CN105031717A - 生物粘合剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物粘合剂及其制备方法和应用，其中生物粘合剂包括Trx-Balcp19k蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。其制备方法包括反转录、扩增、构建重组质粒、转化、诱导、亲和层析、透析等步骤，本发明的生物粘合剂粘附性能强、产量相对高、制备成本低，可应用于生理材料之间、非生理材料之间、生理材料和非生理材料之间的粘附。

Description

生物粘合剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种生物粘合剂及其制备方法和应用。

背景技术

医用粘合剂在医疗器械等领域具有许多用途，包括人体和动物体活性组织创面的封闭修复、手术创面的封闭止血、活性生理组织间的粘合、活性生理组织与非生理材料间的粘合等。医用粘合剂按材料性质可分为化学粘合剂和生物粘合剂。化学粘合剂如a-氰基丙烯酸酯类，虽在临床应用多年，但其降解产物所产生的毒性难以避免。生物粘合剂如纤维蛋白胶，是一种医用创面封闭剂，是从人或动物血浆中提取的蛋白生物制品，主要应用于手术创面止血、促进伤口愈合、封闭缺损组织等，已在外科领域得到广泛应用，但来源于异体的人或动物血清制成的纤维蛋白胶可能激发免疫副反应，其安全性受到广泛关注，同时纤维蛋白胶粘接强度较低。因此急需开发相容性好、潮湿环境粘接强度高、可生物降解的医用粘合剂。

在海洋环境中，一些成体营固着生活的无脊椎动物，例如贻贝和藤壶，它们能够分泌蛋白性的粘附剂，牢固地粘附在几乎任何水下物体表面，具有极强的粘结力、湿粘结特性和耐水性，在生物医用粘合剂、水下胶等领域具有广阔的应用前景。

贻贝和藤壶代表了两种典型的水下粘附机制，前者主要是依靠存在于足丝粘附蛋白中的大量3,4-二羟基苯丙氨酸（多巴，DOPA），而后者主要依靠粘蛋白独特的氨基酸组成和高级结构。贻贝的研究由来已久，足丝粘附蛋白的提取、异源表达以及贻贝仿生粘附材料的研究取得了较大的进展。目前，美国已有BD Bioscience公司从紫贻贝的足部提取到粘附蛋白并已进行商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE，catalog NO 354240，354241。BD Cell-Tak用作细胞和组织粘附剂，可以增强细胞或者组织在各种材料表面（包括塑料、玻璃、金属和各种生物材料）上的粘附。但是贻贝分泌蛋白的量很少，提取成本高且价格昂贵，很难满足需求。而通过基因工程手段表达重组的粘附蛋白存在对翻译后修饰的依赖，使得表达功能性的细菌重组贻贝粘着蛋白变得困难；仿生粘附材料因其结构的简单以及生物相容性等，难以与真正的生物胶媲美。

而藤壶较贻贝在水下表面的粘附更为牢固，以致它们的个体死亡后，钙质外壳仍被紧紧粘附在基材表面，实现牢固的水下粘附。相比于贻贝，藤壶代表了另一种全新的水下粘附模型。研究表明，藤壶粘着蛋白不存在翻译后修饰现象，因而更易通过生物合成的方式获得细菌重组蛋白。

日本科学家用基因工程的方法表达了红巨藤壶中的胶蛋白cp19k、cp20k，厦门大学的研究人员表达了白脊藤壶cp20k蛋白并进行了功能研究，表明cp20k能选择性地粘附在金属等基体材料表面，而cp19k在水下粘附中发挥了关键性的作用，能够粘附在水下不同物理化学特性的材料表面，但目前对白脊藤壶Balcp19k基因的克隆和表达及其粘附性能的研究未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种粘附能力强、产量高、制备成本低的生物粘合剂，还提供了一种制备方法简单、制备成本低的制备方法；该生物粘合剂可应用于非生理材料之间、生理材料之间、非生理材料和生理材料之间的粘结。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方法：

本发明的一种生物粘合剂，包括Trx-Balcp19k融合蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的生物粘合剂，优选的，还包括溶剂。

