KR20230074799A - 리간드의 침출 감소 - Google Patents

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KR20230074799A
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substrate
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fluid
coupled
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KR1020237014256A
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스티븐 프란시스 조셉스
아미르 자프리
마크 라프티스
Original Assignee
이뮤니컴 인코포레이티드
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Abstract

유체로부터 성분을 제거하기 위한 컬럼이 개시된다. 컬럼은 임의의 단면적을 갖는 구획을 갖는다. 구획은 임의의 직경을 갖는 비드를 함유한다. 성분에 결합하도록 선택된 리간드는 비드에 커플링된다. 단면적 및 비드 직경은 구획 내의 유체의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하여 유체 내로의 리간드의 침출을 감소시키도록 선택된다. 또한, 아민 결합에 의해 기질에 부착된 리간드를 포함하는 흡착제가 본원에 기술되며, 여기서 리간드는 기질로부터의 해리에 저항성이 있다.

Description

리간드의 침출 감소
관련 출원에 대한 교차 참조
[0001] 이 출원은 2020년 10월 1일에 출원된 미국 실용 특허 출원 번호 17/061,246에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록
[0002] 본 출원은 서열 목록과 제출되고 있다. 서열 목록은 텍스트 파일 형태로 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된다. 2020년 10월 1일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 "IMMUNICOM-0515514-PCT.txt"이고, 크기는 10.2 KB이며, 그 내용은 전체적으로 참조로 본원에 포함된다.
도입
[0003] 성분채집술은 환자의 혈액이 하나 이상의 특정 구성요소를 분리하고 나머지는 순환계로 반환하는 장치를 통과하는 의료 기술이다. 따라서, 이는 체외 요법이다. 이 기술은 일반적으로 헌혈 센터에서 혈소판을 수집하는 데 사용된다.
[0004] 신체의 염증 및 세포 아폽토시스 조절은 다수의 조절 단백질에 의해 관리되는 복잡한 과정이다. 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)는 항종양제로서 특성 규명된 강력한 사이토카인이다. TNF-알파 효과의 자연적 조절은 억제 분자, 예를 들어 혈장 내 sTNF-R1 및 sTNF-R2와 같은 가용성 TNF-알파 수용체(sTNF-R)의 존재에 기인한다. 가용성 수용체는 TNF-알파에 결합하여 중화시킬 수 있다.
[0005] 혈액에서 sTNF-R을 제거하려는 시도는 잠재적으로 위험한 양의 컬럼 물질의 환자의 혈류 내로의 침출, sTNF-R 제거의 가변성, 부작용 및 성분채집술의 현재 상태가 실용적인 치료적 접근법인지에 대한 의심을 증가시키는 복잡성의 보고로 이어진다.
개요
[0006] 환자의 순환에서 억제 분자를 제거하기 위해 설계된 "제거" 면역요법을 제공하는 것이 바람직한데, 이에 의해 컬럼 물질이 처리된 혈액 성분으로 침출되는 것을 방지하면서 신체의 자연 면역 반응을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 환자의 순환으로부터 sTNF-R을 제거하여 신생물 세포에 대한 TNF-알파의 활성을 폭발시키는 것이 바람직하다.
[0007] 유체로부터 성분을 제거하기 위한 컬럼이 개시된다. 컬럼은 임의의 단면적을 갖는 구획, 임의의 직경을 갖고 구획 내에 배치된 비드, 및 비드에 커플링되고 성분에 결합하도록 선택된 리간드를 포함한다. 상기 단면적 및 비드 직경은 구획 내의 유체의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택된다.
[0008] 환자의 혈액으로부터 성분을 제거하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 환자로부터 혈액을 받는 단계, 혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계, 및 임의의 단면적을 가지며, 성분에 결합하도록 선택된 리간드에 커플링되는 임의의 직경을 갖는 복수의 비드를 함유하는 구획을 통해 성분 중 하나의 일부를 통과시키는 단계를 포함한다. 단면적 및 비드 직경은 구획 내의 혈액 성분의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택된다. 방법은 또한 적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계 및 혼합된 혈액 성분을 환자에게 반환하는 단계를 포함한다.
[0009] 유체로부터 성분을 제거하기 위한 리간드가 개시된다. 리간드는 적어도 2개의 단량체를 포함하며, 이들 각각은 성분에 커플링될 부위, 2개의 단량체 사이의 제1 링커, 및 단량체 중 하나에 커플링되고 화학적 결합에 의해 기질에 커플링되는 제2 링커를 포함한다.
[0010] 유체로부터 성분을 제거하는데 사용하기 위한 기질이 개시된다. 기질은 기질에 커플링된 리간드를 갖는다. 리간드는 적어도 2개의 단량체를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 성분에 커플링될 부위, 2개의 단량체 사이를 커플링하는 제1 링커, 및 단량체 중 하나에 커플링되고 화학적 결합에 의해 기질에 커플링되는 제2 링커를 포함할 수 있다.
[0011] 유체로부터 성분을 제거하는데 사용하기 위한 컬럼이 개시된다. 컬럼은 구획 및 구획 내에 배치된 기질을 갖는다. 기질은 기질에 커플링된 리간드를 갖는다. 리간드는 적어도 2개의 단량체를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 성분에 커플링될 부위를 갖는다. 리간드는 또한 2개의 단량체 사이에 커플링된 제1 링커 및 단량체 중 하나에 커플링되고 화학적 결합에 의해 기질에 커플링된 제2 링커를 포함한다.
[0012] 환자의 혈액에서 표적 성분을 제거하는 방법이 개시된다. 방법은 환자로부터 혈액을 받는 단계, 혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계, 및 리간드에 근접하게 혈액 성분 중 하나의 일부를 통과시키는 단계를 포함한다. 리간드는 적어도 2개의 단량체를 가지며, 이들 각각은 성분에 커플링될 부위를 갖는다. 리간드는 또한 2개의 단량체 사이에 커플링된 제1 링커 및 단량체 중 하나에 커플링되고 화학적 결합에 의해 기질에 커플링된 제2 링커를 갖는다. 방법은 또한 적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계 및 혼합된 혈액 성분을 환자에게 반환하는 단계를 포함한다.
[0013] 성분채집술에 사용하기 위한 비드를 제조하는 방법이 개시된다. 방법은 기질을 산화시키는 단계, TNF-알파의 일부를 포함하는 리간드와 산화된 기질 사이에 쉬프(Schiff) 염기를 형성하는 단계 및 쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계를 포함한다.
[0014] 본원에 개시된 장치 및 방법은 생체내 및 시험관내에서 혈장으로부터 sTNF R을 효율적으로 제거하여 특정 암 종양에 대해 긍정적인 임상적 영향을 제공하면서, 현재 사용 가능한 시스템에서 볼 수 있는, 컬럼으로부터 환자에게 반환된 혈장으로 침출되는 TNF 알파의 부정적인 영향을 피하는 것으로 나타났다. 동일한 장치 및 방법이 다른 표적 성분 및 다른 병태의 치료에 적용 가능하다.
[0015] 일부 양태에서, 대상체의 혈액으로부터 표적 성분을 제거하기 위한 흡착제가 본원에 제시되며, 상기 흡착제는 표면을 포함하는 기질; 아민 결합을 포함하는 링커; 및 TNFα를 포함하는 리간드를 포함하며; 여기서 링커는 기질 및 리간드에 부착된다.
[0016] 일부 양태에서, 대상체의 혈액으로부터 TNF 수용체를 제거하기 위한 흡착제가 본원에 제시되며, 여기서 흡착제는 기질 표면을 포함하는 기질; 및 단일 사슬 TNFα를 포함하는 리간드를 포함하며; 여기서 기질 표면은 아민 결합(예를 들어, 2차 아민 결합)에 의해 단일 사슬 TNFα에 부착된다. 일부 구현예에서, 기질 표면은 폴리사카라이드를 포함한다.
도면의 설명
[0017] 도 1은 예시적인 성분채집 컬럼을 묘사한다.
[0018] 도 2는 도 1의 성분채집 컬럼의 예시적인 부분의 확대도를 묘사한다.
[0019] 도 3은 리간드 및 기질을 포함하는 흡착제의 일부의 예시적인 개략도를 묘사한다.
[0020] 도 4는 리간드를 지나 흐르는 유체에 의해 흡착제에 가해지는 힘의 개념적 설명을 묘사한다.
[0021] 도 5a-5b는 흡착제로부터 리간드 또는 그 일부의 해리의 개념적 예시를 묘사한다.
[0022] 도 6은 컬럼의 유출물에 존재하는 리간드의 정상 상태 양의 예시적인 플롯을 묘사한다.
[0023] 도 7은 시작 동안 컬럼의 유출물에 존재하는 리간드의 양의 예시적인 플롯을 묘사한다.
[0024] 도 8a-8b는 본 개시내용의 특정 양태에 따른, 삼량체를 포함하는 리간드의 도식적 예를 묘사한다.
[0025] 도 9는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 2-스테이지 컬럼을 묘사한다.
[0026] 도 10a는 시아노겐 브로마이드가 아가로스 기질을 제조하는 데 사용되는 과정을 묘사한다.
[0027] 도 10b는 CNBr에 의해 형성된 시아네이트 에스테르를 아민 R-NH2와 반응시켜 아가로스에 리간드를 부착시키기 위한 화학 반응식이다.
[0028] 도 10c는 N-하이드록실 석신이미드(NHS)로 이전에 활성화된 아가로스에 리간드를 부착하기 위한 화학 반응식이다.
[0029] 도 10d는 미리 아가로스 표면 상에 형성된 아실이미다졸에 아민 결합을 형성하여 아가로스에 리간드를 부착시키기 위한 화학 반응식이다.
[0030] 도 11은 두 가지 기본 유형의 생화학적 결합 화학의 결합 에너지를 나타내는 막대 그래프이다.
[0031] 도 12는 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)를 사용하여 기질에 리간드의 일차 아민을 부착하기 위한 예시적인 화학 반응식이다.
[0032] 도 13은 아미드 결합에 의해 아크릴아미드 기질에 부착된 TNF 리간드(각 쌍의 왼쪽 막대) 및 아민 결합에 의해 아가로스 기질에 부착된 TNF 리간드(각 쌍의 오른쪽 막대)의 침출 속도의 벤치-테스트의 예시적인 비교를 묘사한다. 각 유속에 대한 아크릴아미드와 아가로스 침출 속도 사이의 차이는 유의적이었다(p<0.05).
[0033] 도 14는 아미드 결합으로 기질에 부착된 단일 사슬 TNF 리간드(scTNF)(Tx1, Tx2 및 Tx3)와 아민 결합으로 기질에 부착된 scTNF 리간드(Tx4, Tx5, Tx6 및 Tx7)의 침출을 비교하는 실험 데이터의 플롯을 묘사한다.
상세한 설명
[0034] 하기 설명은 성분채집 컬럼 및 그 일부의 구현예를 개시한다. 특정 구현예에서, 컬럼은 예를 들어, 혈액 기증자 센터에서 현재 사용되는 기계 중 하나와 같은 성분채집 기계와 함께 사용된다. 전형적인 기계는 환자로부터 전혈을 추출하고, 혈액을 혈액 성분, 예를 들어 적혈구, 혈소판 및 백혈구, 및 혈장으로 분리한다. 혈액 성분 중 하나, 예를 들어 혈장은 표적 물질을 제거하기 위한 컬럼을 통과할 수 있다. 그 후, 처리된 혈액 성분과 나머지 혈액 성분은 통합되어 환자의 혈류에 재도입된다.
[0035] 이하에 제시된 상세한 설명은 대상 기술의 다양한 구성의 설명으로서 의도되며, 대상 기술이 실시될 수 있는 유일한 구성을 나타내는 것으로 의도하는 것은 아니다. 첨부된 도면은 본원에 통합되며, 상세한 설명의 일부를 구성한다. 상세한 설명은 해당 기술에 대한 완전한 이해를 제공하기 위한 목적의 특정 세부 사항을 포함한다. 그러나, 해당 기술이 이러한 특정 세부사항 없이 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 어떤 경우에는, 해당 기술의 개념이 모호해지는 것을 피하기 위해 잘 알려진 구조와 구성 요소가 블록 다이어그램 형식으로 제시된다. 유사하거나 실질적으로 유사한 구성 요소는 이해하기 쉽도록 동일한 요소 번호로 라벨링된다.
