ES2640321T3 - Método para purificar factor estimulador de colonias de granulocitos humanos a partir de E. coli recombinante - Google Patents

Método para purificar factor estimulador de colonias de granulocitos humanos a partir de E. coli recombinante Download PDF

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Abstract

Un método para purificar factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) a partir de una E. coli recombinante con un alto rendimiento, que comprende las etapas de: (a) cultivar una E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugación; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del sedimento celular obtenido en la etapa (a); (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración; (d) aplicar un producto filtrado obtenido en la etapa (c) a cromatografía de intercambio catiónico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a cromatografía de interacción hidrófoba; y (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a cromatografía de intercambio aniónico.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para purificar factor estimulador de colonias de granulocitos humanos a partir de E. coli recombinante
La presente invencion se refiere a un metodo para purificar factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) a partir de una E. coli recombinante. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para purificar factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) a partir de E. coli recombinante con alta pureza y rendimiento, que comprende las etapas de (a) cultivar una E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugacion; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del sedimento celular obtenido en la etapa (a); (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un acido para separar el producto precipitado resultante por filtracion; (d) aplicar un producto filtrado obtenido en la etapa (c) a cromatograffa de intercambio cationico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a cromatograffa de interaccion hidrofoba; y (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a cromatograffa de intercambio anionico.
Tecnica anterior
Los factores estimuladores de colonias (CSF, por sus siglas en ingles) son producidos por celulas T, macrofagos, fibroblastos y celulas endoteliales, y estas celulas estan ampliamente distribuidas por todo el organismo. Los CSF conocidos incluyen GM-CSF, M-CSf y G-CSF. Entre ellos, el GM-CSF es un factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos, y actua sobre celulas madre de granulocitos o macrofagos para inducir su proliferacion y diferenciacion, estimulando asf la formacion de colonias de granulocitos o macrofagos. El M-CSF (CSF de macrofagos) es un factor estimulador de colonias de macrofagos, y funciona principalmente para estimular la formacion de colonias de macrofagos. El G-CSF (CSF de granulocitos) es un factor estimulador de colonias de granulocitos, y estimula la formacion de colonias de granulocitos e induce la diferenciacion final.
Convencionalmente, para aislar y purificar el G-CSF, se cultivan celulas y se afslan las protemas G-CSF del sobrenadante de cultivo. Sin embargo, este metodo tiene el problema del bajo rendimiento de G-CSF, y por lo tanto no es adecuado para la produccion en masa. Ademas, Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd. (Japon) ha desarrollado un metodo para producir hG-CSF glicosilado en una celula de mairnfero empleando un ADN genomico o ADNc que incluye un polinucleotido que codifica hG-CSF (Patentes Coreanas Num. 47178, 53723 y 57582). Sin embargo, se sabe que la cadena de azucar de hG-CSF glicosilado no es necesaria para la actividad de hG-CSF y la produccion de hG-CSF glicosilado que emplea celulas de mamffero requiere materiales e instalaciones caras y, por lo tanto, tal procedimiento no es economicamente factible.
Se han realizado intentos para producir hG-CSF no glicosilado empleando una celula procariotica. En estos estudios, se producen hG-CSF quetienen un residuo de metionina unido al extremo N del mismo debido al codon de iniciacion ATG, pero esta forma es diferente de la forma nativa. Ademas, el hG-CSF producido en un microorganismo puede estar contaminado con impurezas derivadas de celulas anfitrionas o materiales de cultivo, y se requiere un complicado proceso de purificacion para la aplicacion a un medicamento de alta pureza. Ademas, cuando se utiliza E. coli como celula anfitriona, la mayor parte de los hG-CSF se depositan en las celulas como cuerpos de inclusion insolubles, y se deben convertir en una forma activa a traves de un proceso de replegamiento, con una perdida significativa de rendimiento. Durante el proceso, se inducen una reduccion parcial, una formacion de disulfuro intramolecular o una formacion de disulfuro erronea, y por lo tanto se necesita un procedimiento engorroso para eliminarlos y se produce una perdida de potencia. Un residuo de cistema no participa en la formacion del enlace disulfuro, y por lo tanto existe en forma libre, dando como resultado la perdida adicional de potencia y la reduccion de la estabilidad en una solucion de protema.
Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar un metodo para producir hG-CSF en masa que no tengan residuos de metionina en su extremo N y, por tanto, sean identicos a la forma nativa aunque se utilicen microorganismos.
Con el fin de resolver los problemas, los autores de la presente invencion han informado previamente de que se prepara un nuevo peptido senal secretor con una tasa de expresion elevada modificando el peptido senal conocido de la enterotoxina II termoestable de E. coli (Patente Coreana Num. 316347) y se utiliza para producir hG-CSF nativo. Adicionalmente, los autores de la presente invencion han preparado un vector de expresion que incluye un gen recombinante que se prepara uniendo el gen hG-CSF, en lugar del gen de la enterotoxina, junto al peptido senal modificado de enterotoxina II termoesistente de E. coli, y han transformado E. coli con el vector de expresion, expresando de este modo hG-CSF biologicamente activos en el periplasma al emplear un sistema secretor microbiano (Patente Coreana Num. 356140).
Mediante el uso del sistema microbiano de secrecion de una protema al periplasma, los hG-CSF nativos que no tienen residuo de metionina en el extremo N-terminal se pueden obtener en una forma soluble. Adicionalmente, las protemas periplasmicas son normalmente menos de 10% de la protema celular total y, por tanto, se requiere una purificacion menos extensa de la protema recombinante que para las protemas situadas en el citoplasma. Ademas, no se necesita un procedimiento de desorganizacion celular y se puede minimizar la contaminacion con sacaridos y acidos nucleicos presentes en el citoplasma. Sin embargo, debido al bajo nivel de expresion en la produccion periplasmica, su industrializacion es diffcil. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un metodo
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eficaz para purificar protemas expresadas con alto rendimiento y pureza.
