JP2018533947A - 一本鎖cd27受容体アゴニストタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
1つの実施形態では、第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)は、独立に、グリコシル化されていてもよいアスパラギン残基を任意選択で含む、3〜8個のアミノ酸の長さ、特に3、4、5、6、7又は8個のアミノ酸の長さを有し、好ましくは、グリシン/セリンリンカーである。1つの実施形態では、第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)は配列番号2のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、ポリペプチドは、例えば配列番号17のN末端シグナルペプチドドメインを更に含む、プロテアーゼ切断部位を含んでもよい、、並びに/又は、認識/精製ドメイン、例えば配列番号18のセリンリンカーに結合されたStrep-tagを含み及び/若しくはこれに連結されていてもよいC末端要素を更に含む。
別の実施形態では、配列番号31、32、43又は47の成熟ポリペプチドの149位のアスパラギン残基のみがグリコシル化されている。それは、これらのタンパク質中にはアスパラギン300が存在しないからである。
別の実施形態では、配列番号33の成熟ポリペプチドの145位のアスパラギン残基のみがグリコシル化されている。
別の実施形態では、配列番号44又は46の成熟ポリペプチドの144位及び290位のアスパラギン残基の1つ又は複数がNグリコシル化されている。
別の実施形態では、配列番号45の成熟ポリペプチドの144位のアスパラギン残基のみがNグリコシル化されている。
変異体は当業者に公知の任意の手法で生成させることができる。本明細書に述べるように、置換はCD27L、例えばヒトCD27L(例えば配列番号1)、又はその受容体結合ドメインの少なくとも1つのアミノ酸に影響することがある。これに関し、好ましい置換は配列番号1のヒトCD27Lの以下のアミノ酸、即ちR83、R122、R138、R144、H123、H124、H148、R179、D182、E183のうちの少なくとも1つに影響する。好ましい実施形態では、R138及び/又はR179はS又はDに変異している。
したがって、1つの実施形態は本明細書に記載したCD27受容体アゴニストタンパク質であって、可溶性ドメインのうちの少なくとも1つが野生型CD27Lよりも少なくCD27に結合し及び/又はこれを活性化するCD27Lの変異体又はその受容体結合ドメインを含む、CD27受容体アゴニストタンパク質である。
1つの実施形態は本明細書に記載したCD27受容体アゴニストタンパク質であって、少なくとも1つの人工のNグリコシル化コンセンサス部位がヒトCD27L(配列番号1)のT172〜F185によって定義される配列領域に導入され、それにより受容体の凝集の低減及び/又はシグナリングの低減がもたらされる、CD27受容体アゴニストタンパク質である。この領域における人工のNグリコシル化コンセンサス部位をもたらすCD27Lの変異体の例はD182Sである。
本発明のさらなる実施形態では、可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)、及び(v)の1つ又は複数はCD27Lの変異体又はその受容体結合ドメインを含んでよく、それにより自己凝集性が低減し、及び/又はインビボ安定性が延長する。
これに関して好ましい置換はS117N、T119N、S137N及びR144Nである。それぞれのCD27Lドメインの変異は同じであっても異なっていてもよい。
本発明の一本鎖融合分子は3つの可溶性CD27Lドメイン、即ち成分(i)、(iii)及び(v)を含む。第2及び/又は第3の可溶性CD27Lドメインがアミノ酸配列の変異を含んでもよいN末端が短縮されたドメインである場合には、一本鎖CD27L融合ポリペプチドの凝集に対する安定性が増大する。したがって、好ましくは第2及び第3の可溶性CD27Lドメインの両方は、N末端領域に、好ましくは可溶性CD27LドメインのN末端の最初の5つのアミノ酸の中にアミノ酸配列変異を任意選択で含んでもよい、N末端が短縮されたドメインである。これらの変異は、中性アミノ酸、特にセリン又はグリシンによる塩基性アミノ酸の置き換えを含んでよい。
(a)Glu51〜Asp56
(b)(Gly/Ser)51〜Asp56
から選択される。
グリコシル化部位の総数及び三次元における糖鎖の個別の場所はCD27受容体アゴニストタンパク質のインビボ安定性に影響する。更に、糖鎖の認識は末端サッカライドの局所的密度、糖鎖ツリーの分枝、及び糖鎖の互いの相対的な場所に依存する。
更に、部分的に分解した糖鎖はレクチンによって促進される機構によってCD27受容体アゴニストタンパク質のインビボ半減期を低下させる。分子上のグリコシル化部位の総数を減少させることによって、得られる化合物ではこれらの機構が起こりにくくなり、半減期が増大する。
Fc受容体に基づくインビボ架橋及びCD27受容体スーパークラスタリングに基づく毒性の可能性を避けるために、抗体CH2ドメイン糖鎖の除去が必要である。また、Fcによって促進されるADCC等の望ましくない機構が有毒事象をもたらすこともある。したがって、1つの実施形態では、本発明のCD27受容体アゴニストタンパク質におけるグリコシル化部位の総数は、CH2グリコシル化部位、特にNグリコシル化部位の除去によって減少させ、これにより、非グリコシル化CH2ドメインを生ずる配列番号15のN297S等価変異を含むCD27受容体アゴニストタンパク質(プロテインA)(EU番号付けシステムによる)が得られる。本発明の別の実施形態では、可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)及び(v)の1つ又は複数は、N63及び/又はN170がアスパラギン酸、セリン又はグリシンに変換されてもよく、それによりCD27受容体アゴニスト融合タンパク質のグリコシル化部位の数が減少する。好ましい実施形態では、N63[D,S,G]変異及びN170[D,S,G]変異は、本発明のアゴニストCD27受容体アゴニスト融合タンパク質の可溶性CD27Lドメイン(iii)及び(v)に限られる。
