CN105199016A - Deae-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用，涉及凝胶微球。制备方法：1)制备琼脂凝胶裸球；2)制备琼脂凝胶微球；3)将琼脂凝胶微球移入烧瓶中，加入DEAE-HCl，另将NaOH溶液置于烧杯中，密封后预热，再将预热后的烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，反应3h以上，再取出烧瓶，用水冷却，得琼脂微球；4)将琼脂微球洗涤，即得到DEAE-琼脂凝胶微球。所述DEAE-琼脂凝胶微球可在分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白中应用。所得层析介质分离效果良好、成本低廉，得到的紫菜R-藻红蛋白、螺旋藻C-藻蓝蛋白达到试剂级纯度，可应用于食品、化妆品、保健品、医药和荧光试剂等领域。

Description

DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及凝胶微球，尤其是涉及DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法与应用。

背景技术

藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)是多亚基超大分子量的蛋白色素复合物，与别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)一起构成棒状的藻胆体,附着在类囊体膜的外表面上，构成藻类的捕光系统；除了在光合作用中捕获光量子、传递能量外，还作为储存的蛋白能够使藻类在氮源缺乏的季节维持生存。藻红蛋白根据来源和光谱特性的不同可分为R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白和C-藻红蛋白，藻蓝蛋白则有R-藻蓝蛋白和C-藻蓝蛋白两种。

藻红蛋白和藻蓝蛋白作为水溶性的大分子量功能蛋白，用途极为广泛，可应用于医学诊断、肿瘤光动力治疗、食品和化妆品的添加剂等。藻红蛋白、藻蓝蛋白的光吸收系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、背景光干扰小、不易淬灭、稳定性强，可与特异的抗体或其它的生物分子发生结合，故常作为荧光试剂应用于医学诊断、免疫化学和生物工程等研究领域(流式细胞仪、荧光活细胞分选、荧光免疫分析等)；藻红蛋白、藻蓝蛋白作为肿瘤光动力治疗的最具有开发潜力的光敏剂，可在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的杀伤，有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快，具有高效、无毒、副作用小等优点(要用作分子探针和光敏剂的藻红蛋白、藻蓝蛋白，纯度分别要求A565/A280>4.0、A620/A280>4.0，即试剂级纯度)；藻红蛋白、藻蓝蛋白还具有一系列重要的生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗炎症、抗辐射、提高人体免疫力等，可制成保健食品和药品用于保健、医疗上；食品级藻红蛋白可以取代人工合成色素，用作普通食品和化妆品的添加剂，不仅可以避免人工色素对人体可能的副作用，而且可以使食品色彩艳丽、使化妆品的美容修饰和养颜护肤效果增强。目前我国生产的藻红蛋白多为食品级。高纯度的藻红蛋白生产技术基本由Sigma公司垄断，价格十分昂贵：货号为P8912的R-藻红蛋白标准品价格为6961.50元/mg，货号为52412的试剂级纯度(A566/A280>4.6)R-藻红蛋白价格为1572.48元/mg，货号52468的C-藻蓝蛋白(A620/A280>3.5,A651/A620<0.3)价格为1590.03元/mg(Sigma公司2015年产品目录)。

高纯度藻红蛋白、藻蓝蛋白的制备，是将原料进行细胞破碎、盐析、冷冻离心、透析或超滤等预处理之后，再通过羟基磷灰石柱层析结合离子交换层析进行纯化。所用的离子交换层析填料最常见的是进口的DEAE-Sepharose，Sigma公司给出的报价是1856.79元/50mL；使用GE公司的DEAE-SepharoseFF、SephadexG-150、SephacrylS-200HR等凝胶介质，价格同样十分昂贵，只适合用于实验室研究。因此，制备出高效、经济、易于放大的柱层析介质对于规模化生产高纯度的藻红蛋白来说是首要的任务。