El documento EP 1 837 346 A describe la purificacion de hG-CSF recombinante producido en E. coli mediante un metodo que implica filtracion en gel, filtracion de flujo tangencial, cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de intercambio cationico y una etapa de cromatograffa de filtracion en gel.
El documento US 2008/0260684 describe un metodo para purificar hG-CSF recombinante producido en E. coli y solubilizado a partir de cuerpos de inclusion. Los metodos de purificacion implican al menos una etapa cromatografica de intercambio cationico y al menos una etapa cromatografica de interaccion hidrofoba, opcionalmente con una etapa cromatografica de intercambio cationico adicional.
Descripcion de la invencion
Problema tecnico
En consecuencia, los autores de la presente invencion se han esforzado por abordar los problemas de la tecnica anterior. Como resultado, encontraron que los factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos nativos se pueden producir en masa con alta pureza mediante el cultivo de E. coli recombinante para obtener protemas secretoras y luego aplicar las protemas a la precipitacion acida ^ cromatograffa de intercambio cationico ^ cromatograffa de interaccion hidrofoba ^ cromatograffa de intercambio anionico en este orden, completando asf la presente invencion.
Solucion al problema
La presente invencion proporciona un metodo para purificar factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) de una E. coli recombinante con pureza y rendimiento elevados, que comprende las etapas de:
(a) cultivar E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugacion;
(b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del sedimento celular obtenido en la etapa (a);
(c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un acido para separar el producto precipitado resultante por filtracion;
(d) aplicar un producto filtrado obtenido en la etapa (c) a cromatograffa de intercambio cationico;
(e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a cromatograffa de interaccion hidrofoba; y
(f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a cromatograffa de intercambio anionico.
Efectos ventajosos de la invencion
De acuerdo con el metodo de la presente invencion, el factor estimulador de colonias de granulocitos humanos, identico a la forma nativa expresada en el cuerpo humano, se puede purificar facilmente con rendimiento y pureza elevados sin un procedimiento de activacion adicional. En particular, de acuerdo con el metodo de la presente invencion, las variantes de hG-CSF expresadas en E. coli se eliminan eficazmente para obtener hG-CSF fisiologicamente activos con alta pureza.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 muestra los resultados de la SDS-PAGE de cada solucion obtenida de las etapas de extraccion osmotica, precipitacion con acido, cromatograffa de intercambio cationico y cromatograffa de interaccion hidrofoba de hG-CSF que se purifican a partir del periplasma de E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion, en el que
Calle 1: Patron
Calle 2: Sobrenadante de la centrifugacion primaria de la etapa (b)
Calle 3: Sobrenadante de la centrifugacion secundaria de la etapa (b)
Calle 4: Sobrenadante obtenido por precipitacion con acido de la etapa (c)
Calle 5: Producto filtrado obtenido por filtracion de la etapa (c)
Calle 6: Flujo en columna de la columna de SP-sepharose de la etapa (d)
Calle 7: Flujo del eluato 1 de la columna de la columna de SP-sepharose de la etapa (d)
Calle 8: Flujo del eluato 2 de la columna de la columna de SP-sepharose de la etapa (d)
Calle 9: Flujo del flujo 2 de la columna de la columna de butil-sefarosa de la etapa (e)
Calle 10: Flujo del eluato 2 de la columna de la columna de butil-sefarosa de la etapa (e);
FIG. 2 muestra el resultado de SDS-PAGE del eluato de columna que se obtiene por cromatograffa de intercambio anionico del metodo de purificacion de la presente invencion;
5 FIG. 3 muestra el resultado de la cromatograffa de alta presion en fase inversa del eluato de columna que se obtiene por cromatograffa de intercambio anionico del metodo de purificacion de la presente invencion; y
FIG. 4 muestra el resultado de la cromatograffa de alta presion de exclusion por tamano del eluato de la columna que se obtiene mediante cromatograffa de intercambio anionico del metodo de purificacion de la presente invencion.
Mejor modo para llevar a cabo la invencion
10 La presente invencion proporciona un metodo para purificar simplemente una gran cantidad de factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) con alta pureza a partir de una E. coli recombinante sin un procedimiento de activacion adicional.
Espedficamente, el metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion puede incluir las etapas de:
(a) cultivar una E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugacion; 15 (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF a partir del sedimento celular obtenido en la etapa (a);
(c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un acido para separar el producto precipitado resultante por filtracion;
(d) aplicar un producto filtrado obtenido en la etapa (c) a cromatograffa de intercambio cationico;
(e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a cromatograffa de interaccion hidrofoba; y
20 (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a cromatograffa de intercambio anionico.
El metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque despues de la precipitacion con acido, los hG-CSF obtenidos a partir de E. coli recombinante se aplican a una serie de etapas de cromatograffa (cromatograffa de intercambio cationico, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa de intercambio anionico), aislando de ese modo hG-CSF altamente puros adecuados para uso farmaceutico.
25 A continuacion, se describira en detalle cada etapa del metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion.
La etapa (a) es una etapa de cultivo de una E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugacion. La E. coli recombinante utilizada en esta etapa es cualquiera que exprese hG-CSF, preferiblemente cualquiera que exprese hG-CSF en el periplasma, sin limitacion. Mas preferiblemente, los hG-CSF de la presente invencion son hG-CSF solubles expresados en E. coli. En la presente invencion, la E. coli 30 recombinante que expresa hG-CSF en el periplasma es una E. coli recombinante que se transforma con un vector de expresion que incluye un gen de fusion que codifica una protema de fusion de la secuencia senal secretora y hG- CSF. Los ejemplos representativos de la E. coli recombinante incluyen HM10310, HM10311 (KCCM-10154), HM10409, HM10410 (KCCM-10151), HM10411 (KCCM-10152), HM10413, HM10414, HM10415, HM10510 (KCCM- 10153), HM10511 y HM10512 descritos en la Patente Coreana Num. 356140 de los autores de la presente 35 invencion, en los que la E. coli recombinante es transformada con un vector de expresion preparado por fusion de un peptido senal modificado de enterotoxina II termorresistente y hG-CSF de E. coli, pero no se limitan a ella.
