CN116083475A - 一种在毕赤酵母中表达人igf-1或其类似物lr3 igf-1的方法 - Google Patents

一种在毕赤酵母中表达人igf-1或其类似物lr3 igf-1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在毕赤酵母中表达人IGF‑1或其类似物LR3IGF‑1的方法。为了提高人IGF‑1或其类似物LR3IGF‑1的重组表达能力，本发明在毕赤酵母中通过融合蛋白促进目的蛋白的表达，本申请在IGF‑1或LR3IGF‑1的N端融合木聚糖酶基因XynCDBFV，实现了XynCDBFV‑IGF‑1或LR3IGF‑1融合蛋白的表达。通过融合蛋白之间设计TEV蛋白酶位点，然后纯化时利用TEV蛋白酶切割实现了融合蛋白的分离，得到具有生物活性的人IGF‑1及LR3IGF‑1蛋白。另外，通过高密度发酵，实现了融合蛋白的高效表达。

Description

一种在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法。
背景技术
IGF-1(insulin-like growth factor-1)是一类胰岛素样生长因子，也被称为生长调节素C，其化学结构与胰岛素相似，是体内重要的细胞因子之一。人IGF-1是由70个氨基酸组成的碱性多肽链，有6个半胱氨酸(Cys)，形成三对链内二硫键。血清中的大部分IGF-1是与蛋白IGFBP3(IGF binding protein 3)及ALS(acid-labile subunit)结合组成IGF-1/IGFBP3/ALS三元复合物，该复合物可以延长IGF-1的血清半衰期并调节其功能。在特定条件下，三元复合物中的IGFBP3被特定的蛋白酶酶解，从而使IGF-1从复合物中释放出来。释放出的IGF-1特异地结合到细胞表面的IGF-1受体IGF-1R(IGF-1receptor)，使IGF-1R的β亚基构象发生改变，激活酪氨酸激酶活性，并级联活化PI3K-MAPK通路，从而发挥其各种生物学活性。LR3 IGF-1(Long R3IGF-1)是IGF-1的一个类似物，是将人IGF-1的第三位谷氨酸(Glu)替换成精氨酸(Arg)，同时在其N端引入13个氨基酸组成融合多肽，这13个氨基酸是由猪生长激素的前11个氨基酸再加上缬氨酸(Val)-天冬氨酸(Asn)组成，LR3 IGF-1具有与天然IGF-1几乎相同的二级结构。
目前临床及科学研究中使用的人IGF-1大多来源于大肠杆菌表达系统，但由于IGF-1蛋白存在较多的二硫键，不易于正确折叠，蛋白在表达过程中极易形成包涵体，可溶性表达低。有研究尝试在毕赤酵母中表达LR3 IGF-1,但表达量不高，天然IGF-1在毕赤酵母中的表达还未见报道。综上所述，目前人IGF-1来源仍然非常有限，不能满足临床及科研的需要，因此开发新的能提高此蛋白的表达策略非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法。
根据本发明的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法，包括以下步骤：
合成优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因、毕赤酵母偏爱密码子人LR3IGF-1基因、毕赤酵母偏爱密码XynCDBFV基因，其中，所述毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质，所述毕赤酵母偏爱密码子人LR3 IGF-1基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白质，所述毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白质，
SEQ ID NO.4：人IGF-1基因编码的氨基酸序列：
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA；
SEQ ID NO.5：人LR3 IGF-1基因编码的氨基酸序列：
MFPAMPLSSLFVNGPRTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA；
SEQ ID NO.6：XynCDBFV基因编码的氨基酸序列：
QSFCSSASHSGQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYSDGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFPYAKVYIGD；
构建融合表达载体，所述融合表达载体包括表达XynCDBFV和人IGF-1或LR3IGF-1的表达盒；
