ES2278939T3 - Metodo para la purificacion de moleculas usando alquildioles terminales no ramificados. - Google Patents

Metodo para la purificacion de moleculas usando alquildioles terminales no ramificados. Download PDF

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ES2278939T3 ES02753569T ES02753569T ES2278939T3 ES 2278939 T3 ES2278939 T3 ES 2278939T3 ES 02753569 T ES02753569 T ES 02753569T ES 02753569 T ES02753569 T ES 02753569T ES 2278939 T3 ES2278939 T3 ES 2278939T3
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Abstract

Un método para purificar una molécula de una mezcla que comprende: introducir la mezcla en una columna de cromatografía de líquidos de fase inversa; y eluir la molécula con un tampón que contiene un diol seleccionado entre el grupo compuesto por 1, 5 pentanodiol, 1, 6 hexanodiol y 1, 7 heptanodiol.

Description

Método para la purificación de moléculas usando alquildioles terminales no ramificados.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para purificar moléculas con alquildioles terminales no ramificados. En particular, el método de la invención es útil para purificar moléculas, particularmente proteínas y péptidos, en columnas de cromatografía de líquidos de fase inversa usando un tampón que contiene 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol o 1,7 heptanodiol.
2. Antecedentes de la invención
Las proteínas y péptidos juegan papeles críticos en el metabolismo, expresión génica, transducción de señales, estructuras celulares y extracelulares, que son esenciales para la supervivencia y/o reproducción de cualquier organismo vivo. Muchas proteínas y péptidos son útiles en aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, particularmente, cuando están disponibles en forma pura. Los contaminantes a menudo previenen la consecución de metas terapéuticas y/o de diagnóstico y pueden poner en peligro la salud del paciente.
La purificación de proteínas o la purificación de péptidos es un desafío significativo, especialmente cuando se requieren grandes cantidades de material para fines terapéuticos o de diagnóstico. Los procedimientos que proporcionan simple y rápidamente la proteína o péptido de interés en forma pura y con buen rendimiento son altamente deseables, sin tener en cuenta la escala.
Frecuentemente, las proteínas y péptidos se producen mediante técnicas de ADN recombinante puesto que pueden expresarse grandes cantidades de material heterólogo en bacterias u otras células hospedadoras. Como se conoce bien en la técnica, las técnicas de ADN recombinante implican transfectar células hospedadoras con ADN que codifica la proteína y cultivar las células en condiciones que favorecen la expresión de la proteína heteróloga. (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.565.785, Patente de Estados Unidos Nº 4.673.641, Patente de Estados Unidos Nº 4.738.921).
La hormona humana del crecimiento ("hGH") y antagonistas de hGH, (es decir, antagonistas de la hormona del crecimiento ("GHA")) son ejemplos de proteínas que pueden usarse en varias aplicaciones terapéuticas y que se han producido mediante métodos recombinantes. La hormona humana del crecimiento se ha usado para el tratamiento de enanismo hipopituitario y todas las afecciones resultantes de niveles bajos de producción de hGH, ya esté dicha afección causada por un defecto genético, lesión o hipofisectomía. La hormona humana del crecimiento también puede mejorar la velocidad de recuperación de víctimas de quemaduras y otros pacientes hospitalizados. Por otro lado, se ha usado GHA para tratar acromegalia, una forma de gigantismo causada por la sobreproducción de hGH (Kopchick et al., Patentes de Estados Unidos Nº 5.681.809, 5.958.879, 5.350.836). Otros posibles usos médicos de GHA son la prevención de retinopatía en pacientes de diabetes y el tratamiento de pacientes de cáncer con tumores que sobreexpresan receptores que se unen a la hormona del crecimiento (Clark et al., 1996, WO97/11178).
La cromatografía de líquidos de fase inversa ("RP-LC") y la cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa ("RP-HPLC") se usan comúnmente para purificar moléculas tales como péptidos y proteínas, producidas mediante métodos sintéticos o recombinantes. Los métodos de RP-LC y RP-HPLC pueden separar eficazmente impurezas estrechamente relacionadas y se han usado para purificar muchas moléculas diferentes (Lee et al., "Preparative HPLC", 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610 (1988)). Además, RP-LC y RP-HPLC se han usado con éxito para purificar moléculas, particularmente proteínas, a escala industrial (Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A,
675, 101).
Los eluyentes típicos para RP-LC y RP-HPLC son etanol, isopropanol, metanol y acetonitrilo. Se ha usado acetonitrilo en la purificación de proteínas tales como insulina (Kroeff et al., 1989, J. Chromatography, 461, 45). Sin embargo, estos disolventes son altamente inflamables y tóxicos, lo que presenta una cuestión significativa de seguridad cuando se usa a gran escala. Además, el acetonitrilo a menudo tiene un efecto desnaturalizante cuando se usa como eluyente para cromatografía de fase inversa. La eliminación de disolventes orgánicos tóxicos, particularmente en un proceso a gran escala, supone un gasto significativo.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de procedimientos que separen de forma selectiva moléculas tales como péptidos, polipéptidos (por ejemplo, hGH y GHA) y compuestos orgánicos de impurezas mediante RP-LC y RP-HPLC usando disolventes no inflamables que sean menos tóxicos, más baratos y menos desnaturalizantes que los disolventes típicos usados como eluyentes en RP-LC y RP-HPLC.
3. Sumario de la invención
La presente invención proporciona métodos para purificar moléculas mediante RP-LC y RP-HPLC que usan alquidioles terminales no ramificados como disolventes de elución. En particular, la presente invención purifica moléculas, particularmente proteínas y péptidos en columnas de cromatografía de líquidos de fase inversa usando un tampón que contiene 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol o 1,7 heptanodiol. Estos alquidioles terminales no inflamables son menos tóxicos, más baratos y menos desnaturalizantes que los disolventes típicos usados como eluyentes en RP-LC y 
\hbox{RP-HPLC.}
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para purificar una molécula a partir de una mezcla. En primer lugar, la mezcla se introduce en una columna de cromatografía de líquidos de fase inversa. En segundo lugar, la molécula se eluye de la columna con un tampón que contiene un diol, que es 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol o 1,7 heptanodiol. En una realización preferida, el diol es 1,6 hexanodiol. En una realización preferida, la columna es una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa.
