CN109627308A - 一种藤壶胶蛋白透析工艺和获得两种不同类型蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种藤壶胶蛋白透析工艺，包括以下步骤：将藤壶胶蛋白溶液装入透析袋内，以去离子水为透析液进行透析；所述透析过程中使透析液全程处于磁力搅拌下；所述透析过程中多次更换透析液；所述透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白，直至完成透析过程。本发明还相应提供一种从含Trx‑Balcp19k蛋白溶液中同时收集获得两种不同类型蛋白的方法。本发明通过控制透析液的更换频率以及更换时机，并及时收集透析袋内壁的胶态蛋白以提供更大的蛋白吸附界面，可以得到更多的粘性胶态蛋白，成胶率更高。另外，本发明可显著缩短透析时间，在同样成胶率的情况下，可由原来的12h缩短至约8‑10h。

Description

一种藤壶胶蛋白透析工艺和获得两种不同类型蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及一种生物材料的透析工艺及获得蛋白的方法。

背景技术

海洋中强势污损生物藤壶通过分泌蛋白性的生物胶(藤壶胶)在水下物体表面粘附固化，实现永久附着和污损。藤壶胶是一种多蛋白复合物，其依赖多种蛋白质的相互协同作用在复杂水环境下发挥极强的粘附能力。这种粘附模型给人类研究水下强力胶粘剂提供了新的灵感，在防污新技术、水下修补和生物医学等领域具有重要的应用价值。

专利CN105031717A中通过大肠杆菌异源表达的方法获得的重组藤壶胶蛋白cp19k，通过特定的透析纯化工艺，能够获得一种粘性很好的胶状物。但上述专利中胶态蛋白的产量较少，透析时间较长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种透析时间短、粘性胶状蛋白产量大的藤壶胶蛋白透析工艺，并相应提供一种从含Trx-Balcp19k蛋白溶液中同时收集获得两种不同类型蛋白的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种藤壶胶蛋白透析工艺，包括以下步骤：

将藤壶胶蛋白溶液装入透析袋内，以去离子水为透析液进行透析；

所述透析过程中使透析液全程处于磁力搅拌下；

所述透析过程中多次更换透析液；

所述透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白，直至完成透析过程。

上述藤壶胶蛋白透析工艺中，优选的，所述藤壶胶蛋白为Trx-Balcp19k蛋白。

上述藤壶胶蛋白透析工艺中，优选的，透析袋内Trx-Balcp19k蛋白溶液的浓度为2.0-2.4mg/mL，多次更换透析液是指每隔2-2.5h更换一次透析液，且更换次数为3次。发明人研究发现，随着透析过程的进行，透析袋内蛋白溶液与透析液进行离子交换，第一次更换透析液后，理论上透析袋内蛋白溶液与透析液的离子强度已经相差很大(几十倍或上百倍)，继续更换透析液理论上作用不大，反而会造成透析液的浪费，但发明人意外的发现，控制更换透析液的时机与次数对提高胶态蛋白的成胶率具有明显的提升作用。进一步优选的，第一次更换透析液时控制成胶比率为6-8％，第二次更换透析液时控制成胶比率为18-20％，第三次更换透析液时控制成胶比率为36-40％。更换透析液的时机需要同时满足时间与成胶比率的要求，最终成胶率更高，且透析时间更短。

上述藤壶胶蛋白透析工艺中，优选的，透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白是指：当胶态蛋白的吸附界面占透析袋内壁总面积的20-40％(更优选为30％)时，用移液枪枪尖从透析袋内壁收集胶态蛋白再继续透析。当胶态蛋白的吸附界面占透析袋总吸附界面的20-40％时，肉眼基本能观察到胶状物已经形成，此时即可进行收集，为后续蛋白形成胶状物提供新的界面，有利于收集更多的胶态蛋白。