内部表面領域に存在するCH2(重鎖定常ドメイン2)-グリコシル化は通常、「オープンFcコンフォメーション遷移」の間、サブドメインをプロテアーゼから遮蔽し、ヒンジ-鎖間ジスルフィド結合は減少し、共有結合による鎖間リンケージは破壊される(図6)。これにより、CH2の解離と内部表面領域のプロテアーゼへの露出が可能になる。配列番号15のN297S等価変異を有するFcドメインを含むCD27受容体アゴニストタンパク質(プロテインA)(EU番号付けシステムによる)は非グリコシル化CH2ドメインを生成し、したがってプロテアーゼ消化の対象となりやすく、野生型のCH2グリコシル化を有する等価構造よりも安定性が低い。これは、宿主細胞のプロテアーゼが存在し、長期にわたって構造に接近するUSP/DSP/保存の間の化合物の安定性に影響する。したがって、ある実施形態では、CD27受容体アゴニストはCH2グリコシル化部位を有しないが、各ポリペプチド鎖のリンカー配列(例えばGSGSGNGS、配列番号2)中のグリコシル化部位を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗体Fc断片ドメインはヒンジ-リンカー要素を介して融合している。ヒンジ-リンカー要素は10〜30アミノ酸の長さ、特に15〜25アミノ酸の長さ、例えば22アミノ酸の長さを有する。「ヒンジ-リンカー」という用語は、ヒンジ-リンカー要素がドメインに結合して生物学的に活性なコンフォメーションを保持することができるために十分な長さを有する任意のリンカーを含む。ヒンジ-リンカー要素は好ましくは本明細書において「Igヒンジ領域」と称する免疫グロブリンのヒンジ領域配列を含む。「Igヒンジ領域」という用語は、1つ又は複数のシステイン残基、例えばジスルフィド結合が免疫グロブリンの2つの重鎖を連結する2つのシステイン残基を含む、天然に産生するIgヒンジ領域配列の一部と配列同一性又は類似性を共有するアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドを意味する。
1つの実施形態では、本発明のCD27受容体アゴニストタンパク質は、上側ヒンジのリジン(EU番号付けシステムによるK223)のグリシンへの変異を更に含み、これによりこの部位におけるタンパク質分解プロセシングが低減され、したがって融合タンパク質の全体としての安定性が向上する。ヒンジ領域内における上述の第3のシステイン(EU番号付けシステムによるC225)の導入と上述のリジンのグリシンへの変異(EU番号付けシステムによるK223G)を併せることによって、本発明のCD27受容体アゴニストタンパク質の全体としての安定化がもたらされる。
上述のシステイン(C225)及びリジンのグリシンへの変異(K223G)を含む特に好ましいヒンジ-リンカー要素は、配列番号16(Table 4(表4))で示されるアミノ酸配列を含み、又はこれからなる。
六価のCD27受容体アゴニストタンパク質のホモ二量体を安定化させる鎖間-ジスルフィド結合性は、CD27サブ配列の遊離チオール基によっても影響される。遊離チオール基は、表面に露出したジスルフィド架橋の還元によって、例えばCD27LのC115〜C151ジスルフィドの還元によって作成することができる。これはまた、この構造のヒンジジスルフィド架橋が高タンパク質濃度における製剤の内因性遊離チオールによって自己還元することによる上述のオープンFcコンフォメーションをもたらす。その結果、遊離チオールを含む一本鎖CD27L-Fc融合タンパク質は、酸素及びプロテアーゼへの長時間の曝露が起こる製造及び保存の間、より不安定であることが予想される。
Table 5(表5))のCD27受容体アゴニストタンパク質の非限定的な例の全てによって二量体の形成が可能になることは当業者には明らかである。したがって本発明のさらなる実施形態は、2つの一本鎖融合タンパク質の共有結合で連結された二量体である。例えば453、459及び462位のシステインで連結された配列番号31、43、47の二量体、又は(450、456及び459位で連結された)配列番号32のポリペプチドの二量体、又は(436、442、445位で連結された)配列番号33のポリペプチドの二量体、又は(454、460及び463位で連結された)配列番号34のポリペプチドの二量体、又は(438、444及び447位で連結された)配列番号49のポリペプチドの二量体、又は(442、448及び451位で連結された)配列番号44又は46のポリペプチドの二量体である。
更に、融合ポリペプチドは、配列番号16のヒンジリンカーを介して可溶性CD27Lドメイン(v)にC末端で融合した配列番号13の抗体Fc断片ドメインを含む。発明者らは驚くべきことに、この特定の融合ポリペプチドが二価のアゴニスト抗CD27-mABと比較して改善された生物学的活性を提供し、223位にリシン及びCH2ドメインにN297S変異(EU番号付けによる)を含む同様の融合タンパク質と比較して長期の安定性を有していることを見出した。本発明のCD27受容体アゴニストタンパク質の例示的な実施形態のアミノ酸配列は、配列番号27で示される。