上述的生物粘合剂，优选的，生物粘合剂的溶剂为醋酸或水。进一步优选的，醋酸的体积浓度为5%～10%。

上述的生物粘合剂，优选的，所述Trx-Balcp19k蛋白在所述生物粘合剂中的浓度为0.98～1.78 mg/mL。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种生物粘合剂的制备方法，所述制备方法为： S1、从白脊藤壶软组织提取总RNA，反转录成第一链cDNA；

S2、以步骤S1中第一链cDNA为模板，根据GenBank数据库中白脊藤壶Balcp19k基因序列设计引物进行PCR扩增得到扩增产物；

S3、将所述步骤S2中得到的扩增产物连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质粒；

S4、将所述步骤S3中构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到转化子；

S5、将所述步骤S4中的转化子进行IPTG诱导表达得到表达产物；

S6、将所述表达产物进行镍亲和层析纯化得到Trx-Balcp19k洗脱液；

S7、将所述Trx-Balcp19k洗脱液进行透析过夜，得到Trx-Balcp19k蛋白。

上述的制备方法，优选的，还包括以下步骤：将Trx-Balcp19k蛋白溶于溶剂中得到生物粘合剂。进一步的，溶剂为醋酸时：将醋酸配制成体积浓度为5%～10%的醋酸溶液，将Trx-Balcp19k蛋白溶于所述醋酸溶液中配制成生物粘合剂。进一步的，溶剂为水时：将Trx-Balcp19k蛋白溶于水中配制成生物粘合剂。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中设计的引物为：SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S6中所述亲和层析具体包括以下步骤：

S6-1、将表达产物置于层析柱上用咪唑浓度为50～80mM的咪唑缓冲液（咪唑缓冲液的成分为：50～80mM咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH 8.0）作为漂洗液漂洗层析柱，以去除非特异结合的杂蛋白；

S6-2、用咪唑浓度为250～300mM的咪唑缓冲液（咪唑缓冲液的成分为：250～300mM咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH 8.0）作为洗脱液洗脱层析柱，获得Trx-Balcp19k洗脱液。

上述的制备方法，优选的，亲和层析过程中，漂洗液的体积至少为柱床体积的5倍。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-1中，作为漂洗液的咪唑缓冲液的流速为2.5～5ml/min。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-2中，作为洗脱液的咪唑缓冲液的流速为2.5～5ml/min。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S7中所述透析过程中采用的透析液为去离子水。进一步优选的，去离子水的pH为6～7。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在生理材料之间粘结中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料之间粘结中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料与生理材料之间粘结中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种生物粘合剂，该粘合剂主要由Trx-Balcp19k融合蛋白构成，Trx-Balcp19k蛋白是由白脊藤壶Balcp19k基因经克隆、表达后纯化得到。该Trx-Balcp19k蛋白粘合剂具有粘附性能强、产量高、制备成本低等优势，适合工业化生产。

（2）本发明提供了一种生物粘合剂的制备方法，由白脊藤壶Balcp19k基因经克隆、表达得到表达蛋白后，将表达蛋白进行亲和层析，然后在去离子水中透析得到粘性胶状物，即Trx-Balcp19k融合蛋白，经纯化后的粘性胶状物排除了其他杂蛋白的干扰，粘性更强。同时，申请人首次发现离子强度在粘性胶状物质的形成过程中发挥了重要作用：申请人采用的去离子水、磷酸钠缓冲液（磷酸钠缓冲液包含50mM磷酸氢二钠和50mM氯化钠，pH为8.0）作为比较，仅采用去离子水为透析液时才能获得粘性胶状物，采用其他透析液并不能获得粘性胶状物，这是因为去离子水中离子强度小，而其他透析液中离子强度大，干扰了静电相互作用推动的蛋白聚集。因此，申请人直接将Trx-Balcp19k洗脱液透析到去离子水中，结果发现，透析后的蛋白溶液变得浑浊，且形成了大量的粘性胶状物质，有效提高了Trx-Balcp19k融合蛋白的产量。