上述藤壶胶蛋白透析工艺中，优选的，完成透析过程是指：当透析袋内的离子强度小于200μs/cm时结束透析。透析袋内离子强度太低，再继续透析，会造成透析液的浪费，还会消耗大量的时间，综合考虑后发现当透析袋内的离子强度小于200μs/cm时结束透析，在成胶率、经济成本与时间成本上最合适。

上述藤壶胶蛋白透析工艺的原理如下：1)Trx-Balcp19k蛋白溶液在去离子水中透析时，小分子物质(咪唑，盐离子等)能自由地通过透析膜，而Trx-Balcp19k蛋白分子被截留在透析袋内。随着透析的进行，蛋白质溶液中的盐离子不断减少，当蛋白溶液中的离子强度降到一定值时，静电相互作用、疏水相互作用得以展现并推动蛋白质发生聚集，形成含水量高且高度有序的三维网络结构或基体，即“粘性胶状物质”。2)透析液全程采用磁力搅拌的方法促进离子交换，透析过程中更换透析液可有效缩短透析时长。本发明中增加透析液的更换频率与更换时机主要是为了减少透析时间，增加成胶率，收集透析袋内壁粘性物质为了增加胶状物质的收集量，另外，收集透析袋内粘性物质，给未形成胶状物的蛋白质提高新界面，使透析内、外液中的离子交换速率提高，在一定程度上可以缩短透析的时间。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种从含Trx-Balcp19k蛋白溶液中同时收集获得两种不同类型蛋白的方法，包括以下步骤：

将藤壶胶蛋白溶液装入透析袋内，以去离子水为透析液进行透析；

所述透析过程中使透析液全程处于磁力搅拌下；

所述透析过程中多次更换透析液；

所述透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白，直至完成透析过程；

完成透析过程后，从透析袋内壁收集得到的胶态蛋白累积得到第一种粘性胶态蛋白；将透析后的蛋白上清液中直接经过冷冻干燥获得第二种蛋白。

研究表明，透析后的蛋白上清液直接经过冷冻干燥后也具有较强的粘接性能，但其相比于从透析袋内壁收集的粘性胶态蛋白经冷冻干燥后得到的蛋白样品相比，有以下不足：1、两者的溶解性不同，前者难溶于水，而后者易溶于水；2、两者的形态结构也不同，前者呈棉花状，而后者呈块状；3、二级结构也存在很大的差异；4、粘接性能后者更优。蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲四种类型。冻干后的蛋白上清液和从透析袋内壁收集的粘性胶态蛋白的二级结构存在很大的差异是指：两者的二级结构种类和比例不同。经红外分析结果如下：冻干后的蛋白上清液具有以下性质：吸水前：β-折叠(37.78％)、α-螺旋(53.36％)、无规则卷曲(0)；吸水后：β-折叠(36.22％)、α-螺旋(33.91％)、无规则卷曲(16.75％)。从透析袋内壁收集的粘性胶态蛋白经冷冻干燥后得到的蛋白样品具有以下性质：吸水前：β-折叠(11.37％)、α-螺旋(0.61％)、无规则卷曲(57.67％)；吸水后：β-折叠(48.05％)、α-螺旋(43.01％)、无规则卷曲(1.60％)。由上述数据可以看出，冻干后的蛋白上清液和从透析袋内壁收集的粘性胶态蛋白存在的二级结构种类和比例差异很大，而不同的二级结构导致蛋白的高级结构和性能也不相同。Trx-Balcp19k蛋白胶状物部分具有更优的粘附性能可能与其含有大量β折叠结构有关，在合适的条件下在材料表面自组装形成致密的网状结构。从粘性来看，本发明中从透析袋内壁收集的粘性胶态蛋白经冷冻干燥后得到的蛋白样品比冻干后的蛋白上清液直接经过冷冻干燥得到的样品性能更优。本发明中，第二种蛋白的应用体系可与第一种粘性胶态蛋白不同，可以扩大Trx-Balcp19k蛋白溶液的应用范围。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、现有常规技术中采用透析袋对蛋白溶液透析除盐的过程中发现，随着透析过程的进行，袋内溶液变得浑浊，透析结束时在透析袋内壁形成了一定量的粘性胶状物质，但是并非溶液中的所有蛋白质都会在透析袋上聚集，cp19k蛋白的损耗量较大，且透析耗时过长。本发明通过控制透析液的更换频率以及更换时机，并及时收集透析袋内壁的胶态蛋白以提供更大的蛋白吸附界面，可以得到更多的粘性胶态蛋白，成胶率更高。

