧ（配列番号２６）から選択される。

融合タンパク質は、適した宿主細胞におけるプロセシング、例えば細胞外分泌を可能にするＮ末端シグナルペプチドドメインを追加して含みうる。Ｎ末端シグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ切断部位、例えばシグナルペプチダーゼ切断部位を含み、それによって、成熟タンパク質を得るために、発現後または発現中に除去されうることが好ましい。さらに、融合タンパク質は、認識／精製ドメイン、例えば、ＦＬＡＧドメイン、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇもしくはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩドメインおよび／またはポリＨｉｓドメインを含むか、これに連結した、例えば、１〜５０、好ましくは１０〜３０アミノ酸の長さを有するＣ末端エレメントを追加して含みうる。

さらに、融合ポリペプチドは、さらに別のドメイン、例えば、一本鎖抗体または抗体断片ドメインなどのターゲティングドメインをＮ末端および／またはＣ末端に追加して含みうる。適した抗体の特定の例は、ＥＧＦＲファミリーメンバーに対する抗体などの抗腫瘍抗体である。他のターゲッティング分子の適した例は、インターロイキンなどのサイトカインである。

本発明の特定の融合タンパク質の例は、配列番号２７、２８、２９、４３、４５、４７、４９、および５１である。

本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ＤＮＡ分子、例えば、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子でありうる。核酸分子は、融合タンパク質またはその前駆体、例えば、融合タンパク質のＮおよび／またはＣ末端に位置することが好ましい分泌または精製用シグナル配列または他の異種アミノ酸部分を含みうる、融合タンパク質のプロ型もしくはプレプロ型をコードしうる。異種アミノ酸部分は、プロテアーゼ切断部位、例えば、活性化第Ｘ_ａ因子、トロンビンまたはＩｇＡプロテアーゼ切断部位を介して第１および／または第２のドメインに連結されうる。

本発明の特定の核酸配列の例は、配列番号３０、３１、３２、４４、４６、４８、および５０である。

核酸分子は、発現制御配列、例えば、所望の宿主細胞における核酸分子の発現を可能にする発現制御配列に作用性に連結されうる。核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、染色体挿入型ベクターなどに配置されうる。例えば、適した発現制御配列およびベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、またはこれらのより最近の版に記載されている。

様々な発現ベクター／宿主細胞系が、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を発現するのに使用できる。適した宿主細胞には、細菌、例えば大腸菌などの原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞などの真核宿主細胞が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、本発明は、上述の核酸分子で形質転換または形質移入された非ヒト生物に関する。そのようなトランスジェニック生物は、相同組換えを含めた、遺伝子導入の公知の方法によって作製できる。

本発明のさらに別の態様は、すべて本明細書に記載されている、少なくとも１つの融合タンパク質、それらをコードするそれぞれの核酸、または形質転換もしくは形質移入された細胞を活性薬として含む医薬組成物または診断用組成物に関する。

すべて本明細書に記載されている、少なくとも１つの融合タンパク質、それらをコードするそれぞれの核酸、または形質転換もしくは形質移入された細胞は、治療、例えば、ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの機能障害によって引き起こされる、これに関連する、および／またはこれに伴う障害、とりわけ、腫瘍、例えば固形もしくはリンパ腫瘍などの増殖性障害；感染症；炎症性疾患；代謝病；自己免疫障害、例えば、リウマチ様および／もしくは関節炎疾患；変性疾患、例えば、多発性硬化症などの神経変性疾患；アポトーシス関連疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療で使用できる。

「ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの機能障害」という用語は、本明細書で使用される場合、ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの正常な機能または発現から逸脱するＴＮＦ−ＳＦサイトカインの任意の機能または発現と理解され、例には、当該ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの正常な生理的な発現レベルと比較した、ＴＮＦ−ＳＦ遺伝子またはタンパク質の過剰発現、ＴＮＦ−ＳＦサイトカイン遺伝子またはタンパク質の低減または消失した発現、当該ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの正常な生理活性または結合と比較した、ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの活性増大、ＴＮＦ−ＳＦサイトカインの活性の低減または消失、任意の結合パートナーへの、例えば、受容体、とりわけＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ受容体または別のサイトカイン分子へのＴＮＦ−ＳＦサイトカインの結合増大、任意の結合パートナーへの、例えば、受容体、とりわけＣＤ９５、またはＴＲＡＩＬ受容体または別のサイトカイン分子への結合の低減または消失が挙げられる。

組成物は、単独治療として投与しても、さらに別の投薬、例えば、細胞増殖抑制剤または化学療法剤、コルチコステロイド、および／または抗生物質との併用療法として投与してもよい。

融合タンパク質は、適した手段による特定の状態を治療するのに十分な用量で、それを必要とする対象、とりわけヒト患者に投与される。例えば、融合タンパク質は、薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントと共に医薬組成物として製剤化できる。治療有効性および毒性は、標準プロトコールに従って決定できる。医薬組成物は、全身投与、例えば、腹腔内、筋肉内もしくは静脈内投与、または局所投与、例えば、鼻腔内、皮下もしくは髄腔内投与できる。静脈内投与が好ましい。

投与される融合タンパク質の用量は、当然ながら、治療される対象、対象の体重、疾患のタイプおよび重度、投与の方法、ならびに処方する医師の判断に依る。融合タンパク質の投与には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの日用量が適している。

１．一本鎖ＣＤ９５Ｌ融合タンパク質（ｓｃＣＤ９５Ｌ）の製造
以下に、ヒトＣＤ９５リガンドの受容体結合ドメインに例示される本発明の組換え体タンパク質の一般構造（図１）を示す。

１．１ ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｓｅｒ２１
Ｉｇκシグナルペプチド、アミノ酸Ｇｌｙ２０の後に想定シグナルペプチダーゼ切断部位。

Ｂ）アミノ酸Ｇｌｕ２２〜Ｌｅｕ１６１
ヒトＣＤ９５リガンドの第１の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ９５Ｌ；Ｋ１４５Ｓ突然変異を含む、配列番号６のアミノ酸１４２〜２８１）。

Ｃ）アミノ酸Ｇｌｙ１６２〜Ｇｌｙ１６９
第１のペプチドリンカーエレメント。

Ｄ）アミノ酸Ａｒｇ１７０〜Ｌｅｕ３０７
ヒトＣＤ９５リガンドの第２の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ９５Ｌ；Ｋ１４５Ｓ突然変異を含む、配列番号６のアミノ酸１４４〜１８２）。