Con el fin de expresar hG-CSF en el periplasma de la E. coli recombinante, la E. coli recombinante se puede cultivar mediante cultivo de alimentacion discontinua en un fermentador que contiene un medio LB con un suplemento de 1 a 300 g/L de glucosa como fuente de carbono, de 2 a 15 g/L de KH2PO4, de 0,5 a 3 g/L de (NH^HPO4, de 2 a 10 g/L 40 de NaCl y de 0,5 a 10 g/L de MgCh como minerales, una variedad de oligoelementos, extracto de levadura y triptona. Esta composicion de medio es adecuada para un cultivo de alta densidad de E. coli recombinante y una elevada expresion de hG-CSF en el periplasma de E. coli. En una realizacion preferida de la presente invencion, se utilizo la E. coli recombinante HM10411 (KCCM-10152) para realizar un experimento, y como resultado, se encontro que la composicion del medio aumentaba enormemente la densidad celular de la E. coli recombinante, el nivel de 45 expresion de hG-CSF en E. coli y la tasa de secrecion de hG-CSF al periplasma. El caldo de cultivo obtenido a partir de E. coli recombinante se centrifuga para obtener un sedimento celular.
La etapa (b) es una etapa de separacion de un sobrenadante que contiene hG-CSF a partir del sedimento celular obtenido en la etapa (a). En una realizacion preferida de la presente invencion, cuando se utiliza la E. coli recombinante que expresa hG-CSF en el periplasma, las protemas periplasmicas que incluyen hG-CSF se pueden 50 separar de las celulas mediante extraccion osmotica. A este respecto, la etapa (b) puede incluir las etapas de anadir una solucion tampon que contiene sacarosa al sedimento celular para obtener un sedimento celular por
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centrifugacion; y anadir agua destilada al sedimento de celulas para obtener un sobrenadante que contiene protemas periplasmicas por centrifugacion. En esta etapa, las protemas periplasmicas que incluyen los hG-CSF se extraen por presion osmotica. En primer lugar, cuando el sedimento de celulas se trata con la solucion tampon que contiene sacarosa, por ejemplo, una solucion tampon que contiene sacarosa del 10% al 30%, las celulas se encogen. En ese caso, cuando el sedimento celular se trata nuevamente con agua destilada, las celulas encogidas se expanden y la pared celular se distiende. Por lo tanto, la pared celular no se desorganiza, pero las protemas periplasmicas que incluyen los hG-CSF presentes entre la membrana celular y la pared celular se extraen a traves de la pared celular distendida. En la extraccion osmotica de la etapa (b), se pueden utilizar sacarosa, glucosa, MgCl2, cloruro sodico o similares. Preferiblemente, se utiliza la solucion tampon de sacarosa. El extracto se centrifugo para obtener un sobrenadante que contema la protema periplasmica.
La etapa (c) es una etapa de precipitacion con acido de tratar el sobrenadante que contiene hG-CSF obtenido en la etapa (b) con un acido para separar el producto precipitado resultante por filtracion. En una realizacion preferida de la presente invencion, cuando se utiliza la E. coli recombinante que expresa los hG-CSF en el periplasma, se puede separar un sobrenadante que contiene hG-CSF soluble del sobrenadante incluyendo protemas periplasmicas por precipitacion con acido. Espedficamente, cuando el sobrenadante obtenido en la etapa (b) se trata con un acido para ajustar el pH del sobrenadante de 5,0 a 5,8, preferiblemente de 5,3 a 5,5, precipita la materia insoluble que incluye protemas periplasmicas en el sobrenadante y este producto precipitado se separa por filtracion con el fin de obtener un sobrenadante que contiene hG-CSF soluble. Los ejemplos del acido adecuado para la precipitacion con acido de la etapa (c) incluyen acido acetico, acido fosforico, acido dtrico o similares, y preferiblemente acido acetico. La filtracion se puede realizar utilizando un filtro apropiado, y preferiblemente un filtro de 0,45 a 3 pm. Puesto que en la presente invencion se utiliza E. coli recombinante que secreta hG-CSF al periplasma, no hay necesidad de desorganizar E. coli, y la fraccion del periplasma se puede obtener facilmente a partir del caldo de cultivo para extraer los hG-CSF.
La etapa (d) es una etapa de aplicacion de un producto filtrado que contiene hG-CSF soluble obtenido en la etapa (c) a cromatograffa de intercambio cationico. A traves de esta etapa, se puede eliminar una gran cantidad de impurezas derivadas de celulas anfitrionas o materiales de cultivo para mejorar la eficacia de purificacion.
Un grupo funcional de la columna de la cromatograffa de intercambio cationico utilizada en la presente invencion puede incluir cationes debiles tales como carboximetil- (CM-) y carboxi- (C-) y cationes fuertes tales como sulfo- (S-), sulfometil- (SM-), sulfoetil- (SE-), sulfopropil- (SP-) y fosfo- (P-). Se puede utilizar una variedad de resinas de columna, incluyendo sefarosa, sefadex, agarosa, sefacel, poliestireno, poliacrilato, celulosa y Toyopearl. En una realizacion preferida de la presente invencion, el metodo de purificacion se puede llevar a cabo mediante cromatograffa de intercambio cationico utilizando una columna de SP-sefarosa.