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本明細書で提供するCD27受容体アゴニストタンパク質の治療又は予防有効量の例示的で非限定的な範囲は、約0.1〜100mg/kg(例えば約0.1〜0.5、0.1〜1、0.1〜10、0.1〜20、0.1〜50、0.1〜75、1〜10、1〜15、1〜7.5、1.25〜15、1.25〜7.5、2.5〜7.5、2.5〜15、5〜15、5〜7.5、1〜20、1〜50、7〜75、1〜100、5〜10、5〜15、5〜20、5〜25、5〜50、5〜75、10〜20、10〜50、10〜75若しくは10〜100mg/kg、又はその間の任意の濃度)である。いくつかの実施形態では、CD27受容体アゴニストタンパク質は医薬組成物中に治療有効濃度で、例えば約0.1〜100mg/mlの濃度(例えば約0.1〜0.5、0.1〜1、0.1〜10、0.1〜20、0.1〜50、0.1〜75、1〜10、1〜20、1〜50、1〜75、1〜100、5〜10、5〜15、5〜20、5〜25、5〜50、5〜75、10〜20、10〜50、10〜75若しくは10〜100mg/ml、又はその間の任意の濃度)で存在する。用量値は緩和すべき病状の型及び/又は重篤度によって変動することに注目されたい。いかなる特定の対象に対しても、特定の用量計画は個別の必要性及び/又は組成物を投与する者若しくは投与を監督する者の専門的判断によって時とともに調節できること、並びに本明細書で説明する用量範囲は例示的のみであって特許を請求する組成物の範囲又は実施を限定することを意図していないことを更に理解されたい。
CD27受容体アゴニストタンパク質の製造
1.1ポリペプチドの構造
A)アミノ酸Met1〜Gly20
Igカッパシグナルペプチド、アミノ酸Gly20の後の推定されるシグナルペプチダーゼ切断部位
B)アミノ酸Glu21〜Pro163
ヒトCD27Lリガンド(CD27L、配列番号1のアミノ酸51〜193)の第1の可溶性サイトカインドメイン
C)アミノ酸Gly164〜Ser171
配列番号2の第1のペプチドリンカー要素
D)アミノ酸Glu172〜Pro314
ヒトCD27Lリガンド(CD27L、配列番号1のアミノ酸51〜193)の第2の可溶性サイトカインドメイン
E)アミノ酸Gly315〜Ser322
配列番号2の第2のペプチドリンカー要素
F)アミノ酸Glu323〜Pro465
ヒトCD27Lリガンド(CD27L、配列番号1のアミノ酸51〜193)の第3の可溶性サイトカインドメイン
G)アミノ酸Gly466〜Cys486
配列番号16のヒンジリンカー要素
H)アミノ酸Pro487〜Lys704
配列番号13の抗体Fc断片ドメイン
合成遺伝子は好適な宿主細胞、例えば昆虫細胞又は哺乳類細胞における発現のためのコドンの使用に鑑みて最適化される。好ましい核酸配列を配列番号37に示す。
発現及び精製
2.1 融合ポリペプチドのクローニング、発現及び精製
上述の融合タンパク質は、下記の方法によって2つの異なった真核宿主細胞内で組み換えにより発現される。
上述のCD27受容体アゴニスト融合タンパク質の初期の解析のため、10%のFBS、100units/mlのペニシリン及び100[mu]g/mlのストレプトマイシンを補ったDMEM+GlutaMAX(GibCo)中で増殖させたHek293細胞に、融合ポリペプチドのための発現カセット及び好適な選択マーカー、例えばブラスチシジン、プロマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセットを含むプラスミドを一時的にトランスフェクトする。これらの例では、最終生成物を得るために複数のポリペプチド鎖が必要な場合には、トランスフェクションの間、発現カセットは1つのプラスミドに結合するか、異なったプラスミドの上に位置することになる。トランスフェクションの3日後に組み換え融合ポリペプチドを含む細胞培養上清が回収され、300Xでの遠心で清澄化され、続いて0.22μmの無菌フィルターで濾過される。
インビボで用いるCD27受容体アゴニスト融合タンパク質の大スケール発現のため、上述のタンパク質をコードする合成DNAカセットを、適切な選択マーカー(例えばブラスチシジン、プロマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセット)及び宿主細胞ゲノム中でトランスクリプション活性の挿入部位の数を増大させるために好適な遺伝要素を含む真核細胞発現ベクターに挿入する。配列を検証した発現ベクターを、懸濁に適合したチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-S、Invitrogen)にエレクトロポレーションによって導入する。トランスフェクトした細胞に、トランスフェクション後3日間、適切な選択圧を適用することになる。選択圧の下に培養を続けることにより、ベクター由来の耐性遺伝子を有する生存細胞を回収する。選択した細胞プールを、軌道振盪インキュベーター(100rpm、振盪長50mm)中、37℃及び7%CO2雰囲気下、化学的に定義された培地(PowerCHO2-CD、Lonza)中で安定的に増殖させ、個別の上清をELISAアッセイによって分析し、上述のタンパク質及びタンパク質の産生の前に浸透フラスコ(軌道振盪器、100rpm、振盪長50mm)中で増殖した最大の特異的産生能を有する細胞プールを検出する。
六価のscCD27L-RBD-Fc(プロテインA、配列番号15)融合タンパク質の分析用SECのクロマトグラムを図5(パートB)に示す。三価の対照タンパク質(プロテインX、配列番号38)の分析用SECのクロマトグラムを図5(パートA)に示す。
プロテインAから発現した二量体タンパク質のSDS-PAGEの結果
プロテインAのホモ二量体が共有結合で連結されているかを決定するため、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)実験を還元条件下及び非還元条件下で行なった。還元条件下における主バンドのサイズは非還元条件下で観察されたサイズのわずかに半分である。このことは、ホモ二量体がジスルフィド架橋によって共有結合で連結されていることを示している(図7も参照されたい)。