Ｅ）アミノ酸Ｇｌｙ３０８〜３１５
第２のペプチドリンカーエレメント。

Ｆ）アミノ酸Ａｒｇ３１６〜Ｌｅｕ４５３
ヒトＣＤ９５リガンドの第３の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ９５Ｌ；Ｋ１４５Ｓ突然変異を含む、配列番号６のアミノ酸１４４〜２８１）。

Ｇ）アミノ酸Ｇｌｙ４５７〜Ｌｙｓ４７２
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩモチーフを有するペプチドリンカー。

ｓｃＣＤ９５Ｌのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。融合ポリペプチドは、配列ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号２１）を有する第１および第２のペプチドリンカーを含む。さらに別の好ましいリンカー配列は、上述の配列番号２２〜２６である。第１および第２のペプチドリンカー配列は、同一である必要がないことに留意するべきである。

シグナルペプチド配列（Ａ）は、任意の他の適した、例えば、哺乳動物のシグナルペプチド配列によって置き換えることができる。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩモチーフ（Ｇ）は、所望の場合、他のモチーフによって置き換えても、除去してもよい。

図２３に示す通り、ｓｃＣＤ９５Ｌ（配列番号２７）を一時発現しているＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清を収集し、様々な濃度でＪｕｒｋａｔ細胞を刺激するのに用いた。上清は、さらなる改変なしに直接用いるか、ｓｃＣＤ９５Ｌタンパク質を架橋するために抗Ｓｔｒｅｐｔａｇ抗体（２μｇ／ｍｌ）が添加された。架橋されたｓｃＣＤ９５Ｌ−Ｓｔを含有した細胞上清のみがＪｕｒｋａｔ細胞内のカスパーゼ活性を増大させた。これは、ｓｃＣＤ９５Ｌ単独では、アポトーシス促進性となりうる高次の凝集体を形成しないことを示す。

１．２ ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子は、適した宿主細胞、例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞での発現についてのコドン使用頻度に鑑みて最適化できる。好ましい核酸配列を配列番号３０に示す。

１．３ クローニングストラテジー
合成遺伝子は、例えば制限酵素加水分解によって、適した発現ベクターにクローニングできる。

２．一本鎖ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｓｃ ＴＲＡＩＬ ｗｔ）の製造
２．１ ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｇｌｙ２０
Ｉｇκシグナルペプチド、アミノ酸Ｇｌｙ２０の後に想定シグナルペプチダーゼ切断部位。

Ｂ）アミノ酸Ｇｌｎ２１〜Ｇｌｙ１８２
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第１の可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ、配列番号１０のアミノ酸１２０〜２８１）。

Ｃ）アミノ酸Ｇｌｙ１８３〜Ｓｅｒ１９０
第１のペプチドリンカーエレメント、Ｘと指定された２個のアミノ酸は両方ともＳか、一方がＳであり、かつもう一方がＮである。

Ｄ）アミノ酸Ａｒｇ１９１〜Ｇｌｙ３５１
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第２の可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ、配列番号１０のアミノ酸１２１〜２８１）。

Ｅ）アミノ酸Ｇｌｙ３５２〜Ｓｅｒ３５９
第２のペプチドリンカーエレメントＸと指定された２個のアミノ酸は両方ともＳか、一方がＳであり、かつもう一方がＮである。

Ｆ）アミノ酸Ａｒｇ３６０〜Ｇｌｙ５２０
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第３の可溶性サイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ、配列番号１０のアミノ酸１２１〜Ｇｌｙ２８１）。

Ｇ）アミノ酸Ｇｌｙ５２１〜Ｌｙｓ５３８
Ｓｔｒｅｐｔａｇ ＩＩモチーフを有するペプチドリンカーエレメント。

Ｓｃ ＴＲＡＩＬ ｗｔのアミノ酸配列を配列番号２８に示す。

示したリンカーを、例えば、配列番号２１．２６に示す他の好ましいリンカーで置き換えてもよい。第１および第２のペプチドリンカーは、同一である必要がないことに留意するべきである。

シグナルペプチド配列（Ａ）は、任意の他の適した、例えば、哺乳動物のシグナルペプチド配列によって置き換えることができる。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩモチーフ（Ｇ）は、所望の場合、他のモチーフによって置き換えても、除去してもよい。

様々なリンカーで一本鎖ＴＲＡＩＬがタンパク質を一時発現するＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清（総計９通りの異なったリンカー組合せで、配列番号２８に由来する）を収集し、様々な希釈率でＪｕｒｋａｔ細胞を刺激するのに用いた（例として、１：８希釈を図２５に示す）。上清は、さらなる改変なしに直接用いるか、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔタンパク質を架橋するために抗Ｓｔｒｅｐｔａｇ抗体（２μｇ／ｍｌ Ｓｔｒｅｐ ＭＡＢ Ｉｍｍｏ）が添加された。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨＥＫ２９３細胞培養上清と共に３７°で３時間インキュベートし、溶解し、カスパーゼ活性について分析した。架橋されたｓｃＴＲＡＩＬｗｔタンパク質を含有した細胞培養上清は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるカスパーゼ活性の増大を誘導した（グラフの右側に示す結果）。これは、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔタンパク質単独では、アポトーシス促進性でありうる高次の凝集体を低量しか形成しないことを示す。

２．２ ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子は、適した宿主細胞、例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞での発現についてのコドン使用頻度に鑑みて最適化できる。好ましい核酸配列を配列番号３１に示す。

３．一本鎖突然変異導入ＴＲＡＩＬ融合タンパク質（ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的））の製造
以下に、ＴＲＡＩＬ受容体Ｒ２への選択的結合のための突然変異を含む一本鎖ＴＲＡＩＬポリペプチドの構造を示す。

３．１ ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１〜Ｓｅｒ２９
Ｉｇκシグナルペプチド、アミノ酸Ｇｌｙ２０の後に想定シグナルペプチダーゼ切断部位、およびペプチドリンカー。

Ｂ）アミノ酸Ａｒｇ２９〜Ｇｌｙ１９０
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第１の可溶性のサイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ、突然変異Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１Ｋ、Ｑ１９３Ｒ、Ｈ２６４Ｒ、Ｉ２６６Ｌ、およびＤ２６７Ｑを含む、配列番号１０のアミノ酸１２１〜２８１）。