En la presente invencion, la cromatograffa de intercambio cationico se lleva a cabo utilizando una solucion tampon que contiene acido acetico como eluyente dentro de un pH que vana de pH 4,0 a 6,0, preferiblemente de pH 5,0 a 6,0 a una concentracion de sal de 500 mM o menos, preferiblemente de 200 a 500 mM. La columna de intercambio cationico que se vaya a utilizar se puede equilibrar con una solucion tampon antes de cargar el eluato. El equilibrado de la columna de intercambio cationico se puede realizar utilizando una solucion tampon acuosa de pH 5,0 a 6,0, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una realizacion preferida de la presente invencion, la columna de intercambio de cationes se equilibra con una solucion tampon que contiene acetato de sodio 10 mM (pH 5,4) con antelacion. Despues de que el producto filtrado que contiene hG-CSF sea cargado y adsorbido sobre la columna de intercambio cationico equilibrada, la columna se lava con la solucion tampon de equilibrado para eliminar las protemas e impurezas que no son adsorbidas sobre la columna. Posteriormente, se aplica una solucion tampon de elucion preparada por adicion de cloruro sodico a la solucion tampon de equilibrado a la columna de intercambio cationico, con el fin de hacer eluir los hG-CSF que estan adsorbidos sobre la columna. A este respecto, se aplican preferiblemente de 3 a 7 volumenes de columna de la solucion tampon de elucion. En una realizacion preferida de la presente invencion, se aplican a la columna 4 a 6 volumenes de columna de una solucion tampon (pH 5,2 a 5,6) que contiene acetato sodico de 5 a 20 mM y NaCl de 300 a 400 mM para hacer eluir los hG- CSF que se adsorben sobre la columna.
En la etapa anterior, los peptidos derivados de celulas anfitrionas o los componentes en el medio de cultivo se hacen pasar a traves de la columna o se eliminan durante una etapa de lavado, con el fin de eliminar eficazmente una gran cantidad de impurezas.
La etapa (e) es una etapa de (e) aplicar un eluato obtenido de la cromatograffa de intercambio cationico en la etapa (d) a cromatograffa de interaccion hidrofoba, y una etapa de mejorar la pureza eliminando adicionalmente las impurezas que estan incluidas en el eluato obtenido de la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa anterior.
La cromatograffa de interaccion hidrofoba utilizada en la presente invencion se puede realizar sobre geles con ligandos hidrofobos, adecuadamente alifaticos o aromaticos, libres de carga, unidos a diversas matrices comercialmente disponibles. Los ligandos se pueden acoplar a la matriz mediante tecnicas de acoplamiento convencionales que proporcionan ligandos libres de carga. Los ejemplos de tal tecnica incluyen un metodo de utilizacion del acoplamiento glicidil-eter; un metodo de activacion de una matriz de agarosa con
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glicidoxipropiltrimetoxi-silano en agua y a continuacion inmovilizacion del ligando en alcohol; un metodo de activacion de una matriz de agarosa con bis-epoxido, tal como 1,4-butanodiol diglicidil eter y a continuacion acoplamiento a ligandos tales como aminoalquilo o alquilmercaptano; un metodo de activacion de 1,1-carbonildiimidazol; y un metodo de activacion de divinilsulfona. Los geles resultantes de las tecnicas descritas anteriormente estan libres de carga dentro de todo el intervalo de pH. Los ejemplos del ligando alifatico pueden incluir alquilos lineales tales como propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, alquilos ramificados tales como iso- o neoalquilo y oligoetilenglicol. El ligando aromatico es preferiblemente fenilo. La matriz se puede seleccionar adecuadamente a partir de diversas matrices fuertemente hidrofilas, por ejemplo, una matriz de agarosa tal como sefarosa, una matriz polimerica organica tal como TSK-GEL, y una matriz polimerica organica altamente porosa. La matriz preferida es una matriz de agarosa. Una matriz de agarosa adecuada es sefarosa (Amersham Biosciences), Bio-Gel A (Laboratorios Bio-Rad), Minileak (Kem-En-Tec Diagnostics A/S) o similares. En una realizacion preferida de la presente invencion, la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la presente invencion se lleva a cabo en un gel de butil-sefarosa.
En la presente invencion, la cromatograffa de interaccion hidrofoba se realiza utilizando una solucion tampon dentro del pH que vana de pH 7,0 a 8,5, preferiblemente de pH 7,5 a 8,0, con una concentracion de sal de 100 mM o menos, preferiblemente de 0 a 50 mM como eluyente. La columna de interaccion hidrofoba que se va a utilizar se puede equilibrar con una solucion tampon antes de cargar el eluato. El equilibrado de la columna de interaccion hidrofoba se puede realizar utilizando una solucion tampon acuosa de pH 6,8 a 8,5, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una realizacion preferida de la presente invencion, la columna de interaccion hidrofoba se equilibra con una solucion tampon (pH 7,5) que contiene sulfato de amonio 300 mM y Tris 10 mM por adelantado. Despues de cargar el eluato obtenido en la etapa anterior sobre la columna de interaccion hidrofoba equilibrada para adsorber hG-CSF, la columna se lava con la solucion tampon de equilibrado para eliminar las protemas y las impurezas que no estan adsorbidas sobre la columna. Posteriormente, se aplica a la columna de interaccion hidrofoba una solucion tampon de elucion preparada eliminando sulfato de amonio de la solucion tampon de equilibrado, con el fin de eluir los hG-CSF que estan adsorbidos sobre la columna. A este respecto, se aplican preferentemente de 1 a 4 volumenes de columna de la solucion tampon de elucion. En una realizacion preferida de la presente invencion, se aplican a la columna de 1,2 a 2,5 volumenes de columna de una solucion tampon (pH 7,0 a 8,0) que contiene Tris 5 a 20 mM para hacer eluir los hG-CSF que estan adsorbidos sobre la columna.
En general, antes de realizar la cromatograffa de interaccion hidrofoba, se puede anadir una sal a una fraccion con el fin de aumentar la conductividad de la fraccion. Despues, la elucion se realiza a partir de la matriz utilizando un tampon de baja fuerza ionica. Preferiblemente, en la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la presente invencion, se anade sulfato de amonio al eluato obtenido en la etapa (d), para aumentar su conductividad, similar a la de la solucion tampon de equilibrado. A continuacion, el eluato se carga en la columna de interaccion hidrofoba equilibrada. En la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la presente invencion, el eluato obtenido de la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa anterior se puede cargar tambien sin pretratamiento y los hG- CSF se adsorben sobre la columna. Las impurezas se hacen pasan a traves de la columna o se eliminan durante una etapa de lavado, con el fin de mejorar adicionalmente la eficacia de purificacion.
