CN111394340A - 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用 - Google Patents

高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111394340A
CN111394340A CN202010306225.5A CN202010306225A CN111394340A CN 111394340 A CN111394340 A CN 111394340A CN 202010306225 A CN202010306225 A CN 202010306225A CN 111394340 A CN111394340 A CN 111394340A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
enzyme
filter paper
mutant
15min
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010306225.5A
Other languages
English (en)
Inventor
刘欢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202010306225.5A priority Critical patent/CN111394340A/zh
Publication of CN111394340A publication Critical patent/CN111394340A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24072—Fibrolase (3.4.24.72)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用，酶氨基酸序列(DFE27 enzy me，GenBank:AWA46506.1)在第157位、第187位上发生突变，由原来的A、G分别突变为G、R，其有意效果在于，获得的豆豉纤溶酶具有更高的纤溶活性。

Description

高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用
技术领域
本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用。
背景技术
血栓栓塞性疾病是一类致残率和死亡率较高的常见病，严重危害人类健康和生命，目前抗血栓药物分为抗血小板药、抗凝血药物、溶血栓药物三类，临床证明溶栓疗法是治疗心肌梗塞有效方法之一，溶栓疗法还可用于脑梗塞、急性肺动脉栓塞、周围血管病、不稳定性心绞痛、视网膜血管闭塞以及人工瓣膜血栓形成等方面。应用溶血栓药物的目的是使局部的血栓溶解而不引起全身性纤维蛋白原溶解和破坏正常止血形成的止血栓子。溶栓药物按照作用方式可分为两类：一类为纤溶酶原激活剂类型，其作用机制为激活血液中无活性的纤溶酶原从而形成有活性的纤溶酶催化纤维蛋白的水解，使血栓溶解，常见的有链激酶、尿激酶、t-PA，另一类溶栓药物的作用机制则是直接溶解血栓中的主要基质纤维蛋白，从而使血栓溶解，血管再通，该类药物包括从蚯蚓体内分离出来的蚓激酶及纳豆激酶等溶栓剂。
豆豉是我国传统的大豆发酵食品，据中国药典记载：豆豉具有开胃增食、消积化滞、驱风散寒以及预防心血管疾病等功效，血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，1987年日本的须见洋行等首次从纳豆中提取出具有溶血栓作用的纳豆激酶，该酶能显著溶解体内外血栓，作用时间长，且安全性好，是一种很有潜力的新溶栓药物，近年来，国内学者相继发现我国的豆豉中也存在溶栓酶，并从中筛选出一些菌株，筛选得到的豆豉纤溶酶具有较高纤溶活性及良好的抗凝、溶栓作用，不溶解血细胞，不引起内出血，体内半衰期长，而且可通过消化道直接吸收，另外，该酶来源于传统食品，安全可靠，无毒，并可用细菌或霉菌发酵，进行大量生产，因此，具有重要的药用价值和良好的应用前景，通过改造豆豉纤溶酶的结构，从而提高其酶活力具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供具有更高纤溶酶活的豆豉纤溶酶。
本发明的制备过程如下：
1.从NCBI上获得豆豉纤溶酶序列(DFE27 enzyme，GenBank:AWA46506.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATG AGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGT AGTG，PCR反应结束后，加20μl CloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、NotⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2.质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/DFE27的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3.易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/lMn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、NotⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21，涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；
4.突变文库的高通量筛选
