CN1035193C - 一种制备重组链激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

一种重组链激酶的制备方法，现有技术的基因构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复杂。本发明方法用PCR扩增链激酶基因，与原核表达载体如PLY-4组装成表达质粒PSTE-SK-1，转化大肠杆菌后用温度诱导r-SK基因表达。工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二步法纯化r-SK。本方法所得产品的产量和纯度都很高，成本低。

Description

一种制备重组链激酶的方法
本发明属生物技术方法。
目前特效溶栓药物有人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)，链激酶(SK)，苯甲氧酰纤溶酶原激活剂链激酶复合物(APSAC)等。1993年9月美国Brigharm and Women′s医院，Ridker教授等总结了10万例急性心肌梗塞的溶栓治疗，其结果显示上述各类溶栓药物的药效和副反应无明显差别。rt-PA价格昂贵，每剂2300美元，SK价格比rt-PA低10倍，而且栓塞复发率低，使用较简便。
目前国外各公司用致病性溶血性链球菌作生产菌株，需要顾及环境及工人安全，去除引起低血压，发热等副反应的毒素，以及溶血栓链球菌SK产量低不易纯化等原因，使工艺及设备复杂，成本高，价格贵。80年代初Ferrtti J.J.等从溶血性链球菌噬菌体分离到SK基因，并在大肠杆菌中进行表达，但表达水平很低，只有数百单位/ml菌液，未形成基因工程产品。 1986年和1981年美国和日本的同一专利中SK基因分离与Ferrtti J.J.相同，但表达载体和培养条件不同，在大肠感菌中的表达水平为60～274ug/ml菌液，即6420～29300单位/ml菌液，无纯品得率等数据，也未见形成基因工程产品，1992年古巴HerrenaL.研制了重组链激酶，但其基因构建过程繁琐，在大肠杆菌中的表达水平低，纯化方法复杂，而且纤溶酶原亲和吸附剂等原材料价格昂贵，其产物纯度和得率低，成本高。
本发明的目的为克服现有技术中不安全、成本高的缺点，发明一种用生物高技术制备重组链激酶的方法，使制备过程安全、产品的得率和纯度都很高而成本低。
本发明采用下述技术方案：
(1)从人体口腔分离溶血性链球菌，从培养液中提纯链激酶，测定N末端和C末端5个氨基酸顺序作设计引物的参考。用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体例如含PL，PR启动子，CIT857基因以及5SRNA终止信号等调控元件的PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-l；
(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌，用温度诱导r-SK基因的表达，SDS-PAGE证实表达产物r-SK分子量为43000，以包涵体形成存在于工程菌内，占菌体蛋白的65％以上，工程菌命名PSTE-SK-1；
(3)通过发酵技术扩增工程菌，用M9CAA作基础培养液，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等补液料，发酵参数为温度30-42℃，氧溶量为50-80％，pH6-8，发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。
用本发明方法，每升发酵液得湿菌20克左右，r-SK产品纯度达97-99％，比活性10万IU/mg，纯品产量每升发酵液得600毫克。
纯品r-SK溶液中加入人血清白蛋白，谷氨酸钠以及磷酸盐等稳定剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成白粉状成品。注射用水溶解后应用，以治疗急性心肌梗塞等血栓性疾病为主要用途。
治疗实验性狗心肌梗塞，兔股动脉血栓症(0.3mg/kg)等均在30-60min后血栓溶解，血管再通。治疗兔眼内积血时(10-20u/眼)，24小时后积血消失。治疗兔眼内出血时，数小时后渗出物消失。
本发明运用重组DNA技术，在非致病性大肠杆菌中高效表达r-SK，方法安全，不给环境和操作人员带来任何危害，由于其高效表达和纯化方法简单，使产品的纯度和产量都很高，因此大大降低了r-SK的生产成本及其价格，下表是古巴Herrena L和本发明方法的对照。
      古巴Herrena L                  本发明表达水平占大肠杆菌菌体蛋白25％         65％以上纯化方法纤溶酶原-Sepharose亲和         离子交换，凝胶过滤
      层析，离子交换，凝胶过滤等纯度    比活性5.2万IU/mg               10万IU/mg
