RU2429243C2 - Производство белков - Google Patents
Производство белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2429243C2 RU2429243C2 RU2007124369/10A RU2007124369A RU2429243C2 RU 2429243 C2 RU2429243 C2 RU 2429243C2 RU 2007124369/10 A RU2007124369/10 A RU 2007124369/10A RU 2007124369 A RU2007124369 A RU 2007124369A RU 2429243 C2 RU2429243 C2 RU 2429243C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- nucleic acid
- cells
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 claims abstract description 46
- 239000005019 zein Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229940093612 zein Drugs 0.000 claims abstract description 42
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 88
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 84
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 67
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 92
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 34
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 21
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 21
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 15
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 13
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 13
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 12
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 9
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 9
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 7
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 7
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 6
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- -1 gamma-zein Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101710102211 11S globulin Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000767750 Carya illinoinensis Vicilin Car i 2.0101 Proteins 0.000 description 1
- 101000767759 Corylus avellana Vicilin Cor a 11.0101 Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100037642 Elongation factor G, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000880344 Homo sapiens Elongation factor G, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000622316 Juglans regia Vicilin Jug r 2.0101 Proteins 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101000767757 Pinus koraiensis Vicilin Pin k 2.0101 Proteins 0.000 description 1
- 101000767758 Pistacia vera Vicilin Pis v 3.0101 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100226846 Strongylocentrotus purpuratus EGF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/425—Zeins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантной продукции белков внутри подобных белковым тельцам (ОРБПБТ) отложений рекомбинантного белка в эукариотических хозяйских клетках. Конструируют слитый белок, содержащий индуцирующую белковые тельца последовательность, гетерологичную хозяйской клетке и полученную из гамма-зеина, слитую через С-конец с N-концом последовательности представляющего интерес белка. Полученный слитый белок экспрессируют в хозяйской эукариотической клетке млекопитающих или насекомых. Изобретение позволяет получить представляющие интерес рекомбинантные белки, которые стабильно экспрессируются и накапливаются в хозяйских клетках внутри ОРБПБТ. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
Description
ТЕХНИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
В изобретении рассматривается производство рекомбинантных пептидов и белков в эукариотических клетках и организмах, отличных от высших растений, в качестве хозяйских систем. Более подробно, пептиды и белки слиты с белковыми последовательностями, опосредующими индукцию формирования отложений рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам (ОРБПБТ), стабильно экспрессируются и накапливаются в этих хозяйских системах после трансформации соответствующим вектором.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Производство рекомбинантных белков для применения в терапевтических целях, в качестве пищевых добавок или для промышленного применения ознаменовалось ошеломительным успехом за последнее десятилетие. Было показано, что различные эукариотические клетки и организмы могут продуцировать эффективные лекарственные средства на основе белков. К сожалению, высокие цены, часто выводимые из низких уровней продукции рекомбинантного белка и/или из процедур выделения и очистки белка, могут сводить на нет их промышленное применение. Проведено активное исследование, чтобы улучшить и уровень продукции, и процедуры очистки посредством различных подходов.
Чтобы увеличить стабильность и накопление рекомбинантных белков в высших растениях, была разработана новая технология, основанная на слиянии домена запасного белка семян растений с представляющим интерес белком (WO 2000/003207). Эти запасные белки специфичны для семян растений, где они стабильно накапливаются в белковых тельцах (Galili et al., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442).
Запасные белки встроены в люмен эндоплазматического ретикулума (ЭР) посредством сигнального пептида и собираются либо в эндоплазматическом ретикулуме, образуя специфические органеллы, называемые ЕР-производными белковыми тельцами (ЕР-БТ), либо в белковых запасающих вакуолях (БЗВ) (Okita and Rogers 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-50; Herman and Larkins 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot and Raikel 1999 Plant Cell 11:629-642). Также было описано, что рекомбинантные запасные белки собираются в БТ-подобных органеллах в нерастительных хозяйских системах, таких как ооциты Xenopus и дрожжи.
Экспрессия злаковых проламинов (наиболее распространенных злаковых запасных белков) была описана в ооцитах Xenopus после инъекции соответствующих мРНК. Эту систему использовали в качестве модели для изучения особенностей таргетинга этих запасных белков (Simon et al., 1990, Plant Cell 2:941-950; Altschuler et al., 1993, Plant Cell 5:443-450; Torrent et al., 1994, Planta 192:512-518) и для проверки возможности модификации 19 кДа α-зеина, проламина кукурузы, посредством введения необходимых аминокислот (лизина и триптофана) в его последовательность, без изменения его стабильности (Wallace et al., 1988, Science 240:662-664).
Зеины, коплексная группа проламинов кукурузы, также были продуцированы в дрожжах с различными целями. Coraggio и др., 1988, Eur J Cell Biol 47:165-172, экспрессировали нативный и модифицированный α-зеины в дрожжах, чтобы изучить детерминанты таргетинга этого белка. Kim и др., 2002, Plant Cell 14:655-672, изучали возможные взаимодействия α-, β-, γ- и δ-зеина, которые приводят к формированию белковых телец. Для этого они трансформировали дрожжевые клетки кДНК, кодирующей эти белки. Кроме того, упомянутые авторы сконструировали слитые белки зеин-GFP для определения субклеточной локализации зеиновых белков в дрожжевых клетках. Затем дрожжевые клетки были использованы в качестве модельной экспрессионной системы для изучения свойств зеина. Следует отметить, что Kim и др., 2002, Plant Cell 14:655-672, пришли к заключению, что дрожжи - неподходящая модель для изучения взаимодействия зеина, так как зеины как таковые плохо накапливались в трансформированных дрожжах. Дрожжевые клетки были использованы также в качестве модели для изучения механизмов, которые контролируют транспорт и отложение белковых телец запасных белков пшеницы, называемых глиадинами (Rosenberg et al., 1993, Plant Physiol 102:61-69).
Здесь авторы изобретения показали, что слиянием белковой последовательности, опосредующей индукцию отложений рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам (ОРБПБТ), например, проламинам или проламиновым доменам, с пептидом или представляющим интерес белком (мишень), опосредовано накопление тех ОРБПБТ в клетках организмов, таких как грибы (включая дрожжи), водоросли и животные. Интересно, что эти слитые белки стабильно накапливаются в животных клетках внутри органелл, подобных белковым тельцам.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение связано с системой и способом продуцирования слитого белка, содержащего последовательность, индуцирующую белковые тельца (ПИБТ), и представляющий интерес пептид или белок (часто называемый здесь полипептидом), в эукариотических клетках, отличных от клеток высших растений, таких как клетки животных, грибов и водорослей, а также в культивируемых клетках животных, грибов и водорослей, в которых слитые белки, содержащие пептид или представляющий интерес белок, стабильно накапливаются в качестве подобных белковым тельцам отложений рекомбинантного белка (ОРБПБТ). ПИБТ способны опосредовать индукцию образования ОРБПБТ и вход и/или накопление белка в этих органеллах, как, например, последовательностей природных и модифицированных запасных белков с пептидом или представляющим интерес белком (мишени).