Ｃ）アミノ酸Ｇｌｙ１９１〜Ｓｅｒ１９８
第１のペプチドリンカーエレメント、Ｘに指定されたアミノ酸は実施例２に示す通り。

Ｄ）アミノ酸Ａｒｇ１９９〜Ｇｌｙ３５９
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第２の可溶性のサイトカインドメイン（Ｂに示す突然変異を含む、配列番号１０のＴＲＡＩＬアミノ酸１２１〜２８１）。

Ｅ）アミノ酸Ｇｌｙ３６０〜Ｓｅｒ３６７
第２のペプチドリンカーエレメント、アミノ酸Ｘは実施例２に示す通り。

Ｆ）アミノ酸Ａｒｇ３６８〜Ｇｌｙ５２８
ヒトＴＲＡＩＬリガンドの第３の可溶性のサイトカインドメイン（ＴＲＡＩＬ、Ｂに示す突然変異を含む、配列番号１０のアミノ酸１２１〜２８１）。

Ｇ）アミノ酸Ｇｌｙ５２９〜Ｌｙｓ５４６
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩモチーフを有するペプチドリンカー。

ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。

示したリンカーを、例えば、配列番号２１〜２６に示す他の好ましいリンカーで置き換えてもよい。第１および第２のペプチドリンカーは、同一である必要がないことに留意するべきである。

シグナルペプチド配列（Ａ）は、任意の他の適した、例えば、哺乳動物のシグナルペプチド配列によって置き換えることができる。Ｓｔｒｅｐｔａｇ ＩＩモチーフ（Ｇ）は、所望の場合、他のモチーフによって置き換えても、除去してもよい。

３．２ ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子は、適した宿主細胞、例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞での発現についてのコドン使用頻度に鑑みて最適化できる。好ましい核酸配列を配列番号３２に示す。

４．発現および精製
ａ）融合ポリペプチドのクローニング、発現、および精製
１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中で培養したＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、融合ポリペプチドのための発現カセットを含有するプラスミドで一時的に形質移入した。最終産物を得るのに、例えば、Ｆａｂ−ｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質（図９Ａ）のために、複数のポリペプチド鎖が必要である場合、発現カセットは、１つのプラスミド上で連結されるか、または形質移入中に異なったプラスミド上に置かれた。組換え体融合ポリペプチドを含有する細胞培養上清は形質移入後３日目に採取し、３００×ｇの遠心分離およびそれに続く０．２２μｍ無菌フィルターを通した濾過によって清澄化した。アフィニティー精製のために、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラムに充填し（ゲルベッド１ｍｌ）、１５ｍｌのバッファーＷ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）またはＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化し、細胞培養上清を４ｍｌ／分の流速でカラムに添加した。続いて、カラムを１５ｍｌのバッファーＷで洗浄し、結合したポリペプチドを段階的に７×１ｍｌのバッファーＥ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭデスチオビオチン、ｐＨ８．０）の添加によって溶出した。代わりに、２．５ｍＭデスチオビオチンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４をこの段階に用いることもできる。溶出液画分のタンパク質の量を定量し、ピーク画分を限外濾過によって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でさらに精製した。

ＳＥＣは、Ａｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで行った。カラムをリン酸緩衝食塩水で平衡化し、濃縮されたＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ精製ポリペプチドを０．５ｍｌ／分の流速でＳＥＣカラムに添加した。ポリペプチドの溶出プロフィルを２８０ｎｍの吸光度によってモニターした。

非変性条件下における精製融合ポリペプチドの見かけの分子量を決定するために、分子量が公知である標準タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加した。標準タンパク質の溶離容積に基づいて、検量線をプロットし、精製融合ポリペプチドの見かけの分子量を決定した。

５．アポトーシスアッセイ
様々なＣＤ９５−リガンド（ＣＤ９５Ｌ）およびＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドコンストラクトのアポトーシス誘導活性を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ Ａ３永久Ｔ細胞系を用いた細胞アッセイを用いた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ １６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）を含むフラスコ内で培養した。アッセイの前に、ウェルあたり１００，０００の細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。様々な濃度の融合ペプチドをウェルに添加した後、３７℃で３時間インキュベーションした。溶解バッファー（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＥＢＳＦ、ｐＨ７．５）を添加することによって細胞を溶解させ、プレートを３０分間から２時間氷上に置いた。アポトーシスは、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ−３の活性増大を伴う。それゆえ、アポトーシスの程度を決定するのに、特異的なカスパーゼ基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｂｉｏｍｏｌ）の切断が用いられた。実際、カスパーゼ活性は、ヨウ化プロピジウムおよびＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２で細胞を染色した後に形態学的に決定されたアポトーシス細胞のパーセントと相関する。カスパーゼ活性アッセイのために、２０μｌの細胞溶解液を黒い９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％スクロース、０．１％ＣＨＡＰＳ、５０μＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣおよび２５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５を含有するバッファー８０μｌを添加した後に、プレートをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ５００マイクロタイタープレートリーダーに移し、蛍光強度の増大をモニターした（励起波長４００ｎｍ、発光波長５０５ｎｍ）。

５．１ 細胞死アッセイ
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞における細胞死の測定のために、１５，０００細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を補ったＲＰＭＩ １６４０培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中に一終夜置いた。細胞を最終濃度２．５ｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。細胞死は、バッファーＫＶ（０．５％クリスタルバイオレット、２０％メタノール）で染色することによって定量化した。染色の後に、ウェルを水で洗浄し、空気乾燥させた。色素をメタノールで溶出し、５９５ｎｍの光学濃度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。

６．安定性／凝集試験
６．１．凝集分析の原理（可溶性タンパク質の定義）
単量体（ＴＮＦ−ＳＦ受容体結合モジュールの規定の三量体アセンブリ）の含有量および凝集体は、実施例４に記載の分析的ＳＥＣによって測定される。この特定の目的には、生理的ｐＨの生理的塩濃度を含有するバッファー（例えば、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；ＰＢＳ ｐＨ７．４）中で分析を行う。典型的な凝集分析は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われる。このカラムは、１０〜８００ｋＤａの範囲のタンパク質を分離する。

非変性条件下における精製融合ポリペプチドの見かけの分子量を決定するために、分子量が公知である標準タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加する。標準タンパク質の溶離容積に基づいて検量線をプロットし、精製融合ポリペプチドの見かけの分子量を溶離容積に基づいて計算する。

可溶性の非凝集タンパク質−例えば、三量体ＴＮＦ−ＳＦのＳＥＣの分析は、通常、規定の溶離容積に明確な単一タンパク質ピークを示す。この溶離容積は、特定のタンパク質の見かけの天然分子量に対応しており、一次アミノ酸配列に基づいて計算されるおおよその理論的分子量に応じる。