La etapa (f) es una etapa de aplicacion de un eluato obtenido de la cromatograffa de interaccion hidrofoba en la etapa (e) a cromatograffa de intercambio anionico, y una etapa de eliminacion completa de las impurezas que se incluyen en el eluato obtenido de la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la etapa anterior.
La cromatograffa de intercambio anionico de la presente invencion se lleva a cabo tipicamente utilizando una matriz que contiene un soporte de partmulas insolubles derivatizado con un grupo amina terciaria o cuaternaria (p. ej., dietilaminoetilo, trietilaminoetilo, bencil-dietilaminoetilo). Un soporte adecuado incluye esferas de celulosa, agarosa, dextrano y poliestireno. Preferiblemente, el soporte se derivatiza con el grupo trietilaminoetilo. Los ejemplos de la matriz de intercambio anionico adecuada incluyen Q-sepharose (Amersham Biosciences), Macro-Prep Q (Bio-Rad Laboratories), Q-HyperD (BioSepra, Inc.), Fractogel EMD-TMAE 650 (Merck) o similares. En una realizacion preferida de la presente invencion, la cromatograffa de intercambio anionico de la presente invencion se lleva a cabo utilizando una columna Q-sepharose.
En la presente invencion, la cromatograffa de intercambio anionico se lleva a cabo utilizando una solucion tampon dentro de un pH que vana de pH 6,8 a 8,5, preferiblemente pH 7,0 a 8,0 con una concentracion de sal de 300 mM o menos, preferiblemente de 100 a 250 mM como eluyente. La columna de intercambio anionico que se va a utilizar se puede equilibrar con una solucion tampon antes de cargar el eluato. El equilibrado de la columna de intercambio anionico se puede realizar utilizando una solucion tampon acuosa de pH 6,8 a 8,5, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una realizacion preferida de la presente invencion, la columna de intercambio anionico se equilibra con una solucion tampon (pH 7,5) que contiene Tris 10 mM y urea 100 mM con antelacion. Despues de cargar el eluato obtenido en la etapa previa sobre la columna de intercambio anionico equilibrada para adsorber los hG-CSF a la misma, la columna se lava con la solucion tampon de equilibrado para eliminar las protemas e impurezas que no estan adsorbidas sobre la columna. Posteriormente, se aplica una solucion tampon de elucion preparada por adicion de cloruro de sodio a la solucion tampon de equilibrado a la columna de intercambio anionico, para hacer eluir los hG-CSF que estan adsorbidos sobre la columna. A este respecto, se aplican preferiblemente 1,5 a 5 volumenes de columna de la solucion tampon de elucion. En una realizacion preferida de la presente invencion, se aplican a la columna de 2 a 4 volumenes de columna de una
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solucion tampon (pH 7,0 a 8,0) que contiene Tris 5 a 20 mM, urea 50 a 200 mM y NaCI 150 a 250 mM para hacer eluir los hG-CSF que estan adsorbidos sobre la columna.
Como se ha descrito anteriormente, los hG-CSF se purifican mediante la precipitacion con acido y una serie de cromatograffas de acuerdo con la presente invencion, y los hG-CSF purificados se someten a cromatograffa de alta resolucion de fase inversa y cromatograffa de exclusion por tamano. Como resultado, se obtuvo hG-CSF con una pureza de 99% o mas con un alto rendimiento. Espedficamente, el resultado del analisis de la secuencia N-terminal mostro que el hG-CSF purificado de acuerdo con el metodo de la presente invencion tiene una secuencia identica a la del hG-CSF nativo, y el hG-CSF purificado contiene las protemas derivadas de celulas anfitrionas de 100 ng/mg o menos, los ADN derivados de celulas anfitrionas de 100 pg/mg o menos y enterotoxina de 10 UE/UI de hG-CSF o menos, y muestra una excelente actividad fisiologica. Estos resultados sugieren que, cuando los hG-CSF secretados al periplasma de E. coli recombinante se purifican de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion, se pueden obtener hG-CSF con alta actividad fisiologica y pureza con un alto rendimiento, y tambien se pueden superar la perdida de potencia y la seleccion limitada de columnas.
Ademas, el metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion se caracteriza porque los hG-CSF se pueden purificar con un rendimiento y pureza elevados a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo de E. coli recombinante. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "una gran cantidad de caldo de cultivo" significa un caldo de cultivo obtenido cultivando la E. coli recombinante a un nivel de fermentacion en un medio de 50 L o mas, preferiblemente 80 L o mas y mas preferiblemente 100 L o mas. En una realizacion preferida de la presente invencion, la E. coli recombinante se inocula en 1 L de medio esterilizado para obtener un caldo de cultivo de siembra primario y este caldo de cultivo de siembra se inocula en 14 L de medio esterilizado para obtener un caldo de cultivo de siembra secundario . Finalmente, el caldo de cultivo de siembra secundario se inocula en 120 L de medio esterilizado, seguido de fermentacion. Se utilizan medios adicionales para llevar a cabo el cultivo de alimentacion discontinua, obteniendo de este modo 180 L de caldo de cultivo de E. coli recombinante. Cuando se afslan los hG-CSF y se purifican a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo de E. coli recombinante de acuerdo con el metodo descrito en la Patente Coreana Num. 356140, solo se producen 70 mg de hG-CSF por 1 L. Es decir, el metodo convencional tiene una limitacion en el sentido de que es diffcil producir la protema deseada con pureza y rendimiento elevados. Sin embargo, de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion, aunque el volumen de caldo de cultivo se aumente a escala hasta 100 L o mas, se pueden obtener hG-CSF con una pureza de 99% o mas con un alto rendimiento de 110 mg o mas por 1 L a traves de la precipitacion con acido y una serie de cromatograffas. Por lo tanto, el metodo de purificacion de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar eficazmente para el aislamiento y purificacion de los hG-CSF a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo de E. coli recombinante. Por lo tanto, se puede lograr una mayor productividad mediante su aplicacion industrial.