      SDS-PAGE显示r-SK               98～99％
      占95％                         500～600mg/L发酵液纯品得率r-SK 50mg/L发酵液
实施例(一)：
1、用PCR扩增链激酶基因。
从医院化验室收集溶血性链球菌60株，经筛选，大量培养分泌SK最多的细菌(NO.8)，并从培液提纯SK，然后用氨基酸顺序分析仪和手工分别测定N和C末端5个氨基顺序。按链激酶N端C端各5个氨基酸顺序设计PCR核苷酸引物的顺序，用固相磷酸三酯法藉DNA合成仪合成这两个引物，纯化后用于PCR扩增链激酶基因。两个PCR引物的5’末端分别有限制性内切酶识别顺序。
按FrederickM.Ausubel et al方法制备NO.8链球菌的大分子DNA，使A260/A280比值＞2.0。
PCR反应体系和条件如下：
反应体系：5×PCR缓冲液       20ul
          ddH2O             64ul
          模板DNA            3Ul(lug)
          引物I              1ul(50pmoles)
          引物II             1ul(50pmoles)
          dNTP               10ul(2mM)
          TagDNA聚合酶       1ul(2.5U)
变性温度90℃ 60秒，延伸温度72℃ 120秒，退火52℃ 60秒，15个循环后再加2.5UTag酶，继续进行15个循环。取反应物2ul，用琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，观察到1.3Kb单一条带，符合完整的链激酶基因的长度。反应物经内切酶水解，琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示链激酶基因中特征性的内切酶位点。
2、链激酶基因克隆的构建和DNA顺序分析：
上述PCR反应产物和pUC19质粒各经相同两个内切酶完全水解后加入T4 DNA连接酶反应体系，室温放置1小时，转化大肠杆菌JM83，用氨苄青霉素-LB平板在37℃温箱中筛选培养。
取单个菌落制备质粒，分别用数个内切酶水解质粒，琼脂糖电泳鉴定，呈现SK基因特征性条带者命名质粒(pST-1)。
pST-1质粒核苷酸顺序分析：因SK基因中含有Hind III切点，故首先构建770bp和570bp片段两个亚克隆，然后进行核苷酸顺序分析，肯定链激酶基因的核苷酸顺序和阅读框架。
3、链激酶基因克隆在大肠杆菌中的表达：
表达质粒pSTE的构建：
用限制性内切酶水解pST-1质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收1.3Kb SK基因，然后与原核表达质载体(含PL、PR启动子，CIt857阻抑蛋白基因和5s RNA t1t2终止信号等调控元件)重组。连接反应物用磷酸钙方法转化大肠杆菌K802，经氨苄青霉素筛选培养。挑选单个菌落，制备质粒，用限制性内切酶片段长度鉴定，含SK基因特征性片段者，称为pSTE-1表达质粒，含pSTE-1表达质粒的细菌称为工程菌PSTE-1。
4、PSTE-1在大肠杆菌中的表达和表达产物的鉴定：
挑取pSTE-1单个菌落，在LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，用培液1∶50稀释后，在摇瓶中30℃培养至A600～0.6，3分钟内升温至42℃，继续培养3-4小时，离心收集细菌，用PBS(pH7)洗一次，保存于-20℃或立刻作表达产物的鉴定和纯化。
5、表达产物的鉴定：
SPS-PAGE-
用硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物的分子量和表达水平，以及纤溶活性。
样品溶解液：含0.0625M Trig-HCl(pH6.7)，2％SDS，10％甘油，5％硫基乙醇，0.001％溴酚兰。
样品处理和点样：1ml诱导培养后菌液离心后沉淀悬于100ul样品溶解液，置沸小浴中5分钟，使沉淀溶解。层析峰的样品用等体积2倍浓度样品溶解液混合后再加热处理，点样量各为20ug，对照细菌或诱导前细菌的样品用同样方法培养，用同样条件处理样品。
凝胶染色：考马氏亮兰。
表达水平：凝胶中蛋白质的染色条带用岛津CS-910双波长扫描仪作黑度扫描，计算机处理，打印r-SK峰所占百分比。
结果点样为42℃诱导细菌SDS裂解液在分子量相当于43000处有非常浓集的条带，点样为诱导前细菌的裂解液的在相同部位几乎不见条带。扫描结果表明r-SK占菌体总蛋白的65％以上。
表达产物纤溶活性的鉴定——凝胶板用Triton X-100和生理盐水洗去SDS后，覆盖于含纤维蛋白、纤溶酶原和琼脂糖的凝胶上，37℃保温数小时后，只有温度诱导菌裂解液在43000分子量处有十分清彻透亮带，即此部位纤维蛋白已经溶解，表明43000分子量部位蛋白质具有纤溶活性。