Preferiblemente, el tampón está a un pH entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 12,0. Más preferiblemente, el tampón está a un pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 11,0, lo más preferiblemente, entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. Preferiblemente, la concentración de 1,6 hexanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 80%. Más preferiblemente, la concentración de 1,6 hexanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 50%.
En una realización, la molécula es un polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es hGH o GHA. En una realización preferida, el polipéptido es GHA. En otra realización preferida, el polipéptido es hormona humana del crecimiento. En otra realización, la molécula es un péptido. Preferiblemente, el péptido es \alpha-MSH, encefalina, somatostatina o somatotropina.
En una realización, la columna es una columna de de cromatografía de líquidos de alta resolución. En otra realización, la columna es una columna preparativa. Preferiblemente, la columna tiene un diámetro de entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 2,0 m, más preferiblemente, entre aproximadamente 10 cm y aproximadamente 100 cm.
Preferiblemente, la columna incluye una resina polimérica. En una realización preferida, la resina polimérica es estiren divinilbenceno (es decir, estirénica). En otra realización preferida, la resina polimérica es metacrilato o acrílico.
En una realización, la mezcla se introduce en la columna a aproximadamente 10,0 g de molécula/litro de volumen del lecho. En otra realización, la molécula se purifica adicionalmente después del fraccionamiento por RP-LC.
4. Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna WP-butilo usando un gradiente del 0%-60% de 1,6 hexanodiol en Tris HCl 50 mM, pH 7,2.
La Figura 2 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de la Figura 1.
La Figura 3 ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 1.
La Figura 4 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna de RP-LC CG71-M usando un gradiente por etapas de 1,6 hexanodiol en fosfato de trimetilamina 15 mM a pH 7,2.
La Figura 5 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de la Figura 4.
La Figura 6 ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 4.
La Figura 7 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna de RP-LC CG71-C usando un gradiente de 1,6 hexanodiol en fosfato de trimetilamina 15 mM.
La Figura 8 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna de RP-LC CG71-C usando un gradiente de 1,6 hexanodiol en ácido trifluoroacético al 0,1%.
La Figura 9 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de las Figuras 7 y 8.
La Figura 10 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna CG71-C usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 65% en fosfato de trimetilamina 15 mM, pH 7,2.
La Figura 11 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 65% en fosfato de trimetilamina 15 mM, pH 7,2.
La Figura 12 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna CG300-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 65% en fosfato de trimetilamina 15 mM, pH 7,2.
La Figura 13 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de las Figuras 10 y 11.
La Figura 14 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de la Figura 12.
La Figura 15 ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 10.
La Figura 16 ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 11.
La Figura 17 ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 12.
La Figura 18 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna CG71-M de 140 ml usando un gradiente por etapas de 1,6 hexanodiol al 50% en fosfato de trimetilamina 15 mM, pH 7,2.
La Figura 19(a) ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del flujo a través de la columna de la Figura 18.
La Figura 19(b) ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 18.
La Figura 20 ilustra el perfil de elución de GHA de una columna CG71-M de 100 l usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en fosfato de trimetilamina 15 mM, pH 7,2.
La Figura 21 ilustra el perfil de elución de encefalina de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris 50 mM, pH 7,5.
La Figura 22 ilustra el perfil de elución de \alpha-MSH de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris 50 mM, pH 7,5.
La Figura 23(a) ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 de una solución de 1,0 mg/ml de \alpha.MSH.
La Figura 23(b) ilustra el análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de la Figura 22.
La Figura 24 ilustra el perfil de elución de somatotropina de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris 50 mM, pH 7,5.
La Figura 25 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de la Figura 24.
La Figura 26 ilustra el perfil de elución de somatostatina de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris 50 mM, pH 7,5.
La Figura 27 ilustra el perfil de elución de hGH de una columna CG71-M usando un gradiente de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris 50 mM, pH 7,5.
La Figura 28 ilustra el análisis de SDS-PAGE del eluato de la Figura 27.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a método para purificar moléculas usando alquildioles terminales lineales. Los detalles para poner en práctica la invención se describen en las subsecciones a continuación.
5.1 Definiciones
Como se usa en este documento "molécula" se refiere a un péptido, un polipéptido o un compuesto no peptidilo.
Como se usa en este documento, "péptido" se refiere a moléculas de hasta treinta aminoácidos unidos de forma covalente incluyendo aminoácidos naturales y no naturales de forma L isomérica y D isomérica así como derivados y/o análogos de los mismos. Los ejemplos de péptidos incluyen moléculas tales como encefalina, somatostatina y \alpha-MSH. Otros péptidos que purificarse usando el método de la presente invención, incluyen aunque sin limitación, la lista de péptidos bioactivos que se muestra en el catálogo que puede obtenerse de Bachem Biosciences Limited (Philadelphia, PA).
Como se usa en este documento, "polipéptido" se refiere a péptidos que tienen más de treinta aminoácidos e incluye polipéptidos endógenos y exógenos (es decir, heterólogos). Los ejemplos de proteínas incluyen, aunque sin limitación, hormona humana del crecimiento y antagonista de la hormona del crecimiento.
Como se usa en este documento, "compuesto no peptidilo" se refiere a un compuesto orgánico o inorgánico que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 y 800 Daltons. El compuesto es preferiblemente un compuesto orgánico. Son compuestos particularmente preferidos antibióticos tales como por ejemplo, vancomicina, cefalosporina, penicilina.
Como se usa en este documento, "antagonista de la hormona del crecimiento ("GHA")" se refiere a antagonistas de la hormona humana del crecimiento. GHA tiene efectos inhibidores del crecimiento u otros efectos que antagonizan a la hormona humana del crecimiento. Puede usarse GHA para reducir la actividad de la hormona humana del crecimiento en un ser humano que padece diabetes, retinopatía diabética, nefropatía diabética, tumor de la hormona del crecimiento, acromegalia o gigantismo.
Como se usa en este documento, "tampón" se refiere a una solución que resiste cambios de pH a través de componentes conjugados ácido-base. Los ácidos libres adecuados para formar tampones incluyen por ejemplo, cítrico, acético, fosfórico, maleico, malónico, ftálico, salicílico, fumárico, dimetilmalónico, mandélico, málico, fórmico, tartárico, itacónico, láctico, barbitúrico, ascórbico, 2,2 dimetilsuccínico, succínico, benzoico o propiónico. Las bases libres adecuadas para formar tampones incluyen por ejemplo, Tris, trietilamina, imidazol, brucina, tricina, glicinamida, histidina, etanolamina, glicina, etilamina, o dimetilamina. Los especialistas en la técnica reconocerán que pueden usarse muchos otros ácidos y bases para preparar tampones. Los tampones preferidos típicamente tienen un pH entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 12,0.