タンパク質凝集が起こった場合には、ＳＥＣ分析は、より小さな保持容積の追加のタンパク質ピークを示す。ＴＮＦ−ＳＦファミリーメンバーでは、可溶性タンパク質の凝集が独特の様式で起こる。タンパク質は、「三量体」のオリゴマーを形成する傾向があり、ノナマー（３×３）および２７量体（３×９）を形成する。これらのオリゴマーは、凝集種子として働き、オリゴマーが高含有量だと、タンパク質の凝集をもたらす可能性がある。高分子量のオリゴマーおよび凝集体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムのボイド容積で溶出し、それらの非変性分子量についてＳＥＣによって分析することができない。ＴＮＦ−ＳＦタンパク質の規定の可溶性三量体調製物およびオリゴマー化／凝集調製物のＳＥＣの分析の例を図１７に示す。

（完全な）凝集の誘導により、ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質の精製調製物は、好ましくは、規定の三量体タンパク質のみ、および極めて低量のオリゴマー化タンパク質のみを含有するべきである。

特定のＴＮＦ−ＳＦタンパク質調製物の凝集／オリゴマー化の程度をＳＥＣ分析をベースにして、それぞれ規定の三量体およびオリゴマー／凝集体画分についてＯＤ２８０図のピーク面積を計算することによって決定する。総ピーク面積をベースにして、規定の三量体タンパク質のパーセントを以下の通りに計算する。

（％三量体含有量＝［三量体のピーク面積］／［総ピーク面積］×１００）
この本文で用いられる可溶性タンパク質の定義は、０．２〜１０．０ｍｇ／ｍｌの典型的なタンパク質濃度範囲内で＞９０％の含有量にて特定の可溶性タンパク質（ＴＮＦ−ＳＦドメインの三量体アセンブリ）を含有する、生理的ｐＨの生理的塩濃度バッファー中における精製ＴＮＦ−ＳＦタンパク質のタンパク質調製物について記述するものである。

６．２ 精製されたｓｃ−ＴＲＡＩＬ変異体のＳＥＣ凝集分析
３種の異なるｓｃ−ＴＲＡＩＬ変異体が形質移入され、記載の通りにアフィニティー精製された。続いて、６．１に記載のＳＥＣ分析を用いて、精製タンパク質を、それらにおける規定の可溶性タンパク質の含有量について分析した。一本鎖融合タンパク質の特定の場合には、三量体とは、単一ペプチド鎖によってコードされる３つのコードＴＮＦ−ＳＦドメインの三量体アセンブリを記述するものである（正式には、一本鎖ＴＮＦ−ＳＦタンパク質は、一本鎖アセンブリが分子内相互作用を形成するのみであり［すべてのタンパク質ドメインは単一ペプチド鎖によってコードされている］、異なる個々のポリペプチド鎖間の分子間相互作用を形成するわけではないので、単量体である）。

ＳＥＣによって分析したタンパク質は以下の通りであった。

１．）Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）−ＳＮＳＮ（図１９）：
ＴＲＡＩＬ受容体２相互作用に特異的なＴＲＡＩＬの一本鎖融合タンパク質のＮ末端側に融合したＦａｂドメインを含む融合タンパク質であり、グリコシル化される。

２．）Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）−ＳＳＳＳ（図１８）
ＴＲＡＩＬ受容体２相互作用に特異的なＴＲＡＩＬの一本鎖融合タンパク質のＮ末端側に融合したＦａｂドメインを含む融合タンパク質であり、グリコシル化されない。

３．）Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−ｗｔ−ＳＮＳＮ（図２０）：
一本鎖ＴＲＡＩＬのＮ末端側に融合したＦａｂドメインを含む融合タンパク質であり、グリコシル化される。

ＴＲＡＩＬの３つの精製Ｆａｂ−ｓｃコンストラクトのＳＥＣ分析は、すべてのタンパク質について、規定の可溶性タンパク質画分を示す単一タンパク質ピークを明らかにした（＞９５％の三量体）。これらのタンパク質について計算された見かけのＭＷ（カラムの較正に基づく）は、精製タンパク質について、ＴＮＦ−ＳＦ−ドメインの三量体結合を強く指示する。分析されたタンパク質はいずれも凝集の指標を示さなかった（図１８、１９、２０）。

グリコシル化されている可能性のある「Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＳＮＳＮ」と、非グリコシル化「Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＳＳＳＳ」との比較は、Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）−ＳＮＳＮのグリコシル化による見かけの非変性ＭＷの有意差を示す。

抗体ｆｖ−断片との融合タンパク質としてのｓｃ−ＴＮＦ−ＳＦメンバーの発現は、タンパク質の凝集を促進することが公知である。Ｆａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ変異体の構築原則は、発現されたＴＲＡＩＬ変異体の凝集を示さず、それゆえ、タンパク質の可溶性に関して有益である。

６．３ ｓｃ−ＴＲＡＩＬリンカー変異体の示差的なグリコシル化
タンパク質のグリコシル化は、組換え体Ｓｃ−ＴＮＦ−ＳＦコンストラクトにとって、潜在的な免疫原性および安定性に関して有益でありうる。ｓｃ−ＴＲＡＩＬコンストラクトのグリコシル化を得るために、規定の位置に推定上のＮ結合型グリコシル化部位を含有する特定のリンカー配列を設計した（図２１−Ａを参照）。組換え体発現、および後続のウェスタンブロット分析によって、リンカー配列中のアスパラギン（Ｎ）のそれぞれの位置がタンパク質の後続のグリコシル化に重要であることが明らかにされた。驚いたことに、グリコシル化されるアスパラギンの優先的なリンカー位置は、図２１−Ａに記載の「２」の位置

であると同定された。アスパラギンが他の位置に位置する場合（例えば、位置「１」

、図２１−Ａ参照）それぞれのアスパラギンのグリコシル化は起こらない。この特質は、様々なｓｃ−ＴＲＡＩＬ変異体のウェスタンブロット分析によって確認できた。リンカー１のアスパラギンとリンカー２のアスパラギンとの両方が位置「２」に位置する場合、それぞれのｓｃ−ＴＲＡＩＬ変異体について、有意なグリコシル化依存的ＭＷシフトが観察できた（図２２）。グリコシル化されたｓｃ−ＴＲＡＩＬリンカー変異体のＭＷシフトは、ＳＥＣ分析後に見かけのＭＷを計算することによっても確認できた（図１８、１９）。グリコシル化されないＦａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）ＳＳＳＳは、グリコシル化されたＦａｂ−ｓｃ−ＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）ＳＮＳＮ（８７ｋＤａ）と比較して、明らかにより低いＭＷ（６８ｋＤａ）を有する。