目前的国内外文献中应用离子交换层析介质分离藻红蛋白的纯度多在A565/A280＝5.0左右，藻蓝蛋白多为A620/A280＝4.5左右。郑蔚然(郑蔚然.坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究[D].浙江工业大学.2008)通过HA柱和DEAE-SepharoseF.F离子交换柱层析得到纯度5.3的坛紫菜R-PE；S.N.Tripathi等人(S.N.Tripathi,ShivaliKapoor,AlpanaShrivastava.ExtractionandpurificationofanunusualphcoerythrininaterrestrialdesiccationtolerantcyanobacteriumLyngbyaarboricola[J].JApplPhycol,2007,19:441-447)应用SephacrylS300HR凝胶层析和DEAE-cellulose可得到纯度5.24的藻红蛋白；Jian等人(Jian-FengNiu,Zhang-FanChen,Guang-CeWang,etc.PurificationofphycoerythrinfromPorphyrayezoensisUeda(Bangiales,Rhodophyta)usingexpandedbedabsorption[J].JApplPhycol,2010,22:25-31)利用Phenyl-Sepharose和DEAE-Sepharose可从条斑紫菜中提取出纯度4.5的R-PE；Caroline等人(CarolineCostaMoraes,SusanaJulianoKalil.StrategyforaproteinpurificationdesignusingC-phycocyaninextract[J].BioresourceTechnology,2009,(100):5312-5317)使用强阴离子交换介质QSepharose和分子排阻凝胶SephacyrlS-100HR从螺旋藻中提取纯度4.0的C-PC；廖晓霞等人(廖晓霞，张学武.高效分离纯化藻蓝蛋白新法[J].食品工业科技,2011,32(6):273-275)先用壳聚糖和活性炭处理藻胆蛋白粗品，再用DEAE-SephadexA-25凝胶层析，可得纯度4.3的藻蓝蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供DEAE-琼脂凝胶微球及其制备方法。

本发明的另一目的是提供DEAE-琼脂凝胶微球在分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白中的应用。

所述DEAE-琼脂凝胶微球的化学结构式为：

其中，M代表琼脂糖或者硫琼胶；DEAE中的卤代Cl原子以离子的形式结合在氨基上。

所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

1)将琼脂粉加入三口烧瓶，再加入水，加热溶解，得琼脂溶液；另在反应釜中加入环己烷和司班85，将琼脂溶液倒入反应釜，在70℃下搅拌，冷却后取出混合液，放置直到微球沉降，再洗涤，得琼脂凝胶裸球；

2)在三口瓶中加入步骤1)得到的琼脂凝胶裸球和水，加热搅拌下加入环氧氯丙烷，待溶解后，加入NaOH溶液，将水浴温度升至60℃，持续搅拌，冷却至室温后加入水，调pH至5～6，再用水和乙醇交替洗净后，所得的琼脂凝胶微球保存在乙醇中；

3)将步骤2)所得琼脂凝胶微球移入烧瓶中，加入DEAE-HCl，另将NaOH溶液置于烧杯中，密封后预热，再将预热后的烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，反应3h以上，再取出烧瓶，用水冷却，得琼脂微球；

4)将步骤3)得到的琼脂微球洗涤，即得到DEAE-琼脂凝胶微球。

在步骤1)中，所述琼脂粉与水的配比可为90g∶1500mL；所述加热的温度可为100℃；所述环己烷和司班85的体积比可为2.8∶0.75，所述搅拌的条件可在400r/min下搅拌40min后；所述洗涤可采用质量百分浓度为20％的酒精洗涤。

在步骤2)中，所述琼脂凝胶裸球、水、环氧氯丙烷的配比可为25g∶35mL∶2mL，所述水可采用去离子水；所述加热搅拌的条件可在35℃，200r/min条件下搅拌；所述NaOH溶液的加入量按质量百分比可为环氧氯丙烷的40％，所述加入NaOH溶液的流速可为0.2mL/min；所述持续搅拌的时间可为5h；所述调pH至5～6可采用质量百分浓度为60％的醋酸调pH至5～6；所述再用水和乙醇交替洗净的乙醇可采用质量百分浓度为50％的乙醇；所述琼脂凝胶微球保存在乙醇中的乙醇可采用质量百分浓度为20％的乙醇.