Настоящее изобретение, помимо прочего, связано со способом продуцирования представляющего интерес продукта в виде слитого белка в эукариотических клетках, отличных от клеток высших растений, в качестве хозяйских систем, которые трансформировали последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей часть нуклеиновой кислоты, кодирующей ПИБТ, и часть нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептидный продукт.
В определенном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты, используемой для трансформации, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ПИБТ (i), и последовательность нуклеиновой кислоты (ii), содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес продукт. В одном воплощении 3'-конец последовательности нуклеиновой кислоты (i) связан с 5'-концом вышеупомянутой последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом воплощении 5'-конец последовательности нуклеиновой кислоты (i) связан с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты (ii). Таким образом, последовательность ПИБТ может быть на N-конце или C-конце слитого белка.
В другом конкретном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты, использованной для трансформации, содержит, в дополнение к ранее упомянутым последовательностям нуклеиновой кислоты (i) и (ii), последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность спейсера. Аминокислотная последовательность спейсера может быть аминокислотной последовательностью, расщепляемой или нерасщепляемой ферментативным или химическим способом. В определенном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты (iii) расположена между последовательностями нуклеиновой кислоты (i) и (ii), например, 3'-конец последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связан с 5'-концом вышеупомянутой последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом воплощении 5'-конец вышеупомянутой последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связан с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты (ii).
В другом конкретном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты, используемая с целью трансформации, кодирует специфически расщепляемую последовательность и соответствует таковой, описанной в международной патентной заявке WO 2004003207, которая переуступлена совместно с настоящей заявкой. Кроме того, в другом воплощении, нуклеиновая кислота соответствует таковой, описанной в международной патентной заявке WO 2004003207, где отсутствует последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется ферментативным или химическим способом. В последующем воплощении слитые белки могут быть результатом прямого слияния ПИБТ с представляющим интерес пептидом или белком.
В последующем воплощении способ согласно изобретению дополнительно включает в себя выделение и очистку слитого белка.
В еще одном воплощении представляющий интерес белок слит с природным или модифицированным запасным белком, таким, например, как природные или модифицированные проламины или проламиновые домены. Примеры представляющих интерес белков включают в себя любой белок, имеющий терапевтическое применение, применение в качестве пищевых добавок, для осуществления биологического контроля или для промышленного применения.
Иллюстративные белки и пептиды включают в себя, например, гормон, такой как кальцитонин, гормон роста и пр.; антитела, такие как моноклональные антитела и их фрагменты, антигены, пригодные для [получения] вакцин против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ); поверхностные или ядерные белки вируса гепатита В, [вызывающего] гастроэнтерит коронавируса и им подобные, ингибиторы протеаз, антибиотики, коллаген, человеческий лактоферрин, цитокины, промышленные ферменты, такие как гидролазы, гликозидазы, оксидоредуктазы и т.д.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Чертежи как часть настоящего описания, включают в себя
Фиг.1 - фотография SDS/PAGE-анализа, показывающая накопление слитых белков, включая кальцитонин (Ct), человеческий гормон роста (hGH) и эпидермальный фактор роста (EGF) как отдельных представляющих интерес белков, связанных с последовательностью RX3, производной гамма-зеина, индуцирующей белковые тельца, в трансфицированных клетках млекопитающих. Показаны слитые белки RX3-Ct, RX3-hGH и RX3-EGF, накопленные в трансфицированных культивируемых клетках млекопитающих 293T, CHO и Cos1. Эквивалентные количества трансфицированных клеток млекопитающих извлекали через 44 часа после трансфекции, и соответствующий суммарный растворимый белок исследовали посредством электрофореза и вестерн-блота, с применением анти-гамма-зеиновых антител. Схематические изображения конструкций, кодирующих слитые белки RX3-Ct, RX3-hGH и RX3-EGF, также включены: "с" = клетки; "RX3" = N-концевая, богатая пролином последовательность гамма-зеина без сигнального пептида; "m" = среда. Маркеры молекулярного веса (в кДа) отображены слева.
Фиг.2 - фотография в 6 фотоснимках (A-F), показывающая локализацию слитых белков в ОРБПБТ в трансфицированных клетках. Конфокальную микроскопию применяли, чтобы показать клетки Cos1, экспрессирующие RX3-CT (Фиг.2А), клетки СНО, экспрессирующие RX3-Ct (Фиг.2В) и RX3-EGF (Фиг.2С), и клетки 293Т, совместно экспрессирующие RX3-Ct и маркерный белок DsRed2-ER (Фиг.2D, Фиг.2E и Фиг.2F). RX3-производные слитые белки были иммунолокализованы, с применением анти-гамма-зеиновой сыворотки, в структурах, подобных белковым тельцам (Фиг.2A-2D), и в эндоплазматическом ретикулуме (см. стрелку на Фиг.2А). На Фиг.2Е показан ЭР, окрашенный красным флуоресцирующим белком-маркером DsRed2-ER. На Фиг.2F показано наложение Фиг.2D и Фиг.2E, демонстрирующее совместную локализацию RX3-Ct с DsRed2 в ЭР и в ПИБТ. Вкладки на Фиг.2А и 2С соответствуют большему увеличению изображений ПИБТ. Полосы: 1 микрон.
На Фиг.3 на двух фотоснимках (А и В) показано накопление слитых белков в трансформированных дрожжевых клетках. На Фиг.3А показано накопление слитых белков RX3-EGF (дорожка с117) и RX3-hGH (дорожка с118) в трансформированных Saccharomyces. Эквивалентные количества суммарных белковых экстрактов из клеток и среды исследовали посредством иммуноблотинга с применением специфических антител. Клетки, трансформированные плазмидой pYX243 без вставки, использовали в качестве контроля (С). Нижняя часть каждого фотоснимка содержит схематическую картину конструкций, кодирующих слитые белки RX3-hGH и RX3-EGF.
На Фиг.3В показано накопление hGH и RX3-hGH, содержащих слитые белки, в Pichia pastoris, с применением двух различных сигнальных пептидов. Эквивалентные количества суммарных белковых экстрактов из трансформированных клеток и среды исследовали посредством иммуноблотинга с применением специфических антител. С1 и С2 соответствуют клеткам, трансформированным соответственно плазмидами pPIC9 и pPIC3.5К, использованными в качестве контролей. Схематические изображения конструкций с135 и с121, кодирующих слитый белок RX3-hGH, и конструкции с136, кодирующей hGH, показаны внизу фотоснимков. Маркеры молекулярного веса (в кДа) показаны слева от изображений. "y" = дрожжевые клетки; "m" = среда; "SPg" = сигнальный пептид гамма-зеина; "RX3" = N-концевая богатая пролином последовательность гамма-зеина без сигнального пептида; "EGF" = эпидермальный фактор роста; "hGH" = человеческий гормон роста; "Afprepro" = препропептид альфа-фактора.