三価の対照タンパク質
六価のCD27受容体アゴニスト融合タンパク質とバクテリオファージRB69-FOLDONで安定化された三価のCD27との間の相対的結合を比較するため、CHO-S細胞中でプロテインX(配列番号38)を発現し、以前のセクションに記載したように精製した。以下の実施例ではSECで精製したタンパク質を対照として用いた。プロテインX(配列番号38)の配列をTable 7(表8)に示す。プロテインXのアミノ酸1〜20はシグナルペプチドを表し、成熟タンパク質はアミノ酸Glu51から開始する。このタンパク質は、それぞれが1つの可溶性CD27Lドメイン(配列番号1のE51〜P193)を含む3つの同一のポリペプチドからなっており、この会合体は可撓性リンカーとともにCD27LのC末端に融合したバクテリオファージRB69のフィブリチンの三量体化ドメインによって安定化されている。
TCR活性化と組み合わせたCD27受容体アゴニストはマウスT細胞を活性化する
CD27受容体アゴニストタンパク質のT細胞活性化能を評価するため、磁性ビーズを用いるネガティブ選択により、マウス脾臓からT細胞を精製する。細胞をCFSEで標識し、種々の量のCD27受容体アゴニストタンパク質の存在下又は非存在下に培養して、37℃で2〜5日間、抗マウスCD3抗体と組み合わせる。細胞の分割を測定するための手段としてのCFSE希釈に関するデータをフローサイトメーターで取得する。細胞培養上清と捕捉のための抗マウスIFNγ抗体を用いるELISAアッセイによって、IFNγ産生を測定する。
CD27受容体アゴニストタンパク質が抗マウスCD3抗体とともにT細胞培養中に存在する場合には、CD4+及びCD8+T細胞の両方によるIFNγの分泌の明らかな増強が見られることが予想される。IFNγの産生が高くなったことと同様に、フローサイトメトリーを用いてCFSE希釈を測定することによって、より多くのT細胞が細胞サイクルに動員されることが見られると予想される。これは、T細胞の活性化に関連するCD27受容体アゴニストタンパク質の共刺激効果を立証するものである。
CD27受容体アゴニストタンパク質のマウス免疫細胞へのインビボ結合及び循環リンパ球に対する効果
CD27受容体アゴニストタンパク質の免疫細胞へのインビボ結合を評価するため、種々の濃度でのCD27受容体アゴニストタンパク質の単回静脈注射あり及びなしで、マウスを処置する。動物は20日まで観察し、注射の日から毎日、血液試料を採取する。血液試料を氷の上で蛍光標識抗ヒトFc抗体とともにインキュベートし、続いて赤血球溶解緩衝液を用いて赤血球を溶血させる。次いで試料をフローサイトメーターで分析する。血液からの全リンパ球を、その側方散乱及び前方散乱プロファイルに基づいて同定し、注射を受けたマウスからの染色した集団を未処置の対照動物からの細胞と比較する。
CD27受容体アゴニストタンパク質は、標的受容体CD27を発現している循環リンパ球の表面に結合することが予想される。結合は、おそらくアゴニスト/受容体複合体の内在化を介して起こる標的媒介薬物処理によって時とともに弱くなる傾向がある。
更に、循環リンパ球集団に対するCD27受容体アゴニストタンパク質の効果を評価する。この目的のため、種々の濃度のCD27受容体アゴニストタンパク質の単回静脈注射を受けたマウスから血液試料を注射の日から毎日採取する(上記参照)。赤血球を溶血させた後、B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞又はNK細胞等の免疫細胞のサブセットに対する蛍光抗体で細胞を染色する。染色した細胞をフローサイトメトリーで分析する。
処置期間の経過にわたって循環免疫細胞の数に有意の変化が観察されないことが予想される。
CD27受容体アゴニストタンパク質は抗原特異的CD8+T細胞の増殖及び活性化、並びにマウス末梢血細胞及び脾臓細胞の五量体染色を増大させる
種々の量のCD27受容体アゴニストタンパク質と組み合わせた1〜10mgのニワトリ卵アルブミンをマウスに経静脈注射する。抗マウスCD27及び無関係なヒトIgG1抗体をそれぞれ陽性及び陰性対照として加える。0日目にCD27受容体アゴニストタンパク質を卵アルブミンとともに注射し、1日目に追加量のCD27受容体アゴニストタンパク質を単独で注射する。7〜10日目に末梢血及び脾臓細胞を回収する。脾臓細胞及び全血を染色に用いる。Fc受容体をブロックした後、蛍光標識したH-2 Kb/SIINFEKL、即ち卵アルブミンのペプチドT細胞エピトープと複合させたマウスMHCクラスIの四量体複合体、並びに追加的にマウスCD8及びマウスCD27を検出する蛍光標識抗体によって、室温で30分〜1時間、細胞を染色する。続いて試料を赤血球溶血緩衝液で処理して赤血球を除去し、洗浄して固定する。細胞をフローサイトメーターで分析して、CD8+及びCD27+T細胞コンパートメント中の、MHCクラスIに関連してSIINFEKLペプチドを認識し、したがって抗原特異的である細胞の数を計数する。免疫応答に関連する抗原特異的CD8+T細胞の増殖をアゴニストが増大させるという意味で、CD27受容体アゴニストタンパク質によって補助的な効果が誘発されることが観察されると予想される。これは、CD27受容体アゴニストタンパク質によって発揮される明らかな共刺激効果を立証するものである。
制限プロテアーゼ消化によるCD27受容体アゴニストタンパク質のインビトロ安定性の決定