2、本发明可显著缩短透析时间，在同样成胶率的情况下，可由原来的12h缩短至约8-10h。

3、本发明从含Trx-Balcp19k蛋白溶液中同时收集获得了两种不同类型蛋白，两种蛋白各具特点，大大提升了Trx-Balcp19k蛋白溶液的应用范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中不同透析时间的透析袋对比图。

图2为本发明实施例中粘接性能测试示意图(图中A代表实施例1，B代表实施例2)。

图3为本发明实施例2中不同透析时间的透析袋对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种Trx-Balcp19k蛋白透析工艺，包括以下步骤：将亲和层析(亲和层析参见专利CN105031717A)得到的浓度为2.11mg/mL、体积为14mL的Trx-Balcp19k蛋白溶液装入透析袋内，在磁力搅拌下，置于4℃环境中以去离子水为透析液进行透析，透析过程中每隔约2h更换一次透析液，持续透析8h(此时透析液中的离子强度为173μs/cm)。如图1所示，随着透析时间的延长，透析袋内壁会出现粘性胶状物，且主要集中在透析袋的中下部。需要说明的是，透析本身会损失一部分蛋白，根据过往经验，损失率约为30％。

本实施例中，第一次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.20mg/mL，体积为16.2mL，成胶率约为6.2％；第二次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为0.96mg/mL，体积为17.3mL，成胶率约为19.5％；第三次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为0.87mg/mL，体积为17.8mL，成胶率约为25.2％。透析8h后，透析袋内未成胶的蛋白质溶液为18mL，其浓度为0.84mg/mL，成胶比率为26.9％。将未成胶的蛋白质溶液和粘性胶状物质经过冷冻干燥成蛋白样品。

本实施例中，取7.0mg未成胶的蛋白质溶液样品，滴加30μL PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)，将蛋白样品均匀涂抹于玻璃片上，涂抹面积为700mm²，在加载样品的区域盖上同样大小的玻璃片，具体参见图2。采用夹子固定加载有蛋白样品的玻璃片，放入50℃烘箱约1h，此时蛋白胶液失水固化，待其固化后，采用动态力学测试仪测得Trx-Balcp19k蛋白的最大载荷为75.7N，由此计算得到其剪切强度为108.1kPa。由上述结果可知，未成胶的蛋白溶液上清，仍然均具有很好的粘接性能。

本实施例中，透析过程中，透析内、外液离子强度随时间的变化如下表1所示。

表1：实施例1透析过程中，透析内、外液离子强度随时间的变化

表中，“+++”表示超出测量范围，未检测到具体的离子强度数据，测定方式采用DDS-11A数显电导率仪(雷磁，中国上海)直接测定，下同。

实施例2：

一种Trx-Balcp19k蛋白透析工艺，包括以下步骤：将亲和层析(亲和层析参见专利CN105031717A)得到的浓度为2.11mg/mL、体积为14mL的Trx-Balcp19k蛋白溶液装入透析袋内，在磁力搅拌下，置于4℃环境中以去离子水为透析液进行透析，透析过程中每隔2h更换一次透析液(更换透析液的时间需要同时满足成胶率的要求，下同)，且透析4h后用移液枪枪尖从透析袋内壁收集粘性胶状物，持续透析8h(此时透析液中的离子强度为149.3μs/cm)。如图3所示，随着透析时间的延长，透析袋内壁会出现粘性胶状物，且主要集中在透析袋的中下部。