表达产物在菌体内存在状态——菌体用超声波和高压匀浆泵破膜。离心后，将含同样蛋白量的上清和沉淀分别点样，进行SDS-PAGE，结果显示，点样为沉淀溶解物的行内，在分子量为43000处染色条带很深，而点样为上清液的行内在同样部位，几乎未见染色，表明r-SK表达产物形成了包涵体。
比活性测定——用纤维蛋白凝胶板方法，发色底物法或纤维蛋白凝块溶解法测定r-SK活性，用Lowry比色法测蛋白质含量，比活性＝单位体积样品内r-SK活性单位/单位体积样品中蛋白质含量(mg)。
6、工程菌的发酵：
摇瓶发酵——PSTE-1单个菌落接种于LB-Amp培液，30℃培养过夜，次日用改良M9培养液1∶50稀释，30℃充分振摇培养至A600～0.6，数分钟内升温至诱导温度，继续培养3小时。菌液用已知空重的离心管，5000r.p.m.，4℃离心10min，弃上清，菌块用PBS(pH7.4)洗涤一次，称重，计算菌块湿重，保存于-20℃。
NBS BIO FIII罐发酵——PSTE-1单个菌落在100ml LB-Amp培液中30℃培养过夜，测A600，作为种子液，供发酵用。
Bio FIII罐水蒸汽(120℃，15磅)消毒30分钟，冷却后，安放至操作台，设定温度30℃，pH6-7，溶氧量50-80％，搅拌速度225-800次/分(搅拌速度随氧含量而变速)，各项参数稳定后，按1∶50体积比接种PSTE-1菌液(A600＝1-2)。
在维持上述参数的条件下发酵，待A600达0.6左右时，数分钟内升温至诱导温度继续发酵3小时，自动调节pH6-8左右，努力使氧含量不低于50-80％。
发酵结束后，菌液经离心后保存或作二级发酵用。
7、Rotofor等电聚焦—凝胶过滤方法提纯r-SK：适用于少量制备r-SK：
1、取工程菌4gm悬于低渗缓冲液(0.05M pH7.8Tris-HCl，0.02M EDTA，溶菌酶0.5mg/ml)25ml，室温搅拌60分钟，加Triton X-100至2％，NaCl至0.5M，放置一定时间后，用匀浆器破碎细菌，8000r.p.m.10℃离心60分钟沉淀，用20ml缓冲液(0.05MpH7.8 Tris-HCl，0.02M EDTA)洗涤三次，收集沉淀，悬于20mlH2O，并对H2O透析过夜，透析物中加尿素至终浓度达4M，使包涵体溶解。
2、Rotofor等电聚焦分离r-SK及r-SK的复性：
取上述包涵体溶解液49ml，加Ampholine(pH3-10)1ml，用Rotofor等电聚焦仪12W 4℃聚焦4小时后，从各段溶液取样作SDS-PAGE分析，合并含SK各段溶液，对0.05M pH7.4 PBS，0.02MEDTA透析去除尿素，再用氨基酸—助溶缓冲液稀释，4℃，复性72小时.经8000r.p.m.离心，收集上清进行超滤浓缩。
3、凝胶过滤及灭菌过滤：
取上述经超滤的浓缩液加样于Sephacryl S-200(用助溶缓冲液充分平衡)离子交换柱，流速1ml/min，分步收集，以ECONO低压液相层析仪检测蛋白峰，用SDS-PAGE、r-SK活性和蛋白含量测定，分析和收集含r-SK部分，最后经0.2u微孔膜过滤灭菌后分装并冻干。
纯化过程中各步产物的蛋白质含量、r-SK活性、比活性、提纯倍数和回收率总结于：
  蛋白含量(mg)  r-SK总活性(106)    比活性(Iu mg) 纯化倍数 活性回收数(％)
      湿菌       -     7.8     540      -     100
     包涵体      101     5.6     5500     10.1     72
   Rotofor纯化      46     4.4     95000     175     57
  SephadexG-100      32     3.2     100000     185     41
实施例(二)：
1、工程菌的保存
建立种子库和种子批，保存于专用的-70℃深低温冰箱中
定期检查质粒的内切酶谱和r-SAK的表达水平是否维持在65％以上：
2、工程菌培养
培养基
LB+Amp平板：
Veast Extract  5G    Tryptone    10G
NaCI           5G    Agar        10G
H20   1000ml
高压蒸汽灭菌1kg/cm220分钟，冷却后加氨苄青霉素100ug/mlLB培液：除不加Agar和Amp外，其余同上。
从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，划LB平板(含氨苄青霉素100mg/ml)，30℃培养过夜，从平板上挑取单菌落，接种于LB培养液中，30℃振摇过夜，此为一级种子液，再将一级种子液以1∶10接种LB培养基中，30℃培养3-4小时，此为二级种子液。
3、发酵
