CN1680430A - 人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法和应用。本发明基于蛋白质分子之间相互作用的关键表位理论，根据链激酶和葡激酶的溶栓作用机制，通过噬菌体随机多肽库表面展示技术，以人纤溶酶原为靶蛋白，经生物淘洗，筛选得到与μPg具有高亲和力的多肽序列；固相合成上述模拟肽，所得多肽除了具有溶栓功能外，还具有分子量小，免疫原性低等特性，能防治血栓形成，易于制备口服制剂，适宜作为预防用药使用。并且制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性于基因工程产品相比更易于控制。

Description

人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法和应用。

背景技术

血栓栓塞性疾病严重威胁人类健康，是造成死亡和病残的主要原因之一。血栓的形成减少或阻断组织血供，导致组织局部缺氧、细胞坏死和组织功能丧失。溶栓药物溶解血栓，使血管再通，恢复组织血供，减少细胞死亡，缩小梗塞面积，维持组织功能，降低早期和后期死亡率。溶栓疗法是治疗血栓栓塞性疾病的重要手段。

溶栓药物多为纤溶酶原激活物，能激活血浆中的Pg转变成Pm，Pm催化血栓主要基质纤维蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。目前临床上正式批准的纤溶酶原激活剂类药物主要有t-PA，SK，UK，APSAC，r-PA等。现有的溶栓剂具有教肯定的疗效，可明显降低AMI患者的死亡率和致残率。但是，尚存在若干缺陷：UK，SK是非纤维蛋白特异性溶栓剂；t-PA，scu-PA临床应用时需要大剂量；存在初始再灌注延迟或失败，再通不完全，出血，再栓等问题；SAK虽然是纤维蛋白特异性溶栓剂，但是免疫原性较强，影响其临床使用的安全性；此外，目前的溶栓药物都不宜作为血栓疾病的预防药物使用。

近年来，基于结构的合理设计与基于功能的筛选进行生物大分子模拟肽研究倍受重视，并已取得令人鼓舞的成果。如美国加州Affymax研究所Dower WJ领导的小组应用随机肽库亲和筛选的方法，成功地将EPO(分子量34kD，166a.a.)缩小为20个残基的环肽，仍具有EPO的活性(Johnson et al.，1998；Livnah et al.，1996；Wrighton et al.，1996)。比利时Collen D小组应用随机肽库研究了Sak突变体与Plg之间的相互作用(Jespers et al.，1999)，但国际上迄今未见从模拟肽水平研究两者作用的报道。另一方面，许多蛋白酶由于参予生物体内多种生理、病理过程，成为疾病研究和治疗的靶点，结合噬菌体随机肽库，可以找到与某一特定蛋白酶相作用的多肽类配体，进而研究其作用机制，为新药的研制提供先导化合物或直接作为抑制剂进入临床前研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有防栓溶栓功能、低免疫原性的新型人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法。本发明的另一目的是提供所述模拟肽在制备防止血栓形成药物中应用。

本发明采用噬菌体表面展示的随机肽库筛选和设计新型人纤溶酶原激活剂模拟肽(Thrombolytic Peptidomimetics of SK/SAK，)，所得多肽是模拟链激酶和葡激酶(SK/SAK)功能的溶栓多肽溶栓作用机制的具有溶栓功能的长度为30个残基内的序列，其核心具备序列1的结构：

“His-Ser-Ala-Asn-Gln-His-His-Lys-His-His-His-Pro-His-Phe-Gly-Gly”或序列2的结构“Ser-Ala-Cys-Ser-Pro-Asp-Ala-Ser-Arg-Leu-Cys-Gly-Gly”。采用化学多肽合成方法生产，经实验证实，所得多肽(30个残基以内)除了具有溶栓功能外，还具有分子量小，免疫原性低等新特性，能防治血栓形成，易于制备口服制剂，适宜作为预防用药使用。并且制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性于基因工程产品相比更易于控制。