5.1 Fuentes de moléculas
Pueden prepararse las moléculas mediante cualquier técnica conocida en la técnica. De este modo, por ejemplo, pueden obtenerse proteínas o péptidos cultivando procariotas que secreten proteína o péptido de tipo silvestre o heterólogo, mediante lisis de procariotas, lisis de procariotas que expresen proteínas o péptidos heterólogos, lisis de eucariotas, lisis de eucariotas que expresen proteínas o péptidos heterólogos, cultivo de eucariotas que secreten proteínas o péptidos solubles, síntesis total, etc. Pueden prepararse moléculas orgánicas o inorgánicas usando métodos y procedimientos de síntesis bien conocidos, conocidos por el especialista en la técnica. Las moléculas, si están disponibles en el mercado, pueden adquirirse de proveedores químicos bien conocidos (por ejemplo, Alafa Aesar (Wardhill, MA), por ejemplo Merck KgaA (Darmstadt, Alemania)).
Los procariotas pueden proporcionar proteínas o péptidos después de la lisis celular. Pueden usarse varios métodos para lisar células bacterianas tales como molino de perlas, choque osmótico, fractura por congelación y tratamiento enzimático. Preferiblemente, se usa un homogeneizador a alta presión, tal como un Microfluidizador, para lisar células bacterianas. Como alternativa, pueden cultivarse microorganismos que secreten la proteína o péptido de tipo silvestre o heterólogo, para proporcionar proteínas o péptidos. Pueden cultivarse células procariotas de tipo silvestre o aquellas que expresan proteínas heterólogas, en diversas condiciones conocidas por el especialista en la técnica. El especialista en la técnica conoce métodos para cultivar inóculos e inocular medio de cultivo y en la técnica se han descrito métodos ejemplares. En la técnica también se conocen medios, tiempos, temperaturas y pH preferidos para cultivar microorganismos. De este modo, por ejemplo, las células pueden cultivarse en un medio adecuado para el cultivo de dichas células, por ejemplo, medios mínimos o medios completos (es decir, ricos).
Las proteínas heterólogas pueden producirse ventajosamente mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica para expresar genes. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Vols. 1-3 (1989), y actualizaciones periódicas del mismo, y Ausubel et al., ed., 1989, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., New York. El ADN y el ARN que codifican cualquier proteína heteróloga pueden sintetizarse químicamente usando, por ejemplo, sintetizadores. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M. J. ed., GIRL Press, Oxford.
Pueden utilizarse diversos sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar proteínas. Los sistemas de expresión que pueden usarse para fines de la invención son microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, ADN de fagémido, o ADN de cósmido recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transfectadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión virales recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión virales recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transfectadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, U937) que alojan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores obtenidos del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus, el promotor 7.5 K del virus vaccinia).
En los sistemas eucariotas, pueden usarse varios sistemas de selección, tales como por ejemplo, los genes de timidina quinasa (Wigler et al., 1977, Cell, 11, 223), hipoxantina-guanina fosforribosiltrnsferasa (Szybalska et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 48, 2026), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell, 22, 817) del virus herpes simplex pueden emplearse en células tk^{-}, hprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. Además, puede usarse resistencia antimetabolitos como la base de selección de los siguientes genes: dhrf, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77, 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78, 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78, 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150, 1); e hygro que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene, 30, 147).
En sistemas bacterianos, como se ha mencionado anteriormente, pueden seleccionarse varios vectores de expresión. Las bacterias adecuadas para la puesta en práctica de la invención son bacterias gram positivas y gram negativas. En una realización preferida, se obtienen soluciones de proteínas solubles mediante la expresión de proteínas heterólogas en Eschericia coli ("E. coli") y lisis celular posterior. La proteína puede expresarse en una célula procariota usando sistemas de expresión conocidos por los especialistas en la técnica de la biotecnología. Los sistemas de expresión útiles para la puesta en práctica de la presente invención se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.795.745; 5.714.346; 5.637.495; 5.496.713; 5.334.531; 4.634.677; 4.604.359; y 4.601.980.
Las células procariotas pueden cultivarse en diversas condiciones conocidas por el especialista en la técnica. En un aspecto de la presente invención, las células se cultivan en un medio adecuado para el cultivo de dichas células, por ejemplo, medios mínimos o medios completos (es decir, ricos).
5.2 Purificación de moléculas usando alquildioles terminales
La primera etapa de la presente invención supone introducir una mezcla que contiene una molécula en una columna de cromatografía de líquidos de fase inversa. La mezcla puede contener varios componentes biológicos tales como carbohidratos, lípidos, proteínas, y ácidos nucleicos. La mezcla también puede contener isómeros de la molécula estrechamente relacionados, tales como por ejemplo, regioisómeros, isómeros geométricos o esteroisómeros.
La molécula puede ser un péptido, polipéptido o molécula orgánica (por ejemplo, un antibiótico). Las moléculas peptídicas preferidas son encefalina, somatostatina, somatropina y \alpha-MSH. Otras moléculas que pueden purificarse usando el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, la lista de péptidos bioactivos disponibles de Bachem Biosciences Inc., (Philadelphia, PA). Por tanto, por ejemplo, péptidos natriuréticos atriales, péptidos inhibidores de fibroblastos básicos, bradiquininas, péptidos inhibidores de corticolropinas, son ejemplos de moléculas que pueden purificarse usando el método de la presente invención.
Las moléculas proteicas preferidas son GHA y hGH. Otras proteínas que pueden purificarse usando el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo factores de coagulación sanguínea, Factor VIII, relaxina, factores de crecimiento similares a insulina, interferones, tPA, anticuerpos, antígenos de superficie para vacunas virales, factores de crecimiento animales obtenidos por ejemplo de fuentes porcinas, bovinas u ovinas, insulina, eritropoyetina, factor estimulador de la colonia de granulocitos macrófagos, IGF-2, interleuquinas y otras citoquinas, receptores solubles, selectinas solubles, heregulina, factor de crecimiento vascular endotelial, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), factor de crecimiento similar a EGF, factor de crecimiento transformante epitelial, factor de crecimiento de queratinocitos, factores de crecimiento transformantes del factor de necrosis tumoral o tombopoyetina. Las moléculas orgánicas preferidas incluyen antibióticos tales como vancomicina, cefalosporina C, penicilina G y penicilina V. Otras moléculas orgánicas que pueden purificarse usando el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo macrólidos de polieno, terpenos, alcaloides, carbohidratos o policétidos.