Настоящее изобретение имеет несколько преимуществ и достоинств.
Одно из преимуществ заключается в том, что его использование дает возможность относительно простой и быстрой экспрессии желательного рекомбинантного белка в предпочтительных эукариотических клетках, которые не являются клетками высших растений.
Достоинство изобретения состоит в том, что оно предоставляет источник легкодоступного и быстро очищаемого рекомбинантного белка вследствие экспрессии в ОРБПБТ.
Кроме того, дополнительные преимущества и достоинства станут очевидны квалифицированному сотруднику из последующего обсуждения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рассматриваемые рекомбинантные белки - это слитые белки, которые образуют отложения рекомбинантного белка, подобные белковым тельцам (ОРБПБТ) в хозяйских клетках, в которых они экспрессируются. Формирование ОРБПБТ индуцируется доменами запасных белков, которые образуют высокоплотные включения внутри клеток. Эти плотные включения могут накапливаться в цитозоле, в эндомембранных системных органеллах, митохондриях, пластидах или могут быть секретируемыми. Отложения рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам, имеют предопределенную плотность, которая может различаться у различных слитых белков, но известна для каждого из получаемых слитых белков. Указанная предопределенная плотность ОРБПБТ обычно больше, чем плотность в основном всех эндогенных белков хозяйской клетки, присутствующих в гомогенате, и обычно составляет от 1,1 до 1,35 г/мл. Высокая плотность новых ОРБПБТ имеет место вследствие общей способности рекомбинантных слитых белков собираться в виде мультимеров и накапливаться. Рассматриваемые ОРБПБТ экспрессируются в эукариотах, не высших растениях, и обычно характеризуются их плотностью, как описано выше. ОРБПБТ обычно сферические по форме, имеют диаметр около 1 микрона (мк) и имеют окружающую мембрану, в тех случаях, когда экспрессируются в животных клетках.
Эти слитые белки содержат две полипептидные последовательности, связанные друг с другом напрямую или опосредованно через пептидную связь, из которых одна - последовательность, индуцирующая белковые тельца (ПИБТ), связанная с полипептидным продуктом (например, пептидом или белком), представляющим интерес (мишень). ПИБТ - белковые или пептидные аминокислотные последовательности, которые опосредуют индукцию структур ОРБПБТ и вход и/или накопление белка в органеллах. Предпочтительно, чтобы ПИБТ и хозяйская клетка относились к разным биологическим типам. Поэтому ПИБТ обычно из высших растений, сперматофитов, тогда как хозяйская клетка - эукариотическая, то есть отлична от сперматофита и может быть животной клеткой, как, например, клетки млекопитающих или насекомых, грибов/дрожжей, или клеткой водорослей, все из которых относятся к иным типам, чем сперматофиты. Неограниченные иллюстративные примеры ПИБТ включают запасные белки или модифицированные запасные белки, как, например, проламины или модифицированные проламины, проламиновые домены или домены модифицированных проламинов. Проламины рассмотрены Shewry и др., 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958. Предпочтительные ПИБТ - из проламиновых компаундов, такие как гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса, и описаны ниже.
Гамма-зеин, запасной белок кукурузы, чьи последовательности ДНК и амнокислотных остатков показаны ниже, является одним из четырех проламинов кукурузы и составляет 10-15 процентов суммарного белка в эндосперме кукурузы. Как и другие злаковые проламины, альфа- и гамма-зеины биосинтезируются в полисомах, связанных с мембранами, с цитоплазматической стороны шероховатого ЭР, связываются в люмене и затем изолируются в ЭР-производные белковые тельца (Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403).
Гамма-зеин состоит из четырех характерных доменов i) сигнальный пептид из 19 аминокислот, ii) повторяющийся домен, содержащий восемь блоков гексапептида PPPVHL (SEQ ID NO:1) (53 аминокислоты), iii) ProX домен, где остатки пролина чередуются с другими аминокислотами (29 аминокислот), и iv) гидрофобный С-концевой домен, богатый цистеином (111 аминокислот).
Способность гамма-зеина собираться в ЭР-производных ОРБПБТ не ограничена семенами. На самом деле, когда ген гамма-зеина конститутивно экспрессировался в трансгенных растениях Arabidopsis, запасной белок накапливался в ЭР-производных ПИБТ в клетках мезофилла листа (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). В поисках сигнала, отвечающего за отложение гамма-зеина в ЭР-производных белковых тельцах (проламины не имеют KDEL-сигнала), было показано, что богатый пролином N-концевой домен, включающий в себя тандемный повторяющийся домен, был необходим для удержания в ЭР, и что С-концевой домен вовлекался в формирование белковых телец. Однако механизмы, с помощью которых эти домены способствуют образованию белковых телец, все еще неизвестны.
Поскольку белковые тельца соответственно названы только в семенах, подобные структуры, продуцируемые в других органах растений и продуцируемые не высшими растениями, относятся обычно к отложениям рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам (ОРБПБТ).
Другие пригодные иллюстративные последовательности проламинового типа показаны в Таблице вместе с их GenBank-идентификаторами ниже.
НАЗВАНИЕ БЕЛКА | GENBANK-идентификатор |
α-Зеин (22 кДа) | M86591 |
Альбумин (32 кДа) | X70153 |
β-Зеин (14 кДа) | M13507 |
γ-Зеин (27 кДа) | X53514 |
γ-Зеин (50 кДа) | AF371263 |
δ-Зеин (18 кДа) | AF371265 |
δ-Зеин (10 кДа) | U25674 |
7S Глобулин или Вицилиновый тип | NM_113163 |
11S Глобулин или Легумининовый тип | DQ256294 |
Проламин 13 кДа | AB016504 |
Проламин 16 кДа | AY427574 |
Проламин 10 кДа | AF294580 |
Дополнительные пригодные последовательности получены путем проведения поиска через BLAST во всей неизбыточной базе данных GenBank: CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF (исключая образцы окружающей среды), как описано у Altschul и др., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, применяя запрос, как, например, показано ниже:
RX3 query SEQ ID NO: 2; Alpha-zein SEQ ID NO: 3 and Rice prolamin query SEQ ID NO: 4.
Иллюстративный модифицированный проламин включает (а) последовательность сигнального пептида, (b) последовательность одной или более копий повторяющегося доменного гексапептида PPPVHL белка гамма-зеина (SEQ ID NO: 1), целого домена, содержащего восемь блоков гексапептида; и (с) последовательность целого ProX-домена гамма-зеина или его части. Иллюстративные специфически модифицированные проламины включают в себя полипептиды, идентифицируемые ниже как R3, RX3 и P4, чьи последовательности ДНК и последовательности аминокислотных остатков также показаны ниже.