本发明的技术方案通过下述方法和步骤进行：

1)选择靶蛋白

人微纤溶酶原(μPg)由人的纤溶酶原Pg羧基端261个氨基酸残基组成，含有Pg的丝氨酸蛋白酶活性区，因此当μPg被去酶原化而转变为人微纤溶酶μPm后，仍然保留了Pm水解纤维蛋白，溶解血栓的活性。选择μPg作为随机肽库筛选的靶蛋白，是由于和Pg全长分子相比，μPg的结构更简单，功能更确定，而全长的Pg分子含有诸如Kringle1～5区等其他结构域，部分区域柔性太大，导致构象不够稳定，不利于用肽库进行筛选。

所述的靶蛋白包括μPg/μPm、全长的Pg/Pm及其各个结构功能域，

采用毕赤酵母表达系统(Pichia Pastories)高效表达并纯化得到人纤溶酶原。

2)生物淘洗筛选

将μPg包被96孔板或其他固相支持材料，于4℃、润湿环境中包被过夜；牛血清蛋白(BSA)封闭2hr；加入噬菌体表面展示的随机肽库(美国新英格兰生物公司(NEW ENGLAND BioLabs Inc.)的Ph.D.-C7C^TM 7肽库和Ph.D.-12^TM 12肽库)，于37℃或室温下轻摇，结合1hr，加入洗脱液，洗去非特异性结合的随机肽序列；再加入Tris-HCl(pH 2.2)或μPg溶液或SK/SAK溶液，将和μPg特异性结合的随机肽序列淘洗下，收集洗脱液，作下一轮淘洗的母液，同时留样测定滴度(pfu)，计算该轮淘洗的回收率和各轮淘洗的富集率。生物淘洗一般进行2～3轮。以μPg为靶蛋白，对展示于噬菌体表面的随机肽库进行生物淘洗(Bio-panning)；

本发明所述的噬菌体表面展示的随机多肽库不限于特定的随机肽库，包括构象限制与构象非限制型肽库。本发明采用噬菌体表面展示的随机肽库为基于M13噬菌体的随机肽库。

3)测定特异性随机肽序列

生物淘洗结束后，选取pfu值约为100的平板，挑取10～20个蓝色噬斑，感染OD₆₀₀＝0.6～1.0的宿主菌ER2738，37℃振摇培养4～5hr，高速离心(8000rpm，15min)，上清中加入1/6体积的PEG/NaCl(20％聚乙二醇8000，2.5mMNaCl)于0℃沉淀M13噬菌体的单链DNA(ssDNA)，离心(12000rpm，10min)后沉淀溶于TBS/NaN₃(Tris-Buffer，Supplemented with NaCl)，该ssDNA样品即可用作测序；

4)序列分析

对测序结果进行分析，找出保守序列即能够和μPg特异性结合的多肽序列；确定筛选得到的高亲和力多肽的序列。

5)合成上述多肽

采用Fmoc-氨基酸树脂固相合成法合成上述多肽。经过HPLC纯化，质谱(MS)鉴定，纯度＞95％(由吉尔生化(上海)有限公司提供合成和纯化)；

6)对合成的多肽进一步检测和确认其活性

酪蛋白牛奶板法，检测多肽能否形成溶圈和形成溶圈的大小。

发色底物S2390测定A405值，检测多肽激活μPg的能力。

7)最终得到具有激活人纤溶酶原的活性的多肽药物。

附图说明

图1是序列1的多肽合成后纯化的HPLC分析图谱。

图2是序列2的多肽合成后纯化的HPLC分析图谱。

图3是用S2390作为底物以发色底物法测定多肽活性结果。

具体实施方式

实施例1

人微纤溶酶原(μPm)的表达

将毕赤酵母(购买自美国Invitregin公司)诱导表达质粒pPIC9K/μPm转化GS115菌株(GS115菌株，pPIC9K质粒购买自美国Invitregin公司)，采用电穿孔法转化，0.2cm规格的电转化杯，电压1500V，场强7500V/cm，脉冲时间10ms，筛选His+转化子。用G418筛选在GS115的AOX1基因位点发生多拷贝交换重组的转化克隆。划YPD平板备用并制备甘油菌保存。