[0036] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자"는 순환계를 갖는 임의의 척추동물 유기체를 의미한다. 환자는 인간일 수 있다. 환자는 또한 개 또는 고양이 또는 기타 임의의 포유동물과 같은 동물일 수 있다.
[0037] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유체"는 하나 이상의 혼화성 및/또는 비혼화성 액체 성분, 하나 이상의 용해된 기체 성분 및 하나 이상의 고체 또는 반고체 성분을 포함할 수 있는 조성물을 의미한다. 유체는 세포, 항체, 사이토카인, 펩티드, 단백질 및 sTNF-R과 같은 분자 중 하나 이상을 포함할 수 있는 혈액, 혈액 성분 또는 혈장 또는 혈청과 같은 이의 일부와 같은 생물학적 유체일 수 있다.
[0038] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 어구 "혈액 성분"은 예를 들어 원심분리에 의해 혈액이 분리될 수 있는 유체 중 하나를 의미한다. 예를 들어, 혈액은 주로 적혈구인 제1 혈액 성분, 주로 혈소판과 백혈구인 제2 혈액 성분, 및 주로 혈장인 제3 성분으로 분리될 수 있지만 다른 유형의 분리도 가능하며 이러한 정의 내에 포함된다.
[0039] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "컬럼"은 환자로부터의 유체를 통과시키는 장치를 의미하며, 여기서 컬럼은 유체와 상호작용하는 물질을 포함한다. 컬럼은 크기와 모양이 다양한 구성일 수 있으며, 하나 이상의 흡착제, 기질 또는 리간드를 포함한다.
[0040] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기질"은 구조를 제공하지만 기질에 근접한 물질과 반드시 상호작용할 필요는 없는 물체를 의미한다. 기질 또는 기질의 표면은 하나 이상의 유기 물질, 예컨대 폴리사카라이드를 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 무기 물질, 예컨대 금속, 플라스틱, 세라믹 또는 물을 포함할 수 있다. 기질은 물질, 처리 및/또는 환경에 노출되어 다른 형태, 예를 들어 산화물로 변환된 부분을 포함할 수 있다. 기질은 하나 이상의 층, 예를 들어 코팅 또는 플레이팅을 포함할 수 있다. 기질은 또한 "지지체"라고도 한다.
[0041] 특정 구현예에서, 기질은 입자(예를 들어, 비드)를 포함한다. 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "입자"는 다른 기하학적 형상 또는 구조를 배제하지 않으면서 기질의 예시적인 구조적 구현예를 설명하기 위해 사용된다. 입자(예를 들어, 비드)는 고체 형태, 예컨대 고체 구일 수 있거나 중공 요소 또는 개방 셀 폴(foam)와 같은 구조를 가질 수 있다. 입자는 단순한 기하학적 형태, 예를 들어 구 또는 막대, 또는 "다중-아암 성상(multi-arm star)", 예를 들어 어린이 장난감 잭과 같은 보다 복잡한 형태를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 입자는 입자에 근접한 물질과 상호작용하도록 의도된 리간드 또는 촉매와 같은 다른 물질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 입자는 비드를 포함한다.
[0042] 특정 구현예에서, 입자는 구를 포함한다. 특정 구현예에서, 구를 포함하는 입자는 약 1-600 μm 범위의 평균(mean), 평균(average) 또는 절대 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 구를 포함하는 입자는 약 45-165 μm 범위 또는 약 60-200 μm 범위의 평균, 평균 또는 절대 직경을 갖는다. 입자는 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 일부 구현예에서, 입자는 다공성이고, 약 10 nm 내지 100 nm 범위의 평균, 평균 또는 절대 직경을 갖는 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 셀룰로스, 예를 들어 아가로스 입자이다. 일부 구현예에서, 입자는 SEPHAROSETM 입자이다.
[0043] 본원에 제시된 바와 같이, 기질 또는 입자(예를 들어, 비드)는 종종 표면을 포함한다. 일부 구현예에서, 표면은 하나 이상의 탄소를 포함한다. 특정 구현예에서, 표면은 리간드에 부착되기 전에 하나 이상의 폴리사카라이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 표면은 리간드에 부착되기 전에 하나 이상의 반응성 탄소를 포함한다. 특정 구현예에서, 표면은 리간드에 부착되기 전에 하나 이상의 산화된 폴리사카라이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 표면은 리간드에 부착되기 전에 하나 이상의 알데하이드 모이어티를 포함한다.
[0044] 특정 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 폴리사카라이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 가교된 폴리사카라이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 중성 또는 하전된 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 셀룰로스(예를 들어, 아가로스), 자일란, 덱스트란, 풀루란, 전분 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 안정한 화학 결합을 형성하기 위해 리간드 분자와 상호작용할 수 있는 화학적 활성 연결기를 포함하도록 변형된다. 이의 예는 아민 함유 리간드를 사용한 환원적 아민화 공정에 참여할 수 있는 포르밀 기의 형성을 발생시키는 소듐 메타 퍼아이오데이트에 상기 기질 표면을 노출시킴에 의한 표면 활성화이다[표 2 참조].
[0045] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면"은 3D 형태의 통상적인 외부 물리적 경계뿐만 아니라 기질을 통과하고 이에 근접한 유체에 노출되거나 접촉할 수 있으며, 리간드가 부착될 수 있는 기질(예를 들어, 불용성 매트릭스)의 임의의 부분을 포함한다.
[0046] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "직경"은 구조적 요소의 하나 이상의 인스턴스를 포함하는 체적을 통한 액체의 유동에 영향을 미치는 구조적 구현예의 주요 치수를 식별하는 데 사용된다. 간단한 구조를 갖는 구현예, 예를 들어 고체 구형 비드에서, 직경은 한 표면에서 중심을 통과하는 다른 표면까지의 라인 길이의 일반적인 정의일 수 있다. 내부 구조를 갖는 구현예, 예를 들어 단일 인스턴스가 체적을 채울 수 있는 개방 셀 폼에서, 직경은 폼을 통한 통로의 평균 폭일 수 있다. 복잡한 구조, 예를 들어 다중-아암 성상을 갖는 구현예에서, 직경은 서로의 상단에 쌓일 때 구조 인스턴스의 평균 중심간 분리 간격일 수 있다.
[0047] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 어구 "표적 성분"은 리간드가 상호작용하도록 의도된 화학 물질, 화합물 및/또는 유기 구조를 의미한다. 예시적 상호작용은 표적 성분의 포획을 포함할 수 있다. 특히, 표적 성분은 컬럼을 통과하는 유체로부터 제거하고자 하는 유기 구조일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 성분은 가용성 수용체, 예를 들어 가용성 TNF 수용체이다.
[0048] 용어 "리간드"는 표적 성분에 결합하는 친화성을 갖는 물질을 의미한다. 예로는 리간드 상의 부위가 표적 성분의 전부 또는 일부에 결합하는 것이다. 특정 구현예에서, 리간드는 기질에 분리 불가능하게 결합된다. 분리 불가능하게 결합된 리간드에 대한 표적 성분의 결합은 기질 상에 표적 성분을 유지하기 위한 것이다.
[0049] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리가능한" 및 "분리 불가능한"은 분자가 기질로부터 쉽게 방출될 수 있는 것과 관련된 과정 동안 기질에 부착된 분자를 갖는 의도된 기능을 나타낸다. 부착은 화학적, 물리적 또는 기계적 수단에 의해 파괴될 수 있다. 과정 중에 부착된 분자를 방출하도록 의도된 쉽게 파괴된 부착을 갖는 분자는 분리 가능한 것으로 간주된다. 과정 중에 부착된 분자를 유지하도록 의도된 비교적 강한 부착을 가진 분자는 분리 불가능한 것으로 간주된다. 예를 들어, 비가역적 화학적 변화를 통해 부착을 수정하면 분자의 다른 특성에 영향을 주지 않으면서 분리 가능한 분자를 분리 불가능한 분자로 변환시킬 수 있다.
[0050] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리간드"는 표적 성분에 대한 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 요소를 포함하는 유기 구조, 예를 들어 폴리펩티드 또는 펩티드를 의미한다. 요소는 재조합 단일 사슬 TNF-알파(scTNF-알파)와 같은 하나 이상의 유기 구조를 포함할 수 있다. 요소는 직렬로 연결되거나 다중 아암 분지로 연결될 수 있다. 요소는 공유 결합, 이온 결합, 소수성 결합 및 반 데르 발스 힘을 포함하는 다양한 결합 메커니즘을 통해 서로 커플링될 수 있으며, 화학 물질, 유기 또는 무기 화합물, 또는 중간 위치 또는 말단 위치의 기타 요소를 포함할 수 있다. 리간드는 생물학적 리간드, 예를 들어 자연 발생 리간드, 합성 리간드(예를 들어, 인공적으로 만들어진, 예를 들어, 화학적으로 합성된) 및/또는 재조합적으로 생성된 리간드일 수 있다.
[0051] 일부 구현예에서, 리간드는 생물학적 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 리간드는 가용성 리간드(예를 들어, 막 결합되지 않음)이다. 일부 구현예에서, 리간드는 리간드의 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 리간드의 수용체-결합 부분을 포함한다.
[0052] 특정 구현예에서, 리간드는 TNFα(예를 들어, UniProtKB 수탁 번호 P01375), 이의 수용체-결합 부분, 이의 수용체-결합 변이체, 이의 수용체-결합 융합 단백질 등, 및 이의 조합을 포함한다. 자연적으로 발생하는 TNFα는 막 결합 또는 가용성일 수 있는 동종삼량체로 조립된 3개의 실질적으로 동일한 단량체를 포함한다. 가용성 TNFα는 세포 표면으로부터 TNFα 단량체의 막관통 부분이 절단되어 자연적으로 생성된다. 막 결합 및 가용성 TNFα는 모두 이의 동족 수용체(즉, TNFR1(TNF 수용체 유형 1; TNFRSF1A; CD120a; p55/60) 및 TNFR2(TNF 수용체 유형 2; TNFRSF1B; CD120b; p75/80)에 결합할 수 있다. 따라서, TNFα의 막관통 부분은 수용체 결합에 필요하지 않다. TNFα 이량체 및 TNFα 삼량체 둘 모두는 수용체가 가용성 형태 또는 막 결합 형태로 존재하는지 여부에 관계없이 TNFR1 또는 TNFR2에 특이적으로 결합할 수 있다. TNFα 이량체는 예를 들어, 항체의 Fc 부분과의 융합 단백질로서 TNF 단량체를 재조합적으로 발현함으로써 만들어질 수 있으며, 여기서 Fc 부분은 TNF 분자의 이량체 구성을 차례로 안정화시키는 안정한 이량체를 형성한다.
[0053] 일부 구현예에서, TNFα는 TNFR1 또는 TNFR2에 효율적으로 결합할 수 있는 단일 사슬 이량체 또는 단일 사슬 삼량체로서 재조합적으로 생성된다. 단일 사슬(sc) TNFα의 비제한적 예는 미국 특허 번호 8,927,205, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0162095 및 US 2014/0056843, 등에 기술된 것, 이의 수용체 결합 유도체, 및 이의 수용체 결합 부분을 포함하며, 이들 특허 및 특허 출원 공개 모두는 본원에 참조로 포함된다.
[0054] 일부 구현예에서, 리간드는 하기 나타낸 바와 같은 SEQ ID NO: 1, 2 및/또는 3 중 하나 이상의 인간 TNFα 서열, 이의 이량체, 이의 삼량체, 또는 이의 수용체-결합 부분 또는 유도체를 포함한다:
[0055] (SSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL, SEQ ID NO:1) - [처리된 TNF 단량체, Genbank 수탁 번호. AQY77150.1];
[0056] TNFα의 예시적 삼량체 형태: (MCGSHHHHHHGSASSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALGGGSGGGSGGGSGGGSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALGGGSGGGSGGGSGGGSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL, SEQ ID NO:2); 및
[0057] TNFα의 또 다른 예시적 삼량체 형태: (GSASSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALGGGSGGGSGGGSGGGSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIALGGGSGGGSGGGSGGGSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL, SEQ ID NO:3).