Особо предпочтительные проламины включают в себя гамма-зеин и его составляющие части, например, раскрытые в опубликованной заявке WO2004003207, белок риса rP13 и 22 кДа альфа-зеин кукурузы и его N-концевой фрагмент. Последовательности ДНК и аминокислотных остатков гамма-зеина (27 кДа), белков риса и альфа-зеиновых белков показаны в SEQ ID NO: 5 (последовательность ДНК) и SEQ ID NO: 6 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 7 (последовательность ДНК RX3) и SEQ ID NO: 8 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 9 (последовательность ДНК R3) и SEQ ID NO: 10 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 11 (последовательность ДНК P4) и SEQ ID NO 12 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 13 (последовательность ДНК X10) и SEQ ID NO: 14 (белковая последовательность);
rP13: (белковая последовательность SEQ ID NO: 15 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 16) - проламин риса размером 13 кДа, гомологичный клону - AB016504 Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem. 60(2):335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858;
22aZt (белковая последовательность полной длины SEQ ID NO: 17 и последовательность ДНК полной длины SEQ ID NO: 18) N-концевой фрагмент альфа-зеина кукурузы размером 22 кДа - V01475 Kim et al., 2002 Plant Cell 14 (3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339 (1):14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833.
Примеры представляющих интерес белков включают в себя любые белки, имеющие терапевтическое применение, применение в качестве пищевых добавок, для осуществления биологического контроля или промышленное применение, как, например, моноклональные антитела (такие как IgG, IgM, IgA и т.д.) и их фрагменты, антигены для вакцин (вирус иммунодефицита человека, ВИЧ; предповерхностные (pre-surface), поверхностные и ядерные антигены вируса гепатита В, [вызывающий] гастроэнтерит коронавирус и т.д.), гормоны (кальцитонин, гормон роста и т.д.), ингибиторы протеаз, антибиотики, коллаген, человеческий лактоферрин, цитокины, промышленные ферменты (гидролазы, гликозидазы, оксидоредуктазы и пр.). Предоставлены иллюстративные последовательности ДНК и аминокислотных остатков для представляющих интерес иллюстративных белков: кальцитонин лосося BAC57417 (белковая последовательность SEQ ID NO: 19 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 20);
hEGF - конструкция, основанная на AAF85790 без сигнального пептида (белковая последовательность SEQ ID NO: 21 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 22);
hGH - конструкция, основанная на P01241 без сигнального пептида (белковая последовательность SEQ ID NO: 23 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 24).
В другом воплощении рекомбинантный слитый белок сверх того содержит, вдобавок к последовательностям ПИБТ и представляющего интерес белка, аминокислотную последовательность спейсера. Аминокислотная последовательность спейсера может быть аминокислотной последовательностью, расщепляемой или не расщепляемой ферментативным или химическим способом. В определенном воплощении аминокислотная последовательность спейсера помещена между ПИБТ и представляющим интерес белком. Иллюстративная аминокислотная последовательность расщепляется протеазой, такой как энтерокиназа, Arg--C-эндопротеаза, Glu--C-эндопротеаза, Lys--C-эндопротеаза, Factor Xa и пр. Альтернативно, аминокислотная последовательность кодируется таким образом, чтобы она специфически расщеплялась химическим реагентом, таким, например, как, цианбромид, который производит расщепление по метиониновым остаткам.
В последующем воплощении последовательность нуклеиновой кислоты, используемая для целей трансформации, такая, как раскрыто в патентной заявке WO 2004003207.
Более того, в другом воплощении последовательность нуклеиновой кислоты такова, как определено согласно патентной заявке WO 2004003207, но последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая расщепляемую аминокислотную последовательность, отсутствует.
В предпочтительном воплощении слитые белки получают согласно способу, который включает в себя систему для трансформации эукариотических хозяйских клеток, не являющихся клетками высших растений, такую как система для клеток животных, культур клеток животных, грибов/дрожжей, насекомых или водорослей, последовательностью нуклеиновой кислоты (i) (ДНК или РНК), содержащей первую нуклеиновую кислоту, кодирующую ПИБТ, которая оперативно связана в рамке считывания со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (ii), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептидный продукт; то есть последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует ПИБТ, химически связана (пептидная связь) с последовательностью, которая кодирует представляющий интерес полипептид так, что оба полипептида экспрессируются с их собственных рамок считывания. Хозяйскую клетку поддерживают в течение времени и в условиях выращивания, подходящих для экспрессии слитого белка и накопления экспрессированного слитого белка в отложениях рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам (ОРБПБТ). Образующийся при экспрессии слитый белок накапливается в трансформированной хозяйской системе в виде высокоплотных отложений рекомбинантного белка, которые подобны белковым тельцам. Затем слитый белок может быть выделен из хозяйских клеток либо хозяйские клетки, содержащие слитый белок, могут использоваться, как требуется, например для корма для животных, содержащего дополнительное питательное вещество или добавку. Слитый белок может быть выделен как часть ОРБПБТ или независимо от ОРБПБТ.
Условия выращивания, подходящие для экспрессии слитого белка, обычно отличаются для каждого типа хозяйской клетки. Впрочем, такие условия известны и легко определяются квалифицированными специалистами. Длительность поддержания также может различаться в зависимости от типа хозяйских клеток и от количества слитого белка, который предполагается получить. Опять же такие условия хорошо известны и могут быть легко определены в особых случаях. Кроме того, специфические условия культивирования могут быть получены из приведенных ссылок.
В одном воплощении 3'-конец первой последовательности нуклеиновой кислоты (i) связан (соединен) с 5'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом воплощении 5'-конец первой последовательности нуклеиновой кислоты (i) связан (соединен) с 3'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом воплощении ПИБТ содержит запасной белок или модифицированный запасной белок, его фрагмент или модифицированный фрагмент.
В другом конкретном воплощении слитый белок получают согласно способу, в котором используется система для трансформации хозяйских клеток, такая как система для клеток животных, культур клеток животных, грибов/дрожжей, насекомых или водорослей, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей, в дополнение к ранее упомянутым последовательностям нуклеиновой кислоты (i) и (ii), последовательность нуклеиновой кислоты в рамке (iii), которая кодирует аминокислотную последовательность спейсера. Аминокислотная последовательность спейсера может быть аминокислотной последовательностью, расщепляемой или не расщепляемой ферментативным или химическим способом, как отмечено ранее. В одном конкретном воплощении последовательность нуклеиновой кислоты (iii) расположена между вышеупомянутыми последовательностями нуклеиновой кислоты (i) и (ii), например 3'-конец третьей последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связан с 5'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом воплощении 5'-конец третьей последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связан с 3'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii).