本实施例中，第一次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.61mg/mL，体积为15.7mL，成胶率约为7％；第二次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.22mg/mL，体积为16.9mL，成胶率约为18.8％；第三次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.01mg/mL，体积为14.5mL，成胶率约为36％；当透析8h后，收集透析袋内未成胶的蛋白质溶液，其中，透析袋内未成胶的蛋白质溶液为15mL，浓度为0.70mg/mL，成胶比率为49.2％。将未成胶的蛋白质溶液和粘性胶状物质经冷冻干燥成蛋白样品。

本实施例中，取7.0mg粘性胶状物质样品，滴加30μLPBS缓冲液(0.01M，pH7.4)，将蛋白样品均匀涂抹于玻璃片上，涂抹面积为650mm²(尽量涂抹均匀，以和实施例1中的厚度相同)，在加载样品的区域盖上同样大小的玻璃片，具体参见图2。采用夹子固定加载有蛋白样品的玻璃片，放入50℃烘箱约1h，此时蛋白胶液失水固化，待其固化后，采用动态力学测试仪测得Trx-Balcp19k蛋白的最大载荷为77.8N，由此计算得到其剪切强度为119.7kPa。由上述结果可知，粘性胶状物质样品具有很好的粘接性能，且其剪切强度强于未成胶的蛋白溶液上清。

本实施例中，透析过程中，透析内、外液离子强度随时间的变化如下表2所示。

表2：实施例2透析过程中，透析内、外液离子强度随时间的变化

实施例3：

一种Trx-Balcp19k蛋白透析工艺，包括以下步骤：将亲和层析(亲和层析参见专利CN105031717A)得到的浓度为2.37mg/mL、体积为15mL的Trx-Balcp19k蛋白溶液装入透析袋内，在磁力搅拌下，置于4℃环境中以去离子水为透析液进行透析，透析过程中每隔2h更换一次透析液，且透析4h后用移液枪枪尖从透析袋内壁收集粘性胶状物，持续透析8h。

本实施例中，第一次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.73mg/mL，体积为16.3mL，成胶率约为7.8％；第二次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.32mg/mL，体积为17.1mL，成胶率约为19.5％；第三次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.10mg/mL，体积为16.8mL，成胶率约为39％；当透析8h后，透析袋内未成胶的蛋白质溶液为18.5mL，浓度为0.71mg/mL，成胶比率为43.2％。将未成胶的蛋白质溶液和粘性胶状物质经冷冻干燥成蛋白样品。

本实施例中，取8.0mg粘性胶状物质样品，滴加50μLPBS缓冲液(0.01M，pH7.4)，将蛋白样品均匀涂抹于玻璃片上，涂抹面积为525mm²(尽量涂抹均匀，以和实施例1中的厚度相同)，在加载样品的区域盖上同样大小的玻璃片。采用夹子固定加载有蛋白样品的玻璃片，放入50℃烘箱约1h，此时蛋白胶液失水固化，待其固化后，采用动态力学测试仪测得Trx-Balcp19k蛋白的最大载荷为67.8N，由此计算得到其剪切强度为129.1kPa。由上述结果可知，粘性胶状物质样品具有很好的粘接性能。

本实施例中，未成胶的蛋白质溶液经冷冻干燥成蛋白样品也同样具有较好的粘接性能。

实施例4：

一种Trx-Balcp19k蛋白透析工艺，包括以下步骤：将亲和层析(亲和层析参见专利CN105031717A)得到的浓度为2.15mg/mL、体积为12mL的Trx-Balcp19k蛋白溶液装入透析袋内，在磁力搅拌下，置于4℃环境中以去离子水为透析液进行透析，透析过程中每隔约2h更换一次透析液，且透析4h后用移液枪枪尖从透析袋内壁收集粘性胶状物，持续透析8h。