将步骤三得到的转化后的菌液均匀地涂在预先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直径为9mm含有氨苄青霉素的LB平板上，涂抹的转化液用量以最终每个平板大约长出50个单菌落为宜，37℃培养15h左右，再于4℃下放置1-2h，然后将无菌尼龙膜完全浸湿，立即以平稳的一次性动作将尼龙膜从琼脂面上揭下，将尼龙膜的菌落面向上，置于一块新的LB平板上(预先涂有4μl 5mg/ml IPTG)，37℃下培养4-5h后进行菌落的裂解处理，用细胞壁裂解液(25mmol/l Tris-HCl pH8.0,内含1mg/ml溶菌酶和1mmol/l EDTA pH8.0)、细胞膜裂解液(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,内含0.1％(w/v)Triton-x-100)和平衡缓冲液(50mmol/lTris-HCl pH8.0)分别浸泡3张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止菌落被冲散，将尼龙膜正面向上按细胞壁裂解液、细胞膜裂解液、平衡缓冲液的顺序依次置于3张滤纸上于室温分别处理30min，将上述处理好的尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板(2％琼脂粉，0.5％羧甲基纤维素CMC，0.1mol/l pH6.6咪唑-邻苯二钾酸氢钾缓冲液)上，70℃反应3h，揭去尼龙膜后，在筛选平板上加入适量1mol/l NaCl脱色15min，与尼龙膜上对应的有活性的克隆子周围会出现明显的透明圈；将透明圈比野生型对照大的突变子，挑出后复筛；
5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；
6.突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的E.coli BL21发酵培养；
7.突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；
8.对突变体进行SDS-PAGE电泳；
9.采用Bradford测定蛋白质浓度。
本发明的有益效果是：
获得的豆豉纤溶酶具有更高的纤溶活性。
附图说明
图1豆豉纤溶酶SDS-PAGE电泳图
图2野生型及突变型豆豉纤溶酶三维图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；
表1实验材料和试剂
Figure BDA0002455883500000031
Figure BDA0002455883500000041
表2实验仪器设备
AB104-N电子分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司
PTC-200型PCR仪 美国MJResearch公司
SW-CJ-IBU超净工作台 苏净集团安泰公司
DYY-6D型核酸电泳仪 北京市六一仪器厂
MiniProtein3蛋白电泳系统 美国Bio-Rad公司
GelDoc凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司
UV2450紫外可见光分光光度计 日本Shimadzu公司
Sigma3K-15高速冷冻离心机 德国Sigma公司
TAZ-C型恒温摇床 江苏省太仓市实验设备厂
电热培养箱 天津天宇机电有限公司
蛋白核酸定量测定仪 德国Eppendorf公司
LB培养基配方:胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，pH7.0；
固体LB培养基：每100ml液体LB培养基加2g琼脂粉，高压灭菌；
IPTG储存液(200mg/ml):用去离子水配制成200mg/ml异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1ml，贮存于-20℃；
氨苄青霉素储存液(200mg/ml)：用去离子水配制成200mg/ml的氨苄青霉素(Amp)贮存液，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1ml，贮存于-20℃；
50×TAE电泳缓冲液：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/l EDTA(pH8.0)100ml，用蒸馏水定容至1l；
巴比妥钠-HCl缓冲液：100ml 0.04mol/l巴比妥钠溶液与11.47ml 0.2mol/l HCl溶液混合，再用0.2mol/l HCl准确调节缓冲液pH至7.8；
纤维蛋白原溶液(2mg/ml):将一支纤维蛋白原(98mg)溶解于49ml无菌芭比托纳-HCl缓冲液中，临用前配制；
凝血酶溶液(1BP/ml)：将一支凝血酶(190BP)溶解于190ml无菌巴比妥钠-HCl缓冲液中，保存于4℃冰箱；
尿激酶溶液(100IU/ml)：将一支尿激酶(1280IU)溶解于12.8ml无菌巴比妥钠-HCl缓冲液中，保存于4℃冰箱；
琼脂糖溶液(1.2％)：称取0.60g琼脂糖，溶解于50ml巴比妥钠-HCl缓冲液中；
1.从NCBI上获得豆豉纤溶酶序列(DFE27enzyme，GenBank:AWA46506.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，PCR反应结束后，加20μl CloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、NotⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2.质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/DFE27的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3.易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒为模板，用Not Ⅰ酶切使质粒线性化，用引物序列F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/lMn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、NotⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21，涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；
4.突变文库的高通量筛选