（3）本发明提供了一种生物粘合剂在生理材料之间、非生理材料之间、非生理材料与生理材料之间粘结中的应用，应用方法简单，粘结性能强，适用范围广。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为逆转录PCR扩增的Balcp19k基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图2为验证重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图3为申请人扩增的Balcp19k氨基酸序列与GenBank数据库中收录的Balcp19k序列（编号为AB242295.1）的对比结果。

图4为SDS-PAGE检测亲和层析纯化的重组蛋白的结果图。

图5为透析后吸附在透析袋上的Trx-Balcp19k蛋白粘合剂图片（A），及冷冻干燥后的固体Trx-Balcp19k蛋白粘合剂图片（B）。

图6为不同透析液对Trx-Balcp19k蛋白洗脱液透析结果对比图。

图7为Trx-Balcp19k蛋白粘合剂在亲水性玻璃（A）和疏水性聚苯乙烯表面（B）的粘附性能检测结果图。

图8为利用QCM检测Trx-Balcp19k粘合剂在石英晶片表面吸附量的实验结果图。

图9为利用Trx-Balcp19k粘结工程塑料制品的结果图。

图10为检测Trx-Balcp19k粘结铝片后剪切强度测试方法的简单示意图。

图11为不同样品的粘性剪切强度测试结果图。

图12为利用Trx-Balcp19k粘合剂粘结断裂猪肋骨的实验结果图。

图13为利用MTT法检测Trx-Balcp19k粘合剂对成纤维细胞毒性的实验结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例 1 ：

一种本发明的生物粘合剂，包括Trx-Balcp19k融合蛋白。Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGTGCCCCCACCGTGCGACCTCAGCATCAAATCCAAGCTGAAGCAGGTAGGCGCGACGGCCGGCAACGCGGCCGTCACCACCACCGGCACCACCAGCGGCTCCGGCGTGGTTAAGTGCGTGGTGCGCACGCCCACCTCGGTCGAGAAGAAGGCCGCCGTCGGCAACACAGGTCTCAGCGCGGTCAGTGCTTCCGCCGCCAACGGCTTCTTCAAAAATCTCGGCAAGGCCACCACAGAGGTGAAAACTACCAAAGACGGCACCAAAGTGAAGACGAAAACCGCTGGCAAAGGGAAAACTGGCGGTACGGCCACCACCATCCAGATTGCTGATGCCAATGGTGGCGTCAGCGAGAAATCATTGAAACTCGACCTGCTCACCGACGGACTAAAGTTTGTCAAGGTCACGGAAAAGAAGCAGGGCACGGCGACCTCTTCCAGCGGTCACAAGGCCTCCGGAGTCGGTCACAGTGTCTTCAAGGTGCTGAATGAGGCCGAGACAGAGCTCGAGTTGAAGGGACTCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。

一种本实施例的生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

1、提取总RNA：

利用TRIzol试剂从活的白脊藤壶软组织提取总RNA，用FastQuant（With gDNase）逆转录试剂盒（天根，北京）以总RNA为模板合成第一链cDNA。

2、PCR扩增Balcp19k基因的编码区：

根据GenBank数据库中收录的白脊藤壶Balcp19k基因（AB242295.1）序列，设计扩增Balcp19k基因成熟编码区的特异性引物对（命名为引物F和引物R），其中引物F为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；引物R为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。分别在引物F和引物R的5’端引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，如下划线部分所示。

引物F：5’-GGAATTCGTGCCCCCACCGTGCGACCTCA-3’；

引物R：5’-ACGCGTCGACGAGTCCCTTCAACTCGAGCT-3’。

以步骤1中合成的第一链cDNA为模板，用步骤2中所设计的引物F和引物R按下述PCR体系进行扩增，得到扩增产物。

PCR扩增体系：

第一链cDNA	10 μL
		5×PS Buffer	10 μL
dNTP mix	4 μL
		引物F	2 μL
引物R	2 μL
		高保真Prime STAR HS DNA聚合酶	0.5 μL
ddH2O	21.5 μL