在步骤3)中，所述DEAE-HCl、NaOH溶液、琼脂凝胶微球的体积比可为8∶8∶5，所述DEAE-HCl的摩尔浓度可为1.0～4.0mol/L，NaOH溶液的摩尔浓度可为1.0～4.0mol/L；所述预热可采用在水浴锅中预热，预热的温度可为40～80℃，预热的时间可为10min。

在步骤4)中，所述洗涤可将步骤3)得到的琼脂微球在布氏漏斗中用蒸馏水洗涤；所得DEAE-琼脂凝胶微球可用质量浓度为20％的乙醇溶液保存备用或直接用于分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白。

将琼脂凝胶微球改造成DEAE-琼脂凝胶微球，主要反应路线如下：

其中，M代表琼脂糖或者硫琼胶。DEAE中的卤代Cl原子共价结合在给电子基团三乙氨基上(原料中C旁边的Cl以共价形式存在，反应后为离子形式)，电子云密度增大，具有很强的亲核反应能力，在碱性条件下，很容易与琼脂糖上的羟基发生缩合反应，生成的HCl被NaOH中和，使该反应向右移动。

所述DEAE-琼脂凝胶微球可在分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白中应用。

所述用DEAE-琼脂凝胶微球分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白的方法，具体步骤如下：

将A565/A280、A620/A280的值为3.0左右的R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白上样于直径φ＝1.0～2.6cm、高度h＝20～70cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以0.3～1.5BV/h的流速、含有0.05～1.0mol/LNaCl的0.05～0.3mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集各洗脱组分并检测A565/A280、A620/A280的值，得到试剂级纯度的紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白，冻干保存。

所制备的DEAE-琼脂凝胶微球，其离子交换容量的测定方法如下：

(1)取10mLDEAE-琼脂凝胶微球，用大量蒸馏水洗涤后真空抽干；

(2)用2.0mol/LNaCl250mL浸洗，真空抽干；

(3)依次用500mL0.1mol/LHCl、2000mL0.0001mol/LHCl、2000mL纯化水洗涤，真空抽干；

(4)用500mL10％Na₂SO₄滤洗，用SO₄ ^2-置换出介质上的Cl^-，收集滤液；

(5)滤液用0.05mol/LAgNO₃滴定，测定Cl^-的量，以1mL5％K₂CrO₄为指示剂。

由滴定所得的Cl^-摩尔数除以DEAE-琼脂凝胶微球的体积可得它的离子交换容量E(mmol/L)，约为0.060mmol/mL。

所制得的DEAE-琼脂凝胶微球，其使用方法如下：

(1)将质量百分浓度为20％乙醇溶液保存的DEAE-琼脂凝胶微球用蒸馏水滤洗至无醇味，再用0.01M磷酸盐缓冲液浸泡；

(2)取层析柱竖直固定在架上，在层析柱中预先加入液面高度约5cm的0.1M磷酸盐缓冲液；

(3)将DEAE-琼脂凝胶搅拌成均匀糊状后，用玻璃棒引流，沿着内壁匀速倒入层析柱中，注意避免装柱时的凝胶中产生气泡、断层或裂纹；

(4)用4～6倍柱体积的0.01M磷酸盐缓冲液压实、平衡凝胶柱，吸弃上清液至液面与胶面平齐，沿着内壁加入澄清的样品溶液，注意防止胶面平整性被破坏；

(5)用适宜的洗脱条件洗脱样品，收集不同组分；

(6)洗脱结束后，将凝胶柱用3～4倍柱体积的高浓度缓冲液或0.1mol/LNaOH溶液再生，再用4～6倍0.01M磷酸盐缓冲液平衡以备下次使用，或浸泡在20％乙醇中长期保存。