[0058] 단일 사슬 TNFα는 NH2-T1-L1-T2-L2-T3-COOH 구조를 포함할 수 있으며, 여기서 T1, T2 및 T3는 TNF 단량체의 폴리펩티드 서열, 이의 유도체, 또는 이량체 또는 삼량체 구성으로 조립될 때 TNF 수용체에 결합할 수 있는 이의 부분을 포함하며; L1 및 L2는 단량체 연결 영역을 포함하고; NH2는 리간드의 N-말단을 나타내고, COOH는 리간드의 C-말단을 나타낸다.
[0059] 일부 구현예에서, TNF 단량체의 유도체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하여, TNF 단량체의 유도체가 천연 TNF 단량체와 비교할 경우 TNF 수용체에 특이적으로 그리고 상대적으로 높은 친화도로 결합하는 능력을 유지한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 유사체를 포함할 수 있다.
[0060] 일부 구현예에서, 리간드는 링커 또는 연결 요소를 포함한다. 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 어구 "링커" 또는 "연결 요소"는 2개의 상이한 구조(예를 들어, 리간드와 기질; 리간드와 기질 표면 등) 사이에 결합하는 화합물 또는 구조를 의미한다.
[0061] 일부 구현예에서, 링커는 적합한 펩티드 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신(G) 및/또는 Ser(S) 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 GGGS 또는 GGGGS, 및 이들의 조합의 하나 이상의 유닛(예를 들어, 1 내지 20개 유닛)을 포함한다. 특정 구현예에서, 펩티드 링커는 (GGGS)n 또는 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, 단량체 연결 영역 중 하나 또는 둘 모두는 부재하거나 단일 공유 결합을 포함한다.
[0062] 일부 구현예에서, 링커는 서로 공유 결합된 하나 이상의 탄소를 포함한다.
[0063] 특정 구현예에서, TNFα 리간드 또는 이의 단량체는 TNFα 리간드 또는 이의 단량체의 수용체 결합 부분을 포함한다. TNFα 리간드의 유도체 또는 단량체의 수용체-결합 능력은 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있는데, 이의 비제한적인 예는 플레이트-코팅된 재조합 TNF 수용체(예를 들어, Fc 수용체) 및 태깅된(예를 들어, 히스티딘 태깅된, 플래그 태깅된) 재조합 TNFα 리간드를 사용하는 ELISA, 또는 TNF 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 유세포 분석법 기반 접근법을 포함하며, 이 방법은 세포를 태깅된 재조합 TNFα와 접촉시키는 것을 포함한다. 결합의 후속 검출 및/또는 정량화는 태깅된 리간드에 대한 라벨링된 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 관례적인 것으로 간주된다. 이러한 전통적인 방법을 사용하여 보존적 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 재조합 TNFα 리간드의 수용체 결합 능력을 과도한 실험 없이 테스트할 수 있다.
[0064] 따라서, 일부 구현예에서, TNFα 리간드, 또는 이의 수용체 결합 유도체 또는 변이체는 적어도 약 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8 또는 1 x 10-9의 친화도(Kd)로 이의 동족 수용체에 결합하는 리간드이다. 특정 구현예에서, 리간드는 TNFα, 이의 수용체-결합 이량체, 이의 수용체-결합 삼량체, 또는 이의 수용체 결합 유도체 또는 이의 일부를 포함하며, 이는 적어도 약 1x 10-6, 1x 10-7, 1x 10-8, 또는 1x 10-9의 친화도(Kd)로 이의 동족 수용체(예를 들어, TNFR1 또는 TNFR2)에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 리간드는 인간 TNFα, 이의 수용체-결합 이량체, 이의 수용체-결합 삼량체, 또는 이의 수용체 결합 유도체 또는 이의 일부를 포함하며, 이는 적어도 약 1x 10-6, 1x 10-7, 1x 10-8, 또는 1x 10-9 M의 친화도(Kd)로 이의 동족 수용체(예를 들어, 인간 TNFRSF1A 또는 인간 TNFRSF1B)에 특이적으로 결합한다.
[0065] 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다"는 예를 들어, 적합한 시험관내 검정법(예를 들어, Elisa, 면역블롯, 유동 세포 분석법 등)에 의해 결정되는 바와 같이 다른 분자 또는 다른 펩티드에 결합하는 것보다 표적 성분(예를 들어, 수용체)에 우선적으로 결합하는 리간드를 나타낸다. 특이적 결합은 비특이적 결합에 비해 약 2배 이상, 약 10배 이상, 약 100배 이상, 1000배 이상, 10,000배 이상, 100,000배 이상, 또는 1,000,000배 이상으로 구별된다.
[0066] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 어구 "결합물" 또는 "결합 요소"는 표적 성분에 부착될 화합물 또는 화학 구조(예를 들어, 리간드 또는 리간드)를 의미한다. TNF-R 표적 성분의 예에서, 결합 요소는 TNF-R에 친화성을 갖고 따라서 여기에 결합하는 부위를 포함하는 TNF의 일부일 수 있다.
[0067] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "침출"은 흡착제 또는 기질로부터의 리간드 또는 이의 일부의 손실 또는 분리(예를 들어, 해리)를 의미한다.
[0068] 본 개시내용 내에서 사용되는 바와 같이, 용어 "독성"은 컬럼의 출구 밖으로 통과하는 유체가 허용할 수 없는 위험을 나타내는 것으로 간주되는 물질의 양을 함유함을 의미한다. 환자로부터 받아 처리된 후 환자에게 반환되는 혈액의 경우, 처리된 혈액의 물질 수준이 환자로부터 받은 혈액의 물질 수준보다 충분히 높아 환자에게 반환되는 경우 환자에게 위험할 것으로 간주될 것이다.
[0069] 도 1은 본 개시내용의 특정 양태에 따른 예시적인 성분채집 컬럼(100)을 묘사한다. 컬럼(100)은 입구(130) 및 출구(134)를 갖는 구획(120)을 포함하는 본체(110)를 포함한다. 도 1의 예에서, 구획(120)은 일반적으로 입구(130) 및 출구(134)가 모두 평면 원형 디스크인 우측 실린더이다. 특정 구현예에서, 구획(120)의 단면 형상은 타원형, 직사각형, 또는 다른 규칙적이거나 불규칙하거나 비평면인 기하학적 형상일 수 있다. 특정 구현예에서, 입구(130) 및 출구(134) 중 하나 또는 둘 모두의 크기 및 형상은 구획(120)의 공칭 단면의 크기 및 형상과 상이할 수 있다.
[0070] 구획(120)은 도 1의 예에서 직선인 입구(130)로부터 출구(134)까지의 이상적인 유동 경로(140)를 갖는다. 특정 구현예에서, 유동 경로(140)는 곡선 부분, 코너 또는 다른 기하학적 특징부를 가질 수 있다. 구획(120)은 유동 경로(140)를 따른 지점에서 유동 경로(140)에 수직인 단면적을 갖는다. 특정 구현예에서, 구획(120)은 유동 경로(140)를 따라 상이한 지점에서 상이한 단면적을 가질 수 있다.
[0071] 특정 구현예에서, 유체는 유입 포트(132)로 들어가서 입구(130)로 운반된다. 유사하게, 특정 구현예에서, 출구(134)로부터 나오는 유체는 배출 포트(136)로 운반된다. 사용시, 컬럼은 도 1의 중력 방향이 임의의 방향이 될 수 있도록 거꾸로 된 방향을 포함한 임의의 방향으로 배향될 수 있다.
[0072] 특정 구현예에서, 입구(130) 및 출구(134) 중 하나 또는 둘 모두는 폴리에틸렌 비드를 함께 용융시켜 제조되는 일반적으로 "프릿(frit)"이라고 하는 다공성 웨이퍼를 포함한다. 비드의 직경과 압축 정도는 평균 기공 크기를 생성하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 평균 기공 크기는 20 미크론이다. 특정 구현예에서, 프릿은 동일한 효과로 금속 또는 세라믹을 포함하는 소결 비드에 의해 형성된다.
[0073] 유입되는 유체에 존재하는 가장 큰 요소가 입구(130) 및 출구(134)를 통과하여 컬럼(100)의 막힘을 방지할 수 있도록 프릿에 대한 평균 기공 크기를 선택하는 것이 일반적으로 바람직하다. 구획(120) 내에 도 2의 비드(150)와 같은 기질을 유지하기 위해 평균 기공 크기를 선택하는 것이 추가로 바람직하다.
[0074] 도 2는 본 개시내용의 특정 양태에 따라 도 1에서 "A"로 식별되는, 도 1의 성분채집 컬럼(100)의 예시적인 부분의 확대도를 묘사한다. 특정 구현예에서, 구획(120)은 기질, 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같은 복수의 비드(150)로 적어도 부분적으로 충전된다. 특정 구현예에서, 비드(150)는 10-10000 미크론, 20-1000 미크론, 30-500 미크론, 40-250 미크론, 45-165 미크론, 75-125 미크론의 범위일 수 있는 직경 또는 다른 범위의 직경일 수 있는 직경을 갖는 구체이다. 특정 구현예에서, 비드(150)는 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 미크론의 공통 공칭 직경 또는 다른 공칭 직경을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 비드(150)는 복수의 공칭 직경을 포함할 수 있다.
[0075] 유체가 입구(130)에서 출구(134)로 흐를 때, 유체의 실제 유동 경로는 구불구불한 경로, 예를 들어 비드(150)의 층을 통과하는 경로(142)가 될 것이다. 경로(142)의 길이는 일반적으로 이상적인 유동 경로(140)의 길이보다 길 것이다. 경로(142)의 길이는 계산되거나 추정될 수 있다.
[0076] 특정 구현예에서, 구획(120)은 개방 셀 폼을 포함하는 기질을 함유할 수 있다. 기질의 단일 인스턴스는 구획(120) 또는 구획(120)의 전체 단면적 및 길이의 일부를 충전시킬 수 있다. 이 경우, 기질의 "직경"은 폼을 통과하는 통로의 평균 폭일 수 있는데, 이는 이 통로 폭이 구형 비드의 직경이 비드(150)로 충전된 구획(120)을 통과하는 액체의 유동 속도를 결정하는 것과 유사한 방식으로 기질을 통과하는 액체의 유동 속도를 결정할 것이기 때문이다. 유사하게, 개방 셀 폼을 통과하는 실제 유동 경로는 구불구불할 것이고, 일반적으로 비드(150)의 예에 대해 기술된 바와 같이 이상적인 경로(140)와 동일한 관계를 가질 것이다.
[0077] 컬럼(100)의 유동 속도는 진경로(true path)(142) 또는 이상 유동 경로(ideal flow path)(140) 중 어느 하나를 이용하여 계산될 수 있다. 이러한 길이 차이의 한 가지 효과는 경로(142)를 따른 평균 속도가 이상적 경로(140)를 사용하여 계산된 평균 유체 속도보다 높을 것이라는 점이다. 둘째, 경로(142)를 따른 순간 속도는 변할 수 있다. 경로(142)는 비드(150)의 국부 패킹 배열에 기초한 가변 개방 면적을 갖는 채널을 통과한다. 컬럼(100)의 구획(120)을 통과하는 실제 다수의 유동 경로(142)의 모든 지점을 따라 실제 유체 속도를 정확하게 예측하는 것은 불가능하지는 않더라도 어렵다. 속도-의존적 특성을 결정하는 실험 예를 들어, 리간드의 침출은 도 6과 관련하여 추가로 논의된 대로 수행되어야 한다.
[0078] 도 3은 흡착제(151) 부분의 예시적인 개략도를 묘사한다. 이 예에서, 흡착제(151)는 기질(152) 및 기질 표면(154)을 포함한다. 특정 구현예에서, 기질 표면(154)은 기질(152)을 형성하는 물질의 산화된 형태이다. 다른 구현예에서, 기질 표면(154)은 부재하고, 기질(152)의 물질은 표면에 노출된다. 다른 구현예에서, 기질 표면(154)은 기질(152)의 물질과 상이한 물질을 포함하는 코팅으로 대체된다.
[0079] 특정 구현예에서, 기질 표면(154)은 유체로부터 제거될 표적 성분에 결합하도록 선택된 리간드에 부착된다. 특정 구현예에서, 유체는 혈액 또는 혈장과 같은 이의 일부이고, 제거될 표적 성분은 TNF 수용체이고, 리간드는 TNF 수용체의 일부에 결합한다.