将构建的融合表达载体的表达载体线性化后转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母，培养所述重组毕赤酵母，从而表达XynCDBFV和人IGF-1或LR3 IGF-1的融合蛋白。
根据本发明的在毕赤酵母中表达人IGF-1或LR3 IGF-1的方法，其中，优化的人IGF-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，优化的人LR3 IGF-1基因的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，优化的XynCDBFV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
SEQ ID NO:1：人IGF-1基因优化的核苷酸序列：
Ggtcctgagactttgtgtggagcagagcttgtcgatgctttgcagttcgtttgtggagatcgtggattttacttcaataagcctaccgg
ttacggttcatcctctcgtagagcaccacagaccggcatcgttgatgagtgctgtttcagatcctgtgacttgcgtagacttgagatgtattgcgctcctctgaagcctgctaagtctgct，
SEQ ID NO:2：LR3 IGF-1基因优化的核苷酸序列：
Atgttccctgctatgccattgtcttctttgtttgttaacggtccaagaactttgtgtggagcagagcttgtcgatgctttgcagttcgtttgtggagatcgtggattttacttcaataagcctaccggttacggttcatcctctcgtagagcaccacagaccggcatcgttgatgagtgctgtttcagatcctgtgacttgcgtagacttgagatgtattgcgctcctctgaagcctgctaagtctgct，
SEQ ID NO:3：XynCDBFV基因优化的核苷酸序列：
Caaagtttctgtagttcagcttctcactctggacaaagtgtaaaggtaaccggcaacaaggttggaactattggtggtgttggttacgaattatgggctgatagtggtaataacagtgctactttctattctgatggttccttctcatgtactttccaaaatgctggggattacttatgtcgtagtggtctttctttcgatagtactaagaccccatctcaaattggtcgtatgaaggctgatttcaaacttgtcaaacaaaa
tagttccaatgttggttattcctatgttggtgtttacggttggactagaagtccacttgtcgaatactacattgtcgataattggctta
gtccattcccaccaggtgattgggttggtaacaagaagcatggttctttcactattgatggtgctcaatacactgtttatgaaaaca
ctcgtactggtccatctattgatggtgataccaccttcaatcaatactttagtattcgtcaacaagctcgtgattgtggtaccattgat
atttctgctcactttgatcaatgggaaaagcttggtatgactatgggtaaattacatgaagccaaggttttaggtgaagccggtaacgttaacggtggtgccagtggtaccgctgatttcccgtacgcaaaggtttacattggtgat。
根据本发明的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法，其中，所述表达盒包括以下操作性连接的元件：AOX1启动子，酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因、XynCDBFV基因、人IGF-1或人LR3 IGF-1基因序列、终止子。
根据本发明的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3 IGF-1的方法，其中，在所述酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与XynCDBFV基因之间包含蛋白酶酶切位点(ENLYFQG或KREAEA)；在所述XynCDBFV基因与所述人IGF-1或LR3 IGF-1基因序列之间包含linker序列(RSG)和蛋白酶位点；在终止子之前含有His标签序列。