Последовательность нуклеиновой кислоты (часть), которая кодирует молекулу ранее описанного слитого белка, или коплемент этой кодирующей последовательности, также рассмотрена здесь. Такая часть нуклеиновой кислоты присутствует в изолированной и очищенной форме в некоторых предпочтительных воплощениях.
В живых организмах последовательность аминокислотных остатков белка или полипептида непосредственно связана через генетический код с последовательностью дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) гена, который кодирует белок. Поэтому, вследствие известной вырожденности генетического кода, могут быть получены, если требуется, дополнительные ДНК и соответствующие им последовательности РНК (нуклеиновые кислоты), которые кодируют те же самые последовательности аминокислотных остатков слитого белка, но значительно отличаются от ранее рассмотренной последовательности гена в такой степени, что две этих последовательности не гибридизуются в условиях жесткости, но гибридизуются в условиях умеренной жесткости.
Условия высокой жесткости могут быть определены как составная гибридизация при температуре около 50°-55°С в 6ХSSC и заключительной отмывке при температуре 68°С в 1-3XSSC. Условия умеренной жесткости включают в себя гибридизацию при температуре от 50°С до 65°С в 0,2-0,3 М NaCl, с последующей отмывкой при температуре от 50°С до 55°С в 0,2X SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия).
Нуклеотидная последовательность (последовательность ДНК или последовательность РНК), которая (1) сама кодирует (или комплементарная ей последовательность кодирует) слитый белок, содержащий последовательность, индуцирующую белковые тельца (ПИБТ), и представляющий интерес полипептид также рассмотрена здесь. Как известно, последовательность нуклеиновой кислоты, такая как рассмотренная последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессируется, когда она оперативно связана с соответствующим промотором в соответствующей экспрессионной системе, как обсуждалось здесь.
Для различных хозяев часто предпочтителен определенный кодон для кодирования определенного аминокислотного остатка. Такие предпочтения в отношении кодонов общеизвестны, и ДНК-последовательность, кодирующая последовательность желаемого слитого белка, может быть изменена с использованием in vitro мутагенеза, например, таким образом, что для каждой хозяйской системы, в которой должен экспрессироваться слитый белок, будут использованы предпочтительные для этой хозяйской системы кодоны.
Также в этом изобретении рассматривается рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, например молекула ДНК, составляющая вектор, содержащий одну или более регуляторных последовательностей (контрольные элементы), например промотор, подходящий для управления экспрессией гена в совместимой хозяйской клетке эукариотического организма, оперативно связанный с экзогенным участком нуклеиновой кислоты (например, с участком ДНК или последовательностью ДНК), который, как обсуждалось выше, определяет ген, кодирующий рассмотренный слитый белок. Более конкретно, рассмотрена рекомбинантная молекула ДНК, содержащая вектор, содержащий промотор для управления экспрессией слитого белка в клетках хозяйского организма, оперативно связанный с сегментом ДНК, который определяет ген, кодирующий последовательность, индуцирующую белковые тельца (ПИБТ), связанную с представляющим интерес пептидом. Эта рекомбинантная молекула ДНК, при соответствующей трансфекции и экспрессии в хозяйской эукариотической клетке, обеспечивает образование рассматриваемого слитого белка, такого как ОРБПБТ.
Как известно в данной области, при условии, если присутствует требуемая нуклеиновая кислота, например последовательность ДНК (включая старт- и стоп-сигналы), дополнительные пары оснований обычно могут присутствовать с любого конца сегмента ДНК и этот сегмент может по-прежнему быть использован для экспрессии белка. Это, конечно, предполагает отсутствие в этом сегменте оперативно связанной последовательности ДНК, которая тормозит экспрессию, [с которой] экспрессируется последующий продукт, который расходует слитый белок, желательный для экспрессии, экспрессируется продукт, который расходует желаемый продукт реакции, продуцируемый тем желаемым слитым белком, или, иначе, мешает экспрессии гена данного сегмента ДНК.
Таким образом, поскольку сегмент ДНК свободен от таких "мешающих" последовательностей ДНК, ДНК-сегмент согласно изобретению может составлять от 500 до 15000 пар оснований в длину. Максимальный размер рекомбинантной молекулы ДНК, особенно экспрессионного вектора, определяется главным образом удобством и размером вектора, который может включить хозяйская клетка, тогда как все минимальные последовательности ДНК, требующиеся для репликации и экспрессии, когда необходимо, присутствуют. Минимальные размеры вектора общеизвестны. Такие длинные сегменты ДНК не предпочтительны, но они могут быть использованы.
Участок ДНК, который кодирует ранее описанный слитый белок, может быть синтезирован химическими способами, например, фосфотриэфирным методом, описанным Matteucci и др. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185. Несомненно, посредством химического синтеза можно произвести любые желаемые модификации кодирующей последовательности просто путем замены соответствующих оснований на те основания, которые кодируют нативную последовательность аминокислотных остатков. Однако сегменты ДНК, включающие в себя рассмотренные в настоящей заявке последовательности, являются предпочтительными.
Участки ДНК, содержащие ген, кодирующий слитый белок, предпочтительно получены из молекул рекомбинантной ДНК (плазмидных векторов), содержащих этот ген. Вектор, который управляет экспрессией гена слитого белка в хозяйской клетке, описан здесь как "экспрессионный вектор".
Экспрессионный вектор содержит элементы контроля экспрессии, включая промотор. Ген, кодирующий слитый белок, оперативно связан с экспрессионным вектором, чтобы позволить последовательности промотора управлять связыванием РНК-полимеразы и экспрессей гена, кодирующего слитый белок. Для экспрессии гена, кодирующего полипептид, пригодны промоторы, которые являются индуцибельными, вирусными, синтетическими, конститутивными, как описано Poszkowski и др. (1989) EMBO J., 3:2719 and Odell et al. (1985) Nature, 313:810, так же как и регулируемыми во времени, регулируемыми в пространстве и регулируемыми в пространстве и времени, как описано у Chua и др. (1989) Science, 244:174-181.
Здесь расматриваются экспрессионные векторы, совместимые с эукариотическими клетками, такие как векторы, совместимые с дрожжевыми клетками, или векторы, совместимые с клетками млекопитающих, водорослей или насекомых и пр. Такие экспрессионные векторы могут использоваться также для создания молекул рекомбинантной ДНК, описанных в настоящем изобретении. Как известно, векторы для применения в дрожжах, как, например в S. cerivisiae или Pichia pastoris, могут быть эписомными или интегративными. Экспрессионные векторы эукариотических клеток общеизвестны в данной области и доступны из нескольких коммерческих источников. Обычно такие векторы содержат один или несколько удобных рестрикционных сайтов для введения желаемого участка ДНК и промоторные последовательности. Иногда такие векторы содержат селективный маркер, специфический для применения в эукариотических клетках. Типичные промоторы для применения в S. cerevisiae включают в себя промотор фосфоглицераткиназы (ФГК) S. cerevisiae и отличающиеся промоторы GAL10 и GAL1, тогда как ген алкогольоксидазы (AOX1) - пригодный промотор для Pichia pastoris. Иллюстративная экспрессия слитого белка в S. cerevisiae и Pichia pastoris показана ниже.