この分析に基づいて、本発明者らは、リンカー配列（複数可）内のアスパラギンの位置を改変することによる、ｓｃ−ＴＲＡＩＬコンストラクトの示差的なグリコシル化を主張する。グリコシル化は、タンパク質分解に対して、リンカー配列を保護し、タンパク質を安定できるであろう。加えて、リンカー配列のグリコシル化は、免疫系によるリンカー配列の認識を防止する可能性があり、タンパク質の免疫原性を低減させる可能性がある。したがって、リンカー配列のグリコシル化は、ｓｃ−ＴＲＡＩＬコンストラクトの免疫原性およびタンパク質分解安定性に関して有益であり、タンパク質の半減期に影響を与える可能性がある。組換え体ＴＮＦ−ＳＦメンバーの免疫原性および安定性を改変するのに、リンカーの特異的な示差的グリコシル化が使用できる。

６．３．延長されたリンカー配列およびＮ末端ストーク残基を有するｓｃ−ＴＲＡＩＬ（ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロング）の発現および分析
ＷＯ／２００５／１０３０７７には、本明細書でｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロングと命名された、各ＴＲＡＩＬモジュールが配列番号１０の残基９５〜２８１を含む一本鎖ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドが記載されている。ＴＲＡＩＬモジュールは、少なくとも１２アミノ酸（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）を含むＧｌｙｃｉｎ Ｓｅｒｉｎリンカーによって連結される。本発明のＴＲＡＩＬモジュール（配列番号１０の残基１２１〜２８１を含む）と比較して、ストーク領域を含めた追加の２５アミノ酸が隣接するＴＲＡＩＬモジュールのそれぞれに存在する。

ｓｃ−ＴＲＩＡＬコンストラクトへのリンカー配列の影響を分析するために、ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロングを分析する。発現、精製、および後続のＳＥＣ分析は、１２ａａリンカーを有するｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロングおよび追加のストーク配列が発現され、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞培養上清中に分泌されることを明らかにする。しかし、精製タンパク質のＳＥＣの分析は、ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロングが、オリゴマー化または凝集型のタンパク質を大量に含む複数のピークを示すことを示す。ｓｃ−ＴＲＡＩＬ−（９５−２８１）−ロングの凝集は、Ｎ末端ストークの追加残基と組み合わされた延長リンカー配列の直接的影響である。結果は、このコンストラクトで用いられたより長いリンカーがコンストラクトの凝集特性の増大をもたらすことを示す。

７．１つまたは複数の追加ドメインを含む一本鎖融合ポリペプチドの構築
７．１．可溶性ＴＮＦ−ＳＦおよび当技術分野で公知の抗体断片のアセンブリ
当技術分野では、三量体の三量体化および／または二量体化を得るために、可溶性ＴＮＦ−ＳＦサイトカインドメインを抗体断片に融合できることが公知である。一本鎖抗体と、ＴＮＦ−ＲＢＤおよびストーク領域を含む可溶性ドメインとからなる一本鎖ｓｃＦｖ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質が構築されている。対応する三量体は、３つの一本鎖抗体および３つの可溶性ドメインからなる（図７）。

加えて、各融合タンパク質がＮ末端分子内Ｆｃ−ドメインおよびＣ末端可溶性ドメインを含むＦｃ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質が構築されている（図８）。可溶性ドメインの二量体化は、ジスルフィド架橋を介した２つのＦｃ−ドメインのアセンブリで実現される。続いて、１つのＦｃ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質からの２つの可溶性ドメインと、別のＦｃ−ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質からの１つの可溶性ドメインとの組合せによって三量体を得る。図４から推論できるように、三量体の二量体化も、Ｎ末端Ｆｃ−ＴＮＦ−ＳＦ融合によって媒介される。結論として、３つのＦｃ−抗体断片が三量体の二量体単位で存在する。しかし、そのような融合タンパク質は、大分子量凝集体を形成する可能性が高く、これが大きな不利益となっている。

７．２ １つまたは複数の追加ドメインを含む本発明の融合タンパク質
１つまたは複数の追加ドメインを含む本発明の融合タンパク質は、いくつかの方法で構築できる。以下では、追加ドメインを有する融合タンパク質の構築を、細胞表面抗原ＥｒｂＢ２に対する指向性を有する抗体パーツズマブで例示する。

重鎖のアミノ酸配列を以下の配列番号３３に示す。

軽鎖のアミノ酸配列を以下の配列番号３４に示す。

７．２．１
一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、ＮまたはＣ末端Ｆａｂ抗体断片をさらに含む（図９Ａ）。

ｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合ポリペプチドのＮ末端への抗体Ｆａｂ断片の融合は、以下の２つのストラテジーで実現されうる。

（ｉ）重鎖配列は、さらなるアミノ酸によってＩｇＧ１ヒンジ領域から伸長されて、一本鎖ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質に融合する。

ＩｇＧ１ヒンジ領域を、以下に示す配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

好ましい実施形態では、Ｆａｂドメインは、重鎖のＣ末端システイン（ヒンジ領域のＣ１）でＣＨ１ドメインが終了するように選ばれる。このシステインは、軽鎖とのジスルフィド結合を形成するのに必要である。

後続のリンカーは、ＩｇＧヒンジ領域の部分（例えば、ＤＫＴＨＴまたはＤＫＴ）を含むが、ヒンジ領域のさらなるシステインは含まない。代わりに、グリシン／セリンリンカーが使用される。さらなるシステインが存在しないので、２本のポリペプチド鎖を含む単量体融合タンパク質が得られる。リンカーは、３〜１５アミノ酸の長さを有することが好ましい。リンカーは、下記に示すリンカー１〜７から選択されることがより好ましい。

ｓｃＴＮＦ−ＳＦモジュールのＮ末端側に位置する重鎖モジュールを有する好ましいアミノ酸配列は、配列番号４５、配列番号４７、および配列番号４９に示されている。産生目的には、これらのポリペプチド鎖を、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチド（配列番号４０）と共に共発現させ、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを最終的に得る。

（ｉｉ）軽鎖配列は、一本鎖ＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質に融合させる。

軽鎖（例えば、配列番号３４）の定常領域は、Ｃ末端システイン残基で終わる。この残基は、重鎖のＣ１ヒンジシステインで共有結合によって架橋されうる。軽鎖配列とＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質との連結には、下記に示す通り、リンカー１〜７を用いることが好ましい。リンカー５〜７が好ましい（上記参照）。