为了提高人IGF-1或LR3 IGF-1的重组表达能力，本发明在毕赤酵母中通过融合蛋白促进目的蛋白的表达，本申请在IGF-1或LR3 IGF-1的N端融合木聚糖酶基因XynCDBFV，获得XynCDBFV-IGF-1或LR3 IGF-1蛋白。本发明发现融合XynCDBFV,并且融合蛋白之间用TEV酶切位点(ENLYFQG)很好地实现了XynCDBFV-IGF-1融合蛋白的表达。但在融合蛋白之间用KEX2及STE13酶切位点(KREAEA)却未见融合蛋白表达，仅见到XynCDBFV的表达。另外，通过在体外TEV蛋白酶切割实现了融合蛋白的分离，得到具有生物活性的人IGF-1及LR3 IGF-1蛋白。
附图说明
图1为人IGF-1或LR3 IGF-1表达载体部分结构示意图；
图2为XynCDBFV与人IGF-1及LR3 IGF-1表达的SDSPAGE图及Westernblot图，其中，A为IGF-1，B为LR3 IGF-1；
图3为人IGF-1及LR3 IGF-1纯化后的SDS-PAGE胶图；
图4为人IGF-1及LR3 IGF-1细胞增殖活性实验图，其中，A为IGF-1，B为LR3 IGF-1；
图5为融合蛋白XynCDBFV-TEV-IGF-1及XynCDBFV-TEV-LR3 IGF-1高密度发酵蛋白胶图。
具体实施方式
本申请在实验中发现，导致人IGF-1及LR3 IGF-1难表达的主要有两个方面的原因，一方面是IGF-1蛋白存在多个二硫键，难以正确折叠；另一方面是IGF-1及LR3 IGF-1半衰期短、稳定性差。本申请通过融合在酵母中能实现非常高表达的XynCDBFV，以期能促进其表达。结果发现，融合XynCDBFV的人IGF-1及LR3 IGF-1蛋白，并且中间以TEV酶切位点连接的构建得到了很好的表达。但中间以KEX2及STE13酶切位点连接的构建没检测到IGF-1及LR3 IGF-1的表达，只检测到XynCDBFV的表达。没有融合XynCDBFV也检测不到IGF-1及LR3IGF-1的表达。进一步利用TEV酶的切割，实现了XynCDBFV与IGF-1及LR3 IGF-1的分离，通过简单的纯化步骤，得到了具有生物活性的人IGF-1及LR3 IGF-1。
实施例1融合表达载体的构建
为了提高以上基因在毕赤酵母中的表达量，对本发明的人IGF-1基因、LR3 IGF-1基因、XynCDBFV基因的核苷酸序列进行毕赤酵母细胞偏好的密码子优化。人IGF-1基因优化的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，LR3 IGF-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，XynCDBFV基因优化的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优化的核苷酸序列都是通过化学合成的方法获得，然后将该DNA序列引入表达载体和细胞中。如图1所示，含有融合XynCDBFV基因和人IGF-1基因及LR3 IGF-1基因的表达盒包括以下操作性连接的元件：AOX1启动子、酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因、XynCDBFV基因、人IGF-1基因或LR3 IGF-1基因、终止子。较佳地，在酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与XynCDBFV基因序列之间还包括蛋白酶酶切位点，用于后续将信号肽与表达产物分离；在XynCDBFV基因与目标蛋白之间有linker序列，以便XynCDBFV基因和目标蛋白都得到很好的表达和折叠；在linker序列之后包含有蛋白酶酶切位点，便于XynCDBFV基因与目标蛋白的分离，所述的蛋白酶酶切位点为TEV酶切位点或酵母内源的KEX2及STE13蛋白酶酶切位点；或在目标蛋白基因与终止子之间，还包括蛋白纯化标签的编码基因，从而有利于后续的纯化操作，所述的蛋白纯化标签是6xHis。
按照上述构建策略，利用同源重组方法将所需元件构建到毕赤酵母表达载体pPIC9KEcoRI与NotI之间，得到重组质粒pPIC9K-IGF-1/LR3 IGF-1、pPIC9K-XynCDBFV-KEX2-IGF-1/LR3 IGF-1、pPIC9K-XynCDBFV-TEV-IGF-1/LR3 IGF-1。将其转化到E.coli.DH5α菌株中，得到E.coli.重组菌株，从重组菌株中提取重组质粒。
实施例2重组蛋白的表达、分离
将上述获得的重组质粒用BglII酶切进行线性化，然后将线性化的重组质粒DNA片段采用电击转化的方法转入新鲜的毕赤酵母GS115感受态细胞中。大约2–3天后，MD平板长出克隆子。然后挑取克隆子进行小管诱导表达检测，从培养箱中取出长有克隆子的MD培养板，用无菌的牙签挑取克隆子。然后将该牙签放入酵母培养管中，每支酵母培养管中装有3mLBMGY培养基。在30℃，220rpm条件下培养48小时；将酵母培养管中培养的菌液在4,500rpm条件下离心5分钟，弃去上清，再向酵母培养管中加入1mL新鲜的BMMY诱导培养基；在30℃，220rpm条件下诱导培养48小时，以上操作均为无菌环境；将诱导48小时后的酵母培养液倒入2mL的离心管中，12,000rpm离心2分钟；取发酵上清液制样进行蛋白SDS-PAGE电泳分析。