[0080] 컬럼(100)의 치수는 부분적으로 유체와 리간드 사이에 원하는 접촉 시간을 제공하기 위한 경로 길이(도 2의 140 또는 142)의 선택을 기반으로 할 수 있다. 가능하게는 각각 다른 길이를 가질 수 있는 복수의 실제 유동 경로(142)가 있다고 가정하면, 각각의 경로(142)를 따른 실제 접촉 시간은 상응하게 상이할 수 있다. 원하는 접촉 시간은 일반적으로 최소 접촉 시간이다. 유속 및 단면적과 함께 이상 경로(140)의 길이를 사용하면 컬럼(100)에 대한 최소 접촉 시간을 제공할 것이다.
[0081] 특정 구현예에서, 리간드는 기질 표면(154)에 커플링된 하나 이상의 리간드(300)를 포함한다. 이 예에서, 표적 성분은 가용성 TNF 수용체이고, 리간드(300)는 TNFα 삼량체(310)를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드(300)는 삼량체(310)와 기질 표면(154) 사이에 커플링된 링커(320)를 포함한다. 특정 구현예에서, 작용기(330)는 리간드(300) 내에 배치될 수 있다.
[0082] 도 3의 예시적 리간드(300)에서, 삼량체(310)와 링커(320) 사이의 결합(350), 링커(320)와 작용기(330) 사이의 결합(352), 및 작용기(330)와 표면 코팅(154) 사이의 결합(354)이 있다. 일부 리간드는 추가 내부 구조를 가질 수 있는 반면 다른 리간드는 이러한 구조 중 일부를 생략할 수 있다. 이러한 리간드(300)의 구조는 개념을 설명하기 위한 예시로서 제공되며, 이는 특정 구조로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 링커(320)와 표면 코팅(154) 사이에 직접적인 결합(354)이 있을 수 있다. 결합(350, 352, 354)은 단일 또는 이중 이온 결합 또는 공유 결합일 수 있다. 각각의 결합(350, 352, 354)은 결합 강도를 가지며, 여기에서 결합 강도를 초과하는 힘을 가하면 결합이 파괴될 것이다.
[0083] 상이한 유형의 결합은 상이한 강도를 갖는다. 표 1(출처: T.L. Cottrell, The Strengths of Chemical Bonds, 2d ed., Butterworth, London, 1958; B. deB. Darwent, National Standard Reference Data Series, National Bureau of Standards, no. 31, Washington, 1970; S.W. Benson, J. Chem. Educ. 42:502(1965) 및 J.A. Kerr, Chem. Rev. 66:465(1966))은 다양한 요소 사이의 결합 강도의 선택된 값을 나열한다. 결합 강도는 예상치 못한 방식으로 결합 유형과 주변 화학 구조 둘 모두에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 표 1의 라인 1은 탄소-질소 결합이 탄소에 두 번째 질소가 부착되어 있고 질소에 산소가 부착되어 있을 때 동일한 결합의 강도보다 더 큰 결합 강도를 가짐을 보여준다. 유사하게는, 탄소와 산소 사이의 이중 결합(라인 5)은 단일 결합(라인 4)보다 약하다. 따라서, 결합 강도만으로 침출을 예측할 수 없다.
표 1 - 결합 해리 에너지
결합 △Hf 298 (kJ/mol)
C-N 770
NC-NO 121
N-O 630
C-O 1077
C=O 749
OC=O 532
[0084] 도 3으로 돌아가서, 결합(354)의 강도는 리간드의 침출과 관련하여 제한된 양태일 수 있다. 결합(354) 강화는 침출을 감소시킬 수 있다. 기질에 대한 리간드의 결합을 강화하는 예에서, 폴리사카라이드 기질이 사용되고, 예를 들어 소듐 메타퍼아이오데이트(NaIO4)와 같은 무기염을 사용하여 기질의 표면이 산화된다. 그 후, 기질은 리간드에 노출되고, 리간드의 일차 아민은 산화된 기질 표면 층과 함께 쉬프 염기를 형성한다. 이것은 상대적으로 약하고 가역적인 이중 결합이다. 이 결합은 약한 환원제, 예를 들어 소듐 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN)에 노출되어 단일 비가역 결합, 예를 들어 아민 결합으로 전환된다.
[0085] 도 4는 본 개시내용의 특정 양태에 따라 리간드(300)를 지나 흐르는 유체에 의해 예시적인 리간드, 즉 리간드(300)에 가해지는 힘의 개념적 예시를 묘사한다. 유체 유동의 특성은 많은 요인 예를 들어 유체의 점도, 유체에 현탁된 고체 또는 반고체 성분, 및 유체와 기질 표면(154) 사이의 접착성에 따라 달라진다. 특정 구현예에서, 유체의 유동은 기질 표면(154)으로부터의 거리와 관련된 속도 구배를 갖는 층류, 특히 기질 표면(154)에 바로 근접한 층류일 수 있다. 특정 구현예에서, 유체의 유동은 부분적으로 난류일 수 있다.
[0086] 유체 유동의 특성에 따라 리간드(300)의 구조, 예를 들어 삼량체(310), 링커(320) 또는 작용기(330) 중 임의의 구조에 힘이 가해진다. 그 후, 이러한 힘은 리간드(300)의 결합에서 전단력 및 모멘트를 생성할 수 있다. 도 4의 개념적 구조에서 전단력 Fs1과 모멘트 M1이 결합(354)에서 생성되고, 전단력 Fs2와 모멘트 M2는 결합(352)에서 생성되며, 전단력 Fs3과 모멘트 M3은 결합(350)에서 생성된다.
[0087] 도 5a는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 리간드(300)의 내부 결합의 파괴의 개념적 예시를 묘사한다. 이 예에서, 도 4에 도시된 전단력 Fs3 또는 모멘트 M3 중 하나는 특정 결합의 강도를 초과하는 응력을 결합(350)에 생성하였다. 이것이 발생한 경우, 결합(350)은 "파괴"되고 삼량체(310)의 일부를 포함하는 리간드 단편(301)은 리간드(300)의 나머지로부터 분리되었다. 특정 구현예에서, 파괴(350A)는 링커(320)의 계면에 있을 수 있는 반면, 다른 구현예에서 파괴는 삼량체(310)의 계면 또는 중간 위치에서 발생할 수 있다. 일반적으로, 예시적 리간드(리간드(300))에 근접한 유체의 속도를 감소시키면 리간드가 유체로 침출되는 것을 감소시킬 것이다.
[0088] 도 4의 전단력 Fs2 및 M2가 결합(350)의 파괴 전에 결합(352)의 강도를 초과하는 경우, 결합(352)이 먼저 파괴되었을 것이다. 이는 분리된 단편(301)이 원래 리간드(300)의 더 큰 부분을 차지하는 것과 거의 동일한 상황을 초래할 것이다. 두 경우 모두, 분리된 부분(302)은 삼량체(310)의 일부를 포함한다.
[0089] 도 5b는 본 개시내용의 특정 양태에 따른, 리간드(300)와 기질 표면(154) 사이의 결합 파괴의 개념적 예시를 묘사한다. 이 예에서, 파괴(354A)는 작용기(330)와 기질 표면(154) 사이에 있을 수 있다. 다른 시나리오에서, 기질 표면(154)의 일부는 기질 표면(154)의 나머지 부분으로부터 떨어져 나갈 수 있거나 작용기(330)의 결합이 분리 지점일 수 있다. 모든 경우에, 전체 리간드(300)는 부분(302)으로서 비드(150)로부터 분리된 것으로 간주된다. TNF-알파를 포함하는 리간드(300)의 경우, 분리된 단편(301, 302)은 scTNF-알파로 간주될 수 있다.
[0090] 도 6은 본 개시내용의 특정 양태에 따른, 컬럼을 통과하는 액체의 유속에 기초하여 유출물, 즉 컬럼으로부터의 "침출"에 존재하는 정상 상태 리간드 양의 예시적인 플롯(600)을 묘사한다. 이러한 유형의 실험은 컬럼의 특정 설계 양태, 예를 들어 구획의 단면적과 입자 유형, 형상 및 크기(예를 들어, 비드 직경)를 결정하는 데 이용될 수 있다. 리간드의 가장 약한 결합의 강도는 리간드의 구조와 기질에 어떻게 결합되어 있는지에 따라 달라지며, 구획 내의 국부 유체 속도는 기질 유형에 따라 달라지므로, 기질로부터 리간드의 분리에 대한 표준 속도 임계값은 없다. 유출 유체 중의 리간드 양의 결정은 적절한 실험실 과정, 예를 들어 침출된 리간드의 일부를 검출하도록 선택된 분석 크로마토그래피를 사용하여 결정될 수 있다. 도 3의 예시적인 리간드에서, 삼량체(310)가 기질(152)로부터 해리되는 리간드(300)의 임의의 단편에 존재할 것이기 때문에 삼량체(310)를 검출하는 것이 바람직하다.
[0091] 개념적으로 그리고 이론에 얽매이지 않으면서, 도 6은 임의의 범위의 유속에 걸쳐 컬럼 내로 흐르는 어떠한 리간드도 함유하지 않는 유체를 예시하고, 컬럼 밖으로 흐르는 유체에서 리간드의 수준이 측정된다. 유속 V1까지는 유출 유체에 측정 가능한 양의 리간드는 없다. 그 유속 초과에서는 유출물 중 리간드의 양이 증가하기 시작하며, 이는 컬럼 구획 내의 일부 위치에서 국부적 유체 속도가 리간드 결합 중 하나에서 발생되는 힘이 그 결합의 강도를 초과하는 임계값을 능가하여 리간드 또는 리간드 또는 이의 일부를 기질로부터 해리함을 나타낸다.
[0092] 개념적으로, 유출물 중 리간드의 양은 선형으로 증가할 수 있거나, 도 6에 도시된 바와 같이 국부 유체 속도가 구획의 증가하는 부피에서 임계값을 초과할 경우 기하급수적 증가율로 증가할 수 있다. 특정 환경에서, 예를 들어 유동 경로를 변경하고 동일한 전체 유동 속도에서 더 높은 국부적 속도를 생성하는 기질의 기계적 압축에 의해 야기되는 곡선(610)의 불연속성(도 6에 도시되지 않음)이 있을 수 있다.
[0093] 이 예에서, 유속 V2 이상에서 유출 유체에 존재하는 리간드의 양은 "독성"으로 간주되다. 독성 수준 미만일 때 측정 가능한 리간드의 양, 예를 들어 V1 초과인 반면 V2 미만인 유속의 유체에 존재하는 양은 허용가능할 수 있다. 특정 구현예에서, 유출 유체 중의 허용가능한 소정 수준의 리간드가 선택된다.
[0094] 도 7은 본 개시내용의 특정 양태에 따른, 개시 동안 컬럼의 유출물에 존재하는 리간드의 양의 예시적인 플롯(700)을 묘사한다. 곡선(710)은 펌프가 시간 T1에서 시작될 때 컬럼을 통한 유속을 나타낸다. 이 예의 펌프는 목표 유속(오른쪽 y축)까지 급격하게 상승하는 거의 계단 함수 유속 프로파일을 생성한다. 컬럼이 유체로 미리 채워진 경우에도 이 유동 프로파일은 도 4를 참조하여 설명된 바와 같이 정상 상태 규모보다 큰 전단력과 모멘트를 리간드에 생성시킬 수 있는 일시적 압력파를 컬럼 내에서 생성할 수 있다. 이와 같이, 리간드의 결합 강도는 정상 상태 유동 동안보다 컬럼 구획의 훨씬 더 많은 부분에서 초과될 수 있어, 곡선(720)에 의해 예시된 바와 같이 초기 유출에서 분리된 리간드 단편의 급증을 초래한다. 유출 유체 중의 리간드의 양은 곡선(720)으로 묘사되어 있는데, 이는 왼쪽 y축에 해당하며 시간 T2에서 정점에 도달한 다음 곡선(710)의 정상 상태 유속에 상응하는 정상 상태 수준으로 감소한다. 이 예에서, 독성 수준(730)은 정상 상태 값 위에 있지만 곡선(720)의 급증은 독성 값을 초과한다.