从上述YPD平板上挑取表达菌株接种于BMGY培养基中扩增培养约24小时后，测OD₆₀₀＝0.2-0.6，离心，收集菌体，换BMMY诱导培养基，用甲醇作为碳源诱导表达72-96h。离心后收集上清。

人微纤溶酶原(μPm)的纯化

毕赤酵母上清用40％硫酸铵沉淀，0℃过夜，高速离心(10,000rpm 30min)，收集沉淀，溶于5ml PB(0.02M，pH7.4)缓冲液中，Sephacyl S-100凝胶过滤，收集洗脱峰。

上述凝胶过滤洗脱峰上样于Q-Sepharose FF(经0.02M PB(pH 8.0)缓冲液平衡)，离子交换柱用0.02M PB(pH 8.0)洗脱杂蛋白，然后用1M NaCl进行梯度洗脱，在98％NaCl梯度时收集洗脱峰。

冷冻干燥离子交换洗脱峰收集液，冻干粉于低温保存待用。

噬菌体表面随机肽库的亲和筛选

a)μPg包被：

用0.1M NaHCO₃(pH8.6)制备100ug/ml的μPg溶液，上述溶液点样于96孔板(150ul/孔)，振摇，4℃保湿过夜，轻微振摇；

b)生物淘洗：

接种ER2738于10ml LB(含四环素50ug/ml)中，37℃培养过夜，

放大上述过夜菌至20ml LB(含四环素50ug/ml)中，37℃培养至对数早期(OD₆₀₀＝0.5-1.0)，

倒出96孔板上的包被液，去除干净剩余的包被液，加入封闭液，4℃封闭1h以上，

倒出封闭液，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)快速洗6次，振摇，倒出溶液并去除干净剩余溶液，

用TBST稀释10ul噬菌体原库(美国新英格兰生物公司(NEW ENGLANDBioLabs Inc.)的Ph.D.-C7C^TM 7肽库和Ph.D.-12^TM 12肽库)(滴度为2×10¹¹)，用微量移液器加于96孔板中，100ul/孔，于室温下轻摇10-60min，

倒出上述溶液，并去除干净剩余溶液，

用TBST洗涤10次，并去除干净剩余溶液，

加入洗脱液(100ul/孔)，轻摇10min(洗脱液：0.2M Glycine-HCl(pH2.2)+1mg/ml BSA)，

用微量移液器吸出上述洗脱液，转移至离心管中，并加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和酸度(1.5ml)，

取1ul洗脱液备用测滴度，

剩余洗脱液用于肽库的扩增：加入至生长至对数早期的宿主菌培养液中(ER2738，OD₆₀₀＝0.5-1.0)，37℃剧烈振摇4.5h，

收获上述培养液，转移至离心管中，高速离心(10,000rpm 10min 4℃)，上清转移至一新的离心管中，再次高速离心，

吸取80％的离心后上清，转移至新的离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀后0℃过夜；

制备扩增库

将上述沉淀过夜的噬菌体收集液高速离心(10,000rpm 15min 4℃)，弃上清，重复离心5min，吸弃剩余上清，加入1ml TBS重悬沉淀，溶液转移至tube管中，高速离心5min，去除不溶杂质，吸取上清，转移至新tube管中，加入1/6体积PEG/NaCl，0℃沉淀1h，高速离心10min，弃上清，高速离心5min，吸弃剩余上清，加入200ul TBS，0.02％NaN3重悬沉淀，高速离心1min，上清转移至新tube管中，即得扩增的肽库。