Modo de la invencion
A continuacion, se describira la presente invencion con mas detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo para propositos ilustrativos, y no se pretende que la invencion este limitada por estos Ejemplos.
Ejemplo de referencia 1 Cultivo de E. coli recombinante que expresa hG-CSF en periplasma
Se inoculo E. coli HM10411 (KCCM-10152, Patente de Corea Num. 356140) transformada con un vector de expresion T017SG que tema una fusion de un peptido senal modificado de enterotoxina II termorresistente de E. coli y hG-CSF en un recipiente de cultivo de vidrio que contema 1 L de medio LB (triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L)) para realizar un cultivo de siembra primario. El medio de cultivo se cultivo a 37°C durante 11 a 13 horas bajo agitacion vigorosa y ventilacion, y a continuacion se inoculo en un recipiente de cultivo que contema 14 L de medio LB esterilizado para realizar un cultivo de siembra secundario durante 2 a 3 horas. El caldo de cultivo obtenido se utilizo como siembra para la fermentacion y se inoculo en 120 L de medio esterilizado con un suplemento de 1,4 g/L de glucosa como fuente de carbono, 10 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de (NH4)2HPO4, 5 g/L de NaCl y 1,2 g/L de MgCh como minerales, una variedad de oligoelementos, extracto de levadura y triptona. Durante la fermentacion, se anadieron glucosa y extracto de levadura adicionales para llevar a cabo un cultivo de alimentacion discontinua durante 25 horas o mas, y el cultivo se completo para proporcionar 180 L de caldo de cultivo. Despues de la finalizacion de la fermentacion, el caldo fermentado se centrifugo a 7.000 rpm y el sedimento celular obtenido se almaceno a -70°C.
Ejemplo 1: Purificacion de hG-CSF a partir de caldo de cultivo de E. coli recombinante <1-1> Extraccion osmotica de protemas periplasmicas
El sedimento de E. coli obtenido en el Ejemplo de Referencia se suspendio en 170 L de solucion tampon de sacarosa (sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, Tris 30 mM, pH 7,5) y se agito durante 90 minutos, seguido de centrifugacion primaria a 7.000 rpm, y de este modo se separo un sedimento. Se anadieron 170 L de agua destilada a 4°C al sedimento separado y se realizo una centrifugacion secundaria a 7.000 rpm para eliminar un sedimento y aislar un sobrenadante que contema protemas periplasmicas. Durante este procedimiento, se extrajeron las protemas presentes en el periplasma de E. coli. Los sobrenadantes obtenidos en los procedimientos de
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centrifugacion primaria y secundaria se analizaron mediante SDS-PAGE (Calles 2 y 3 de la FIG. 1).
<1-2> Precipitacion con acido
Se anadio acido acetico al 1% al sobrenadante que contema protema periplasmica obtenido en el Ejemplo <1-1> para ajustar el pH de 5,6 a 5,7. En este momento, los materiales insolubles incluidos en el sobrenadante se hicieron precipitar mediante tratamiento con acido, y se realizo una filtracion para eliminarlos, con el fin de obtener un sobrenadante que contema hG-CSF. El sobrenadante obtenido por tratamiento con acido y el producto filtrado obtenido por filtracion se analizaron mediante SDS-PAGE (Calles 4 y 5 de la FIG. 1).
<1-3> Cromatograffa de intercambio cationico
La cromatograffa de intercambio cationico del producto filtrado obtenido en el Ejemplo <1-2> se realizo utilizando una columna de SP-sepharose como sigue. El producto filtrado se cargo y adsorbio sobre la columna de SP- sepharose equilibrada con una solucion tampon 1 (acetato de sodio 10 mM, pH 5,4) a una velocidad de flujo de 40 cm/h, y despues las protemas que no habfan sido adsorbidas sobre la columna se eliminaron por lavado con una solucion tampon igual. Posteriormente, se aplican 5 volumenes de columna de la solucion tampon 1 (acetato de sodio 10 mM, pH 5,4) que contema cloruro sodico 300 mM a la columna para hacer eluir los hG-CSF de la columna. El flujo y el eluato obtenidos mediante la cromatograffa de intercambio cationico se analizaron mediante SDS-PAGE (Calles 6 a 8 de la FIG. 1).
<1-4> Cromatograffa de interaccion hidrofoba
El eluato obtenido en el Ejemplo <1-3> se diluyo por adicion de sulfato amonico hasta una concentracion final de 300 mM, y se realizo la cromatograffa de interaccion hidrofoba utilizando una columna de butil-sefarosa como sigue. El eluato se cargo y se adsorbio sobre la columna de butil-sefarosa equilibrada con una solucion tampon 2 (sulfato de amonio 300 mM, Tris 10 mM, pH 7,5) a una velocidad de flujo de 80 cm/h, y a continuacion las protemas que no eran adsorbidas sobre el columna se eliminaron por lavado con una solucion tampon igual. Posteriormente, se aplicaron a la columna 1,5 volumenes de columna de la solucion tampon 2 (Tris 10 mM, pH 7,5), excluyendo el sulfato de amonio, para hacer eluir los hG-CSF de la columna. El flujo y el eluato obtenidos mediante la cromatograffa de interaccion hidrofoba se analizaron por SDS-PAGE (Calles 9 a 10 de la FIG. 1).