La columna puede ser de baja presión, presión media o alta presión, la última de las cuales se llena con un medio que tiene un diámetro de partícula de menos de aproximadamente 20 \mum. Preferiblemente, para purificación a escala preparativa la columna es una columna de baja presión. Preferiblemente, la columna se llena con un medio que tiene un diámetro de partícula de entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 300 \mum, más preferiblemente, entre aproximadamente 15 \mum y aproximadamente 120 \mum y lo más preferiblemente, entre aproximadamente 35 \mum y aproximadamente 120 \mum. Preferiblemente, el medio de la columna tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 0 \ring{A} a aproximadamente 1000 \ring{A}, más preferiblemente entre aproximadamente 150 \ring{A} y aproximadamente 300 \ring{A}. Por tanto, pueden
usarse medios no porosos (es decir, perlas poliméricas no porosas) y porosos para llenar columnas de RP-LC.
La resina de columna puede ser cualquier material hidrófobo adecuado, incluyendo, aunque sin limitación, resinas poliméricas tales como resinas de poliestiren divinilbenceno (por ejemplo, CG-300, CG-1000 o CG-161), resinas de acrilato o resinas de metacrilato (por ejemplo, CG-71-C o CG-71-M), resinas basadas en sílice (por ejemplo, sílice con un grupo alquilo C1-C18, derivados de fenilo, compuestos de aminoalquilo o aminofenilo), resinas basadas en agarosa (por ejemplo, agarosa con un grupo alquilo C1-C18 o derivados de fenilo), resinas basadas en sefarosa (por ejemplo, sefarosa con un grupo alquilo C1-C18 o derivados de fenilo) y resinas basadas en superosa (por ejemplo, superosa con un grupo alquilo C1-C18 o derivados de fenilo). Los especialistas en la técnica entenderán que en la técnica se conocen muchos otros adsorbentes hidrófobos y pueden usarse en la presente invención. La resina de columna puede adquirirse de varios proveedores tales como, Bayer Corporation (Morris Township, NJ), Serva (Heilderberg, Alemania), Alltech Associates, Inc. (Deerfield, ILL) TosoHaas (Montgomery, PA), Pharmacia (Piscataway, NJ), The Separations Group, Inc (Hesperia, CA), Waters Corporation (Milford, MA), Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) y Polymer Labs (Church Stretton, Shropshire, Inglaterra). El tipo de resina usada para purificar una molécula puede determinarse fácilmente por los especialistas en la técnica y dependerá de factores tales como por ejemplo, la naturaleza de la molécula, el nivel de pureza requerido o la cantidad de molécula purificada requerida.
La columna puede ser una columna analítica o preparativa. La cantidad de molécula introducida en la columna está generalmente entre aproximadamente 0,01 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 70,0 g de molécula/litro de volumen del lecho, preferiblemente, entre aproximadamente 0,02 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 40,0 g de molécula/litro de volumen del lecho, más preferiblemente entre aproximadamente 0,05 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 30,0 g de molécula/litro de volumen del lecho, aún más preferiblemente, entre aproximadamente 1,0 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 25,0 g de molécula/litro de volumen del lecho y lo más preferiblemente, entre aproximadamente 3,0 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 15,0 g de molécula/litro de volumen del lecho. En una realización preferida, la cantidad de molécula introducida en la columna es aproximadamente 10,0 g de molécula/litro de volumen del lecho. Generalmente, el límite inferior para la carga es la capacidad para detectar producto que eluye del medio de la columna, mientras que el límite superior para la carga es la capacidad de saturación de la resina. Debe observarse que las cantidades anteriores son sólo directrices generales y dependerán de factores experimentales tales como la naturaleza de la molécula, el caudal, el tipo de resina y similares.
En una realización preferida, la columna es una columna preparativa, lo que significa escala preparativa y/o carga preparativa. El diámetro de la columna está preferiblemente entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 2 m, más preferiblemente, entre aproximadamente 10 cm y aproximadamente 100 cm.
La longitud de la columna debe ajustarse a escala de forma apropiada al diámetro de la columna. En general, esta es una determinación empírica que pueden realizar fácilmente los especialistas en la técnica. Los factores que pueden ser importantes para determinar la relación entre el diámetro de la columna y la longitud de la columna incluyen tamaño del lecho, tipo de elución (por ejemplo, elución isocrática frente a de gradiente), tipo de resina (por ejemplo, las columnas de intercambio iónico son más cortas y las columnas de exclusión por tamaño son más largas; las dos columnas varían en longitud por causa de los diferentes modos de separación), tiempo de procesamiento deseado y similares. Idealmente, la longitud óptima de la columna para un diámetro dado es una que proporcione separación eficaz de impurezas de la molécula en una resina particular. Normalmente, una vez que se ha determinado la altura de la columna para un proceso de purificación particular, el aumento de la escala puede requerir aumentar el diámetro y el caudal proporcionalmente mientras se mantiene constante la altura.
En general, la cantidad de molécula purificada requerida determinará el tamaño de la columna. De este modo, por ejemplo, pueden usarse columnas con diámetros de hasta dos o tres metros para purificar cantidades particularmente grandes de material.
El disolvente de carga puede ser cualquier disolvente pero es preferiblemente un tampón acuoso que contenga el péptido o proteína especialmente durante la purificación a gran escala. En algunas situaciones, (es decir, purificación de GHA) el disolvente de carga puede contener grandes cantidades de poilietilenglicol (aproximadamente 10-20% p/v).
El caudal de la columna puede variar entre aproximadamente 30 cm/hora y aproximadamente 300 cm/hora. Preferiblemente, el caudal es aproximadamente 60 cm/hora cuando se introduce la molécula en la columna y aproximadamente 120 cm/hora cuando se eluye la molécula de la columna. Debe observarse que el caudal depende de la viscosidad de la fase móvil, tamaño del lecho, eficacia de unión y límites de presión de la resina y el equipo. La pendiente del gradiente está preferiblemente entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 5% (p/p) de diol/volúmenes de columna ("VC"), más preferiblemente entre aproximadamente el 1,25% y aproximadamente el 5% (p/p) de diol/VC, lo más preferiblemente aproximadamente el 2,5% (p/p) de diol/VC.