小管诱导表达得到阳性克隆子后，对阳性克隆子进行摇瓶表达检测。将表达菌株接种于新鲜的YPD液体培养基(30mL)中进行活化培养，在30℃，220rpm条件下培养48小时；将活化好的菌液，以1％的接种量转接于BMGY液体(400mL)培养基中，在30℃，220rpm条件下培养48小时；然后收集菌体，4,500rpm，4℃离心5分钟，弃去上清，再加入BMMY培养基(提前加入5‰的甲醇)，继续在30℃，220rpm诱导摇瓶培养48–72小时，并且每隔12小时补加一次甲醇，比例为5‰；将诱导培养液12,000rpm，4℃离心10分钟，收集培养上清液，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析、Westernblot分析及后续蛋白纯化(图2)。
在摇瓶发酵培养结束后，从发酵培养基中进行人IGF-1及LR3 IGF-1的分离及纯化。这一步可采用本领域技术人员熟知的技术。例如硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤法纯化；或采用亲和层析法纯化。然而，为了提高纯化的效率，本申请还进行了纯化工艺的优化，以提高纯化的效率。因在摇瓶表达上清中融合蛋白XynCDBFV和目标蛋白人IGF-1及LR3IGF-1中包含蛋白酶TEV的酶切位点，纯化后的融合蛋白利用TEV酶酶切作用使XynCDBFV和目标蛋白IGF-1及LR3 IGF-1分离。因为人IGF-1及LR3 IGF-1的C端设计了6xHis标签，因此用TEV的酶切后的混合物采用Ni柱进行纯化。纯化步骤如下:将预装的Ni-NTAAgarose用20mMTrisHcl、0.5MNacl、10mMimidazolepH8.0结合缓冲液平衡；将用0.22uM滤膜过滤后的发酵上清液流经Ni-NTAAgarose；用含10mMimidazole结合缓冲液洗去Agarose表面未结合蛋白及用含40mMimidazole的漂洗缓冲液洗去杂蛋白后，用含300mMimidazole的洗脱缓冲液洗出目标蛋白，最后经过透析换至PBS缓冲液后保存。从图3可以看出，经过Ni-NTAAgarose纯化后，人IGF-1及LR3 IGF-1蛋白得到了很好的分离，纯度可达95％以上。
用上述纯化的人IGF-1蛋白及LR3 IGF-1进行细胞增殖活性实验，小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3做为实验细胞系。96孔板中每孔加入1.2×104个细胞，每个处理预铺6孔，培养16h；吸取培养液，用100uLPBS洗一次，然后每孔加入含0.1％FBS的DMEM培养基，培养24h；吸取培养液，以无血清的DMEM培养基稀释样品。按下列浓度梯度稀释：0、5、10、20、40、50ng/mL，培养24-36h；吸取上清，换成加了cck-8的DMEM，加入无细胞空白对照，培养1h后，在450nm波长处测定吸光值。图4结果显示，纯化的人IGF-1蛋白及LR3 IGF-1对NIH3T3具有显著增殖作用，并基本与商品化的R&Dsystems公司的IGF-1蛋白活性相同，证明了它具有生物活性。
实施例3高密度发酵生产融合蛋白XynCDBFV-TEV-IGF-1/LR3 IGF-1
通过摇瓶水平筛选得到的XynCDBFV-TEV-IGF-1/LR3 IGF-1阳性克隆子，进行高密度发酵。高密度小试发酵是在实验室15L罐上进行的，具体流程如下：
高密度发酵过程分四个阶段：菌体培养阶段、碳源饲喂阶段、甘油-甲醇混合饲喂阶段、甲醇诱导表达阶段。在菌体生长阶段：种子液接种发酵培养基，利用初始碳源进行生长繁殖，当碳源消耗殆尽时；进入碳源饲喂阶段：再流加一定量的新鲜碳源(甘油)，使毕赤酵母进一步提高细胞密度；甘油-甲醇混合饲喂阶段：使用甲醇和甘油同时补料，让菌体慢慢适应甲醇，缓慢进行过度，减少甲醇对宿主的毒副作用；进入甲醇诱导培养阶段：甲醇流加速率随着诱导阶段以及罐中溶氧进行调整。在整个实验流程中不同时间点进行取样，测定菌体湿重以及检测蛋白表达情况。
1.菌体培养阶段
所述发酵培养基质量终浓度组成：26.7ml/L的85％磷酸，0.93g/L的硫酸钙，18.2g/L的硫酸钾，14.9g/L的MgSO4·7H2O，4.13g/L的氢氧化钾，40g/L的甘油，4.35ml/LPTM1缓冲液，溶剂为去离子水，pH5.0；所述的甘油补料培养基组成：质量浓度25％甘油，12ml/LPTM1缓冲液；