[0095] 이 급증 효과는 유출물 중 리간드 수준의 급증 없이 목표 유속으로 천천히 상승하도록 펌프의 가속을 제어함으로써 피할 수 있다. 허용 가능한 상승률은 유체의 점도, 입구 및 출구의 공극 크기, 컬럼 단면적 및 비드 크기와 같은 여러 요인에 따라 달라진다. 특정 구현예에서, 증가된 수준의 리간드를 갖는 초기 유체가 전환되어 환자에게 반환되지 않는 경우 이러한 급증이 허용될 수 있다.
[0096] 시작 시 압력 또는 유동의 급증에 비추어 도 1의 컬럼(100)을 고려하면, 특정 특징부가 그 효과를 완화하거나 피하는 데 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 입구(130) 및 동등하게는 출구(134)는 컬럼(100)의 본체(110)와 관련하여 이동할 수 있다. 특정 구현예에서, 스프링(도 1에 도시되지 않음)은 입구(130)에 편향력을 인가한다. 특정 구현예에서, 본체(110)의 내부 벽과 입구(130)의 주변부 사이에 슬라이딩 시일(sliding seal)이 있으며, 이는 유체가 입구(130)를 우회하는 것을 방지한다. 특정 구현예에서, 본체(110)와 관련하여 입구(130)의 변위에 의해 덮이지 않은 입구(130)의 주변 시일에 근접한 채널(도 1에서 미도시됨)이 있으며, 이에 의해 입구(130) 주위로 유체의 우회 유동을 허용한다. 이러한 우회 유동은 도 7과 관련하여 추가로 논의되는 급격한 압력 급증을 줄일 수 있다.
[0097] 특정 구현예에서, 구획(120)을 통한 유체 유동의 방향은 "위", 즉 중력에 반대되고, 흐르는 유체는 도 2의 비드(150)의 일부가 서로 분리되도록, 예를 들어 "부유"하게 할 수 있다. 출구(134)에 인가되는 충분한 편향력은 이러한 분리를 방지할 수 있고, "거꾸로 된" 위치에서 컬럼(100)의 적절한 작동을 촉진할 수 있다.
[0098] 특정 구현예에서, 개시 동안 유체의 급증은 도 2의 비드(150)를 압축하는 구획(120)에서 압력파를 생성하여 컬럼(100)의 성능을 영구적으로 저하시킬 수 있다. 유동 방향으로의 입구(130) 이동은 입구(130)를 통한 유동이 제한되도록 입구(130)의 다공성 영역의 일부를 마스킹하는 유동 제어부(도 1에 미도시)와 입구(130)를 접촉하게 할 수 있다. 초기 유속이 급증하는 경우, 이러한 제한은 구획(120) 내의 유체 속도의 상승 속도를 제한하여 비드(150)의 압축을 방지할 수 있다. 대안적으로, 유동 방향으로의 출구(134)의 이동은 압력 급증 동안 비드(150)의 분리를 허용함으로써 비드의 압축을 방지할 수 있다. 두 경우 모두, 압력 급증이 소산된 후 스프링이 입구(130) 또는 출구(134)를 원래 위치로 되돌린다.
[0099] 도 8a는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 삼량체(810)를 포함하는 리간드(800)의 도식적 예를 묘사한다. 삼량체(810)는 서로 근접하게 배열된 유기 구조, 예를 들어 TNF-알파의 3개의 단량체(812)를 갖는다. 각각의 단량체(812)는 단량체(812)에 근접한 유체의 표적 성분의 일부, 예를 들어 혈장 중의 TNFR1에 결합할 구조를 갖는 하나 이상의 부위를 포함한다. 단량체(812A)는 단량체(812A) 및 기질(832) 각각에 화학 결합, 예를 들어 이온 또는 공유 결합을 형성하는 링커 구조(832)에 의해 기질(830)에 커플링된다. 단량체(812b 및 812c)는 전자기 인력, 예를 들어 반 데르 발스 힘 또는 수소 결합을 통해 단량체(812a)에 커플링된다. 이온 또는 공유 결합과 달리 전자기 인력은 화학 결합으로 인한 것이 아니며 비교적 약하기 때문에 교란에 더 취약하다. 결과적으로, 단량체(812b 및 812c)는 단량체(812a)를 기질(832)로부터 분리하는데 필요한 것보다 더 낮은 수준의 인가된 힘으로 단량체(812a)로부터 분리될 수 있다.
[00100] 도 8b는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 삼량체(860)를 포함하는 리간드(850)의 도식적 예를 묘사한다. 삼량체(860)는 예를 들어 TNF-알파와 같은 유기 구조의 3개의 단량체(812)를 가지며, 이들은 링커(833)를 통해 서로 커플링되어 단일 사슬 구조를 형성하며, 이는 단량체(812) 중 하나의 한쪽 말단에서 링커 구조(832)에 의해 기질(830)에 커플링된다. 링커(832, 833)가 각 측에서 구조체에 대한 화학 결합을 형성하기 때문에, 기질(830)로부터 리간드(800)의 일부, 예를 들어 단량체(812b 또는 812c)를 분리하는 데 필요한 힘보다 기질(830)로부터 리간드의 임의의 부분(860), 예를 들어, 단량체(812) 중 하나를 분리하는데 더 높은 수준의 인가된 힘이 필요하다. 따라서, 이러한 형태로 삼량체(860)를 형성하는 것은 동일한 조건, 예를 들어 유체 점도 및 상대 속도, 온도, 기질 조성 및 단량체 구조 하에 리간드(800)의 일부의 침출과 비교하여 기질(832)에 근접하게 통과하는 유체로의 리간드(850)의 일부의 침출에 대한 증가된 저항성을 제공한다.
[00101] 도 9는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 2-스테이지 컬럼(900)을 묘사한다. 특정 구현예에서, 제1 스테이지(901)는 일반적으로 하우징(110), 제1 기질(910), 예를 들어 입구 포트(132)로 흐르는 유체의 성분을 포획할 리간드를 함유하는 구획(120)을 갖는 도 1의 컬럼이다. 출구 포트(136)는 제2 스테이지(902)의 입구 포트(132b)에 커플링되며, 이는 제2 효과를 갖는, 예를 들어 기질(910)로부터 분리된 리간드의 단편을 포획하는 제2 기질(920)을 함유하는 구획(120b)을 갖는다. 제2 스테이지(902)는 기질(910)의 리간드가 배출 포트(136B) 밖으로 흐르는 유체에 존재하는 위험을 줄이기 위한 것이다.
[00102] 표 2(출처: GT Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc., 1992 Harcourt Brace & Company)는 전기영동에 의한 큰 분자의 분리를 위해 분자 생물학에서 자주 사용되는 폴리사카라이드 중합체인 아가로스를 포함하는 지지체에 부착된 항체 면역글로불린 G(IgG)의 누출 또는 "침출"을 나열한다. IgG는 요오드-125(125I)로 태깅되며, 이는 방사성 면역 측정법 및 신체 외부의 단백질과 관련된 기타 감마-계수 절차에서 항체를 태깅하는데 일반적으로 사용되는 방사성 동위원소이다. 태깅된 IgG는 도 10a-10d에 기술된 것과 같은 상이한 방법을 사용하여 아가로스에 부착되었다. 분당 카운트(cpm)로 측정된 방사능의 초기 양은 28일 기간에 걸쳐 기질로부터 침출된 IgG 및 표본에 대해 측정된 다음 표준화된 비교를 제공하기 위해 비교되었다.
표 2 - 다양한 커플링 방법으로 제조된 고정화된 IgG 친화성 지지체에서 125I 표지된 IgG의 누출
지지체 겔 1ml 중 총 방사능(cpm) 28일에 유출된 총 수(cpm) 일일 누출(%) 결합
CNBr-아가로스 6.20 x 104 57800 0.03 -O-C(NH2+)-O-NH-R
CDI-아가로스 0.47 x 104 4948 0.04 -O-C(O)-NH-R
트레실-아가로스 0.43 x 104 26306 0.22 -O-C(O)-NH-R
NHS-활성화됨 0.62 x 104 74846 0.43 -C(O)-NH-R
주기산염/환원적 아미노화 1.00 x 104 6948 0.02 -CH2-NH-R
** 표 2에 사용된 "R"은 단백질 또는 폴리펩티드이다.
[00103] 표 2에서 표준화된 누출이 아민을 사용하여 기질에 리간드를 부착하는 다양한 방법에 걸쳐 한 자릿수에 걸쳐 변한다는 것을 알 수 있다. 표의 첫 번째 항목은 도 10a-10b에 묘사된 과정에 관한 것이다. CNBr-아가로스, CDI-아가로스 및 환원적 아미노화의 누출률은 모두 유사하며, 특히 이것이 본질적으로 표준 편차 범위를 갖는 실험적 측정치라는 점을 고려할 때 그렇다. 이러한 유형의 벤치(bench) 특성화를 기반으로 하여 결합 유형 간의 작은 차이는 환원성 아미노화가 다른 부착 방법보다 현저하게 적은 침출을 생성할 것이라고 예측하지 않는다. 이것은 도 14의 데이터에서 관찰되고 아래에서 더 논의되는 침출의 큰(2배) 규모 감소와 대조된다.
[00104] 도 10a는 본 개시내용의 특정 양태에 따른 시아노겐 브로마이드(CNBr)가 아가로스 기질을 제조하는 데 사용되는 공정을 묘사한다. 아가로스는 아가로스의 하이드록실 기와 반응하여 시아네이트 에스테르 M-O-C-N≡C를 형성하는 수산화나트륨(NaOH)에 노출된다. 임의의 특정 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 쉬프 염기를 형성한 다음 소듐 시아노 보로하이드라이드로 처리하여 환원성 아미노화로 전환하면 더 높은 강도의 결합이 생성될 수 있다.
[00105] 도 10b는 CNBr에 의해 형성된 시아네이트 에스테르를 아민 R-NH2와 반응시켜 이소우레아 유도체를 형성함으로써 단백질 리간드를 아가로스에 부착시키는 화학 반응식이며, 이는 표 2의 첫 번째 항목과 관련이 있다.
[00106] 도 10c는 N-하이드록실 석신이미드(NHS) 에스테르에 대한 아민 결합을 형성함으로써 이전에 NHS로 활성화된 아가로스에 단백질 리간드를 부착시키기 위한 화학 반응식으로, 표 2의 네 번째 항목과 관련이 있다.
[00107] 도 10d는 미리 아가로스 표면에 형성된 아실이미다졸에 아미드 결합을 형성하여 아가로스에 단백질 리간드를 부착시키는 화학 반응식이다.
[00108] 도 11은 본 개시내용의 특정 양태에 따라, 2가지 기본 유형의 생화학적 결합 화학 - 아민 및 아미드의 몰당 킬줄(kJ/mol)로 측정된 결합 에너지의 플롯(1000)이다. 데이터는 문헌 [I.I. Marochkin et al., Amide bond dissociation enthalpies: Effect of substitution on NAC bond strength, Comp and Theo Chem 991 (2012) 182-191, and J. Lalev
Figure pct00001
e et al., N-H and r(C-H) Bond Dissociation Enthalpies of Aliphatic Amines, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9613-9621]에서 가져온 것이다. 아민의 평균 결합 에너지는 아미드의 결합 에너지보다 낮지만, 아미드의 스캐터(1020)는 아민의 스캐터(1010)보다 훨씬 넓다. 결과적으로 두 화학 물질의 실제 결합 에너지가 다를 것이라고 예상하지 못할 것이다.
[00109] 표 1 및 도 11에 그 예가 제공된 기존 실험실 데이터를 기반으로 하여, 화학물질 또는 제조 순서에 기초한 기질에 대한 리간드의 부착 강도를 예측하는 것은 불가능하다. 도 11의 교본 데이터를 기반으로 하여 아민 결합이 아미드 결합보다 약할 것으로 예상할 수 있다.
[00110] 도 12는 본 개시내용의 특정 양태에 따른, 기질에 단백질 리간드를 부착하기 위한 예시적인 화학 반응식이다. 예를 들어, 폴리사카라이드를 포함하는 기질 표면은 산화되어 기질 표면에 포르밀 기를 생성한다. 일차 아민에 노출되면 표면에 쉬프 염기가 생성되는데, 이는 쉽게 가역적이기 때문에 기질에 대한 분리 불가능한 결합으로 적합하지 않다. 소듐 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN 또는 NaCNBH3)에의 후속 노출은 쉬프 염기를 강한 비가역적 2차 아민 결합으로 전환시킨다.