本发明采用的交联琼脂凝胶微球呈球形，以琼脂凝胶微球总质量计，琼脂凝胶微球中的琼脂含量为6％～10％，粒径在50～120μm范围内均匀分布，机械强度高，在高压灭菌锅中120℃灭菌30min条件下不破裂。

紫菜R-藻红蛋白、螺旋藻C-藻蓝蛋白与DEAE-琼脂凝胶微球的结合力取决于彼此间相反电荷基团的库仑力，这种作用力与平衡和洗脱溶液的pH及离子浓度有关，pH值决定了DEAE-琼脂凝胶微球和R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白的电离程度，洗脱液中带负电荷的离子与R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白竞争DEAE-琼脂凝胶微球上带正电的三乙氨基。通过调整平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度可以使R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白在DEAE-琼脂凝胶微球上实现吸附和解吸，本发明使用pH约为7.0的低浓度磷酸盐缓冲液作为平衡和洗脱缓冲液，有良好的分辨率且保持R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白的稳定。

本发明选用人工养殖的紫菜提取R-藻红蛋白，用天然螺旋藻提取C-藻蓝蛋白，具有来源广泛、成本低、含量较高等优点，极具研究和生产价值。

柱层析所用的DEAE-琼脂凝胶微球离子交换容量约为0.060mmol/L,是GE公司DEAE-SepharoseFastFlow的离子交换容量(0.110～0.160mmol/L)的0.38～0.55倍，但由于使用琼脂代替琼脂糖为原料，成本仅为后者的2.5％～4％，在R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白分离方面效果相近，可大规模制备和使用。

本发明通过调控一定的温度、pH、反应物的量等条件，将琼脂凝胶微球与DEAE偶联，改造成弱阴离子交换介质；由于琼脂凝胶微球利用琼脂为原料，相对于以琼脂糖为原料制备的Sepharose琼脂糖凝胶微球，制备成本仅为后者的2.5％～4％，可以大规模用于试剂级纯度的紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白的分离。

本发明所得的层析介质分离效果良好、成本低廉，得到的紫菜R-藻红蛋白、螺旋藻C-藻蓝蛋白达到试剂级纯度，可应用于食品、化妆品、保健品、医药和荧光试剂等领域。

附图说明

图1为纯度为5.0的紫菜R-藻红蛋白在259～700nm范围内的扫描光谱。

图2为纯度为4.3的紫菜R-藻红蛋白在259～700nm范围内的扫描光谱。

图3为纯度为4.4的螺旋藻C-藻红蛋白在220～700nm范围内的扫描光谱。

图4为纯度为4.1的螺旋藻C-藻红蛋白在200～700nm范围内的扫描光谱。

图5为DEAE-琼脂凝胶微球分离紫菜R-藻红蛋白的洗脱曲线。

图6为DEAE-琼脂凝胶微球分离螺旋藻C-藻蓝蛋白的洗脱曲线。

图7为DEAE-琼脂凝胶微球的微观形态。

图8为DEAE-琼脂凝胶微球的粒径分布。

具体实施方式

实施例1

将90g琼脂粉加入三口烧瓶，加入1500mL纯化水，100℃加热并搅拌至完全溶解。往5L反应釜中加入2.8L环己烷和750mL司班85，将溶解完全的琼脂溶液趁热倒入反应釜，70℃、400r/min搅拌40min后停止搅拌，缓慢冷却，取出混合液，放置直到微球沉降，用20％酒精洗涤并保存。在250mL三口瓶中加入25g上述琼脂凝胶裸球和35mL去离子水，35℃、200r/min条件下加入2mL环氧氯丙烷，搅拌溶解1h。之后以0.2mL/min的流速滴加40％的NaOH溶液，持续50min。将水浴温度升至60℃，持续搅拌5h。冷却至室温，加入100mL去离子水，用60％醋酸调pH至5～6。用去离子水和50％乙醇交替洗净后，所得的微球保存在20％乙醇中。