将步骤三得到的转化后的菌液均匀地涂在预先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直径为9mm含有氨苄青霉素的LB平板上，涂抹的转化液用量以最终每个平板大约长出50个单菌落为宜，37℃培养15h左右，再于4℃下放置1-2h，然后将无菌尼龙膜完全浸湿，立即以平稳的一次性动作将尼龙膜从琼脂面上揭下，将尼龙膜的菌落面向上，置于一块新的LB平板上(预先涂有4μl 5mg/ml IPTG)，37℃下培养4-5h后进行菌落的裂解处理，用细胞壁裂解液(25mmol/l Tris-HCl pH8.0,内含1mg/ml溶菌酶和1mmol/l EDTA pH8.0)、细胞膜裂解液(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,内含0.1％(w/v)Triton-x-100)和平衡缓冲液(50mmol/lTris-HCl pH8.0)分别浸泡3张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止菌落被冲散，将尼龙膜正面向上按细胞壁裂解液、细胞膜裂解液、平衡缓冲液的顺序依次置于3张滤纸上于室温分别处理30min，将上述处理好的尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板(2％琼脂粉，0.5％羧甲基纤维素CMC，0.1mol/l pH6.6咪唑-邻苯二钾酸氢钾缓冲液)上，70℃反应3h，揭去尼龙膜后，在筛选平板上加入适量1mol/l NaCl脱色15min，与尼龙膜上对应的有活性的克隆子周围会出现明显的透明圈；将透明圈比野生型对照大的突变子，挑出后复筛；
5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序，测序结果见表3；
6.突变体的生产
将含有突变质粒的E.coli BL21活化后接入LB液体培养基中，37℃、180rpm培养10h左右制成种子液；然后在250ml三角瓶中加入50ml LB液体培养基(pH为7.0)，接入5％(v/v)的种子液，37℃、180rpm药瓶培养72h；
7.突变体的纯化
1)样品准备
发酵培养后的菌液在4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液，4℃过滤除菌；
2)盐析
在粗酶液中缓慢加入研细的硫酸铵至80％饱和度，并以磁力搅拌器进行搅拌，4℃静置过夜，4℃10000rpm离心15min，弃上清，沉淀用50mM pH7.5 Tris-HCL缓冲液溶解；
3)DEAE-Sephadex阴离子交换柱层析
a.Sephadex柱预处理
DEAE-Sephadex阴离子交换柱(Φ1.6cm×20cm)预先用pH 8.0、0.05mol/l Tris-HCL缓冲液平衡过夜，将硫酸铵沉淀所得酶蛋白回溶于pH 8.0、0.05mol/l Tris-HCl缓冲液后上柱，每次上样量为1ml，先用pH 8.0、0.05mol/l Tris-HCl缓冲液洗脱至无蛋白析出，再用0-1mol/l NaCl溶液线性梯度洗脱，流速0.5ml/min，每管收集3ml，利用紫外分光光度计于280nm处检测每管收集液的吸光度值，并合并吸收峰，PEG20000浓缩后测定酶活和比活力，收集活性组分后进一步纯化；
b.装柱
Sephadex G-100凝胶溶胀后装柱(Φ2.6cm×80cm)，预先用pH5.3、0.05mol/l PBS缓冲液平衡过夜，用1ml样品上样，用相同的缓冲液洗脱，洗脱流速为0.3ml/min，每管收集3ml，检测每管OD280nm后合并吸收峰，PEG 20000浓缩后分别测定酶活和比活力，收集活性部分储存于-20℃备用；
c.透析
在烧杯中加入10g/l无水碳酸钠和1mmol/l的EDTA溶液500ml，将按需要剪裁好的透析袋放入其中，煮沸30min，以去除透析袋上的金属离子，处理后于4℃下保存备用，将适量的蛋白提取液装入透析袋中，两端用透析夹夹紧，于pH 5.3、0.05mol/l PB S缓冲液中4℃透析24h，每2-4h更换一次透析液；
d.沉淀蛋白液浓缩
将PEG 20000粉末均匀涂抹于透析袋外面，浓缩时置于冰箱中，并及时更换干燥的PEG 20000粉末，直至样品浓缩至所需要的体积；
8.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳凝胶的制备参照试剂盒说明书，使用分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，以0.1％考马斯亮蓝R-250进行染色，见图1；
9.蛋白质浓度测定
具体操作方法根据Bradford法蛋白定量试剂盒说明书进行操作。
野生型和突变型豆豉纤溶酶在胞外生产水平上没有明显差异，纯化酶的回收率约为10-24％，纯化后突变酶的纯度与分子量通过SDS-PAGE分析估计，突变酶分子量与野生型大小相当约29KD，野生型及突变型豆豉纤溶酶三维图见图2。
表3突变体的测序结果
突变体编号 原始核酸序列 突变后核酸序列 原始氨基酸序列 突变后氨基酸序列
突变体158 GCA GGT A G
突变体187 GGC CGC G R
实验一：酶活的测定方法
1.将灭菌的2.0％琼脂倒入平板，放于超净台风干，取8.0ml保温于55℃的1.2％琼脂糖于小三角瓶中，加入8.0ml 0.3％纤维蛋白原于小三角瓶中摇匀，再加入0.65ml凝血酶(1BP/ml)，迅速混匀后倒入9.0cm平板，静止冷却半小时备用，用2.0mm孔径的胶头滴管在平板上打孔；
2.尿激酶标准曲线制作
将尿激酶标准品(6.25、12.5、25、50、100IU/ml)各取10μl点样于新配的纤维蛋白平板上，放置10min，37℃培养18h后取出，测量透明圈直径，以水解圈的面积的自然对数为纵坐标，以标准酶活力的自然对数为横坐标，绘制标准曲线；
3.纤溶酶活力的测定
将纯化后的纤溶酶用巴比妥钠缓冲液稀释适当倍数，使测定值在尿激酶标准曲线范围内，稀释液点样于纤维蛋白平板上，以尿激酶作参照，量取水解圈的直径计算酶活力，酶的活力单位用尿激酶单位IU表示。
实验结果见表4。
表4酶活测定结果
名称 酶活(IU/mg) 提高比率
野生型 10570.8±38.42 -
突变体157 11404.7±46.27 7.89％
突变体187 11975.9±59.31 13.29％