En la segunda etapa de la presente invención, la molécula se eluye de la columna con un tampón que contiene un diol tal como 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol o 1,7 heptanodiol. Típicamente, la columna fraccionará diversos componentes de la mezcla durante la elución. Preferiblemente, el tampón está a un pH de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 12,0, más preferiblemente, entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 11,0 y lo más preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. Los especialistas en la técnica reconocerán que se requiere un pH de entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 6,0 para cromatografía ácida. Análogamente, se requiere un pH de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0 para cromatografía neutra, mientras que se necesita un pH de entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 12,0 para cromatografía básica). Cualquier tampón apropiado (por ejemplo, fosfato, acetato, Tris-HCl, trietilamina, ácido trifluoroacético o citrato por ejemplo) que mantenga el pH en el intervalo deseado para la purificación, puede usarse para poner en práctica la presente invención. La selección de un tampón de concentraciones apropiadas está dentro de las capacidades de los especialistas en la técnica.
La concentración de diol empleada para la elución variará y depende de factores tales como el tipo de molécula purificada, el tipo de resina utilizada, el caudal y similares. Como tal, la concentración de diol requerida para eluir una molécula particular de una columna puede determinarla fácilmente un especialista en la técnica, sin experimentación indebida.
El disolvente de elución es preferiblemente un alquildiol terminal, más preferiblemente, 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol o 1,7 heptanodiol, lo más preferiblemente, 1,6 hexanodiol. Generalmente, el porcentaje máximo de disolvente de elución en el tampón se determina mediante el límite de solubilidad de la molécula y el diol juntos. Preferiblemente, la concentración de 1,6 hexanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y el 80%, más preferiblemente entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 50%. Preferiblemente, la concentración de 1,5 pentanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y el 80%, más preferiblemente entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 70%. La temperatura preferida para la elución es generalmente a aproximadamente 25ºC, aunque pueden emplearse temperaturas más altas o más bajas. Las presiones de funcionamiento preferidas variarán, dependiendo de si la columna está diseñada para uso a alta presión o a baja presión. Preferiblemente, las columnas de alta presión funcionarán entre aproximadamente 2068,43 kPa (300 psi) y aproximadamente 34473,79 kPa (5000 psi), más preferiblemente, entre aproximadamente 344,73 kPa (500 psi) y aproximadamente 13789,51 kPa (2000 psi). Preferiblemente, las columnas de baja presión funcionarán entre aproximadamente 0 kPa (0 psi) y 344,73 kPa (500 psi), más preferiblemente, entre 0 kPa (0 psi) y 34,47 kPa (50 psi).
Las condiciones preferidas para la purificación de GHA son llenar una columna de RP-LC de entre aproximadamente 45 cm a aproximadamente 200 cm de diámetro con una resina basada en metacrilato (por ejemplo, CG71) o estireno (por ejemplo, CG300) usando un tampón de pH neutro, con una carga de entre aproximadamente 1,0 g a aproximadamente 10 g de GHA/litro de volumen del lecho. Se usa entre aproximadamente el 0% y el 50% (v/v) de 1,6 hexanodiol disuelto en Tris HCl 50 mM para eluir GHA de la columna. La longitud de la columna está preferiblemente entre 10 cm y aproximadamente 20 cm. La presión de funcionamiento preferida está entre aproximadamente 0 kPa (0 psi) y aproximadamente 344,73 kPa (500 psi), más preferiblemente, entre aproximadamente 0 kPa (0 psi) y aproximadamente 34,47 kPa (50 psi).
5.3 Procesado de moléculas después de la purificación usando alquildioles terminales no ramificados
Pueden procesarse adicionalmente las moléculas, por ejemplo, para proporcionar moléculas de un nivel mayor de pureza. El nivel de pureza dependerá del uso potencial de la molécula. En algunos casos, el método de la presente invención, podría ser la última etapa de purificación con las moléculas necesitando solamente intercambio de tampón o concentración antes de su uso pretendido. En otros casos, las moléculas pueden necesitar purificación adicional después del uso del método de la presente invención, antes de su uso pretendido.
Puede usarse cualquier método de purificación conocido por el especialista en la técnica para purificación adicional, si fuese necesaria. Dichas técnicas se han descrito ampliamente para proteínas en "New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology", Walker, J.M. ed., Humana Press, Clifton, N. J., 1988; y Protein Purification: Principles and Practice, 3ª ed., Scopes, R. K., Springer-Verlag, New York, N.Y., 1987. En general, las técnicas que incluyen, aunque sin limitación, precipitación con sulfato de amonio, centrifugado, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración en gel, cromatografía de fase inversa (y las formas de HPLC o FPLC de la misma), recristalización y cromatografía de adsorción (es decir, en sílice o alúmina) pueden usarse para purificar adicionalmente las moléculas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención pero no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención.
6.1 Ejemplo 1
Experimentos de Bakerbond con butilo
Los experimentos con butilo se realizaron en una columna AKTA (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se realizaron gradientes por etapas y lineales para eluir GHA. La longitud del gradiente y las pendientes del gradiente se ajustaron de acuerdo con el experimento. Los efluentes se controlaron mediante absorbancia UV a 280 nm. El sistema de tampón estaba compuesto por fosfato de trieltilamina 15 mM ("TEAP") a pH 7,2 como tampón A y el tampón B fue TEAP 15 mM a pH 7,2 que contenía 1,6 hexanodiol entre el 60% y el 70%.
La Figura 1 muestra el perfil de elución de GHA de una columna de butilo de poro ancho (Mallinckrodt Baker Inc., Phillpsburg, NJ) usando 1,6 hexanodiol como eluyente. El análisis de SDS-PAGE del eluyente se muestra en la Figura 2 (pistas 2-4). La Pista 4 que corresponde a la fracción 29 contiene claramente GHA. La Pista 2 y la Pista 3 (Fracciones 8 y 22, respectivamente) contienen algo de GHA pero a un grado mucho menor que la Pista 4. La fracción 29 se correlaciona con el ápice del pico de absorbancia a 280 nm. La Figura 3 es el análisis de RP-HPLC C-4 de las fracciones reunidas que muestra un pico de GHA y un pico de GHA succinilado a los 12,6 minutos y 13,4 minutos, respectivamente. El rendimiento de GHA era de aproximadamente el 34%.