本实施例中，第一次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.59mg/mL，体积为13.6mL，成胶率约为6.8％；第二次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为1.26mg/mL，体积为14.5mL，成胶率约为19.1％；第三次更换透析液后，蛋白质溶液浓度约为0.93mg/mL，体积为14.3mL，成胶率约为36.2％；当透析8h后，透析袋内未成胶的蛋白质溶液为15mL，其浓度为0.63mg/mL，成胶比率为43.6％。将未成胶的蛋白质溶液和粘性胶状物质经冷冻干燥成蛋白样品。

本实施例中，取8.0mg粘性胶状物质样品，滴加50μLPBS缓冲液(0.01M，pH7.4)，将蛋白样品均匀涂抹于玻璃片上，涂抹面积为525mm²(尽量涂抹均匀，以和实施例1中的厚度相同)，在加载样品的区域盖上同样大小的玻璃片。采用夹子固定加载有蛋白样品的玻璃片，放入50℃烘箱约1h，此时蛋白胶液失水固化，待其固化后，采用动态力学测试仪测得Trx-Balcp19k蛋白的最大载荷为62.3N，由此计算得到其剪切强度为118.6kPa。由上述结果可知，粘性胶状物质样品具有很好的粘接性能。

对比例1：

将体积为15mL、浓度为2.02mg/mL的Trx-Balcp19k蛋白洗脱液未经透析直接冻干得到冻干粉。待样品完全干燥后，称取其质量，约为669.72mg。

称取224.3mg(其中包含的Trx-Balcp19k蛋白量约为7mg)冻干粉，滴加30μLPBS缓冲液(0.01M，pH7.4)进行充分溶解。结果发现，未经透析的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉难溶于PBS缓冲液，即使加大PBS的量，也不能完全溶解；此时，采用超声使不溶解的蛋白颗粒分散成小颗粒，尝试粘接玻璃，发现玻璃轻易地被分离开，几乎没有粘接能力(未测量到粘接性能数据)。实验结果表明：未经透析的Trx-Balcp19k蛋白经冻干后发生了变性，失去了粘接能力。

Claims (7)

1.一种藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，包括以下步骤：

将藤壶胶蛋白溶液装入透析袋内，以去离子水为透析液进行透析；

所述透析过程中使透析液全程处于磁力搅拌下；

所述透析过程中多次更换透析液；

所述透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白，直至完成透析过程。

2.根据权利要求1所述的藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，所述藤壶胶蛋白为Trx-Balcp19k蛋白。

3.根据权利要求2所述的藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，透析袋内Trx-Balcp19k蛋白溶液的浓度为2.0-2.4mg/mL，多次更换透析液是指每隔2-2.5h更换一次透析液，且更换次数为3次。

4.根据权利要求3所述的藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，第一次更换透析液时控制成胶比率为6-8％，第二次更换透析液时控制成胶比率为18-20％，第三次更换透析液时控制成胶比率为36-40％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白是指：当胶态蛋白的吸附界面占透析袋内壁总面积的20-40％时，用移液枪枪尖从透析袋内壁收集胶态蛋白再继续透析。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的藤壶胶蛋白透析工艺，其特征在于，完成透析过程是指：当透析袋内的离子强度小于200μs/cm时结束透析。

7.一种从含Trx-Balcp19k蛋白溶液中同时收集获得两种不同类型蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将藤壶胶蛋白溶液装入透析袋内，以去离子水为透析液进行透析；

所述透析过程中使透析液全程处于磁力搅拌下；

所述透析过程中多次更换透析液；

所述透析过程中不断收集透析袋内壁的胶态蛋白，直至完成透析过程；

完成透析过程后，从透析袋内壁收集得到的胶态蛋白累积得到第一种粘性胶态蛋白；将透析后的蛋白上清液中直接经过冷冻干燥获得第二种蛋白。