Claims (2)

1.高纤溶活性豆豉纤溶酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(DFE27 enzyme，Ge nBank:AWA46506.1)在第157位、第187位上发生突变，由原来的A、G分别突变为G、R，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得豆豉纤溶酶序列(DFE27 enzyme，GenBank:AWA46506.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、NotⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/DFE27的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCATGAGCACGATGAGCGCCG-3'，R:TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAGAAGCATCACCAAGTTTTGTAGTG，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/l Mn2+，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、NotⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21，涂布于固体LB平板(100μg/mlAmp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；
4)突变文库的高通量筛选
将步骤三得到的转化后的菌液均匀地涂在预先涂有4μl IPTG(5mg/ml)直径为9mm含有氨苄青霉素的LB平板上，涂抹的转化液用量以最终每个平板大约长出50个单菌落为宜，37℃培养15h左右，再于4℃下放置1-2h，然后将无菌尼龙膜完全浸湿，立即以平稳的一次性动作将尼龙膜从琼脂面上揭下，将尼龙膜的菌落面向上，置于一块新的LB平板上(预先涂有4μl 5mg/ml IPTG)，37℃下培养4-5h后进行菌落的裂解处理，用细胞壁裂解液(25mmol/lTris-HCl pH8.0,内含1mg/ml溶菌酶和1mmol/l EDTA pH8.0)、细胞膜裂解液(10mmol/lTris-HCl pH8.0,内含0.1％(w/v)Triton-x-100)和平衡缓冲液(50mmol/l Tris-HClpH8.0)分别浸泡3张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止菌落被冲散，将尼龙膜正面向上按细胞壁裂解液、细胞膜裂解液、平衡缓冲液的顺序依次置于3张滤纸上于室温分别处理30min，将上述处理好的尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板(2％琼脂粉，0.5％羧甲基纤维素CMC，0.1mol/l pH6.6咪唑-邻苯二钾酸氢钾缓冲液)上，70℃反应3h，揭去尼龙膜后，在筛选平板上加入适量1mol/l NaCl脱色15min，与尼龙膜上对应的有活性的克隆子周围会出现明显的透明圈；将透明圈比野生型对照大的突变子，挑出后复筛；
5)将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；
6)突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的E.coli BL21发酵培养；
7)突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；
8)对突变体进行SDS-PAGE电泳；
9)采用Bradford测定蛋白质浓度。
2.根据权利要求1所述的高纤溶活性的豆豉纤溶酶的应用，其特征在于，所述酶用于溶解血栓。
CN202010306225.5A 2020-04-17 2020-04-17 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用 Withdrawn CN111394340A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010306225.5A CN111394340A (zh) 2020-04-17 2020-04-17 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010306225.5A CN111394340A (zh) 2020-04-17 2020-04-17 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111394340A true CN111394340A (zh) 2020-07-10

Family

ID=71426512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010306225.5A Withdrawn CN111394340A (zh) 2020-04-17 2020-04-17 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111394340A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110777136B (zh) 一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用
CN103937830B (zh) 一种高效分泌表达纳豆激酶的重组菌
CN106995811A (zh) 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用
CN106318940A (zh) 耐高温sod蛋白及其克隆和纯化方法
CN106929496A (zh) 一种药用级重组人激肽原酶产业化生产方法
CN111676211B (zh) 一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体
JPS6034181A (ja) ノイラミニダ−ゼの製造法
CN109679941B (zh) 一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用
CN111394340A (zh) 高纤溶活性的豆豉纤溶酶的制备和应用
CN110438027B (zh) 产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株gutu06及其筛选方法
CN103667201B (zh) 海洋微生物菌株ys0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法
CN105296448A (zh) 一种琼胶酶及其制备方法
CN113564151B (zh) 一种提高ce酶结构异构催化活性的方法及其突变体
CN109265553B (zh) 一种细胞珠蛋白与方格星虫纤溶酶的融合蛋白
CN103865905A (zh) 一种内切葡聚糖酶
CN117384873A (zh) 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用
CN111269905B (zh) 用于降低啤酒非生物性浑浊的热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶
CN108949785A (zh) 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用
CN114507615B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其生产纤溶酶的应用
CN116286755B (zh) 一种巴曲酶的表达纯化方法及应用
CN111286498B (zh) 用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶
CN113736684B (zh) 一种利用西洋参内生菌发酵制备溶栓酶的方法
CN100371439C (zh) 一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法
CN117074699B (zh) 一种筛选代谢蔗糖的干酪乳杆菌发酵剂的方法
CN108795781A (zh) 一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200710