サイトカインモジュールに隣接したリンカー内の最後のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒのいずれかであることが好ましい。以下に、好ましいリンカー配列を示す。

さらに、リンカーは、Ｎグリコシル化モチーフ（ＮＸＳ／Ｔ、配列中、Ｘは任意のアミノ酸でありうる）を含みうる。

ｓｃＴＮＦ−ＳＦモジュールのＮ末端側に位置する軽鎖モジュールを有するアミノ酸配列の一実施形態を配列番号５１に示す。

Ｆａｂ−ｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質の場合、２本のポリペプチド鎖の共発現が、ｓｃＴＮＦ−ＳＦモジュールに追加されるＦａｂモジュールの正しいアセンブリを得るのに必要である。（図９Ａ参照）。パーツズマブ重鎖および軽鎖モジュール（配列番号３３および配列番号３４）は、シグナルペプチドを付与され、逆翻訳され、この結果得られた合成遺伝子（配列番号４１および配列番号４２）は、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ特異的またはｓｃＴＲＡＩＬＲ２特異的遺伝子モジュール（配列番号３１および配列番号３２）の上流に遺伝学的に融合された。この結果得られた遺伝子カセットの例を配列番号４６、４８、および５０に示す。適切な発現ベクター中にサブクローニングした後、この結果得られたプラスミドから選択したものをＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的なタンパク質発現に用いた。重鎖ＴＲＡＩＬまたは軽鎖ＴＲＡＩＬ発現プラスミドは、単独で、または必要とされる軽鎖もしくは重鎖をコードする、Ｆａｂ断片のベクターと組み合わせて形質移入した（図２６）。驚いたことに、融合タンパク質内のモジュールの組合せは、分泌ベースの発現中におけるｓｃＴＲＡＩＬタンパク質の相対的安定性に影響を与えた。Ｆａｂドメインの軽鎖モジュールがｓｃＴＲＡＩＬドメインのＮ末端側に融合される場合（配列番号５１に例示される）、別々に発現された際に、発現産物がそれ自体安定であり、分泌される（レーン１〜４、図２６）。したがって、そのような融合ポリペプチドが重鎖モジュールと共に共発現される場合、２つの主要なタンパク質種、すなわち、（１）２本のポリペプチド鎖からなるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質、および（２）混入物として、機能的Ｆａｂドメインの無い軽鎖−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質が潜在的生産過程中に形成されると予測できる。それゆえ、発現のためにｓｃＴＮＦ−ＳＦ−モジュールのＮ末端側に重鎖モジュールを融合させて、この技術的不利益を避けるのが好ましい。

ｓｃＴＲＡＩＬ−モジュールのＮ末端側に融合させた重鎖モジュールを有する本発明の組換え体Ｆａｂを含むｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質（Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＮＳＮまたはＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮ）の機能解析を図２８に示す。図１９および２０に例示されるように、最終精製ステップとして、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた。

ＴＮＦスーパーファミリーの人工架橋されたリガンドまたは膜結合リガンドを用いることによって、可溶性のホモ三量体リガンドと比較して優れた生理活性が容易に実現できる。したがって、一本鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）コンストラクトを、これらのｓｃＴＲＡＩＬタンパク質に融合したＨｅｒ２選択的Ｆａｂ断片（「パーツズマブ」）を介して、抗原Ｈｅｒ２を発現する細胞上に局所濃縮することによって、それらの細胞傷害性生理活性が増強されるはずである。同様に、Ｈｅｒ２特異的Ｆａｂ断片（パーツズマブ−Ｆａｂ）とのプレインキュベーションによる細胞上のＨｅｒ２結合部位のブロッキングは、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の細胞傷害性生理活性を減少させるのみであるはずである。図２８Ａに示すように、タンパク質濃度の増大に従って生存率が低減するので、ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトはＨＴ１０８０細胞の死を誘導する。これと一致して、ＨＴ１０８０細胞をＦａｂ断片（パーツズマブ−Ｆａｂ）と共にプレインキュベーションし、続いてＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクト（Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬＲ２−ＳＮＳＮまたはＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＳＮＳＮ）と共に一終夜インキュベーションすると、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬコンストラクトの細胞傷害性活性を低減させ（図２８Ｂ）、一方Ｆａｂのみでは細胞死を誘導しない。

技術的効果の増大は、ＴＮＦスーパーファミリーの人工架橋されたリガンドまたは膜結合リガンドの使用によって実現でき、可溶性のホモ三量体リガンドと比較して特に優れた生理活性をもたらす。したがって、一本鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）によって例示されるようなリガンドまたは一本鎖リガンドを細胞上または隣接細胞上に局所濃縮すると、これらの融合タンパク質の生理活性を増強するはずである。これらの一本鎖リガンドの局所濃縮（またはターゲッティング）は、例えば、細胞、例えば腫瘍細胞などに存在している任意の抗原に結合するアミノ酸配列を有する一本鎖リガンドを融合させることによって特異的に誘導することができる。抗原結合配列の例は、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片などの抗体から得ることができる。標的細胞上に発現されている抗原の例は、ＥＧＦＲファミリーの受容体などの受容体、または結合抗体を生成できる任意の他の抗原でありうる。この関連で特別に興味深いのは、腫瘍または癌細胞に特異的な細胞表面抗原である。

７．２．２
別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、追加のＮまたはＣ末端ｓｃＦｖ抗体断片をさらに含む（図９Ｂ）。

この実施形態では、上述のリンカー５〜７が使用できる。さらに、リンカーは、Ｎグリコシル化モチーフを含みうる。

一本鎖サイトカイン融合タンパク質に融合させるための好ましい一本鎖Ｆｖ−パーツズマブ断片は、配列番号３３のアミノ酸Ｇｌｕ１〜Ｓｅｒ１１９および配列番号３４のＡｓｐ−Ｌｙｓ１０７またはＴｈｒ１０９を含みうる。ＶＨ断片およびＶＬ断片はリンカーによって連結できる。

パーツズマブのｓｃＦｖ−ドメインの一実施形態を、以下の配列番号３６に示す。

アミノ酸１〜２０（下線部）は、Ｎ末端分泌シグナルペプチドを構成する。

７．２．３
さらに別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、追加のＮまたはＣ末端Ｆｃ抗体断片を含む（図１０および１１）。