PCR反应程序：95℃预变性1min；20个循环，包括95℃变性30sec，70℃退火30sec，退火温度每循环下降0.5℃，72℃延伸1min；额外的20个循环，包括95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min；4℃保存。

将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。其中泳道1为DNA Marker，泳道2为扩增产物。Balcp19k基因编码区长519bp，与泳道2中星号所示扩增产物条带的大小一致，表明成功扩增出目的条带。

3、构建重组质粒

3.1、PCR产物和pET-32a(+)原核表达载体的双酶切：采用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对逆转录PCR产物和pET-32a(+)质粒进行双酶切，具体的反应体系为：

PCR产物或pET-32a(+)质粒 33μL

EcoRⅠ 1.5μL

SalⅠ 1.5μL

10×H Buffer 4μL

将上述反应体系在37℃水浴孵育5 h左右，酶切产物通过凝胶电泳回收。

3.2、连接反应：将步骤3.1中制备得到的目的片段与载体经T4 DNA连接酶（购自Takara公司）于16℃水浴连接过夜得到连接产物。

连接反应体系如下：

载体 5μL

目的片段 3μL

T4 DNA连接酶 1μL

连接缓冲液 1μL

4、将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得转化子：

将大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰上融化，加入连接产物，冰浴30 min。然后于42℃水浴热激90 sec，添加800 μL无抗性的LB培养液孵育45 min。于5000 rpm，3 min离心去除大部分培养基，留200 μL重悬菌体，涂布含氨苄青霉素抗性的固体平板培养基上，37℃过夜培养。

5、重组质粒的提取及验证

5.1挑取固体平板培养基上的单菌落，在含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养得到菌液。利用菌液PCR按下述反应体系和程序对大肠杆菌转化子进行初次筛选。

PCR反应体系：

菌液	0.5 μL
		10×PCR Buffer	1 μL
dNTP mix	1 μL
		引物F	0.5 μL
引物R	0.5 μL
		rTaq	0.25 μL
ddH2O	6.25 μL

PCR反应程序：95℃预变性1 min；95℃变性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。能够通过菌液PCR扩增出长度为519bp的Balcp19k基因编码区的为阳性菌液，不能扩增出的为阴性。

5.2选择菌液PCR筛选结果为阳性的菌液，利用质粒小提试剂盒（天根，北京）提取质粒，并利用EcoRⅠ单酶切，EcoRⅠ/SalⅠ双酶切检验重组质粒，具体反应体系如下：

EcoRⅠ单酶切反应体系

质粒 5μL

EcoRⅠ 0.5μL

10×H Buffer 1μL

ddH₂O 3.5μL

EcoRⅠ/SalⅠ双酶切反应体系

质粒 5μL

EcoRⅠ 0.5μL

SalⅠ 0.5μL

10×H Buffer 1μL

ddH₂O 3μL

于37℃反应1 h后，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，图2为重组质粒的验证结果。图2中，泳道1和泳道7为DNA Marker、泳道2为pET-32a(+)空质粒、泳道3为pET-32a(+)-Balcp19k重组质粒、泳道4为EcoRⅠ单酶切的重组质粒、泳道5为EcoRⅠ/SalⅠ双酶切的重组质粒，泳道6为菌液PCR扩增的目的条带。从图2中可知，已成功构建了重组质粒。

5.3 通过测序对重组质粒进行进一步验证。扩增的Balcp19k基因编码区序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

GTGCCCCCACCGTGCGACCTCAGTATCAAATCCAAGCTGAAGCAGGTAGGCGCGACGGCCGGCAACGCGGCCGTTACCACCACCGGCACCACCAGCGGCTCCGGCGTGGTTAAGTGCGTGGTGCGCACGCCCACCTCGGTCGAGAAGAAGGCTGCCGTCGGCAACACGGGCCTCAGCGCGGTCAGTGCTTCCGCCGCCAACGGCCTCTTCAAAAATCTCGGCAAGGCCACCACAGAGGTGAAAACTACCAAAGACGGCACCAAAGTGAAGACGAAAACCGCTGGCAAAGGGAAAACTGGCGGTACGGCCACCACCCTCCAGATTGCTGATGCCAATGGTGGCGTCAGCGAGAAATCATTGAAACTCGACCTGCTCACCGACGGACTAAAGTTTGTCAAGGTCACGGAAAAGAAGCAGGGCACGGCGACCTCTTCCAGCGGTCACAAGGCCTCCGGAGTCGGTCACAGTGTCTTCAAGGTGCTGAATGAGGCCGAGACAGAGCTCGAGTTGAAGGGACTC。