[00111] 도 13은 본 개시내용의 특정 양태에 따른 기질 및 결합 유형의 2개의 조합의 벤치 테스트 침출 속도의 예시적인 비교(1300)를 묘사한다. 컬럼의 왼쪽 세트는 비드에 TNF-알파 리간드를 부착하는 아미드 결합이 있는 아크릴아미드 비드를 사용하여 컬럼으로 취한 측정치이다. 컬럼의 오른쪽 세트는 도 12의 식에 의해 형성된 것과 같이 비드에 TNF-알파 리간드를 부착하는 아민 결합이 있는 아가로스 비드를 사용하여 동일한 컬럼으로부터 취한 측정치이다. "휘스커" 막대는 각 컬럼의 데이터 세트의 다중 측정의 통계적 분산을 나타낸다. 도 11에 의해 제안된 경향과는 반대로, 아민 결합이 침출을 덜 허용한다는 것, 즉 기질에 대한 리간드의 더 강한 부착을 형성하였음을 알 수 있다. 개별 폴리펩티드에 대한 다중 결합이 전체 결합 강도를 증가시킬 수 있다는 것이 본 발명자들의 주의를 끌었고, 상기 폴리펩티드는 기질 표면에 2개 이상의 결합을 분포시켰다. 이 가능성은 전체 용량이 결합된 리간드의 몰량을 아민 결합의 경우 7배(데이터는 표시되지 않음) 초과하고 그에 비해 아미드 결합의 경우 10배 초과하기 때문에 본 예에서 감소된다. 따라서, 각각의 경우 리간드 밀도는 사용 가능한 활성 부위보다 상당한 차이만큼 적다. 두 시스템 간의 차이는 모든 유속에 대해 통계적으로 유의하다(p < 0.05). 침출은 다양한 유속에서 측정되었으며, 이는 결합 유형과 기질의 조합 둘 모두에 대해 더 낮은 유속에서 침출 속도의 뚜렷한 감소를 보여준다.
[00112] 도 14는 본 개시내용의 특정 양태에 따라 두 시스템의 침출을 비교하는 실험 데이터의 플롯(1100)을 묘사한다. sTNF-R을 제거하기 위한 치료는 단일 환자에 대해 6개의 순차적인 세션에서 반복적으로 시행되었으며, 세션 데이터는 시간 순서로 군 Tx1-Tx6으로 표시되었다. 본원에 개시된 바와 같이 컬럼에서 리간드로서 TNF-알파를 사용한 처리, 따라서 유출물 중 scTNF-알파는 침출의 지표이다. 각 세션 동안, 처리된 혈장(컬럼으로부터의 유출물)에서 scTNF-알파의 수준을 30분 간격으로 샘플링하고(처리당 5회) 측정하고 컬럼(1110)으로 플로팅하였다. 군(1120)의 처음 세 세션(Tx1-Tx3)은 아미드 결합으로 기질에 결합된 리간드를 포함하는 컬럼 시스템 A로 수행되었다. Tx1-Tx3 동안 유출물 중 scTNF-알파의 초기 수준(D1)은 마이크로리터당 250-350 피코그램(pg/ml) 범위에 있으며, 후속 수준은 각 처리 과정에 걸쳐 단조로운 방식으로 20-40 mg/pl 범위의 최종 수준으로 감소하는 것을 볼 수 있다. 군(1130)의 세션 Tx4 Tx7은 본원에 기술된 컬럼 시스템 B로 수행되었으며, 여기서 시스템 B는 산화된 표면을 갖는 기질 및 비가역적 2차 아민 결합으로 기질에 결합된 동일한 리간드를 포함하였다. 각 세션 Tx4-Tx7의 유출물 중 scTNF-알파의 5가지 측정값 모두는 20 pg/ml 미만이며, 대부분은 5 pg/ml 미만이다.
[00113] 침출 속도는 혈액 성분이 흡착제를 포함하는 컬럼을 통해 흐를 때 임의의 기간에 걸쳐 기질로부터 해리되는 리간드의 양이다. 침출 속도는 종종 임의의 기간 후 통과하는 컬럼에서 검출된 리간드의 양에 의해 결정된다. 초기 침출 속도는 소정의 유속(예를 들어, 10 ml/분)으로 소정 기간(예를 들어, 1 내지 10분) 동안 리간드가 혈액 생성물과 처음 접촉한 후 측정된 침출 속도이다. 침출 속도는 리간드를 포함하는 컬럼을 포함하는 적합한 성분채집 시스템을 사용하여 측정될 수 있으며, 여기서 환자의 혈액 또는 혈액 성분(예를 들어, 혈장 또는 혈청)이 컬럼을 통해 흐른다. 침출 속도 또는 초기 침출 속도는 적절한 검출 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
[00114] 특정 구현예에서, 흡착제는 기질 표면으로부터의 해리에 저항성인 리간드를 포함한다. 기질로부터 리간드의 해리는 침출 속도 또는 초기 침출 속도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 리간드를 기질에 부착시키는 결합(예를 들어, 아민 결합)을 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드는 리간드를 기질에 부착시키는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 아민 결합에 의해 또는 아민 결합을 포함하는 링커에 의해 기질에 부착되는 리간드는 다른 유형의 결합에 의해 기질에 부착된 리간드보다 해리에 대해 더 저항성이 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 아미드 결합, 이중 결합, 삼중 결합, NC-NO, C-O, C=O, OC=O, OC-N, N-N, N=N, S-S 등 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 결합에 의해 동일한 기질에 부착되는 동일한 리간드에 비해 기질로부터의 해리에 대해 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 저항성이 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 아미드 결합에 의해 또는 아미드 결합을 포함하는 링커에 의해 동일한 기질에 부착된 동일한 리간드를 포함하는 또 다른 리간드에 비해 기질로부터의 해리에 대해 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 저항성이 있다.
[00115] 특정 구현예에서, 본원에 기술된 리간드는 10 ml/min의 유속에서 약 50 pg/ml 미만, 약 10 pg/min 미만, 약 7 pg/ml 미만, 약 5 pg/ml 미만 또는 약 2 pg/ml 미만의 기질로부터의 리간드의 초기 침출 속도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 리간드는 약 1 내지 10분, 1 내지 5분 또는 약 2-3분의 기간 동안 10 ml/분의 유속으로 측정할 경우 약 50 pg/ml 미만, 약 25 pg/ml 미만, 약 20 pg/ml 미만, 약 10 pg/ml 미만 또는 약 5 pg/ml 미만의 기질로부터의 리간드의 초기 침출 속도를 나타낸다.
[00116] 혈액-여과 컬럼의 개시된 예는 환자를 치료하는 맥락에서 혈액으로부터 특정 혈액 성분, 예를 들어 sTNF-R을 제거하여 환자의 면역 체계가 sTNF-R에 의해 마스킹되는 특정 종양을 인식하고 공격할 수 있게 함으로써 제시된다. 리간드, 특히 본 예의 TNF-알파의 침출의 이전의 제한적 부작용은 리간드에 대한 기계적 손상을 방지하기 위해 컬럼 내의 유체 속도를 주의 깊게 제어함으로써 방지된다. 이러한 전래의 위험이 제거됨에 따라 이러한 형태의 성분채집술의 사용은 다른 치료법으로는 다루기 힘든 것으로 입증된 병태를 치료하는 실행 가능하고 안전한 방법이 된다.
[00117] 본 출원은 당업자가 본원에 기재된 다양한 양태를 실시할 수 있도록 제공되는 설명을 포함한다. 전술한 내용은 최선의 방식 및/또는 다른 예라고 간주되는 것을 설명하였으나, 이러한 양태에 대한 다양한 수정이 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 본원에서 정의된 일반적인 원리는 다른 양태에 적용될 수 있음이 이해된다. 개시된 공정에서 단계 또는 블록의 특정 순서 또는 계층 구조는 예시적인 접근법의 예시임이 이해된다. 설계 기본 설정에 따라 공정의 단계 또는 블록의 특정 순서 또는 계층이 재배열될 수 있음이 이해된다. 첨부된 방법 청구는 샘플 순서로 다양한 단계의 요소를 제시하며, 제시된 특정 순서 또는 계층 구조로 제한되지 않는다. 따라서, 청구범위는 본원에 제시된 양태로 제한하려는 것이 아니라 언어 청구범위와 일치하는 전체 범위에 부여되어야 한다.
예시적인 구현예
[00118] 구현예에서, 컬럼은 임의의 단면적을 갖는 구획, 임의의 직경을 갖고 구획 내에 배치된 비드, 및 비드에 커플링되고 성분에 결합하도록 선택되는 리간드를 갖는다. 단면적 및 비드 직경은 구획 내의 유체의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택된다. 리간드는 리간드를 포함하는데, 여기서 리간드는 TNF-알파, 또는 이의 일부 또는 기능적 단편 또는 기능적 변이체, 또는 TNF-알파의 삼량체를 포함할 수 있다. 제1 임계값은 출구로부터 유출되는 유체 중의 리간드의 양을 소정의 수준 미만으로 유지하도록 선택될 수 있다. 제1 임계값은 유체에 의해 리간드에 가해지는 힘을 제2 임계값 아래로 유지하여 리간드의 유체 내로의 침출을 감소시키도록 선택될 수 있다. 리간드는 임의의 강도를 갖는 결합을 포함할 수 있고, 제2 임계값 아래로 힘을 유지하는 것은 결합을 파괴하는 것을 방지할 수 있다. 비드는 아가로스를 포함할 수 있고, 결합은 아민 결합을 포함할 수 있다. 힘은 전단력 및 모멘트 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 제2 임계값은 전단력과 관련된 제3 임계값 및 모멘트와 관련된 제4 임계값 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구획은 입구, 출구 및 입구에서 출구까지의 유동 경로를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 유동 경로는 유체와 리간드 사이의 접촉 시간을 제공하도록 선택될 수 있는 길이를 가질 수 있다. 비드는 복수의 비드를 포함할 수 있다. 리간드는 복수의 비드 각각에 각각 커플링된 리간드의 복수의 부분을 포함할 수 있다. 리간드는 비드에 분리 불가능하게 커플링될 수 있다.
[00119] 한 구현예에서, 방법은 환자로부터 혈액을 받는 단계, 혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계, 성분에 결합하도록 선택되는 리간드에 커플링되는 임의의 직경을 갖는 복수의 비드를 함유하며, 임의의 단면적을 갖는 구획을 통해 혈액 성분 중 하나의 일부를 통과시키는 단계로서, 단면적과 비드 직경이 구획 내부에 혈액 성분의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택되는, 단계, 적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계, 및 혼합된 혈액 성분을 환자에 반환시키는 단계 중 하나 이상을 포함한다. 제1 임계값은 유체에 의해 리간드에 가해지는 힘을 제2 임계값 아래로 유지하도록 선택될 수 있다. 리간드는 임의의 강도를 갖는 결합을 포함할 수 있고, 제2 임계값 아래로 힘을 유지하는 것은 결합을 파괴하는 것을 방지할 수 있다. 힘은 전단력 및 모멘트 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 제2 임계값은 전단력과 관련된 제3 임계값 및 모멘트와 관련된 제4 임계값 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 리간드는 비드에 분리 불가능하게 결합될 수 있다.
[00120] 특정 구현예에서, 리간드는 하나 이상의 링커 또는 링커 요소를 포함한다.