Ｆｃ抗体断片ドメインは、ヒト免疫グロブリンＧ重鎖由来、とりわけヒト免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖由来であることが好ましい。特に好ましい実施形態では、Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、配列番号３７に示される。

アミノ酸Ｌｙｓ１〜Ｇｌｕ１６はヒンジ領域を規定する。

Ｃ末端融合（図１１）には、Ｆｃ−ドメインは完全な定常ドメイン（配列番号３７のアミノ酸１７〜２３０）および一部分または完全なヒンジ領域、例えば、完全なヒンジ領域またアミノ酸Ａｓｐ４から始めるヒンジ領域を含むことが好ましい。

Ｃ末端Ｆｃ抗体断片（例えば、図１１）を連結するための好ましいリンカーを以下に示す。

すべてのリンカーがＧｌｙＧｌｙから始まる。但し、ＴＲＡＩＬのＣ末端アミノ酸がＧｌｙであることを考慮に入れる。リンカーの位置３では、代わりに、ＰｒｏまたはＳｅｒが存在する。リンカー８は、重鎖のＣｙｓ１システインを含む。

リンカー８〜１０は、他のポリペプチド、例えば、さらなるｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質のＣ末端融合にも適していることに留意するべきである。

詳細には、ｓｃＴＲＡＩＬｗｔモジュール（配列番号２８）、ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）モジュール（配列番号２９）、およびｓｃＣＤ９５Ｌモジュール（配列番号２７）を、配列番号３７のＡｓｐ４から始まるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＮ末端に、表２に示す４つのリンカーエレメントを用いて融合させた。

精製および特性分析用に、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ（アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ）をＦｃ−ドメインのＣ末端側に配置した。このアフィニティータグは、ＣＨ３配列のＣ末端リジン残基を置換する柔軟なリンカーエレメント（アミノ酸配列ＳＳＳＳＳＳＡ）によってＣＨ３ドメインに連結された。記載したタンパク質モジュールと同様に、ｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質のアミノ酸配列は逆翻訳され、それらのコドン使用頻度を哺乳動物細胞ベースの発現用に最適化した。遺伝子合成は、ＥＮＴＥＬＥＣＨＯＮ ＧｍｂＨ（独国Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって行われた。より大きな融合タンパク質のための発現カセットは、適したサイズおよび適した制限酵素パターンのＤＮＡモジュールで始まる通常のクローニング手順によって組み立てられた。例として、結果として得られる一本鎖ＴＲＡＩＬｗｔ ＦＣ０１融合タンパク質（ｓｃＴＲＡＩＬｗｔ−ＦＣ０１）用の遺伝子カセットを配列番号４４に示し、コードされているタンパク質配列を配列番号４３に示す。短縮されたリンカー変異体（表１）をコードする遺伝子カセットを、配列番号４４から始めて、ＰＣＲベースのサブクローニングストラテジーによって生成した。最終発現カセットを中間クローニングベクターから切り離し、ｐＣＤＮＡ４−ＨｉｓＭａｘのバックボーンに、このプラスミドのユニークなＨｉｎｄ−ＩＩＩ部位、Ｎｏｔ−Ｉ部位またはＸｂａ−Ｉ部位を用いてサブクローニングした。ＦａｂおよびＦｃ融合タンパク質のアセンブリには、ベクターバックボーンにユニークなＳｇＳ−Ｉ部位を導入し、Ｎｏｔ−Ｉ部位を置き換えた。すべての発現カセットをＤＮＡシーケンシングによって慣行的に確かめた。

タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一時的に発現させ、細胞培養上清を、それらのプロアポトーシス活性についてモニターした。図２７に示すように、本発明のｓｃＴＲＡＩＬ−Ｆｃ融合タンパク質は、カスパーゼ活性の顕著な増大を誘導することができた。これは、２つのｓｃＴＲＡＩＬｗｔモジュールのＦｃベースの二量体化の効力を確認する。同様の結果がｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）−Ｆｃ融合タンパク質についても得られた（データは示されていない）。

Ｆｃ−抗体断片がｓｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合（図１０参照）、Ｆｃモジュールのアミノ酸配列は、以下の配列番号３８に示す通りであることが好ましい。

アミノ酸１〜２０（下線部）は、Ｎ末端分泌シグナルペプチドを構成する。

ＦｃモジュールをＳｃＴＮＦ−ＳＦ融合タンパク質に連結するには、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを用いることが好ましい。すべてのリンカーは、セリンで始まるのが好ましく、グリシンまたはセリンで終わるのが好ましい。好ましいリンカー配列１１〜１２を以下に示す。

７．３ 本発明の一本鎖融合タンパク質の二量化
７．３．１ １つの追加ドメインを含む一本鎖融合ポリペプチド
本発明の三量体融合タンパク質は、さらに二量体化させることができる。

一実施形態では、本明細書に定義されるリンカー構造を介して第１の融合タンパク質のＣ末端を直接的に第２の融合タンパク質のＮ末端に連結した場合に二量体化が得られる（図１２）。

別の実施形態では、追加ドメインとしてＦａｂ抗体断片を含む本発明の融合タンパク質を、本発明のさらに別の融合タンパク質と、本明細書に定義されるリンカーを介して直接的に、または本発明のさらに別の融合タンパク質に融合したｓｃＦｖ抗体断片を介して間接的に連結できる（図１３）。それによって、本発明の三量体融合タンパク質の二量体化が実現される。

別の実施形態では、追加ドメインとしてＦａｂ抗体断片を含む本発明の２つの融合タンパク質のアセンブリを介して三量体の二量体化を得ることができる（図１４）。この場合、分子間ジスルフィド架橋が形成される。

ｓｃＴＮＦ−ＳＦドメインのＮ末端側の二量体化Ｆａｂ断片（例えば、図１４）の構築には、ＩｇＧヒンジ領域（配列番号３５）の天然システイン残基を用いることが好ましい。

Ｆａｂ配列のＣ末端システインは、軽鎖とジスルフィド結合を形成する、ヒンジ領域のＣ１残基に対応することが好ましい。第２のシステインＣ２は、２つのＦａｂモジュールの共有結合に使用できる。第３のシステイン残基Ｃ３は、オープンとなっていても、隣接鎖のＣ３と連結していてもよい。Ｆａｂ重鎖配列と、ｓｃＴＮＦ−ＳＦドメインのＮ末端との間の好ましいリンカーは、以下に示すリンカー１３〜２２である。