该基因序列所编码的氨基酸序列与GenBank数据库中的序列（AB242295.1）存在两个氨基酸的差异（第69位和第106位），具体的氨基酸序列对比结果见图3所示。图3为Balcp19k氨基酸序列对比结果。AB242295.1为GenBank数据库中收录的序列，Balcp19k为我们扩增的序列。序列比对发现，AB242295.1第69位的苯丙氨酸F和106位的异亮氨酸I在Balcp19k中都被亮氨酸L所取代。

6、重组蛋白的诱导表达及亲和纯化

6.1 将上述构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，倒置于37℃的恒温培养箱中过夜生长。

6.2 挑取LB固体培养基上的单菌落，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃的恒温培养箱振荡培养过夜。

6.3 按1∶100的比例接种菌液到新的带氨苄青霉素抗性的LB培养液中，在37℃振荡培养，用紫外分光光度计检测其在600 nm处的光吸收值（OD600）。当OD600达到0.6～0.8时，添加IPTG至终浓度为1 mM，诱导重组蛋白的表达。于37℃诱导5 h后，离心（4℃，6000 rpm，10 min）收集大肠杆菌细胞，并用预冷的磷酸缓冲溶液洗涤菌体沉淀。

6.4 将菌体沉淀重悬于结合缓冲液（50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl, 10mM imidazole，pH 8.0），并添加溶菌酶rLysozyme（生工，上海）使终浓度为35kU每克细胞湿重，于30℃孵育15 min后，超声破碎细胞。低温离心（4℃，14000 rpm，30 min）后，转移上清液到新的离心管中，加入适当体积的Ni-NTA His·Bind^® Resins，4℃振荡结合一小时左右。

6.5 把结合后的蛋白质混合溶液转移到平衡后的层析柱上，收集穿透液，然后用浓度为50mM的咪唑缓冲液（50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，50mM imidazole，pH 8.0）作为漂洗液漂洗层析柱至少5倍柱床体积，收集漂洗液；最后用浓度为250mM的咪唑缓冲液（50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0）作为洗脱液洗脱目的蛋白，得到Trx-Balcp19k蛋白洗脱液。Trx-Balcp19k蛋白洗脱液通过SDS-PAGE进行检测。图4为SDS-PAGE检测亲和层析纯化的目的蛋白的结果。泳道1为穿透液，泳道2为漂洗液，泳道3为上样时添加了还原剂DTT的Trx-Balcp19k蛋白洗脱液，泳道4为上样时未添加还原剂的Trx-Balcp19k蛋白洗脱液，泳道5为预染蛋白Marker，相应的条带大小已经标出。SDS-PAGE结果表明，大部分杂蛋白已经被穿透和漂洗掉，纯化的Trx-Balcp19k蛋白具有较高的纯度和产量。

在步骤6.5中，作为漂洗液的咪唑缓冲液中咪唑的浓度为50mM～80mM均可实施；作为洗脱液的咪唑缓冲液中咪唑浓度为250mM～300mM均可实施。

7、Trx-Balcp19k蛋白粘合剂的生成及保存

将亲和层析纯化得到的Trx-Balcp19k蛋白洗脱液装入半透膜袋内，放入pH为6的去离子水（去离子水pH为6～7均可实施）中在4℃透析过夜，以除去高浓度的盐。为使透析效果更好，利用磁力搅拌仪对透析液进行搅动，期间更换2~3次透析液，可观测到有Trx-Balcp19k蛋白粘性物吸附在透析袋上（见图5A）。为了方便Trx-Balcp19k蛋白粘性物的使用与保存，利用移液枪枪尖刮下吸附在透析袋上的粘性物质，并冷冻干燥过夜得到Trx-Balcp19k蛋白冻干粉（见图5B）。冻干后的固体样品可长期保存于-20℃。