Ниже проиллюстрирована продукция слитого белка посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках млекопитающих с использованием вектора рекомбинантной ДНК, который экспрессирует ген слитого белка в хозяйских клетках яичника китайского хомячка (CHO), в хозяйских клетках обезьяны Cos1 и человеческих хозяйских клетках 293Т. Для достижения этого используются процедуры, которые общеизвестны в данной области и описаны более подробно у Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratories (1989).
Система с клетками насекомых также может быть использована для экспрессии рассмотренного слитого белка. Например, в одной такой системе ядерный полиэдральный вирус Autographa californica (AcNPV) или бакуловирус применяют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или личинки Trichoplusia. Последовательности, кодирующие слитый белок, могут быть клонированы в незначимый район вируса, такой как ген полиэдрина, и помещены под контроль полиэдринового промотора. Успешное введение последовательности слитого белка выключает ген полиэдрина и позволяет создать рекомбинантный вирус без белковой оболочки. Затем рекомбинантные вирусы можно использовать например, для инфицирования клетки S. Frugiperda или личинки Trichoplusia, в которых может быть экспрессирован слитый белок. E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227; и V. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, в Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996). Гетерологичные гены, помещенные под контроль полиэдринового промотора ядерного полиэдрального вируса Autographa californica (AcNPV), часто экспрессируются на высоких уровнях во время последних стадий инфекции.
Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие ген слитого белка, сконструированы с применением системы шаттл-векторов бакуловируса (Luckow et al. (1993) J. Virol., 67:4566-4579) коммерчески доступны в качестве экспрессионных систем бакуловируса Bac-To-Bac® (Life Technologies). Получают стоки рекомбинантных вирусов, и экспрессию рекомбинантного белка контролируют по стандартным протоколам (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992; и King et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992).
Выбор экспрессионного вектора и, в конечном счете, того, с каким промотором оперативно связан ген, кодирующий слитый белок, зависит напрямую от желыемых функциональных особенностей, таких, например, как размещение и время экспрессии белка, а также от хозяйских клеток, которые подлежат трансформации. Эти общеизвестные ограничения являются неотъемлемой частью технологии конструирования рекомбинантных молекул ДНК. Однако вектор, пригодный для применения на практике настоящего изобретения, может управлять репликацией и, предпочтительно, также экспрессией (для экспрессионного вектора) гена слитого белка, заключенного в участок ДНК, с которым он оперативно связан.
Экспрессированные ОРБПБТ и их слитые белки могут быть получены из экспрессирующих хозяйских клеток обычными способами, используемыми при биохимическом и биологическом выделении белка. Так как ОРБПБТ плотнее других белков, присутствующих в хозяйских клетках, ОРБПБТ особенно удобны для отделения посредством центрифугирования клеточного гомогената. Слитые белки могут быть получены из осажденных ОРБПБТ посредством растворениия окружающей мембраны в буфере, содержащем восстановитель, такой как 2-меркаптоэтанол.
Без дальнейших уточнений предполагается, что специалист в данной области может на основании предшествующего описания и подробных примеров, приведенных ниже, использовать настоящее изобретение в его полном объеме. Следовательно, последующие предпочтительные специфические воплощения должны быть истолкованы только как иллюстративные и никоим образом не должны расцениваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Накопление слитых белков в трансфицированных клетках млекопитающих
Синтетические гены, соответствующие последовательностям зрелого кальцитонина (Ct) и EGF, также как и кДНК, кодирующая hGH-последовательность, были слиты с последовательностью RX3, кодирующей N-концевой гамма-зеин (WO2004003207) и введены в вектор pcDNA3.1 (Invitrogen) для получения конструкции p3.1RX3Ct, p3.1RX3EGF и p3.1RX3hGH. Эти конструкции, кодирующие слитые белки RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH, вводили в культивируемые клетки млекопитающих 293T, Cos1 и CHO методом трансфекции, основанным на липофектамине (Invitrogen). Клетки 293T и Cos1, трансфицированные плазмидой pECFP-N1 (Clontech), содержащей генную последовательность усиленного голубого флуоресцирующего модифицированного GFP, использовали в качестве контролей.
Накопление слитых белков в транзитно трансфицированных клетках исследовали посредством Вестерн-блота, с использованием антител, полученных против гамма-зеина. После 44 часов трансфекции тотальные растворимые белки экстрагировали буфером А (100 мM Tris-HCl pH 8,0, 150 мM NaCl, 5 мM EDTA, 0,5% SDS, 0,5% Triton X-100, 2% 2-меркаптоэтанол и ингибиторы протеаз). Аликвоты среды инкубации клеток осаждали и хранили при -20°C. Белки, экстрагированные из эквивалентных количеств трансфицированных клеток, разделялись посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.
Как может быть видно из результатов, отображенных на Фиг.1, три исследованных слитых белка RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH накапливались очень эффективно, независимо от типа культивируемых клеток, отобранных для экспрессии: сравните образец RX3-hGH, накапливавшийся в обеих линиях культивируемых клеток, 293Т и СНО, и образец RX3-EGF - в клетках СНО и Cos1. Слитые белки обнаруживались в белковых экстрактах, соответствующих трансфицированным клеткам (дорожки с), и не обнаруживалось иммунореактивной полосы в культуральной среде клеток (дорожки m). Это наблюдение говорит о том, что RX3-домен способен собирать и удерживать слитые белки в эндомембранном компартменте.
Эти результаты показывают, каким образом слитые белки, производные RX3, собираются и накапливаются в эндомембранной системе в трех типах исследованных клеток млекопитающих (человеческие клетки 293Т, клетки обезьяны Cos1 и клетки хомячка СНО), свидетельствуя о том, что эффективное накопление желаемого белка может быть достигнуто в любой клетке млекопитающих или в клетках выбранного организма через слияние с RX3-доменом.
Пример 2: Субклеточная локализация слитых белков в трансфицированных клетках млекопитающих
Как определено, поскольку N-концевая последовательность гамма-зеина RX3 могла индуцировать подобные белковым тельцам отложения рекомбинантного белка в клетках млекопитающих, локализация слитых белков RX3-Ct и RX3-EGF исследовалась иммуногистохимически с применением конфокальной микроскопии. Трансфицированные клетки фиксировали на 10 минут в 3,7% параформальдегиде и после отмывки в солевом фосфатном буфере инкубировали с гамма-зеиновой антисывороткой (разведение 1/700) в течение 1 часа. Неиммунная сыворотка использовалась в качестве контроля. Первичные антитела были детектированы с антикроличьими антителами, конъюгированными с красителями Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 555 (Molecular probes).