実施例1に記載したように、検討すべき全てのCD27受容体アゴニストタンパク質を発現し、六価のFc融合タンパク質として精製する。セットは、CH2ドメインのN297S変異(EU番号付けシステムによる)、及び3つのジスルフィド架橋の生成が可能で、更に上部ヒンジのリジン(EU番号付けシステムによるK223)がグリシンに変異(K223G)して欠落しているヒンジ領域を含むCD27受容体アゴニストタンパク質を含んでいる。制限プロテアーゼ消化アッセイにおいて、3つのジスルフィドを可能にするヒンジの文脈でN297S変異及びK223G変異を同時に含む上述のCD27受容体アゴニストタンパク質を、2つのジスルフィド又は3つのジスルフィドのいずれかを可能にするヒンジ領域の文脈でN297S変異を含むがK223野生型は存在するCD27受容体アゴニストタンパク質と比較することになる。
更に、4アミノ酸に還元された第2のリンカー要素(iv)及び短縮されたヒンジ要素(vi)を有するCD27受容体アゴニストタンパク質を検討する(例えば配列番号32及び34)。両方の組み換え戦略(3つのジスルフィドを可能にするヒンジ領域の文脈でのN297SとK223Gの変異の組合せ)及びリンカー要素の短縮(iv及びvi)は、それぞれの分子の安定性に影響する可能性がある。
本発明の異なったCD27アゴニストタンパク質の安定性は、インビトロの制限プロテアーゼ消化によって取り扱うことができる。この分析のため、上述のCD27受容体アゴニストタンパク質を、異なった時間、異なった温度(例えば4℃、25℃、37℃)で、低濃度のプロテアーゼ(例えばトリプシン、V8プロテアーゼ)とともにインキュベートする。続いて、特定のタンパク分解断片の定量及びその外観を時間にわたって異なった方法、例えばSDS-PAGE、分析用SEC又は当技術で公知の分析用マススペクトリー法(例えばナノRP-HPLC-ESI-MSMS)によって測定することができる。検討するタンパク質はその配列の大部分を共通して有するので、個別のタンパク質から時間にわたって特定のタンパク分解断片がより速く出現し、その量が多いことを用いて、その相対的安定性を判定し、互いに順位を付けることができる。検討した上述のCD27受容体アゴニストタンパク質のプロテアーゼに基づくデコイ動力学に関して、そのタンパク分解安定性に関する以下の順序が予想される。
半減期の決定
プロテインA分子は3つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で連結された2つのポリペプチドからなっており、ヒンジリンカーにK223G変異、並びにFc領域にN297S変異(EU番号付けシステムによる)を含み、その結果、CH2ドメインは非グリコシル化されている。精製されたプロテインAのマウスにおける半減期を試験した。
安定性/凝集試験
実施例2に記載したように分析用SECによってモノマー及び凝集物の含量を決定する。この特定の目的のため、生理学的pHで生理学的食塩濃度を含む緩衝液(例えば0.9% NaCl、pH7.4、PBS pH7.4)中で分析を行なう。典型的な凝集分析はSuperdex200カラム(GE Healthcare)で行なう。このカラムは10〜800kDaの範囲のタンパク質を分離する。
モノマー含量[%]=[モノマータンパク質のピーク面積]/[全ピーク面積]×100
三価及び六価のCD27受容体リガンド構築物のQCM分析による平衡結合定数の決定
三価及び六価のプロテインX及びプロテインAの平衡結合定数(KD)は、自動化バイオセンサーシステム(Attana A100)によって決定される動的結合データ(kon及びkoff)に基づいて算出される。A100により、クオーツ結晶マイクロバランス(QCM)手法に基づいてリアルタイムで分子間相互作用を検討することができる。
この目的のため、カルボキシル活性化QCMチップの表面にヒトCD27受容体を固定化する。続いて、三価又は六価のプロテインX又はプロテインAをそれぞれ、異なった濃度(例えば0.5、1、2、5及び10μg/ml)で被分析物質として用いて、リガンド-受容体結合(kon)及び解離(koff)の動的結合データを解析する。解析はリアルタイムで行なわれ、対応するKDを算出することができる。KD=koff/kon。
QCM解析から、三価のプロテインXは対応する固定化CD27受容体に低いnM範囲のKDで結合し、KDの予想値は1〜100nMであることが示される。しかし、プロテインAの六価の構築物は対応する固定化CD27受容体に対してpM範囲の高い結合親和性を示し、KDの予想値は1〜1000pMである。動的結合データ(kon及びkoff)の共通の特徴は六価の構築物が三価の構築物と比較してより速いkonを示すことである。更に、六価のリガンドは三価のリガンドと比較すればより遅い解離(koff)が一般に観察される。
細胞増殖アッセイ
ネガティブ選択及び磁性ビーズを用いて、新鮮なバフィーコート製剤から一次ヒト細胞を単離した。細胞にCFSE色素を担持させ、ウェルあたり2×10e6細胞で24ウェルプレートに播種した。T細胞を抗ヒトCD3抗体(クローンHIT3a、1μg/ml)、抗ヒトCD28抗体(クローンCD28.2、5μg/ml)、及び種々の量のCD27Lアゴニスト(プロテインA)(10〜1000ng/ml)とともにインキュベートし、又は対照として単に培地中に放置した。37℃で6日間インキュベートした後、グアバeasyCyteフローサイトメーターにより全ての細胞をCFSE蛍光について評価した。
抗CD3抗体及び抗CD28抗体とインキュベートしたのみの細胞は培地対照と比較してCFSE蛍光(GeoMean)を失っていることが観察され(Table 9(表10))、細胞分割及びそれによるCFSE色素の希釈が示された。重要なことに、この効果は細胞をCD27Lアゴニスト(プロテインA)とともにインキュベートした場合にもより強く、濃度依存性であった。GeoMean値を用いて、増殖が促進された細胞の百分率を誘導することができ、CD27L(プロテインA)アゴニストとともにインキュベートした細胞は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体とともにインキュベートしただけの細胞又は培地のみの中に放置した細胞より強く増殖することが明らかである。