<1-5> Cromatograffa de intercambio anionico
El eluato obtenido en el Ejemplo <1-4> se diluyo por adicion de urea hasta una concentracion final de 50 mM, y se realizo una cromatograffa de intercambio anionico utilizando una columna Q-sepharose como sigue. El eluato se cargo y adsorbio sobre la columna Q-sepharose equilibrada con una solucion tampon 3 (Tris 10 mM, pH 7,5, urea 100 mM) a una velocidad de flujo de 60 cm/h, y a continuacion las protemas que no eran adsorbidas sobre la columna se eliminaron por lavado con una solucion tampon igual. Posteriormente, se aplicaron a la columna 3 volumenes de columna de la solucion tampon 3 (Tris 10 mM, pH 7,5, urea 100 mM) que contema cloruro de sodio 250 mM para hacer eluir los hG-CSF de la columna. El eluato obtenido por cromatograffa de intercambio anionico se analizo mediante SDS-PAGE (Calle 2 de la FIG. 2).
Con el fin de examinar la pureza de los hG-CSF purificados a partir de la E. coli recombinante por los procedimientos de los Ejemplos <1-1> a <1-5>, se llevaron a cabo la sDS-PAGE, el analisis de la secuencia N-terminal, la cromatograffa de alta presion de fase inversa, y la cromatograffa de exclusion portamano.
Ejemplo Experimental 1: Analisis SDS-PAGE
En primer lugar, se analizaron el sobrenadante, el flujo de columna y el eluato de columna obtenidos en cada procedimiento de los Ejemplos <1-1> a <1-5>, y un G-CSF patron (NIBSC, Codigo Num. 88/502) mediante SDS- PAGE de acuerdo con un metodo tfpico. Los resultados de la SDS-PAGE se muestran en las FIGS. 1 y 2. En la FIG. 1, la Calle 1 es un G-CSF patron, la Calle 2 es el sobrenadante de la centrifugacion primaria obtenido por extraccion osmotica del Ejemplo <1-1>, la Calle 3 es el sobrenadante de la centrifugacion secundaria obtenido por extraccion osmotica del Ejemplo <1-1>, la Calle 4 es el sobrenadante obtenido por tratamiento con acido en la etapa de precipitacion con acido del Ejemplo <1-2>, la Calle 5 es el producto filtrado obtenido por filtracion en la etapa de precipitacion acida del Ejemplo <1-2>, la Calle 6 es el flujo de columna obtenido de la cromatograffa en columna de SP-sepharose del Ejemplo <1-3>, las Calles 7 y 8 son el eluato de la columna 1 y 2 obtenido de la cromatograffa en columna de SP-sepharose del Ejemplo <1-3>, la Calle 9 es el flujo de columna obtenido de la cromatograffa en columna de butil-sefarosa del Ejemplo <1-4>, y la Calle 10 es el eluato de la columna obtenido de la cromatograffa en columna de butil-sefarosa del Ejemplo <1-4>. En la FIG. 2, la Calle 1 es un Met-hG-CSF patron, y la Calle 2 es el eluato de la columna obtenido de la cromatograffa en columna de Q-sepharose del Ejemplo <1-5>.
Los resultados del analisis de SDS-PAGE mostraron que los hG-CSF aislados y purificados a partir de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion tienen un peso molecular igual al de la forma nativa.
Ejemplo Experimental 2: Analisis de la secuencia N-terminal
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Los hG-CSF purificados por los procedimientos de los Ejemplos <1> a <1-5> se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana transferida se tino utilizando una solucion de Ponceau S y a continuacion se analizo la secuencia N-terminal (15 aminoacidos) en el Korea Basic Science Institute (rama de Seul).
Como resultado, se encontro que la secuencia N-terminal de hG-CSF aislada y purificada a partir de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion era identica a la de la forma nativa y contema las protemas derivadas del anfitrion de 100 ng/mg o menos, los ADN derivados del anfitrion de 100 pg/mg o menos y la enterotoxina de 10 UE/UI hG-CSF o menos.
Ejemplo Experimental 3: Cromatograffa de alta presion de fase inversa
El eluato obtenido en el Ejemplo <1-5> se aplico a una columna de sflice de butilsililo, y despues se anadio TFA/agua al 0,1% y TFA/acetonitrilo al 0,1% como fase movil a la columna para realizar la cromatograffa de alta presion de fase inversa. El cromatograma resultante se muestra en la FIG. 3.
Como se muestra en la FIG. 3, se encontro que los hG-CSF aislados y purificados a partir de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion teman una pureza muy alta mediante la eliminacion eficaz de microvariedades que teman caractensticas similares.
Ejemplo Experimental 4: Cromatograffa de alta presion de exclusion portamano
El eluato obtenido en el Ejemplo <1-5> se aplico a una columna de gel de sflice hidrofila (peso molecular de 20.000 a 200.000), y a continuacion se anadieron fosfato de potasio 20 mM (pH 6,0)/cloruro sodico 200 mM como fase movil a la columna para realizar la cromatograffa de alta presion de exclusion por tamano. El cromatograma resultante se muestra en la FIG. 4.
Como se muestra en la FIG. 4, se encontro que los hG-CSF aislados y purificados a partir de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion teman una pureza muy alta por eliminacion eficaz de peptidos que teman caractensticas similares.
En los Ejemplos Experimentales 1 a 4, se confirmo que se pueden obtener hG-CSF nativos con una pureza de 99% o mas, con un rendimiento de 110 mg por 1 L de caldo de cultivo de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion. Como grupo de comparacion, los hG-CSF se purificaron a partir de la E. coli recombinante de acuerdo con el metodo de purificacion descrito en la Patente Coreana Num. 356140 (resina de intercambio ionico, columna de adsorcion y filtracion en gel o cromatograffa en columna de anticuerpo) y se obtuvieron hG-CSF con una pureza de 99% o mas con un rendimiento de 70 mg por 1 L de caldo de cultivo. Este resultado indica que se pueden obtener hG-CSF con una pureza de 99% o mas con un rendimiento mejorado de 50% o mas por el metodo de purificacion de la presente invencion, en comparacion con el metodo descrito en la Patente Coreana Num. 356140.