[00121] 링커는 기질의 표면 및 리간드에 공유 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 하나의 탄소(예를 들어, 기질 표면의 탄소) 및 적어도 하나의 질소(예를 들어, 리간드의 질소)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커의 적어도 하나의 탄소는 기질의 표면으로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 링커의 적어도 하나의 탄소는 기질 표면의 포르밀 기로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 링커의 적어도 하나의 질소는 리간드로부터 유도된다. 특정 구현예에서, 링커의 적어도 하나의 질소는 리간드의 일차 아민으로부터 유도된다. 특정 구현예에서, 링커는 적어도 2개의 탄소 및 1개의 질소를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 하나의 탄소 및 하나의 질소를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 기질의 표면으로부터 유도된 탄소를 리간드의 일차 아민으로부터 유도된 질소에 결합시키는 단일 공유 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 산소를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 이중 또는 삼중 결합을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 카르보닐 기를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 황을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 흡착제는 하나 이상의 링커(예를 들어, 복수의 링커)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 하기 나타낸 구조 (I)을 포함한다:
Figure pct00002
(I);
상기 식에서, M은 기질 또는 기질 표면(예를 들어, 아가로스 비드)이고, R은 리간드(예를 들어, scTNFα)이고, R2는 부재하거나, 알킬, 치환된 알킬, 모노사카라이드 또는 CH2이다. 특정 구현예에서, 링커는 구조 M-R2-CH2-NH-R3-R 또는 M-CH2-NH-R을 포함하며, 여기서 M은 기질 또는 기질 표면(예를 들어, 아가로스 비드)이고, R은 리간드(예를 들어, scTNFα)이고, 각각 또는 R2 및 R3은 독립적으로 부재하거나, 알킬 또는 치환된 알킬이다. 일부 구현예에서, (상기 구조 (I)의) M 또는 R2는 모노사카라이드, 폴리사카라이드 또는 셀룰로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 존재하는 경우 R2는 O(산소)가 아니다. 일부 구현예에서, R3은 아미노산 또는 아미노산 측쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 기질 또는 기질 표면은 아민(예를 들어, 2차 아민)에 의해 리간드에 부착된다.
[00122] 한 구현예에서, 흡착제는 기질, 링커 및 리간드를 포함하고, 여기서 링커는 기질 및 리간드에 부착되어 기질을 리간드에 결합시킨다.
[00123] 한 구현예에서, 컬럼은 입자가 구획 내에 배치된 구획을 포함하고, 입자는 기질 및 기질에 결합된 리간드를 포함하고, 리간드는 적어도 2개의 단량체를 포함하며, 이들 각각은 표적 성분에 결합할 부위, 두 단량체 사이의 제1 링커 및 단량체 중 하나와 기질 사이의 제2 링커를 포함한다.
[00124] 한 구현예에서, 방법은 환자로부터 혈액을 받는 단계, 혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계, 적어도 2개의 단량체를 포함하는 리간드에 근접하게 혈액 성분 중 하나의 일부를 통과시키는 단계로서, 단량체 각각은 성분에 커플링할 부위, 두 단량체 사이의 화학 결합에 의해 결합된 제1 링커 및 단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 결합된 제2 링커를 포함하는, 단계, 적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계, 및 혼합된 혈액 성분을 환자에 반환하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[00125] 한 구현예에서, 방법은 기질을 산화시키는 단계, TNF-알파의 일부를 포함하는 리간드와 산화된 기질 사이에 쉬프 염기를 형성하는 단계 및 쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
[00126] 표제 및 소제목은 존재하는 경우, 편의상 사용되며 본 발명을 제한하지 않는다.
[00127] 단수의 요소에 대한 참조는 구체적으로 언급되지 않는 한 "하나 및 단지 하나뿐"을 의미하는 것이 아니라, "하나 이상"을 의미한다. 관사("a" 및 "an")의 사용은 "적어도 하나"라는 문구와 동등한 것으로 해석되어야 한다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "세트" 및 "일부"는 하나 이상을 지칭한다.
[00128] 본 개시내용에서 사용되는 용어 예컨대, "상단", "하단", "상부", "하부", "좌측", "우측", "전방", "후방" 등은 일반적인 중력 기준 프레임이 아니라 임의의 참조 프레임을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상단면, 하단면, 전면 및 후면은 중력 기준 프레임에서 상향, 하향, 대각선 또는 수평으로 연장될 수 있다.
[00129] 남성 대명사(예를 들어, 그의)에는 여성 및 중성 성별(예를 들어, 그녀의 및 이의)이 포함되며 그 반대도 마찬가지이다. 당업자에게 알려지거나 나중에 알려지게 되는, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 다양한 양태의 요소에 대한 모든 구조적 및 기능적 등가물은 명백히 참조로 본원에 포함되며 청구범위에 포함되도록 의도된다. 더욱이, 본원에 개시된 어떠한 것도 그러한 개시가 청구범위에 명시적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 대중에게 헌정되도록 의도되지 않는다. 요소가 "위한 수단"이라는 문구를 사용하여 명시적으로 언급되지 않았거나 방법 청구항의 경우 해당 요소가 "위한 작동"이라는 문구를 사용하여 인용되지 않는 한 어떠한 청구 요소도 35 USC §112, 여섯 번째 단락의 조항에 따라 해석되어서는 안된다.
[00130] "양태"와 같은 문구는 해당 양태가 대상 기술에 필수적이거나 해당 양태가 대상 기술의 모든 구성에 적용된다는 것을 의미하지 않는다. 양태에 관한 개시는 모든 구성 또는 하나 이상의 구성에 적용될 수 있다. 양태와 같은 문구는 하나 이상의 양태를 참조할 수 있으며 그 반대도 마찬가지이다. "구현예"와 같은 문구는 해당 구현예가 대상 기술에 필수적이거나 해당 구현예가 대상 기술의 모든 구성에 적용된다는 것을 의미하지 않는다. 구현예에 관한 개시는 모든 구현예 또는 하나 이상의 구현예에 적용될 수 있다. 구현예와 같은 문구는 하나 이상의 구현예를 참조할 수 있으며 그 반대도 마찬가지이다.
[00131] "예시적인"이라는 단어는 본원에서 "예 또는 예증으로 제공하는 것"을 의미하는 데 사용된다. "예시적인"으로서 본원에 기술된 임의의 양태 또는 설계는 반드시 다른 양태 또는 설계보다 바람직하거나 유리한 것으로 해석되지 않는다.
[00132] 당업자에게 알려지거나 나중에 알려지게 되는, 본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 다양한 양태의 요소에 대한 모든 구조적 및 기능적 등가물은 명백히 참조로 본원에 포함되며, 청구범위에 포함되도록 의도된다. 더욱이, 본원에 개시된 어떠한 것도 그러한 개시가 청구범위에 명시적으로 인용되었는지 여부에 관계없이 대중에게 헌정되도록 의도되지 않는다. 청구요소가 "위한 수단"이라는 문구를 사용하여 명시적으로 언급되지 않았거나 방법 청구항의 경우 해당 요소가 "위한 단계"라는 문구를 사용하여 인용되지 않는 한 어떠한 청구 요소도 35 USC §112, 여섯 번째 단락의 조항에 따라 해석되어서는 안된다. 또한, 설명 또는 청구범위에서 "포함하다(include)", "가지다" 등의 용어가 사용되는 범위까지, 이러한 용어는 용어 "포함하다(comprise)"가 청구범위에서 전형적인 단어로서 사용되는 경우 해석되는 바와 유사한 방식으로 용어 "포함하다"를 포괄적인 것으로 의도된다.
[00133] 본 개시내용의 구현예가 상세하게 설명되고 예시되었지만, 이는 단지 예시 및 예를 위한 것이며 제한적으로 받아들여져서는 안 되며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 명백하게 이해되어야 한다.
추가 구현예
A1. 유체로부터 성분을 제거하기 위한 컬럼으로서, 컬럼은
임의의 단면적을 포함하는 구획;
구획 내에 배치되고 임의의 직경을 갖는 비드; 및
비드에 커플링되고, 성분에 결합되도록 선택되는 리간드를 포함하며;
단면적 및 비드 직경이 구획 내의 유체의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택되는, 컬럼.
A2. 구현예 A1에 있어서, 비드가 복수의 리간드를 포함하는, 컬럼.
A3. 구현예 A2 또는 A2에 있어서, 리간드가 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 일부를 포함하는, 컬럼.
A4. 구현예 A1 내지 A3 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 TNF-알파의 일부의 삼량체를 포함하는, 컬럼.
A5. 구현예 A1 내지 A4 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 임계값이 출구로부터 유출되는 유체 중 리간드의 양을 소정 수준 미만으로 유지하도록 선택되는, 컬럼.
A6. 구현예 A1 내지 A5 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 임계값이 유체에 의해 리간드에 가해지는 힘을 제2 임계값 미만으로 유지하여 리간드의 유체 내로의 침출을 감소시키도록 선택되는, 컬럼.
A7. 구현예 A1 내지 A6 중 어느 한 구현예에 있어서,
리간드가 임의의 강도를 갖는 결합을 포함하고;
제2 임계값 미만으로 힘을 유지시키는 것이 결합 파괴를 방지하는, 컬럼.
A8. 구현예 A1 내지 A7 중 어느 한 구현예에 있어서,
비드가 아가로스를 포함하고;
결합은 아민 결합을 포함하는, 컬럼.
A9. 구현예 A1 내지 A8 중 어느 한 구현예에 있어서,
힘이 전단력 및 모멘트 중 하나 이상을 포함하고;
제2 임계값은 전단력과 관련된 제3 임계값 및 모멘트와 관련된 제4 임계값 중 하나 이상을 포함하는, 컬럼.
A10. 구현예 A1 내지 A9 중 어느 한 구현예에 있어서,
구획이 입구, 출구 및 입구로부터 출구로의 유동 경로를 추가로 포함하고;
유동 경로가 임의의 길이를 가지며;
길이는 유체와 리간드 사이의 접촉 시간을 제공하도록 선택되는, 컬럼.
A11. 구현예 A1 내지 A10 중 어느 한 구현예에 있어서,
비드가 복수의 비드를 포함하고;
리간드는 복수의 비드 각각에 각각 커플링된 리간드의 복수 부분을 포함하는, 컬럼.
A12. 구현예 A1 내지 A11 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 비드에 분리 불가능하게 커플링된, 컬럼.
B1. 환자의 혈액으로부터 표적 성분을 제거하는 방법으로서,
환자로부터 혈액을 받는 단계;
혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계;
혈액 성분 중 하나의 일부를 임의의 단면적을 가지며, 성분에 결합하도록 선택된 리간드가 커플링되고 임의의 직경을 갖는 복수의 비드를 포함하는 구획을 통해 통과시키는 단계로서, 단면적 및 비드 직경이 구획 내의 혈액 성분의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택되는, 단계;
적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계; 및
혼합된 혈액 성분을 환자에게 반환하는 단계를 포함하는, 방법.
B2. 구현예 B1의 방법에 있어서, 제1 임계값이 유체에 의해 리간드에 가해지는 힘을 제2 임계값 미만으로 유지하도록 선택되는, 방법.
B3. 구현예 B1 또는 B2에 있어서,
리간드가 임의의 강도를 갖는 결합을 포함하고;
제2 임계값 미만으로 힘을 유지시키는 것이 결합 파괴를 방지하는, 방법.
B4. 구현예 B1 내지 B3 중 어느 한 구현예에 있어서,
힘이 전단력 및 모멘트 중 하나 이상을 포함하고;
제2 임계값은 전단력과 관련된 제3 임계값 및 모멘트와 관련된 제4 임계값 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
B5. 구현예 B1 내지 B4 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 비드에 분리 불가능하게 커플링된, 방법.
C1. 유체로부터 성분을 제거하기 위한 리간드로서, 리간드는
성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
두 단량체 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제1 링커; 및
단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제2 링커를 포함하는, 리간드.
C2. 구현예 C1에 있어서, 리간드가 3개 및 단지 3개의 단량체를 포함하는, 리간드.
C3. 구현예 C1 또는 C2에 있어서, 리간드가 2개 및 단지 2개의 제1 링커를 포함하는, 리간드.
C4. 구현예 C1 내지 C3 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 1개 및 단지 1개의 제2 링커를 포함하는, 리간드.
C5. 구현예 C1 내지 C4 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 링커가 아민 결합을 포함하는, 리간드.
C6. 구현예 C1 내지 C5 중 어느 한 구현예에 있어서, 단량체가 사이토카인 수용체에 결합할 부위를 포함하는, 리간드.
C7. 구현예 C1 내지 C4 중 어느 한 구현예에 있어서, 단량체가 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)를 포함하는, 리간드.
D1. 유체로부터 성분을 제거하는 데 사용하기 위한 비드로서, 비드가
기질; 및
기질에 커플링된 리간드로서, 리간드가
성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
2개 단량체 사이에 커플링된 제1 링커; 및
단량체 중 하나에 커플링되고 화학적 결합에 의해 기질에 커플링되는 제2 링커를 포함하는 리간드를 포함하는, 비드.
D2. 구현예 D1에 있어서, 기질이 부분적으로 산화되는, 비드.
D3. 구현예 D1 또는 D2에 있어서, 기질이 폴리사카라이드를 포함하는, 비드.