さらに、リンカーは、上述のように、Ｎグリコシル化モチーフの取込みによって修飾されていてもよい。

さらに別の実施形態では、追加のＮおよび／またはＣ末端ドメインとしてＦｃ抗体断片を含む本発明の融合タンパク質の二量体化は、前記融合タンパク質のうちの２つの間の分子間ジスルフィド架橋の形成によって得ることもできる。その場合、三量体融合タンパク質の二量体あたり１つのＦｃ抗体断片が存在するのみである。それによって、当技術分野のＦｃ抗体断片融合タンパク質とは対照的に、高分子量の凝集体が形成される可能性はそれほど高くない。

７．３．２ 複数の追加ドメインを含む一本鎖融合ポリペプチド
一本鎖融合ポリペプチドは、１つまたは複数の追加ドメイン、例えば、さらに別の抗体断片および／またはさらに別のターゲティングドメインおよび／またはさらに別のサイトカインドメインを含みうる。

一追加ドメインとしてＦｃ抗体断片を含む本発明の融合タンパク質は、さらに別のＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体断片に、Ｎ末端融合Ｆｃ抗体断片のＮ末端を介して（図１５）連結することも、Ｆｃ抗体断片がそのＣ末端で本発明の融合タンパク質に連結している場合には、さらに別のリンカー構造を介して直接的にそのＮ末端で（図１６）連結することもできる。

さらに別の抗体断片に加えて、またはさらに別の抗体断片の代わりに、さらに別のサイトカイン（好ましくはインターロイキン）が融合タンパク質に連結していてもよい。それによって、アゴニストｓｃＣＤ９５ＬとアンタゴニストｓｃＣＤ９５Ｌ分子の組合せ、または代わりに、ｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ１特異的）とｓｃＴＲＡＩＬ（Ｒ２特異的）の組合せを得ることが可能である。

前記融合タンパク質はアポトーシスの誘導に特に有用である。

Claims (15)

1. （ｉ）第１の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、
   （ｉｉ）第１のペプチドリンカー、
   （ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、
   （ｉｖ）第２のペプチドリンカー、および
   （ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン
   を含み、実質的に非凝集性である、一本鎖融合ポリペプチド。
2. 前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインが可溶性ＣＤ９５ＬまたはＴＲＡＩＬドメインから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記第２および／または第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインが、アミノ酸配列突然変異を場合によって含むＮ末端短縮ドメインである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインの少なくとも１つ、とりわけ前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つが、ヒトＣＤ９５Ｌのアミノ酸Ａｒｇ１４４とＶａｌ１４６との間で始まるＮ末端配列を有する可溶性ＣＤ９５Ｌドメインであり、Ａｒｇ１４４および／またはＬｙｓ１４５が中性アミノ酸によって、例えば、ＳｅｒまたはＧｌｙによって置き換えられていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインの少なくとも１つ、とりわけ前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つが、
   （ａ）Ａｒｇ１４４−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４５−Ｖａｌ（１４６）、
   （ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４４−Ｌｙｓ１４５−Ｖａｌ（１４６）、および
   （ｃ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４４−（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１４５−Ｖａｌ（１４６）
   から選択されるＮ末端配列を有する可溶性ＣＤ９５Ｌドメインである、請求項４に記載のポリペプチド。
6. 前記可溶性ＣＤ９５ＬドメインがヒトＣＤ９５ＬのＬｅｕ２８１で終わる、ならびに／または位置Ｌｙｓ１７７の突然変異、例えば、Ｌｙｓ１７７→Ｇｌｕ、ＡｓｐもしくはＳｅｒ、および／もしくは位置Ｔｙｒ２１８の変異、例えば、Ｔｙｒ２１８→Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｐを場合によって含む、請求項２から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインの少なくとも１つ、とりわけ前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つが、ヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｎ１２０とＶａｌ１２２との間で始まるＮ末端配列を有する可溶性ＴＲＡＩＬドメインであり、Ａｒｇ１２１が中性アミノ酸、例えば、ＳｅｒまたはＧｌｙで置き換えられていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
8. 前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインの少なくとも１つ、とりわけ前記可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つが
   （ａ）Ａｒｇ１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３、および
   （ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１−Ｖａｌ１２２−Ａｌａ１２３
   から選択されるＮ末端配列を有する可溶性ＴＲＡＩＬドメインである、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 前記可溶性ＴＲＡＩＬドメインがヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸Ｇｌｙ２８１で終わる、および／または位置Ｒ１３０、Ｇ１６０、Ｈ１６８、Ｒ１７０、Ｈ１７７、Ｙ１８９、Ｒ１９１、Ｑ１９３、Ｅ１９５、Ｎ１９９、Ｋ２０１、Ｙ２１３、Ｔ２１４、Ｓ２１５、Ｈ２６４、Ｉ２６６、Ｄ２６７もしくはＤ２６９または前記位置の２カ所以上の突然変異を場合によって含む、請求項７または８に記載のポリペプチド。
10. 前記第１および前記第２のペプチドリンカーが、独立して３〜８アミノ酸の長さ、とりわけ３、４、５、６、７または８アミノ酸の長さを有し、好ましくはグリシン／セリンリンカーであり、グリコシル化されていてもよいアスパラギン（ａｓｐａｒｉｇｉｎｅ）残基を場合によって含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
11. プロテアーゼ切断部位を含んでいてもよいＮ末端シグナルペプチドドメインを追加して含む、ならびに／または認識／精製ドメインを含んでいてもよい、および／もしくは認識／精製ドメインに連結していてもよいＣ末端エレメントを追加して含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
12. Ｎ末端および／またはＣ末端にさらに別のドメイン、例えば、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインなどの一本鎖抗体または抗体断片を追加して含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 好ましくは発現制御配列と作用性に連結している、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
14. 請求項１３に記載の核酸分子で形質転換または形質移入された細胞または非ヒト生物であって、前記細胞が、例えば、原核細胞または真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である、細胞または非ヒト生物。
15. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１３に記載の核酸分子を活性薬として含む医薬組成物または診断用組成物であって、とりわけ治療における使用のため、さらにとりわけ、ＴＮＦサイトカインの機能障害によって引き起こされる、これに関連する、および／またはこれに伴う障害、とりわけ、腫瘍、例えば固形もしくはリンパ腫瘍などの増殖性障害；感染症；炎症性疾患；代謝病；自己免疫障害、例えば、リウマチ様および／もしくは関節炎疾患；変性疾患、例えば、多発性硬化症などの神経変性疾患；アポトーシス関連疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療における使用のための組成物。