CD27アゴニスト結合アッセイ
ネガティブ選択及び磁性ビーズを用いて、新鮮なバフィーコート製剤から一次ヒト細胞を単離した。細胞をウェルあたり2×10e6細胞で24ウェルプレートに播種した。T細胞を抗ヒトCD3抗体(クローンHIT3a、1μg/ml)、抗ヒトCD28抗体(クローンCD28.2、5μg/ml)、及び種々の量のプロテインA(CD27L、10〜1000ng/ml)とともにインキュベートし、又は対照として単に培地中に放置した。37℃、3日後に細胞を抗ヒトCD27抗体及び抗ヒトCD4抗体又は抗ヒトCD8抗体で蛍光標識した。CD4+及びCD8+T細胞集団中のCD27蛍光をグアバeasyCyteフローサイトメーターで評価した。
抗CD3抗体及び抗CD28抗体とインキュベートしたT細胞を培地のみの中に放置した細胞と比較すると(Table 10(表11))、CD27の蛍光シグナルが低いことが観察され、活性化によって誘起された受容体の下方制御が示される。重要なことに、この効果は細胞をCD27アゴニスト(プロテインA)とともにインキュベートした場合により強く、用量依存性であり、CD27アゴニスト(プロテインA)によって引き起こされる補助的な効果を示している。アゴニストは天然のCD27リガンド(CD70)の受容体結合ドメインを模倣しているので、CD27の表面発現が低いことはCD27アゴニスト(プロテインA)の結合に際しての受容体の内在化による可能性がある。この結果は、インビトロにおけるCD27アゴニスト(プロテインA)のその受容体に対する結合を明らかに示唆している。
雌C57BI/6Nマウスの皮下同系結腸癌MC38-CEAにおけるプロテインAの抗腫瘍効果
材料及び方法
皮下に移植した同系結腸癌モデルMC38-CEAにおけるプロテインAの抗腫瘍効果を評価するため、研究はそれぞれ5〜6週齢の12匹の雌C57BI/6Nマウスを含む3実験群からなっていた。全ての動物についてPBS中の1×106個のMCE38-CEA腫瘍細胞を動物の左側腹部に皮下移植した。腫瘍移植の8日後に原発腫瘍が24.5〜106.25mm3の体積に達したとき、36匹の腫瘍担持動物をランダムに3群(n=12)に分けた。同じ日に、10ml/kgのビヒクル対照(PBS)、並びに1mg/kg及び10mg/kgの試験化合物プロテインAによる処置を開始した。全群の動物を毎週2回、8、12、15及び19日目に静脈(i.v.)処置した。19日目に最後の投与を行なった後、24時間で(20日目)研究を終了し、動物を犠牲死させ、剖検を行なった。剖検の際、動物の体重を測定し、イソフルランで麻酔した。血清を調製するため、眼球後静脈穿刺によって血液試料を採取した。その後、頸椎脱臼によって動物を死亡させ、原発腫瘍を採取して湿潤重量及び腫瘍体積を決定した。更に、分析のため脾臓組織も採取した。
研究の経過中、全ての研究群の動物の平均体重は一定であるか、僅かに増加した。大きな体重減少は観察されなかった。
プロテインAは原発腫瘍増殖の用量依存性阻害を示した。用量1mg/kgにおけるプロテインAの腫瘍増殖阻害(25.8%)は見られたが、統計的に有意ではなかった。用量10mg/kgのAPG1293は、20日目にインビボで測定すると統計的に有意な腫瘍増殖阻害(48.2%)を示した。剖検の間に、原発腫瘍を切除して腫瘍体積及び湿潤腫瘍重量を決定した。高用量群(10mg/kg)の湿潤腫瘍重量はビヒクルと比較して有意に(P=0.0295)低減していた(図9)。また高用量群の腫瘍体積もビヒクル群と比較して有意に低減していた(図10)。
プロテインAは雌C57BI/6Nマウスの皮下同系MC38-CEA結腸癌モデルにおいてインビボ用量依存性抗腫瘍効果応答を示した。
雌BALB/cマウスの皮下同系結腸癌CT26におけるプロテインAの抗腫瘍効果
材料及び方法
雌BALB/cマウスの皮下に移植した同系結腸癌CT26におけるプロテインAの抗腫瘍効果を評価した。研究はそれぞれ5〜6週齢の10匹の雌BALB/cマウスを含む3実験群からなっていた。全ての動物について細胞培養培地(フェノールレッドなしのRPMI)中の5.0×105個のCT26腫瘍細胞を動物の右側腹部に皮下移植した。0日目(腫瘍移植の11日後)に原発腫瘍が23.5mm3〜132.7mm3の体積に達したとき、30匹の腫瘍担持動物をランダムに3群(n=10)に分けた。同じ日に、10ml/kgのビヒクル対照(群1、PBS)、並びに1mg/kg(群2)及び10mg/kg(群3)の試験化合物プロテインAによる処置を開始した。全群の動物を毎週2回、11日目(0日目)、15日目(4日目)、及び18日目(7日目)に静脈(i.v.)処置した。18日目に最後の投与を行なった後、72時間で21日目(10日目)に研究を終了し、動物を犠牲死させ、剖検を行なった。剖検の際、動物の体重を測定し、イソフルランで麻酔した。血清を調製するため、血液試料を採取した。その後、頸椎脱臼によって動物を死亡させ、原発腫瘍を採取して湿潤重量を決定した。更に、分析のため脾臓組織も採取した。
研究の経過中、全ての研究群の動物の平均体重は一定であるか、僅かに増加した(図1)。体重はプロテインAによる処置に影響されなかった。
雌BALB/cの皮下に移植した同系結腸癌CT26モデルにおいて試験した任意の用量(1mg/kg及び10mg/kg)のプロテインAによって誘導された腫瘍増殖阻害をビヒクル対照(PBS)と比較した。推定した腫瘍体積に対する1mg/kg及び10mg/kgのプロテインAによる処置の効果は同程度であり、15日目(4日目)の2回目のプロテインAの投与以後、ずっと顕著であった。20日目にインビボで測定すると、1mg/kg及び10mg/kgの用量のプロテインAは、統計的に有意な腫瘍増殖阻害効果、即ちそれぞれ84.7%(P<0.001)及び73.1%(P<0.001)を示した。