6.2 Ejemplo 2
Experimentos a pequeña escala con columnas de metacrilato CG71-M
Una columna CG71-M Amberchrom de 10 mm x 10 cm (8,0 ml) (TosoHaas, Montgomeryville, PA) se equilibró a 2 ml/minuto en TEAP 15 mM, pH 7,2. Se introdujo una alícuota de 27 ml de GHA (2,6 mg/ml, disuelto en Tris 50 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM) en la columna CG71-M equilibrada y después se lavó con tampón de equilibrado. La columna se eluyó por etapas con hexanodiol comenzando con hexanodiol al 32,5% en TEAP 15 mM, pH 7,2 después con hexanodiol al 49% en TEAP 15 mM, pH 7,2 y hexanodiol al 65% en TEAP 15 mM, pH 7,2. El eluyente se controló mediante absorbancia a 280 nm y las fracciones reunidas se analizaron mediante SDS-PAGE y RP-HPLC.
Los resultados de la cromatografía de la columna CG71-M Amberchrom de 8,0 ml se muestran en la Figura 4. El GHA se eluyó mediante un gradiente por etapas de hexanodiol al 32,5% en TEAP 15 mM, pH 7,2 con un rendimiento del 98%. La Figura 5 muestra el análisis de SDS-PAGE de la proteína eluida. Como puede verse en la Figura 5, pista 10, la proteína eluida está compuesta principalmente de GHA junto con algunos contaminantes. Las Fracciones 10 a 14 se reunieron y se analizó el contenido de proteína mediante RP-HPLC C-4, que se muestra en la Figura 6. El volumen del reunido era 20 ml a 3,43 mg/ml, lo que se traduce en 68,6 mg de GHA total. La cantidad de GHA introducido en la columna era de aproximadamente 69,5 mg.
6.3 Ejemplo 3
Experimentos de pH con CG71-C
Una columna (5 mm x 10 mm (2,0 ml) de Amberchrom CG71-C (TosoHaas Montgomeryville, PA) se equilibró con TEAP 15 mM, pH 7,2 mientras que otra columna (5 mm x 10 mm (2,0 ml)) de Amberchrom CG71-C se equilibró con ácido trifluoroacético ("TFA") al 0,1%. Para los experimentos a pH bajo, el tampón A era TFA al 0,1% y el tampón B era 1,6 hexanodiol al 80% en TFA al 0,1%. Para experimentos a pH neutro, el tampón A era TEAP 15 mM, pH 7,2 y el tampón B era 1,6 hexanodiol al 65% en TEAP 15 mM, pH 7,2. Cada columna se cargó con un total de 15 mg de GHA obtenido usando el procedimiento de Hayenga et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/307.549. Se pasaron gradientes lineales del 0% al 100% de tampón B sobre 20 volúmenes de columna. El efluente se controló mediante absorbancia a 280 nm. Las fracciones se recogieron y analizaron mediante RP-HPLC y
SDS-PAGE.
Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8, lo que demuestra que el hexanodiol puede eluir GHA de columnas basadas en metacrilato. El fraccionamiento de otras proteínas o contaminantes estrechamente relacionados es evidente en los perfiles de elución puesto que los picos en el perfil de elución tienen crestas. El perfil de elución de los experimentos de pH neutro se extiende sobre un volumen menor que el perfil de elución a pH bajo. El análisis de SDS-PAGE del experimento de pH bajo (Figura 9, gel 1, pistas 5-9 y gel 2, pistas 2-4) y el experimento de pH neutro (Figura 9, gel 2, pistas 5-9) indica que las fracciones contienen GHA, lo que se confirmó mediante análisis RP-HPLC C-4. Los volúmenes de fracciones reunidas fueron 15 ml y 33 ml para el experimento de pH 7,2 y el experimento de pH bajo, respectivamente. El rendimiento de cada columna supera el 96%, lo que indica la recuperación de aproximadamente 14,5 ml de GHA.
6.4 Ejemplo 4
Exploración de resinas de metacrilato (CG71-M) y resina de estiren divinilbenceno (CG300-M)
Se equilibraron tres columnas que contenían resina Amberchrom CG71-M (TosoHaas Montgomeryville, PA), Amberchrom CG71-C y Amberchrom CG300-M, (TosoHaas Montgomeryville, PA) respectivamente en TEAP 15 mM, pH 7,2. Cada columna se cargó con 40 ml de material de la fase superior diluida (preparado mediante extracción en dos fases, usando el procedimiento de Hayenga et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/307.549) que contenía aproximadamente 0,5 mg/ml de GHA. Las columnas se cargaron a 10 mg/ml. Después de la carga, cada columna se lavó con TEAP 15 mM, pH 7,2. Se usó un gradiente lineal de hexanodiol del 0% al 65% en TEAP 15 mM, pH 7,2 para eluir GHA de las columnas (se usaron aproximadamente 20 volúmenes de columna de disolvente). El efluente se controló mediante absorbancia a 280 nm y se recogieron las fracciones apropiadas. Las fracciones se analizaron mediante RP-HPLC C-4 y SDS-PAGE.
Se decidió usar el método de la presente invención como un sustituto de una columna Amberchrom CG1000, que es una resina de fase inversa basada en estiren divinilbenceno que se usó anteriormente para purificar GHA de una fase superior diluida obtenida usando el procedimiento de Hayenga et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/307.549. Se usó típicamente acetonitrilo para eluir GHA de la columna Amberchrom CG1000, lo que aumentó significativamente el coste asociado con el proceso por causa de requisitos de manejo y costosa
eliminación.
Por tanto, las resinas de metacrilato Amberchrom CG71-C, Amberchrom CG71-M y la resina de estiren divinilbenceno Amberchrom CG300-M cargadas como se ha descrito anteriormente, se eluyeron usando un gradiente de 1,6 hexanodiol especificado anteriormente. Las Figuras 10, 11 y 12 muestran los perfiles de elución generados en cada resina, respectivamente. Cada cromatograma ilustra que el 1,6 hexanodiol puede eluir proteína de cada resina. La Figura 13 ilustra el análisis de SDS-PAGE para los reunidos de elución de CG71C y CG71M, mientras que las Figuras 15 y 16 son cromatogramas de RP-HPLC C-4 para los reunidos de elución de CG71C y CG71M, respectivamente.