发酵罐(5L或10L)灭菌后，放出罐中的H2O，换入培养液，校正和设置各种参数.取出二级种子菌，以1∶10接种于发酵罐内，通入空气，进行发酵。
发酵过程中保持以下条件：温度：30℃，pH：6-8，DO：50-80％，搅拌速度：以DO为主自动控制，每小时取出5ml菌液检测。
细菌密度(OD600)和Glucose浓度
用氨水调节发酵液酸碱度，保持pH6-8，泡沫多时，加入除泡剂。
诱导升温前后补充酪蛋白水解液，葡萄糖和多种微量元素。
诱导培养3-4小时后，OD600达到15以上时，停止发酵，从发酵罐中放出菌液，离心分离细菌并称重，多得细菌立即进行破菌，分离包涵体，或将细菌冻存于-70℃。
4、细菌破碎
破菌：湿菌悬浮于缓冲液中，加入到高压匀浆泵中，用适当压力爆裂细菌。
质控指标：用显微镜检查细菌破碎后：检查方法：将匀浆前的细菌悬浮液，经适当稀释后均匀图片，革兰氏染色，镜检4个视野的细菌数(A)，打匀浆后的悬液，同样稀释后，均匀图片，观察4个视野未破碎细菌数(B)。
细菌破碎率％＝(A-B)/A×100
细菌破碎率达95％以上后，离心收集沉淀，即粗制包涵体，粗包涵体中r-SK占菌体总蛋白75-85％以上。
5、包涵体纯化
粗提包涵体用洗涤法纯化，使r-SK占菌体总蛋白的90％左右。
6、r-SK的溶解和复性
纯化后的包涵体用6M盐酸胍溶解，10000rmp离心30分钟，留取上清。对PB透析多次，20000rmp离心30分钟，留上清，此时r-SK占菌体蛋白95％左右，比活性在6.5万IU/mg以上，r-SK得率65％左右。
7、纯化
离子交换层析：用Waters650或Econo层析系统检测。阴离子交换柱用PB平衡，将复性后的r-SK溶液过柱，流速：1.0ml/min，然后用PB洗柱，用线性盐酸梯度和线性pH梯度的PB洗脱r-SK，流速：4.0ml/min，收集第一个洗脱峰(r-SK)。
SDS-PAGE分析，r-SK纯度应达到94％。比活性：8.0IU/mg以上。r-SK得率：＞55％，蛋白浓度7mg/ml。
凝胶过滤：凝胶，用无热源、无菌、无离子水溶涨，高压消毒，装柱，PB平衡，样品经过0.22U的滤器过滤后上样，用PB洗脱，流速：5.0ml/min。纤维蛋白凝胶溶解法测定r-SK活性，合并活性峰各管。此时产物比活性10万IU/mg左右，每L发酵液得纯品600mg左右，纯度97-99％。 r-SK得率：40-50％。
8、无菌过滤、分装、冻干：
根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂
r-SK    500,000IU
磷酸盐Na2HPO4 1.33mg Nall2PO4 0.31mg  150万IU/瓶
谷氨酸钠(注射用)    30mg/瓶
人血清白蛋白    13mg/瓶
以上原料必须符合注射用药的要求
无菌过滤：在洁净度达到100级的条件下，用0.22μ无菌过滤器过滤。
用分装机分装，每瓶含50万或150万IU。
分装好的样品，置入冻干机内冻干并在冻干机内自动加瓶塞，然后加铝盖，贴标签，装箱。
保存于8-12℃冰箱。
用血管造影术证明r-SK治疗狗股动脉血栓和狗冠状动脉血栓有显著疗效。
附图说明：
图一是链激酶基因表达质粒构建图
图二是链激酶基因的核酸顺序

Claims (1)

1、一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化，其物征在于：(1)从人口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定其N末端和C末端氨基酸顺序作设计PCR引物的参考，用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与含有PL、PR启动子、CIT857基因以及5SRNA终止信号的原核表达载体PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1；(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌K802(ATCC33526)，用温度诱导r-SK基因的表达，表达产物以包涵体形式存在于工程菌内；(3)通过发酵技术扩增工程菌，用温度诱导基因表达，发酵参数为温度28℃-42℃，氧溶量为50％-80％，pH6-8；(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤、离子交换二步法纯化产品。(5)构建的链激酶因的核苷酸顺序如下：
ATG AAA AAT TAC TTA TCT TIT GGG ATG TTT GCA CTG CTG TTT GCA TTA ACA TTT GGA
Met Lys Asn Tyr Leu Ser Phe Gly Met Phe Ala Leu Leu Phe Ala Leu Thr Phe Gly
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