实施例2

取50mL实施例1的琼脂凝胶微球用大量蒸馏水洗涤，真空抽滤至液面与胶面平齐，移入500mL烧瓶中，加入80mL1.0mol/L的DEAE-HCl，另取80mL1.5mol/LNaOH溶液置于500mL烧杯中。密封后放入水浴锅中45℃预热，10min后将烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，开始反应。反应3h后，取出烧瓶，用水冷却。琼脂微球在布氏漏斗中用蒸馏水洗涤，得到DEAE-琼脂凝胶微球，离子交换容量约为0.060mmol/mL，备用。

实施例3

取50mL实施例1的琼脂凝胶微球用大量蒸馏水洗涤，真空抽滤至液面与胶面平齐，移入500mL烧瓶中，加入80mL1.6mol/L的DEAE-HCl，另取80mL2.5mol/LNaOH溶液置于500mL烧杯中。密封后放入水浴锅中70℃预热，10min后将烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，开始反应。反应4h后，取出烧瓶，用水冷却。琼脂微球在布氏漏斗中用蒸馏水洗涤，得到DEAE-琼脂凝胶微球，离子交换容量约为0.065mmol/mL，备用。

实施例4

取50mL实施例1的琼脂凝胶微球用大量蒸馏水洗涤，真空抽滤至液面与胶面平齐，移入500mL烧瓶中，加入80mL3.0mol/L的DEAE-HCl，另取80mL3.5mol/LNaOH溶液置于500mL烧杯中。密封后放入水浴锅中80℃预热，10min后将烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，开始反应。反应3.5h后，取出烧瓶，用水冷却。琼脂微球在布氏漏斗中用蒸馏水洗涤，得到DEAE-琼脂凝胶微球，离子交换容量约为0.062mmol/mL，备用。

实施例5

取3mgA565/A280值在3.0左右的R-藻红蛋白样品，上样于φ＝1.6cm、h＝35cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以0.3BV/h的流速、含有0.05～0.5mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集试剂级纯度的紫菜R-藻红蛋白，冻干，得1.8mg纯度5.0的R-藻红蛋白(如图1所示)，得率为60％。冻干粉置于-20℃避光保存。

实施例6

将6.2mgR-藻红蛋白粗品上样于φ＝2.6cm、h＝65cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以1.5BV/h的流速、含有0.05～1.0mol/LNaCl的0.3mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集试剂级纯度的紫菜R-藻红蛋白，冻干，得3.4mg纯度4.3的R-藻红蛋白(如图2所示)，得率为55％。冻干粉置于-20℃避光保存。

实施例7

取2.3mgA620/A280值在3.0左右的C-藻蓝蛋白样品，上样于φ＝1.0cm、h＝20cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以0.6BV/h的流速、含有0.1～0.4mol/LNaCl的0.2mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集试剂级纯度的螺旋藻C-藻蓝蛋白，冻干，得1.5mg纯度4.4的C-藻蓝蛋白(如图3所示)，得率为65％。冻干粉置于-20℃避光保存。

实施例8

取3.8mgA620/A280值在3.0左右的C-藻蓝蛋白样品，上样于φ＝1.6cm、h＝55cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以1.1BV/h的流速、含有0.05～0.7mol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集试剂级纯度的螺旋藻C-藻蓝蛋白，冻干，得2.6mg纯度4.1的C-藻蓝蛋白(如图4所示)，得率为68％。冻干粉置于-20℃避光保存。

DEAE-琼脂凝胶微球分离紫菜R-藻红蛋白的洗脱曲线参见图5，DEAE-琼脂凝胶微球分离螺旋藻C-藻蓝蛋白的洗脱曲线参见图6，DEAE-琼脂凝胶微球的微观形态参见图7，DEAE-琼脂凝胶微球的粒径分布参见图8。