按配方配置发酵培养基，充分溶解后定容7.5升移入15L发酵罐中，饱和蒸汽121℃灭菌20min后降温至30℃,并按每升培养基加入4.37mLPTM1后接入种子液600ml,种后料位约9.0L，30℃通气搅拌培养18-22h,培养过程中用氨水维持pH值5.0。
2.碳源饲喂阶段
确认上一步糖耗完后，开始此步骤。连续流加25％甘油(每升中含12mLPTM1),流加量为36mL/h/L,30℃培养3-5h,流加过程中pH用氨水维持在5.0,溶氧维持在20％以上。此步结束时菌体湿重达到160-170g/L。
3.甘油-甲醇混合饲喂阶段
流加25％甘油(质量体积比):甲醇(8:1,v/v),其中每升含12mLPTM1,流加量为9mL/h/L,30℃培养4h,pH用氨水维持在5.0。
4.甲醇诱导表达阶段
上步进行完毕进入甲醇诱导表达阶段,前2小时流加量为1.6mL/h/L(诱导剂甲醇每升含12mLPTM1),后调整为3.2mL/h/L在诱导过程中每24h取样一次测定表达的酶的积累量。在甲醇补料阶段完毕后，收取含XynCDBFV-TEV-IGF-1/LR3 IGF-1的发酵液，整个发酵过程大概持续约120h，如图5所示，发酵罐水平的SDS-PAGE电泳结果显示发酵液中包含XynCDBFV-TEV-IGF-1/LR3 IGF-1蛋白。
以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (4)

1.一种在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3IGF-1的方法，其特征在于，所示方法包括以下步骤：
合成优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因、LR3IGF-1基因、毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因，其中，所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因编码氨基酸序列如SEQID NO：4所示的蛋白质，所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人LR3IGF-1基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白质,所述优化的毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白质，
构建融合表达载体，所述融合表达载体包括表达XynCDBFV和人IGF-1或XynCDBFV和LR3IGF-1表达盒；
将构建的融合表达载体的表达载体线性化后转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母，培养所述重组毕赤酵母，从而表达XynCDBFV蛋白与人IGF1或LR3IGF-1的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3IGF-1的方法，其特征在于，所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人LR3IGF-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述优化的毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3IGF-1的方法，其特征在于，所述表达盒包括以下从5’端至3’端连接的元件：AOX1启动子，酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因、所述优化的毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因、所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1基因或LR3IGF-1、终止子。
4.根据权利要求3所述的在毕赤酵母中表达人IGF-1或其类似物LR3IGF-1的方法，其特征在于，在所述酿酒酵母a-Factor信号肽编码基因与所述优化的毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因之间包含蛋白酶酶切位点ENLYFQG或KREAEA；在所述优化的毕赤酵母偏爱密码子XynCDBFV基因与所述优化的毕赤酵母偏爱密码子人IGF-1或LR3IGF-1基因之间包含linker序列RSG和蛋白酶位点ENLYFQG或KREAEA；在终止子之前含有His标签序列。
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