取1ul扩增库备用测滴度，剩余4℃贮存；

测定滴度

制备对数早期宿主细胞ER2738 10ml，离心后浓缩至1ml LB(含四环素)中，4℃保存待用，取1ul扩增库，用LB分级稀释10⁸-10¹¹；对于直接淘洗下来的未扩增库，稀释10¹-10⁴，取100ul ER2738，加入10ul稀释好的样品，室温下放置1-5min，上述感染细胞加入熔化后冷却的上层胶(45℃，3ml/板)中，混匀，倒于预温的LB/IPTG/Xgal平板上，使上层胶分布均匀，冷却5min后，倒置平板，37℃培养过夜，取噬斑数约10²的平板清点噬斑数，计算滴度：

pfu(每10ul肽库的滴度)＝样品稀释倍数×噬斑数×10，

滴度要求至少达到1×10⁹pfu；

重新用μPg包被一新的96孔板，利用扩增肽库进行第二轮筛选，重复上述步骤2-3次。

计算各轮筛选富集率：

对各轮筛选时从96孔板上洗脱得到的未扩增肽库测定滴度，并和上一轮筛选时的相应滴度比较，得到各轮筛选的肽库富集率

测定筛选得到的特异性序列：

生物淘洗2-3轮后，对最终筛选得到的肽库测定滴度，挑取噬斑数不超过100的平板，挑取单个噬斑10-20个，转移至10ml对数早期的宿主菌细胞培养液中，37℃振摇培养4.5h

收获细胞，高速离心20min，取上清，加入1/6体积的PEG/NaCl，室温放置30min或0℃过夜，高速离心20min，弃上清，移弃少量残留PEG，用30ul TE(pH 8.0)重悬沉淀，煮沸2min，高速离心，取上清，-20℃保存待用，

PCR测序

引物序列如下：

上游引物(-28 gIII sequencing primer)

5’-GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAAC-3’

下游引物(-96 gIII sequencing primer)

5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGG-3’

采用ClustalX进行多重序列的比对分析；

合成及纯化多肽

采用Fmoc-保护的多肽固相合成法，Fmoc-氨基酸王树脂合成，液相色谱HPLC纯化合成产物(柱型号：Hypersil-Keystone)，收集纯度＞95％的洗脱峰，质谱MS验证。

硫酸铵沉淀

在0℃条件下在等量破胞上清液中缓慢、搅拌加入固体(NH₄)₂SO₄，使其终浓度分别为50％，60％，70％，80％，90％，静置2hr，10,000rpm，30min离心收集沉淀。沉淀经15％SDS-PAGE分析确定沉淀目的蛋白的(NH₄)₂SO₄，最佳饱和度为40％。按上述方法沉淀破胞上清中的蛋白质，-70℃保存。

凝胶过滤层析

Sephacryl S-100层析柱(2.5×100cm)用0.02M pH 7.4 PB缓冲液平衡。硫酸铵沉淀的蛋白用0.02M pH7.4 PB缓冲液重悬，离心后上清上样于凝胶层析柱，0.02M pH7.4 PB缓冲液洗脱，流速2ml/min。分部收集洗脱峰，15％SDS-PAGE鉴定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。

离子交换层析

SP-Sepharose FF层析柱(2.5×15cm)先后用10倍柱床体积0.1M pH 8.0Tris-HCl和0.02M pH8.0 Tris-HCl缓冲液平衡。样品5ml/min上样后0.02M pH8.0 Tris-HCl洗至基线，1mol/L NaCl连续梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，并以Bradford法(Bio-Rad)测定蛋白浓度。纯化后的目的蛋白分装，冷冻抽干。

纯度鉴定及分子量测定

冻干的蛋白样品进行15％SDS-PAGE，考马斯亮兰R-250染色，PharmaciaImageMaterR VDS扫描测定纯度。

冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0mg/ml，HPLC分析纯度。

纤溶活性的测定

分别以酪蛋白凝胶板溶圈法、发色底物法测定。

1)蛋白凝胶板溶圈法：

凝胶含1.6％脱脂奶粉，1％琼脂粉，0.02％NaN₃和5μg/ml纤溶酶原。凝胶经打孔后，在各孔加等体积标准品系列(wt-Sak)或样品液，37℃湿盒保温过夜。测定各孔溶圈半径，以标准品活性的对数和溶圈半径的对数作标准曲线，计算样品的活性单位。