Ejemplo Experimental 5: Ensayo de potencia ex vivo
Con el fin de examinar la actividad fisiologica de los hG-CSF obtenidos de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion, los hG-CSF purificados en el Ejemplo <1-5> y un patron internacional (NIBSC) se sometieron a ensayo de potencia ex vivo en celulas de medula osea derivadas de ratones. Espedficamente, los femures se diseccionaron de ratones de 4 a 6 semanas de edad y las celulas de medula osea se cosecharon, y a continuacion se cultivaron a una densidad adecuada. Los hG-CSF purificados y la muestra patron internacional se mezclaron con las celulas de medula osea cultivadas variando la concentracion (100,00, 33,33, 11,11, 3,70, 1,23, 0,41, 0,14, 0,05, 0,02, 0,01 ng/ml) y se cultivaron durante 2 a 3 dfas. Se anadio [metil-H2]timidina al medio de cultivo, y las celulas se cultivaron durante 10 a 20 horas mas. A continuacion, se aislaron las celulas y se midieron los CPM utilizando un contador beta. Como resultado, se encontro que los hG-CSF aislados y purificados de acuerdo con el metodo de purificacion de la presente invencion satisfadan el patron internacional de 0,6 a 1,4 x 108 UI/mg.
Aplicabilidad Industrial
El metodo de la presente invencion puede purificar facilmente el factor estimulador de colonias de granulocitos humanos, de una manera identica a la forma nativa expresada en el organismo humano, con rendimiento y pureza elevados sin un proceso de activacion adicional. En particular, de acuerdo con el metodo de la presente invencion, las variantes de hG-CSF expresadas en E. coli se eliminan eficazmente para obtener hG-CSF fisiologicamente activos con una alta pureza.

Claims (19)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para purificar factores estimuladores de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF) a partir de una E. coli recombinante con un alto rendimiento, que comprende las etapas de:
    (a) cultivar una E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un sedimento celular por centrifugacion;
    (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del sedimento celular obtenido en la etapa (a);
    (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un acido para separar el precipitado resultante por filtracion;
    (d) aplicar un producto filtrado obtenido en la etapa (c) a cromatograffa de intercambio cationico;
    (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a cromatograffa de interaccion hidrofoba; y
    (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a cromatograffa de intercambio anionico.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde en la etapa (a), los hG-CSF se expresan en el periplasma de E. coli recombinante.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la E. coli recombinante es una o mas seleccionadas del grupo que consiste en E. coli BL21 (DE3)/pT14SS1SG (HM 10310), E. coli BL21 (DE3)/pT14SS1S17SEG (HM 10311; Num. de acceso KCCM-10154), E. coli BL21(DE3)/pTO1SG (HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTO1S17SG (HM 10410, Num. de acceso KCCM-10151), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG (HM 10411, Num. de acceso KCCM- 10152), E. coli BL21(DE3)/pTO17TG (HM 10413), E. coli BL21 (DE3)/pTO17AG (HM 10414), E. coli BL21 (DE3)/pTO17GG (HM 10415), E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3VG (HM 10510, Num. de acceso KCCM-10153), E. coli BL21(DE3)/pBAD17SG (HM 10511) y E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG (HM 10512).
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde en la etapa (b), el sobrenadante que contiene hG - CSF se separa del sedimento celular por extraccion osmotica.
  5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde la extraccion osmotica se realiza tratando el sedimento celular con una solucion tampon que contema sacarosa del 10% al 30% para obtener un sedimento celular por centrifugacion, anadiendo agua destilada al sedimento celular y luego realizando la centrifugacion.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde en la etapa (c), el pH del sobrenadante se ajusta de 5,0 a 5,8 portratamiento con acido.
  7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el acido de la etapa (c) se selecciona del grupo que consiste en acido acetico, acido fosforico y acido cftrico.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa (d) se realiza utilizando una columna seleccionada del grupo que consiste en sefarosa, sefadex, agarosa, sefacel, poliestireno, poliacrilato, celulosa y Toyoperl.
  9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa (d) se lleva a cabo utilizando una columna SP-sepharose.
  10. 10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa (d) se lleva a cabo utilizando una solucion tampon que contiene acido acetico dentro del pH que oscila de pH 4,0 a 6,0 con una concentracion de sal de 200 a 500 mM.
  11. 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la cromatograffa de intercambio cationico de la etapa
    (d) se lleva a cabo utilizando una solucion tampon que contiene cloruro de sodio de 200 a 500 mM y acetato de sodio de 5 a 20 mM a pH de 5,0 a 6,0.
  12. 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la etapa (e) se lleva a cabo utilizando una columna de sefarosa, Bio - Gel A o Minileak que tiene un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, isoalquilo, neoalquilo y oligoetilenglicol.
  13. 13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la etapa
    (e) se realiza utilizando una columna de butil-sefarosa.
  14. 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la etapa (e) se lleva a cabo utilizando una solucion tampon dentro de un pH que vaffa de pH 7,0 a 8,5 con una concentracion de sal de 0 a 100 mM.
  15. 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde la cromatograffa de interaccion hidrofoba de la etapa (e) se realiza utilizando una solucion tampon que contiene Tris de 5 a 20 mM a pH de 7,0 a 8,0.
  16. 16. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de intercambio anionico de la etapa (f) se realiza utilizando una columna seleccionada del grupo que consiste en Q-sepharose, Macro-Prep Q, Q-HyperD y Fractogel EMD-TMAE 650.
  17. 17. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 16, en donde la cromatograffa de intercambio anionico de la etapa (f) 5 se lleva a cabo utilizando una columna Q-sepharose.
  18. 18. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cromatograffa de intercambio anionico de la etapa (f) se lleva a cabo utilizando una solucion tampon dentro de un pH que vana de pH 6,5 a 8,5 con una concentracion de sal de 100 a 300 mM.
  19. 19. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 18, en donde la cromatograffa de intercambio anionico de la etapa (f) 10 se lleva a cabo utilizando una solucion tampon que contiene cloruro sodico de 100 a 300 mM, Tris de 5 a 20 mM y
    urea 50 a 200 mM a pH 7,0 a 8,0.
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