Микрофаги из трансфицированных клеток выделяли с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Leica TCS SP, Heidelberg, Germany), снабженного спектрофотометрами для выбора диапазона длин волн. Изображения зеленой флюоресценции были получены при возбуждении аргоновым ионным лазером при длине волны 488 нм с использованием диапазона длин волн эмиссии 495-535 нм. Изображения красной флуоресценции были получены после возбуждения при 543 нм гелий-неоновым лазером и эмиссионном окне 550-600 нм. Оптические сечения были 0,5 мкм толщиной. Цифровые изображения и проекции записывали с применением компьютерных программ для конфокальной микроскопии.
На Фиг.2 показаны конфокальные проекции клеток, трансфицированных p3.1Ct и p3.1RX3EGF. Как показано на фиг.2, соответствующие слитые белки, RX3-Ct и RX3EGF, были выявлены в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР, стрелка в Фиг.2A), указывая на то, что сигнальный пептид гамма-зеина функционирует в клетках млекопитающих, где он опосредует перемещение слитого белка в ЭР. Образцы, инкубированные с неиммунной сывороткой, использованные в качестве контроля, не показали какой-нибудь значительной флуоресценции (не показано).
Важно отметить, что неожиданно слитые белки накапливались в больших бляшках, очевидно окруженных мембраной (см. вкладку в Фиг.2А). Эти структуры, которые отсутствуют в нетрансфицированных клетках, сопоставимы по размеру с белковыми тельцами растений, имеющими диаметр около 1 микрона (вкладки А и С). Этот результат удивителен не только из-за того факта, что животные клетки могут воспроизводить БТ-органеллу хранения, описанную в растениях, но и из-за большего количества ОРБПБТ, наблюдаемых во всех трансфицированных клетках, демонстрируя, таким образом, эффективную накопительную емкость этих клеток. Более того, различные типы трансфицированных клеток продемонстрировали сходный характер локализации и накопления слитых белков (см. Фиг.2А, 2В и 2D), который проявляется независимо от того, какая мишень слита с ПИБТ (Фиг.2В и 2С).
Клетки были совместно трансфицированы плазмидой pDsRed2-ER (Clontech), содержащей последовательность флуоресцирующего белка, используемого в качестве ЭР-маркера для исследования субклеточного происхождения этих индуцированных ПИБТ. Интересно то, что как может быть видно на Фиг.2D, 2E, и 2F, оба белка, RX3-Ct и ЭР-маркер, совместно локализуются в ЭР и в БТ-подобных отложениях, указывая на ЭР-происхождение индуцированных ОРБПБТ в клетках млекопитающих, как происходит в клетках растений.
Пример 3: Накопление слитых белков в трансформированных дрожжевых клетках
Последовательности, кодирующие EGF и hGH, были слиты с последовательностью RX3, кодирующей N-концевой гамма-зеин (WO2004003207), и введены в вектор pYX243 (R&D системы), чтобы получить конструкции c117 и c118. Эти конструкции, которые кодируют слитые белки RX3-EGF и RX-hGH, вводили в Saccharomyces cerevisiae.
Экспрессионный анализ производили, выращивая трансформанты на среде, содержащей галактозу, и эквивалентные количества и клеток, и среды, исследовали посредством SDS-PAGE и иммуноблотинга с применением специфических антител против рекомбинантных экспрессированных белков. Как может быть видно из Фиг.3А, оба слитых белка, RX3-EGF (дорожки c117) и RX3-hGH (дорожки c118), накапливались в клетках дрожжей, следов белка в среде обнаружено не было.
Изучали также накопление hGH и слитых белков, производных hGH, в дрожжах Pichia pastoris, которые трансформировали конструкциями c135 и c121 (кодирующими слитый белок RX3-hGH) и c136 (кодирующей белок hGH, см. схематическое изображение на Фиг.3B). Были отобраны трансформанты, накапливающие наивысшие уровни рекомбинантных белков.
Использовали два разных сигнальных пептида для экспрессии слитого белка: сигнальный пептид гамма-зеина (Фиг.3В, SPg) и дрожжевой препропептид альфа-фактора (Фиг.3B, Afprepro). Кроме того, исследовали также контроль секреции с использованием дрожжевого препропептида альфа-фактора, оперативно слитого с hGH. Суммарные белки из клеток и среды исследовали посредством Вестерн-блота с применением специфических антител кролика против hGH.
Как ожидалось, hGH секретировался в среду (Фиг.3B, дорожка c136/m), когда использовали препропептид альфа-фактора. В противоположность этому слитый белок RX3-hGH накапливался внутри дрожжевых клеток независимо от использованного сигнального пептида. Как можно видеть из Фиг.3B, слитый белок был внутри клеток в обоих случаях: и когда использовали дрожжевой препропептид альфа-фактора (дорожка c135/y), и когда использовался сигнальный пептид гамма-зеина (дорожка c121/y); следов белка в среде обнаружено не было (не показано). Таким образом, N-концевого богатого пролином домена гамма-зеина было достаточно для того, чтобы опосредовать удержание белка в эндомембранном компартменте дрожжевых клеток, а именно в плотной фракции, соответствующей структурам, подобным БТ, которые могут быть отделены путем центрифугирования.
Результаты, полученные с Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, - это примеры других эукариотических организмов, отличающихся от царств растений и животных, где слитые белки, содержащие запасной белок семян, эффективно собираются и накапливаются в структурах, подобных БТ.
Экспериментальные примеры
Плазмидные конструкции для трансфекции клеток млекопитающих
Синтетический ген, соответствующий последовательности зрелого кальцитонина (Ct), был получен, как описано в патентной заявке WO2004003207.
Синтетический ген, кодирующий 53 аминокислоты активного hEGF, был выделен с помощью ПЦР с перекрытием праймеров, с применением 4 олигонуклеотидов размером около 60 оснований, с 20 перекрывающимися основниями. кДНК синтетического hEGF включала в себя 5'-линкерную последовательность, соответствующую специфическому сайту расщепления Factor Xa. Олигонуклеотиды (EGF1 SEQ ID NO: 25; EGF2 SEQ ID NO: 26; EGF3 SEQ ID NO: 27; EGF4 SEQ ID NO: 28) очищали посредством полиакриламидного денатурирующего геля.
Последовательность кДНК, кодирующая 191 аминокислоту человеческого гомона роста (hGH), была получена из кДНК гипофиза человека (Clontech, BDBiosciences) посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидов GH5 (SEQ ID NO: 29) и GH3 (SEQ ID NO: 30), которые включали в себя последовательность, соответствующую сайту расщепления энтерокиназы.