Las Fracciones 11 a 18 (24 ml) comprendían las fracciones reunidas para el experimento de Amberchrom CG71-C (84% de rendimiento de GHA). El material restante se encontró en el volumen de vacío, lo que sugiere que la capacidad de unión de esta resina es de aproximadamente 8 mg/ml de GHA. Las Fracciones 10 a 16 (21 ml) se reunieron para el experimento de Amberchrom CG71-M (103% de rendimiento de GHA). La carga para esta columna, en base al GHA, es de 10 mg/ml. No se detectó GHA en el volumen de vacío de Amberchrom CG71-M. Los datos se resumen en la Tabla 1, que se muestra a continuación.
TABLA 1
1
El experimento de Amberchrom CG300-M y los análisis de RP-HPLC C-4 y SDS-PAGE resultantes (Figuras 17 y 14, respectivamente) muestran que parte del GHA se eluye de esta columna mediante 1,6 hexanodiol. Sin embargo, el perfil (Figura 11) muestra que la elución es difusa y se arrastra más allá del fin del gradiente. Por tanto, en estas condiciones, el 1,6 hexanodiol al 50% no consigue eluir completamente el GHA de la resina.
6.5 Ejemplo 5
Aumento a escala usando un gradiente por etapas
Puesto que la resina Amberchrom CG71-M proporcionaba resultados favorables en los experimentos preliminares descritos en el Ejemplo 4, se seleccionó está resina para el experimento de aumento a escala. Se vacío una columna Amberchrom CG71-M de 235 ml (5 cm x 12 cm) y se equilibró en Tris HCl 50 mM, pH 7,2. Se introdujeron cuatro litros de fase superior diluida x2 obtenida mediante el procedimiento de Hayenga et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/307.549, a 20 ml/minuto y se eluyeron con un gradiente por etapas de 1,6 hexanodiol al 50% en Tris HCl 50 mM, pH 7,2. La columna se controló mediante absorbancia a 280 nm y las fracciones se recogieron y analizaron mediante RP-HPLC C-4 y SDS-PAGE.
El cromatograma para el experimento de Amberchrom CG71-M de 235 ml se muestra en la Figura 18. El perfil de elución muestra un pico, que es consecuente con una elución por etapas en 1,6 hexanodiol al 50%. La carga de la columna para este experimento fue de 8,3 mg/ml (aproximadamente 2000 mg en 235 ml de resina). El cromatograma de RP-HPLC C-4 (Figura 19a) para el volumen de vacío no muestra GHA. Sin embargo, el rendimiento de GHA solamente fue del 67%. Las Fracciones 6-12 constituyen el pico principal, lo que supone el 47% del material eluido. Las Fracciones 1 a 5 y 13 a 20 completan el equilibrio. El cromatograma de RP-HPLC C-4 (Figura 19b) para las fracciones reunidas mostraba GHA esencialmente puro. Experimentos posteriores demostraron que un gradiente lineal de 1,6 hexanodiol del 0% al 50% en Tris HCl 50 mM, pH 7,2 proporcionaba rendimientos superiores de GHA, que estaban generalmente entre el 80% y el 95%.
6.6 Ejemplo 6
Preparación a gran escala de GHA
Una columna Amberchrom CG71-M de 100 l (100 cm x 13 cm) se equilibró con 3 volúmenes de columna de Tris 50 mM, pH 7,2. Se introdujo fase superior diluida (aproximadamente 1000 l) que contenía GHA, obtenida a partir del procedimiento de Hayenga et al., Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 09/307.549 en la columna a 7,9 l/minuto. Se introdujeron aproximadamente 10 g de GHA por l de resina en la columna. La columna se lavó después con 2 volúmenes de columna de Tris 50 mM, pH 7,2 a 60 cm/hora y 3 volúmenes de columna de Tris 50 mM, pH 7,2 a 120 cm/hora. Se eluyó el GHA con un gradiente de 20 volúmenes de columna de 1,6 hexanodiol del 0% al 50%. El tampón A es Tris 50 mM, pH 7,2 (10 volúmenes de columna) y el tampón B es 1,6 hexanodiol al 50% (p/p), Tris 50 mM, pH 7,2 (10 volúmenes de columna). La elución de GHA se controló mediante absorbancia a 280 nm.
Se eluyeron dos picos principales durante el gradiente y se recogieron por separado. En general, el primer pico se eluye durante el segundo y tercer volúmenes de columna (aproximadamente, seis volúmenes de columna) y cuando se reúne es aproximadamente 600 l. Los dos picos se analizaron mediante RP-HPLC C-4 para determinar la concentración de GHA. Generalmente, el rendimiento de GHA estaba entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 95% en el pico principal. La Figura 20 muestra un cromatograma típico para una purificación a escala de 100 l usando resina CG71-M, mientras que la Tabla 2; a continuación, muestra los rendimientos para cinco purificaciones de GHA usando la misma resina.
TABLA 2
2
La columna se regeneró después de cada purificación con 2 volúmenes de columna de un gradiente de isopropanol al 0-100%, 1 volumen de columna de isopropanol, un gradiente inverso de isopropanol al 100-0% seguido de 1 volumen de columna de agua y 1,5 volúmenes de columna de hidróxido sódico 0,5 N. La columna se puso en contacto con NaOH 0,5 N durante entre aproximadamente 12 y aproximadamente 18 horas. Después la columna se lavó con 2 volúmenes de columna de agua destilada. La columna puede almacenarse en etanol al 20% y NaOH 0,01 N.