通常，每1升的大肠杆菌发酵液能够获得5～15mg的Trx-Balcp19k蛋白。

对比例 1

按照实施例1的制备方法制备Trx-Balcp19k蛋白粘合剂，与实施例1的区别仅在于将亲和层析纯化得到的Trx-Balcp19k蛋白洗脱液装入半透膜袋内，分别放入磷酸根的离子强度为10mM的PBS溶液（pH7.4）、将前述PBS溶液稀释10倍的溶液、将前述PBS溶液稀释20倍的溶液和去离子水中，在4℃透析过夜。透析结果参见图6：从图6中可知：当透析液为10mM的PBS时，透析袋内的液体保持澄清透明的状态，无胶状物质生成。再次将Trx-Balcp19k洗脱液分别透析到稀释了10倍和20倍的PBS中，我们发现，在两种透析液中，透析袋内的溶液均变得浑浊并且都形成了粘性胶状物质；而且，随着稀释倍数的不断增大，溶液的浑浊程度加深，且形成了更多的胶状物质。最后，直接将Trx-Balcp19k洗脱液透析到去离子水中，结果发现，透析后的蛋白溶液变得浑浊，且形成了大量的粘性胶状物质。以上结果清晰表明，离子强度在粘性胶状物质的形成过程中发挥了重要作用。

实施例 2

取实施例1中的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉溶解于5%的醋酸中配制成浓度为1.33mg/mL的生物粘合剂。

对实施例2的生物粘合剂进行粘性测试：

生物粘合剂在玻璃载玻片和聚苯乙烯细胞培养皿上粘附性能的测定：在清洗干净的亲水性玻璃载玻片和疏水性聚苯乙烯细胞培养皿上，各滴加5μL实施例2的生物粘合剂，同时滴加等体积等浓度的牛血清白蛋白（BSA）和Cell-Tak分别进行阴性和阳性对照。实施例2的生物粘合剂在空气中吸附干燥后，先利用纯水进行漂洗，再利用考马斯亮蓝R-250染色液（2g考马斯亮蓝R-250，溶于500ml甲醇，再溶于100ml乙酸，最后加水补齐1L）进行染色，利用脱色液（500ml甲醇，100ml乙酸，400ml纯水）进行漂洗，干燥后观察。

结果如图7所示，阴性对照BSA在亲水性玻璃（A）和疏水性聚苯乙烯（B）表面几乎全部被洗掉；而Trx-Balcp19k生物粘合剂在两种表面上都显示出与阳性对照Cell-Tak相当的粘附量。

生物粘合剂在石英晶片上粘附性能的测定：将实施例2的生物粘合剂滴加到石英晶片（基频为5MHz，购于上海辰华公司）表面，同时滴加等量等浓度的BSA和Cell-Tak分别作阴性对照和阳性对照。在空气中干燥后，用去离子水进行冲洗，干燥后测量其振动频率，通过频率差值表征样品在金电极表面的粘附情况。

结果见图8所示，Trx-Balcp19k粘合剂表现出与Cell-Tak相当的频率变化，从而表明两者相当的表面粘附能力。

实施例 3

取5mg实施例1的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉，滴加少量去离子水将其润湿，制备成湿润的胶状生物粘合剂。

将实施例 3 的生物粘合剂粘结非生理材料（工程塑料）：在工程塑料制成的细菌培养皿表面，添加少量实施例3的生物粘合剂，然后将不同大小的移液枪枪尖倒扣于粘合剂上并轻轻挤压，静置于水平桌面在空气中过夜干燥后，检测粘结结果。粘结结果参照图9：从图9中可以观测到枪尖已牢固吸附在培养皿表面。