D4. 구현예 D1 내지 D3 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 링커의 화학 결합이 아민 결합을 포함하는, 비드.
E1. 유체로부터 성분을 제거하는 데 사용하기 위한 컬럼으로서, 컬럼이
구획;
구획 내에 배치된 비드를 포함하며, 비드는
기질; 및
기질에 커플링된 리간드로서, 리간드가
성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
2개의 단량체 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제1 링커; 및
단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제2 링커를 포함하는, 리간드를 포함하는, 컬럼.
F1. 환자의 혈액으로부터 표적 성분을 제거하는 방법으로서,
환자로부터 혈액을 받는 단계;
혈액을 적어도 2개의 혈액 성분으로 분리하는 단계;
리간드에 근접하게 혈액 성분 중 하나의 일부를 통과시키는 단계로서, 리간드는
성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
두 단량체 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제1 링커; 및
단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제2 링커를 포함하는, 단계;
적어도 2개의 혈액 성분을 함께 혼합하는 단계; 및
혼합된 혈액 성분을 환자에게 반환하는 단계를 포함하는, 방법.
G1. 성분채집 입자를 제조하는 방법으로서,
기질을 산화시키는 단계;
종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 일부를 포함하는 리간드와 산화된 기질 사이에 쉬프 염기를 형성하는 단계; 및
쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계를 포함하는, 방법.
G2. 구현예 G1에 있어서, 기질을 산화시키는 단계가 기질을 무기 염에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
G3. 구현예 G2에 있어서, 무기 염이 소듐 메타퍼아이오데이트를 포함하는, 방법.
G4. 구현예 G1 내지 G3 중 어느 한 구현예에 있어서, 쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계가 기질을 환원제에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
G5. 구현예 G1 내지 G4 중 어느 한 구현예에 있어서, 환원제가 소듐 시아노보로하이드라이드를 포함하는, 방법.
H1. 대상체의 혈액으로부터 표적 성분을 제거하기 위한 흡착제로서, 흡착제가
표면을 포함하는 기질;
아민 결합을 포함하는 링커; 및
TNFα를 포함하는 리간드를 포함하며;
링커는 기질 및 리간드에 부착되는, 흡착제.
H2. 구현예 H1에 있어서, 흡착제가 하기 구조 (I)을 포함하는, 흡착제:
Figure pct00003
(I)
상기 식에서, M은 기질이고, R은 리간드이고, 링커는 -R2-CH2-NH이고, 여기서 R2는 부재하거나, 알킬 또는 치환된 알킬이다.
H3. 구현예 H2에 있어서, R2가 CH2인, 흡착제.
H4. 구현예 H1 내지 H3 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 복수의 리간드를 포함하는, 흡착제.
H5. 구현예 H1 내지 H4 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 입자 또는 비드를 포함하는, 흡착제.
H6. 구현예 H1 내지 H5 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 폴리사카라이드를 포함하는, 흡착제.
H7. 구현예 H1 내지 H6 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 셀룰로스를 포함하는, 흡착제.
H8. 구현예 H1 내지 H7 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 약 60-200 μm 범위의 평균(mean), 평균(average) 또는 절대 직경을 갖는, 흡착제.
H9. 구현예 H1 내지 H8 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 약 45-165 μm 범위의 평균, 평균 또는 절대 직경을 갖는, 흡착제.
H10. 구현예 H1 내지 H9 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질이 다공성인, 흡착제.
H11. 구현예 H1 내지 H10 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 TNF 수퍼패밀리 리간드의 적어도 3개의 단량체를 포함하는 삼량체를 포함하는, 흡착제.
H12. 구현예 H11에 있어서, 3개의 단량체 중 적어도 2개가 동일한, 흡착제.
H13. 구현예 H1 내지 H12 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 단일 사슬 TNFα를 포함하는, 흡착제.
H14. 구현예 H1 내지 H13 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커의 N이 리간드의 일차 아민으로부터 유도되는, 흡착제.
H15. 구현예 H1 내지 H14 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커의 CH2가 기질로부터 유도되는, 흡착제.
H16. 구현예 H1 내지 H15 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드 대 기질의 비가 적어도 50:1인, 흡착제.
H17. 구현예 H1 내지 H11 중 어느 한 구현예에 있어서, 리간드가 아미드 결합, 이중 결합, 삼중 결합, NC-NO, C-O, C=O, OC=O, OC-N, N-N, N=N 및 S-S로부터 선택되는 결합에 의해 제2 기질에 부착되는 제2 리간드에 비해 기질로부터의 해리에 대해 적어도 2배, 적어도 5배 또는 적어도 10배 더 저항성인, 흡착제.
H18. 구현예 H1 내지 H17 중 어느 한 구현예에 있어서, 기질로부터의 리간드의 초기 침출 속도가 10 ml/분의 유속에서 약 10 ng/분 미만 또는 약 5 ng/분 미만인, 흡착제.
H19. 구현예 H1 내지 H18 중 어느 한 구현예에 있어서, 기재로부터 리간드의 초기 침출 속도가 약 2분의 기간 동안 10 ml/min의 유속으로 측정할 경우 약 50 pg/ml 미만, 약 25 pg/ml 미만, 약 20 pg/ml 미만, 약 10pg/ml 또는 약 5 pg/ml 미만인, 흡착제.
I1. 구현예 H1 내지 H19 중 어느 하나의 흡착제를 제조하는 방법으로서, 리간드 및 기질 표편을 포함하는 혼합물을 소듐 시아노보로하이드라이드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 리간드는 적어도 하나의 일차 아민을 포함하고, 기질 표면은 적어도 하나의 알데하이드 모이어티를 포함하여, 구현예 H1-H19 중 어느 하나의 흡착제를 생성하는, 방법.
I2. 구현예 I1에 있어서, 접촉하기 전에 기질 표면을 산화시켜 적어도 하나의 알데하이드 모이어티를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
J1. 대상체의 혈액으로부터 TNF 수용체를 제거하기 위한 흡착제로서, 흡착제가
기질 표면을 포함하는 기질; 및
단일 사슬 TNFα를 포함하는 리간드를 포함하며;
여기서 기질 표면은 아민 결합에 의해 단일 사슬 TNFα에 부착되는, 흡착제.
J2. 구현예 J1에 있어서, 아민 결합이 2차 아민 결합인, 흡착제.
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNICOM, INC. JOSEPHS, Steven JAFRI, Amir RAPTIS, Mark <120> REDUCED LEACHING OF A LIGAND <130> 022947-0515514 <140> To Be Assigned <141> Herewith <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala 1 5 10 15 Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn 20 25 30 Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val 35 40 45 Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly 50 55 60 Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys 85 90 95 Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp 100 105 110 Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 115 120 125 Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu 130 135 140 Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 2 <211> 509 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trimeric peptide <400> 2 Met Cys Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 20 25 30 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 35 40 45 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 65 70 75 80 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 85 90 95 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 100 105 110 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 115 120 125 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 130 135 140 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp 180 185 190 Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu 195 200 205 Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 210 215 220 Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val 245 250 255 Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys 260 265 270 Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro 275 280 285 Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly 290 295 300 Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg 305 310 315 320 Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile 325 330 335 Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 355 360 365 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 370 375 380 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 385 390 395 400 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 405 410 415 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 420 425 430 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 435 440 445 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 450 455 460 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 465 470 475 480 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 485 490 495 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 500 505 <210> 3 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trimeric peptide <400> 3 Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala 1 5 10 15 His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn 20 25 30 Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn 35 40 45 Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val 50 55 60 Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His 65 70 75 80 Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu 100 105 110 Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu 115 120 125 Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu 130 135 140 Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 180 185 190 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 195 200 205 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 210 215 220 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 225 230 235 240 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 245 250 255 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 260 265 270 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 275 280 285 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 290 295 300 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 305 310 315 320 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp 340 345 350 Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu 355 360 365 Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 370 375 380 Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile 385 390 395 400 Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val 405 410 415 Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys 420 425 430 Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro 435 440 445 Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly 450 455 460 Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg 465 470 475 480 Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile 485 490 495 Ile Ala Leu

Claims (25)

  1. 유체로부터 성분을 제거하기 위한 컬럼으로서, 컬럼은
    임의의 단면적을 포함하는 구획;
    구획 내에 배치되고, 임의의 직경을 갖는 비드; 및
    비드에 커플링되고, 성분에 결합하도록 선택된 리간드를 포함하며;
    단면적 및 비드 직경은 구획 내의 유체의 유동 속도를 제1 임계값 미만으로 유지하도록 선택되는, 컬럼.
  2. 제1항에 있어서, 비드가 복수의 리간드를 포함하는, 컬럼.
  3. 제2항에 있어서, 리간드가 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 일부를 포함하는, 컬럼.
  4. 제3항에 있어서, 리간드가 TNF-알파의 일부의 삼량체를 포함하는, 컬럼.
  5. 제1항에 있어서, 제1 임계값이 출구로부터 유출되는 유체 중의 리간드의 양을 소정의 수준 미만으로 유지하도록 선택되는, 컬럼.
  6. 제1항에 있어서, 제1 임계값이 유체에 의해 리간드에 가해지는 힘을 제2 임계값 미만으로 유지하여 유체 내로의 리간드의 침출을 감소시키도록 선택되는, 컬럼.
  7. 제6항에 있어서,
    리간드가 임의의 강도를 갖는 결합을 포함하고;
    제2 임계값 미만으로의 힘을 유지하는 것이 결합 파괴를 방지하는 것인, 컬럼.
  8. 제7항에 있어서,
    비드가 아가로스를 포함하고;
    결합은 아민 결합을 포함하는, 컬럼.
  9. 제6항에 있어서,
    힘이 전단력 및 모멘트 중 하나 이상을 포함하고;
    제2 임계값은 전단력과 관련된 제3 임계값 및 모멘트와 관련된 제4 임계값 중 하나 이상을 포함하는, 컬럼.
  10. 제1항에 있어서,
    구획이 입구, 출구 및 입구로부터 출구로의 유동 경로를 추가로 포함하고;
    유동 경로는 임의의 길이를 가지며;
    길이는 유체와 리간드 사이의 접촉 시간을 제공하도록 선택되는, 컬럼.
  11. 제1항에 있어서,
    비드가 복수의 비드를 포함하고;
    리간드는 복수의 비드 각각에 각각 커플링된 리간드의 복수의 부분을 포함하는, 컬럼.
  12. 제1항에 있어서, 리간드가 비드에 탈착 불가능하게 커플링되는, 컬럼.
  13. 유체로부터 성분을 제거하기 위한 리간드로서, 리간드가
    성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
    두 단량체 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제1 링커; 및
    단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제2 링커를 포함하는, 리간드.
  14. 제13항에 있어서, 리간드가 3개 및 단지 3개의 단량체를 포함하는, 리간드.
  15. 제13항에 있어서, 리간드가 2개 및 단지 2개의 제1 링커를 포함하는, 리간드.
  16. 제13항에 있어서, 리간드가 하나 및 단지 하나의 제2 링커를 포함하는, 리간드.
  17. 제16항에 있어서, 제2 링커가 아민 결합을 포함하는, 리간드.
  18. 제13항에 있어서, 단량체가 사이토카인 수용체에 결합할 부위를 포함하는, 리간드.
  19. 제13항에 있어서, 단량체가 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)를 포함하는, 리간드.
  20. 유체로부터 성분을 제거하는 데 사용하기 위한 컬럼으로서, 컬럼이
    구획;
    구획 내에 배치된 비드를 포함하며, 비드는
    기질; 및
    기질에 커플링된 리간드로서, 리간드가
    성분에 커플링될 부위를 각각 포함하는 적어도 2개의 단량체;
    두 단량체 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제1 링커; 및
    단량체 중 하나와 기질 사이의 화학 결합에 의해 커플링된 제2 링커를 포함하는, 리간드를 포함하는, 컬럼.
  21. 성분채집 입자를 제조하는 방법으로서,
    기질을 산화시키는 단계;
    종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 일부를 포함하는 리간드와 산화된 기질 사이에 쉬프 염기(Schiff base)를 형성하는 단계; 및
    쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 기질을 산화시키는 단계가 기질을 무기 염에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 무기 염이 소듐 메타퍼아이오데이트를 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 쉬프 염기를 2차 아민 결합으로 전환시키는 단계가 기질을 환원제에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 환원제가 소듐 시아노보로하이드라이드를 포함하는, 방법.
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