本发明将藻胆蛋白粗品上样于自制的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，优化洗脱条件，得到试剂级纯度的R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白(A565/A280>4.0，A620/A280>4.0)，冻干保存。本发明纯化效果好、分离速率快、上样量大、得率较高、能耗低、自制的层析介质成本低廉、原料价廉易得，适合用于紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白的规模化制备。

Claims (10)

1.DEAE-琼脂凝胶微球，其特征在于其化学结构式为：

其中，M代表琼脂糖或者硫琼胶；DEAE中的卤代Cl原子以离子的形式结合在氨基上。

2.如权利要求1所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将琼脂粉加入三口烧瓶，再加入水，加热溶解，得琼脂溶液；另在反应釜中加入环己烷和司班85，将琼脂溶液倒入反应釜，在70℃下搅拌，冷却后取出混合液，放置直到微球沉降，再洗涤，得琼脂凝胶裸球；

2)在三口瓶中加入步骤1)得到的琼脂凝胶裸球和水，加热搅拌下加入环氧氯丙烷，待溶解后，加入NaOH溶液，将水浴温度升至60℃，持续搅拌，冷却至室温后加入水，调pH至5～6，再用水和乙醇交替洗净后，所得的琼脂凝胶微球保存在乙醇中；

3)将步骤2)所得琼脂凝胶微球移入烧瓶中，加入DEAE-HCl，另将NaOH溶液置于烧杯中，密封后预热，再将预热后的烧杯中的NaOH倒入烧瓶中，封口，开动旋转蒸发仪，反应3h以上，再取出烧瓶，用水冷却，得琼脂微球；

4)将步骤3)得到的琼脂微球洗涤，即得到DEAE-琼脂凝胶微球。

3.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述琼脂粉与水的配比为90g∶1500mL；所述加热的温度可为100℃。

4.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述环己烷和司班85的体积比为2.8∶0.75，所述搅拌的条件可在400r/min下搅拌40min后；所述洗涤可采用质量百分浓度为20％的酒精洗涤。

5.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述琼脂凝胶裸球、水、环氧氯丙烷的配比为25g∶35mL∶2mL。

6.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述水采用去离子水；所述加热搅拌的条件可在35℃，200r/min条件下搅拌；所述NaOH溶液的加入量按质量百分比可为环氧氯丙烷的40％，所述加入NaOH溶液的流速可为0.2mL/min；所述持续搅拌的时间可为5h；所述调pH至5～6可采用质量百分浓度为60％的醋酸调pH至5～6；所述再用水和乙醇交替洗净的乙醇可采用质量百分浓度为50％的乙醇；所述琼脂凝胶微球保存在乙醇中的乙醇可采用质量百分浓度为20％的乙醇。

7.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述DEAE-HCl、NaOH溶液、琼脂凝胶微球的体积比为8∶8∶5，所述DEAE-HCl的摩尔浓度可为1.0～4.0mol/L，NaOH溶液的摩尔浓度可为1.0～4.0mol/L；所述预热可采用在水浴锅中预热，预热的温度可为40～80℃，预热的时间可为10min。

8.如权利要求2所述DEAE-琼脂凝胶微球的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗涤是将步骤3)得到的琼脂微球在布氏漏斗中用蒸馏水洗涤；所得DEAE-琼脂凝胶微球可用质量浓度为20％的乙醇溶液保存备用或直接用于分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白。

9.如权利要求1所述DEAE-琼脂凝胶微球在分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白中应用。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于用DEAE-琼脂凝胶微球分离高纯度紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白的方法，具体步骤如下：

将A565/A280、A620/A280的值为3.0左右的R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白上样于直径φ＝1.0～2.6cm、高度h＝20～70cm的DEAE-琼脂凝胶微球层析柱，以0.3～1.5BV/h的流速、含有0.05～1.0mol/LNaCl的0.05～0.3mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集各洗脱组分并检测A565/A280、A620/A280的值，得到试剂级纯度的紫菜R-藻红蛋白和螺旋藻C-藻蓝蛋白，冻干保存。