6.7 Ejemplo 7
Experimentos con otras proteínas y péptidos
Se seleccionaron cinco proteínas o péptidos diferentes para determinar la aplicabilidad general del método. Met-encefalina sintética (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, Bachem Biosciences Inc (Philadelphia, PA), 0,5 mg/ml), \alpha-MSH sintético (acetil-ACTH, Bachem Biosciences Inc (Philadelphia, PA), 0,5 mg/ml), somatotropina sintética (Bachem Biosciences Inc (Philadelphia, PA), 0,5 mg/ml), somatostatina (aislada de pituitarias de cerdo (0,5 mg/ml)) y hGH recombinante (Bachem Biosciences Inc (Philadelphia, PA), 0,5 mg/ml), se introdujeron de forma individual en una columna Amberchrom CG71-M de 1 ml (5 mm x 5 cm) a aproximadamente 1 mg/ml de resina. Se dispuso un sistema AKTA (es decir, un sistema de FPLC de Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) con Tris HCl 50 mM, pH 7,5 como tampón A y 1,6 hexanodiol al 50%, Tris HCl 50 mM, pH 7,5 como tampón B. Se pasó un gradiente lineal de tampón B del 0 al 100% durante 20 VC para eluir cada columna. Las fracciones se recogieron y analizaron mediante HPLC C-4 y SDS-PAGE.
La Figura 21 es el perfil de elución para encefalina eluida de CG71-M con un gradiente de 1,6 hexanodiol. La encefalina se eluye cuando el disolvente en la entrada de la columna es aproximadamente B al 31%.
El cromatograma que representa la elución de \alpha-MSH se observa en la Figura 22. La proteína se eluye cuando el disolvente en la entrada de la columna es aproximadamente tampón B al 54%. La Figura 23(a) muestra un control mientras que la Figura 23(b) muestra los resultados del análisis de RP-HPLC C-4 del eluato de CG-71.
La somatotropina comienza a eluirse cuando el disolvente en la entrada de la columna CG-71-M es aproximadamente tampón B al 80% pero no se eluyó completamente después de 10 volúmenes de columna de hexanodiol al 50% (véase Figura 24). El análisis de SDS-PAGE indica algún fraccionamiento en el pico (Figura 25). El análisis de RP-HPLC C-4 muestra la presencia de otras especies, pero no en las cantidades que sugieren los resultados de SDS-PAGE. Parece que la columna CG-71-M fracciona diferentes especies de somatotropina en la muestra.
La somatostatina se eluye cuando el disolvente en la entrada de la columna CG-71-M es aproximadamente B al 66% (Figura 26). El análisis de RP-HPLC C-4 demostró la presencia de somatostatina en la fracción del pico.
La hormona humana del crecimiento se eluye cuando el disolvente en la entrada de la columna CG-71-M es aproximadamente B al 60% (Figura 27). La hormona humana del crecimiento es un único pico y parece ser homogéneo. El análisis de SDS-PAGE (Figura 28) muestra que hay otros componentes presentes. Puede observarse una cresta que comprende el 5% del área total integrada en el borde de arrastre del pico principal, en el cromatograma de HPLC C-4.
La presente invención no debe limitar su alcance por las realizaciones ejemplificadas que pretenden ser ilustraciones de aspectos de la invención y aspectos cualesquiera que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y describen en este documento serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (22)

1. Un método para purificar una molécula de una mezcla que comprende:
introducir la mezcla en una columna de cromatografía de líquidos de fase inversa; y
eluir la molécula con un tampón que contiene un diol seleccionado entre el grupo compuesto por 1,5 pentanodiol, 1,6 hexanodiol y 1,7 heptanodiol.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula es un polipéptido.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la molécula se selecciona entre el grupo compuesto por hormona humana del crecimiento y antagonista de la hormona del crecimiento.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula es un péptido.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el péptido se selecciona entre el grupo compuesto por \alpha-MSH, encefalina, somatostatina y somatotropina.
6. El método de la reivindicación 1, en el que el diol es 1,6 hexanodiol.
7. El método de la reivindicación 1, en el que la columna es una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la columna es una columna preparativa.
9. El método de la reivindicación 1, en el que la columna tiene un diámetro de entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 2,0 m.
10. El método de la reivindicación 9, en el que la columna tiene un diámetro de entre aproximadamente 10 cm y aproximadamente 100 cm.
11. El método de la reivindicación 1, en el que la columna incluye una resina polimérica.
12. El método de la reivindicación 11, en el que la resina polimérica es estiren divinilbenceno.
13. El método de la reivindicación 11, en el que la resina polimérica es metacrilato o acrílico.
14. El método de la reivindicación 11, en el que la mezcla se introduce en la columna a entre aproximadamente 1,0 g de molécula/litro de volumen del lecho y aproximadamente 25,0 g de molécula/litro de volumen del lecho.
15. El método de la reivindicación 3, en el que el polipéptido es antagonista de la hormona del crecimiento.
16. El método de la reivindicación 3, en el que el polipéptido es hormona humana del crecimiento.
17. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón está a un pH entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 12,0.
18. El método de la reivindicación 17, en el que el tampón está a un pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 11,0.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el tampón está a un pH entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0.
20. El método de la reivindicación 7, en el que la concentración de 1,6 hexanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 80%.
21. El método de la reivindicación 20, en el que la concentración de 1,6 hexanodiol en el tampón está entre aproximadamente el 0% y aproximadamente el 50%.
22. El método de la reivindicación 1, que comprende además purificación adicional de la molécula.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602004020473D1 (de) * 2003-06-24 2009-05-20 Organon Nv Abtrennung von lipopolysacchariden aus lipopolysaccharidkomplexen mit hilfe von nicht-entzündbaren lösungsmitteln
US7413658B2 (en) * 2003-11-21 2008-08-19 Akzo Nobel N.V. Separation method
US20080085562A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-10 Idexx Laboratories, Inc. Detection of gadolinium chelates
US20080085563A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-10 Idexx Laboratories, Inc. Detection of Gadolinium Chelates
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Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ212523A (en) * 1985-06-24 1989-01-06 Univ Massey Mobile phase for purification of proteins by high performance liquid chromatography
DD285113A5 (de) * 1989-06-21 1990-12-05 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur gewinnung von reinem menschlichen wachstumshormon (hgh)
WO1991015502A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 Shiseido Company, Ltd. Process for purifying polypeptide
US5693769A (en) * 1991-12-13 1997-12-02 Transcell Technologies, Inc. Glycosylated steroid derivatives for transport across biological membranes and process for making and using same
ES2364776T3 (es) * 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG & CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
CA2253830A1 (en) * 1996-05-08 1997-11-13 Eli Lilly And Company Bovine dipeptidylaminopeptidase 1
US5994511A (en) * 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
DE19836213A1 (de) * 1998-08-11 2000-02-24 Gerhard Harry Scholz Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien
US6437101B1 (en) * 1999-05-07 2002-08-20 Akzo Nobel N.V. Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction

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