将实施例 3 的生物粘合剂粘结非生理材料（铝片）：

参见图10：（1）将1mm厚的铝板切割成长宽为100 mm×10 mm的铝条，然后在铝条边缘打一小孔以便固定。铝条先用5% (w/v) NaOH浸泡5分钟，然后用蒸馏水清洗，再置于30% (v/v) HNO₃浸泡1分钟，蒸馏水清洗后晾干。

（2）称取5mg的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉，按实施例3所述的方法制备胶状生物粘合剂，添加在铝条的边缘，然后将另一铝条叠加在上面，重叠区域面积约为12 mm×10 mm；为保证样品均匀平坦分布，测试前将两片铝板紧密压合，并用夹子夹住在37℃彻底固化。

（3）用拉力测试仪，拉伸速度为0.5 mm/min，测量两铝板之间的粘性剪切强度。粘结的剪切强度等于最大拉伸载荷（N）除以样品重叠面积（m²）。

同时采用牛血清白蛋白和溶菌酶作为阴性对照，PVA工艺胶和UHU胶作为阳性对照。

结果见图11所示：阴性对照BSA和lysozyme的粘性强度很低，而Trx-Balcp19k胶状粘合剂具有较高的粘性强度，与PVA工艺胶和UHU胶相当。

将实施例 3 的生物粘合剂粘结生理材料（猪肋骨）：

取新鲜猪肋骨3根，折断；然后称取5mg的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉，按实施例3所述的方法制备胶状生物粘合剂，分别添加到3根肋骨的断面上，将断裂的肋骨复位后在室温下粘结24小时左右，同时采用BSA进行对照。结果发现BSA无法进行粘接，而生物粘合剂能够将猪肋骨进行粘接，粘结效果参见图12。

通过拉伸测试测量实施例3的生物粘合剂粘结的猪肋骨的拉伸强度，结果为75.8±4.3kPa左右。

实施例 4

对生物粘合剂的细胞毒性分析。利用MTT法检测实施例1的Trx-Balcp19k蛋白对成纤维细胞的毒性，具体检测方法为：

（1）将实施例1的Trx-Balcp19k蛋白冻干粉溶于5%乙酸配成浓度为1mg/mL的Trx-Balcp19k粘合剂，取5μL的Trx-Balcp19k粘合剂滴加到96孔板上，同时滴加等量等浓度的Cell-Tak、5%乙酸和3μL的Compont医用胶作为对照，在培养箱中放置过夜待样品干燥。以不添加任何样品的空白孔为空白对照。

（2）干燥后，利用PBS对孔进行清洗，每孔滴加100μL浓度为5×10⁴个/mL的NIH-3T3成纤维细胞，在37℃，5%二氧化碳的环境中培养24小时后，每孔添加25μL的MTT溶液（5mg/mL溶于PBS），37℃培养4小时后，小心吸掉培养基，滴加150微升DMSO溶解形成的紫色晶体。

（3）避光，在摇床上振荡溶解1小时后，利用酶标仪测量其在595nm处的吸光值。

检测结果参见图13：阳性对照Cell-Tak对成纤维细胞的生长具有促进作用，Trx-Balcp19k生物胶则有微弱的毒性，而含有微量添加剂的α-氰基丙烯酸正丁酯医用胶则对成纤维细胞表现出很强的毒性，几乎全部的细胞被杀死。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

<110> 中国人民解放军国防科技大学

<120> 生物粘合剂及其制备方法和应用

<130> 无

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1068

<212> DNA

<213> Balanus albicostatus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1068)

<223> 根据实验要求而设计，作为Trx-Balcp19k蛋白的DNA序列。

<400> 1

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccgaatt cgtgccccca ccgtgcgacc tcagcatcaa atccaagctg 540

aagcaggtag gcgcgacggc cggcaacgcg gccgtcacca ccaccggcac caccagcggc 600

tccggcgtgg ttaagtgcgt ggtgcgcacg cccacctcgg tcgagaagaa ggccgccgtc 660

ggcaacacag gtctcagcgc ggtcagtgct tccgccgcca acggcttctt caaaaatctc 720

ggcaaggcca ccacagaggt gaaaactacc aaagacggca ccaaagtgaa gacgaaaacc 780

gctggcaaag ggaaaactgg cggtacggcc accaccatcc agattgctga tgccaatggt 840

ggcgtcagcg agaaatcatt gaaactcgac ctgctcaccg acggactaaa gtttgtcaag 900

gtcacggaaa agaagcaggg cacggcgacc tcttccagcg gtcacaaggc ctccggagtc 960

ggtcacagtg tcttcaaggt gctgaatgag gccgagacag agctcgagtt gaagggactc 1020

gtcgacaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactga 1068

<210> 2

<211> 519

<212> DNA

<213> Balanus albicostatus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(519)