プロテインAは1mg/kg及び10mg/kgの試験用量で雌BALB/cの皮下移植同系結腸癌CT26モデルにおいてビヒクル対照(PBS)と比較して高度に有意な腫瘍増殖阻害効果を示した。
CD27受容体アゴニストタンパク質はインビボでマウス抗原特異的CD8陽性T細胞のクローン性増殖を増大させる
gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)を用いて、「ドナー」OT-1マウスの脾臓及びリンパ節からT細胞を単離した。細胞をPBS中に再懸濁し、「レシピエント」C57BI/6マウスに静脈注射した。1日後(0日目)、マウスに5mgのニワトリ卵アルブミン(OVAタンパク質)の腹腔内注射、及び六価のプロテインA(0.1、1又は10mg/kg)、三量体CD27リガンド(プロテインX)(10mg/kg)、又はビヒクル対照の静脈内注射を行なった。種々の時点で連続的に血液を採取した。最終時点では脾臓も採取した。
CD27受容体アゴニストの半減期はN結合型糖鎖の数と相関する
プロテインA分子は3つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で連結された2つのポリペプチドからなっており、ヒンジリンカーにK223G変異、並びにFc領域にN297S変異(EU番号付けシステムによる)を含み、その結果、CH2ドメインはグリコシル化されている。プロテインBはプロテインAと同じFcドメイン配置を有しているが、リンカー要素(iv)が短く、N結合したグリコシル化コンセンサス部位を欠いている。プロテインBは配列番号47で表わされるが、C末端Strep-tagを有している。プロテインCはプロテインBと同じ配置を有しているが、可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)及び(v)のそれぞれにN63D変異を含む。プロテインCは配列番号43で表わされる。プロテインDはプロテインCと同じ配置を有し、可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)及び(v)のそれぞれにN63D変異を含むが、N末端に短縮された可溶性CD27Lドメインを有する。プロテインDは配列番号45で表わされる。
したがって、成熟タンパク質は共有結合で連結された2つのポリペプチドからなるので、プロテインAは16個のN結合型糖鎖を含み、プロテインBは14個のN結合型糖鎖を含み、プロテインC及びプロテインDは両方とも全部で8個のN結合型糖鎖を含む。精製したプロテインA、B、C及びDについて、マウスにおける半減期を試験した。
2 CH2ドメイン
3 CH3ドメイン
4 ヒンジ-システイン
5 N297位に結合したCH2糖鎖
6 上側ヒンジリジン(K223)
Claims (26)
- 一本鎖融合ポリペプチドを含むCD27受容体アゴニストタンパク質であって、
(i)第1の可溶性CD27Lドメイン、
(ii)第1のペプチドリンカー、
(iii)第2の可溶性CD27Lドメイン、
(iv)第2のペプチドリンカー、並びに
(v)第3の可溶性CD27Lドメイン、並びに
(vi)配列番号16及び19〜24を含む群から選択されるヒンジリンカー、並びに
(vii)抗体Fc断片を含み、
抗体Fc断片(vii)が配列番号13若しくは14で示されるアミノ酸配列又は配列番号13若しくは14のアミノ酸1〜217からなる、CD27受容体アゴニストタンパク質。 - 抗体Fc断片(vii)がヒンジリンカー(vi)を介して第3のCD27Lドメイン(v)のC末端に融合している、請求項1に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 実質的に非凝集性である、請求項1又は2に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 第2及び/又は第3の可溶性CD27Lドメインが、任意選択でアミノ酸配列変異を含む、N末端が短縮されたドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性CD27Lドメインのうちの少なくとも1つ、特に可溶性CD27Lドメイン(iii)及び(v)のうちの少なくとも1つが、配列番号1のヒトCD27Lのアミノ酸Glu51又はAsp56で開始するN末端配列を有する可溶性CD27Lドメインであり、Glu51が中性アミノ酸、例えばSer又はGlyで置き換えられていてもよい、請求項1から4のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性CD27Lドメインのうちの少なくとも1つ、特に可溶性CD27Lドメイン(iii)及び(v)のうちの少なくとも1つが、
(a)Glu51〜Asp56及び
(b)(Gly/Ser)51〜Asp56
から選択されるN末端配列を有する可溶性CD27Lドメインである、請求項5に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。 - 可溶性CD27Lドメインが配列番号1のアミノ酸Pro193で終止し、及び/又は任意選択でW55、N63、R83、R122、R138、R144、H123、H124、H148、N170、R179、D182、E183の位置に又は前記位置の2つ以上に変異を含む、請求項5又は6に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 少なくとも可溶性CD27Lドメイン(iii)が配列番号1のPro193で終止している、請求項5から7のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)及び(v)が配列番号1のヒトCD27Lのアミノ酸Glu51〜Pro193からなる、請求項6から8のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性CD27Lドメイン(i)、(iii)及び(v)の1つ又は複数がAsn63及び/又はAsn170のアスパラギン酸、セリン又はグリシンへの変換を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- アスパルテート変換N63[D,S,G]及び/又はN170[D,S,G]が可溶性CD27Lドメイン(iii)及び(v)に限られている、請求項10に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)が、独立に、グリコシル化されていてもよいアスパラギン残基を任意選択で含む、3〜8個のアミノ酸の長さ、特に3、4、5、6、7又は8個のアミノ酸の長さを有し、好ましくは、グリシン/セリンリンカーである、請求項1から11のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)が配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項12に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 例えば配列番号17のN末端シグナルペプチドドメインを更に含む、プロテアーゼ切断部位を含んでもよい、並びに/又は、認識/精製ドメイン、例えば配列番号18のStrep-tagを含んでもよい及び/若しくはこれに連結されていてもよいC末端要素を更に含む、請求項1から13のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 配列番号15、配列番号25〜35及び/又は配列番号43〜47のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- それぞれが配列番号27、29〜35及び/又は43〜47で示されるアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 2つのポリペプチドが
a)配列番号27、29、30、35の457位、463位及び466位、又は
b)配列番号31、43、47の453位、459位及び462位、又は
c)配列番号32の450位、456位及び459位、又は
d)配列番号33の436位、442位及び445位、又は
e)配列番号34の454位、460位及び463位、又は
f)配列番号44、46の442位、448位及び451位、又は
g)配列番号45の438位、444位及び447位
に形成された3つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、請求項16に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。 - 配列番号27、29、30、34、35のN149及びN300、又は配列番号31、32、43、47のN149、又は配列番号33のN145、又は配列番号44、46のN144及びN290、又は配列番号45のN144のリストから選択される1つ又は複数のNグリコシル化アスパラギン残基を含む、請求項16又は17に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- ポリペプチドが更に翻訳後修飾されている、請求項1から18のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 翻訳後修飾がN末端グルタミンのピログルタメートへの修飾を含む、請求項19に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質。
- 好ましくは発現制御配列に作動可能に連結された、請求項1〜20のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項21に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項21に記載の核酸分子又は請求項22に記載のベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた細胞又は非ヒト生命体であって、細胞が例えば原核細胞又は真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、又はより好ましくはヒト細胞若しくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、細胞又は非ヒト生命体。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載のCD27受容体アゴニストタンパク質、請求項21に記載の核酸分子、又は請求項22に記載のベクターを活性薬剤として含む医薬組成物又は診断用組成物。
- 1つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及び/又はアジュバントを更に含む、請求項24に記載の医薬組成物又は診断用組成物。
- 治療、より詳細にはCD27Lの機能不全によって引き起こされる、これに関連する、及び/又はこれに付随する障害、特に腫瘍等の増殖性障害、例えば固形又はリンパ腫瘍、感染症、炎症、代謝性疾患、自己免疫障害、例えばリウマトイド及び/又は関節炎疾患、退行性疾患、例えば多発性硬化症等の神経退行性疾患、アポトーシス関連疾患又は移植拒絶反応の予防及び/又は処置において用いるための、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
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