2)色底物法：

反应体系为：纤溶酶原0.0625μg/ml，发色底物S2390 0.25μg/ml，0.05M pH7.4的磷酸钠缓冲液。96孔板加入100μl纤溶酶原和发色底物S2390混合液，再加入等体积标准品(wt-Sak)系列和样品，37℃湿盒孵育一段时间，待开始显色后每5min用Bio-Rad 550酶标仪测定OD₄₀₅；绘制标准曲线，取线性最好的标准曲线计算样品活性。

活性检测的结果表明筛选得到的多肽具有一定的纤溶活性，具有开发成为新型溶栓药物的前景。表1为本发明多肽纤溶活性的测定结果。

表1

	空白组	药物组1	药物组2	药物组3	药物组4
						药物浓度	0	2.5uM	25uM	250uM	2.5mM

各种药物浓度所得数据的单因素方差分析(SNK法，F＝13.12，P＜0.01)
		组别	x±s(均数±标准差)
空白组药物浓度1药物浓度2药物浓度3药物浓度4	0.16±0.010.17±0.010.18±0.010.21±0.01*0.22±0.01*
		注：*表示药物浓度3、药物浓度4与空白组、药物浓度1、药物浓度2相比，均数要大，P＜0.05

                        SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>人纤溶酶原激活剂模拟肽及其制备方法

<130>复旦0505

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>synthesized

<400>1

His Ser Ala Asn Gln His His Lys His His His Pro His Phe Gly Gly

1                  5                        10                   15

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>synthesized

<400>2

Ser Ala Cys Ser Pro Asp Ala Ser Arg Leu Cys Gly Gly

1                   5                     10

Claims (5)

1、人纤溶酶原激活剂模拟肽，其特征在于所述模拟肽是模拟链激酶和葡激酶功能、具有溶栓功能、长度为30个残基内的溶栓多肽序列，其核心具备序列1的结构His-Ser-Ala-Asn-Gln-His-His-Lys-His-His-His-Pro-His-Phe-Gly-Gly或序列2的结构Ser-Ala-Cys-Ser-Pro-Asp-Ala-Ser-Arg-Leu-Cys-Gly-Gly。

2、按权利要求1所述的人纤溶酶原激活剂模拟肽的制备方法，其特征在于通过下述方法和步骤，

1)选择靶蛋白

选择μPg作为随机肽库筛选的靶蛋白，

采用毕赤酵母表达系统高效表达并纯化得到人纤溶酶原；

2)生物淘洗筛选

以μPg为靶蛋白，对展示于噬菌体表面的随机肽库进行生物淘洗2～3轮；

3)测定特异性随机肽序列

生物淘洗后，挑取pfu值约为100的平板上蓝色噬斑，感染宿主菌，37℃培养，离心后，上清中加入PEG/NaCl，于0℃沉淀M13噬菌体的单链DNA，离心后沉淀溶于TBS/NaN₃，得样品ssDNA用作测序；

4)序列分析

对测序结果进行分析，确定筛选得到的μPg特异性结合的多肽序列；

5)合成上述多肽

采用Fmoc-氨基酸树脂固相合成法合成上述多肽。经过HPLC纯化，质谱(MS)鉴定，纯度＞95％；

6)检测和确认合成的多肽活性

酪蛋白牛奶板法，检测多肽能否形成溶圈和形成溶圈的大小；

发色底物S2390测定A405值，检测多肽激活μPg的能力；

7)得具有激活人纤溶酶原的活性的多肽药物。

3、按权利要求2的方法，其特征在于所述的靶蛋白包括μPg/μPm、全长的Pg/Pm及其各个结构功能域。

4、根据权利要求2所述的方法，其中所述的宿主菌不限于特定的宿主菌，只要能够被噬菌体感染。

5、根据权利要求2所述的方法，其中所述的宿主菌为大肠杆菌ER2738。

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