<223> 根据实验要求而设计，作为Balcp19k基因编码区序列。

<400> 2

gtgcccccac cgtgcgacct cagtatcaaa tccaagctga agcaggtagg cgcgacggcc 60

ggcaacgcgg ccgttaccac caccggcacc accagcggct ccggcgtggt taagtgcgtg 120

gtgcgcacgc ccacctcggt cgagaagaag gctgccgtcg gcaacacggg cctcagcgcg 180

gtcagtgctt ccgccgccaa cggcctcttc aaaaatctcg gcaaggccac cacagaggtg 240

aaaactacca aagacggcac caaagtgaag acgaaaaccg ctggcaaagg gaaaactggc 300

ggtacggcca ccaccctcca gattgctgat gccaatggtg gcgtcagcga gaaatcattg 360

aaactcgacc tgctcaccga cggactaaag tttgtcaagg tcacggaaaa gaagcagggc 420

acggcgacct cttccagcgg tcacaaggcc tccggagtcg gtcacagtgt cttcaaggtg 480

ctgaatgagg ccgagacaga gctcgagttg aagggactc 519

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> 根据实验要求而设计，作为扩增Balcp19k基因成熟编码区的引物。

<400> 3

ggaattcgtg cccccaccgt gcgacctca 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 根据实验要求而设计，作为扩增Balcp19k基因成熟编码区的引物。

<400> 4

acgcgtcgac gagtcccttc aactcgagct 30

Claims (10)

1.一种生物粘合剂，其特征在于，包括Trx-Balcp19k蛋白，所述Trx-Balcp19k蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，还包括溶剂，所述溶剂为水或体积浓度为5%～10%的醋酸。

3.一种权利要求1或2所述生物粘合剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、从白脊藤壶软组织提取总RNA，反转录成第一链cDNA；

S2、以步骤S1中第一链cDNA为模板，根据GenBank数据库中白脊藤壶Balcp19k基因序列设计引物进行PCR扩增得到扩增产物；

S3、将所述步骤S2中得到的扩增产物连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质粒；

S4、将所述步骤S3中构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到转化子；

S5、将所述步骤S4中的转化子进行IPTG诱导表达得到表达产物；

S6、将所述表达产物进行镍亲和层析纯化得到Trx-Balcp19k洗脱液；

S7、将所述Trx-Balcp19k洗脱液进行透析过夜，得到Trx-Balcp19k蛋白。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：将Trx-Balcp19k蛋白溶于溶剂中得到生物粘合剂。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中设计的引物为：SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中所述亲和层析具体包括以下步骤：

S6-1、将表达产物置于层析柱上用咪唑浓度为50mM～80mM的咪唑缓冲液漂洗层析柱，以去除非特异结合的杂蛋白；

S6-2、用咪唑浓度为250mM～300mM的咪唑缓冲液洗脱层析柱，获得Trx-Balcp19k洗脱液。

7.根据权利要求3至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中所述透析过程中采用的透析液为去离子水。

8.一种权利要求1～2中任一项所述的生物粘合剂或权利要求3至7中任一项所述制备方法制备得到的生物粘合剂在生理材料之间粘结中的应用。

9.一种权利要求1～2中任一项所述的生物粘合剂或权利要求3至7中任一项所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料之间粘结中的应用。

10.一种权利要求1～2中任一项所述的生物粘合剂或权利要求3至7中任一项所述制备方法制备得到的生物粘合剂在非生理材料与生理材料之间粘结中的应用。