Синтетические гены, соответствующие последовательностям зрелого кальцитонина (Ct, WO2004003207) и hEGF, так же как и кДНК, кодирующая hGH, были слиты с последовательностью RX3, кодирующей N-концевой гамма-зеин (патентная заявка WO2004003207) и введены в pUC18. Рестрикционные фрагменты SalI-BamHI плазмид pUC18RX3Ct, pUC18RX3EGF и pUC18RX3hGH, производных pUC18, содержащие соответствующие последовательности слитого белка RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH, были введены в вектор pcDNA3.1- (Invitrogen), рестрицированный XhoI-BamHI. В итоговых конструкциях, названных p3.1RX3CT, p3.1RX3EGF и p3.1RX3hGH, последовательности слитого белка находились под CMV-промотором и терминатором pA BGH.
Плазмидные конструкции для трансформации в дрожжи
Хозяйские штаммы и векторы:
Штамм Saccharomyces cerevisiae (генотип Mata his3 leu2 met15 ura3 bar1::URA3) трансформировали с применением конструкций, производных вектора pYX243 (GAL промотор, LEU2, AmpR, из R&D Systems). Штамм Pichia pastoris GS115 (his4) и вектор pPIC9 и pPIC3.5K (AOX1 промотор, HIS4, AmpR) были из Invitrogen life tech.
Плазмидные конструкции:
Рестрикционные фрагменты SalI (тупой конец)-BamHI из плазмид pUC18RX3EGF и pUC18RX3hGH, производных pUC18, описанных выше, содержащие соответствующие последовательности слитого белка RX3-EGF и RX3-hGH, были введены в вектор pYX243 (R&D Systems), рестрицированный EcoRI (тупой конец)-BamHI. В итоговых конструкциях, названных, соответственно, c117 и c118, последовательности слитого белка находились под индуцибельным GAL-промотором.
Рестрикционные фрагменты SalI (тупой конец)-BamHI (тупой конец) плазмид pUC18RX3EGF и pUC18RX3hGH, производных pUC18, были ввдены в вектор pPIC3.5K (Invitrogen), рестрицированный NotI (тупой конец)-EcoRI (тупой конец), для получения плазмид c120 и c121, чтобы трансформировать Pichia Pastoris.
Плазмиду pPIC9 (Invitrogen) применяли для исследования экспрессии слитого белка с использованием сигнального пептида дрожжей, препропептида альфа-фактора Saccharomyces. Последовательности, фланкированные XhoI-NotI, кодирующие белки RX3-hGH и hGH, были получены посредством ПЦР с использованием pUC18RX3hGH в качестве матрицы и олигонуклеотидов af06 (SEQ ID NO: 31), afRX (SEQ ID NO: 32) и 06Not (SEQ ID NO: 33).
Эти последовательности содержали последовательность, кодирующую сайт KEX2, необходимый для эффективного разрезания препропептида альфа-фактора (Invitrogen, Pichia expression Kit). ПЦР-продукты клонировали в pPIC9, рестрицированную XhoI-NotI, дающую плазмиды c135 и c136, содержащие соответственно белковые последовательности RX3-hGH и hGH, слитые с препропептидом альфа-фактора.
Трансформация дрожжей
Штамм Saccharomyces cerevisiae (leu2) трансформировали плазмидными конструкциями c117 и c118 посредством метода LiAc Method (Ito et al. 1983, J. Bacteriol. 153:163-168), трансформанты отбирали на Leu- чашках. Экспрессионный анализ проводили посредством выращивания трансформантов в среде, содержащей галактозу (необходимый состав).
Штамм Pichia pastoris GS115 (his4) трансформировали, используя набор Pichia EasyComp Kit (Invitrogen life tech.) с линеаризованными (с помощью SacI) плазмидами c120 и c121, и высевали на среде RDB His-. Mut-фенотипы определяли посредством пересева колоний на чашки с MD и ММ агаром. Испытания экспрессии проводили посредством выращивания трансформантов в среде YPD в течение двух дней. После этого клетки осаждали и суспендировали в ММ среде в течение следующих 48 часов, метанол добавляли каждые 24 часа до конечной концентрации 0,5%. Были отобраны трансформанты, накапливавшие самые высокие уровни рекомбинантного белка. Среды готовили, как описано Invitrogen (Pichia expression Kit).
Выделение белков дрожжей и Вестерн-блот
S. cerevisiae и P. рastoris, экспрессирующие рекомбинантные слитые белки, осаждали. Аликвоты соответствующей среды инкубации осаждали и хранили для исследования при -20°C. Осадки клеток также замораживали, и после оттаивания клетки разрушали посредством стандартных методов с использованием стеклянных бусин и среды H (50 мМ HCl-Tris pH 8,0, 150 мM NaCl, 5 мM EDTA, 200 мM DTT и ингибиторы протеаз). Эквивалентные количества и клеток, и среды исследовали посредством SDS-PAGE и иммуноблотинга с использованием специфических антител против рекомбинантных экспрессированных белков.
Каждый из цитируемых здесь патентов и статей считается включенным в настоящее описание в виде ссылки. В настоящем описании предполагается, что использование единственного и множественного числа является взимозаменяемым.
Предшествующее описание и примеры приводятся как иллюстративные и не могут быть расценены как ограничивающие объем настоящего изобретения. Кроме того, в рамках сущности и объема этого изобретения возможны вариации, которые могут быть предложены специалистами в данной области.
Claims (7)
1. Хозяйская эукариотическая клетка, которая содержит рекомбинантный слитый белок внутри подобных белковым тельцам (ОРБПБТ) отложений рекомбинантного белка, где указанный слитый белок содержит две последовательности, связанные вместе, из которых одна последовательность - это индуцирующая белковые тельца последовательность, гетерологичная хозяйской клетке, и другая - последовательность представляющего интерес белка, где хозяйская эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающих или насекомых, где индуцирующая белковые тельца последовательность, гетерологичная хозяйской клетке, получена из γ-зеина, и где С-конец индуцирующей белковые тельца последовательности связан с N-концом представляющего интерес белка.
2. Хозяйская клетка по п.1, где указанная плотность ОРБПБТ составляет приблизительно от 1,1 до 1,35 г/мл.
3. Хозяйская клетка по п.1, где указанный слитый белок дополнительно содержит линкерную последовательность между последовательностью, индуцирующей белковые тельца, и последовательностью представляющего интерес белка.
4. Способ получения слитого белка, который включает следующие стадии:
(а) трансформацию эукариотических хозяйских клеток последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей первую нуклеиновую кислоту (i), кодирующую последовательность, индуцирующую белковые тельца (ПИБТ), которая оперативно связана в рамке со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (ii), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептидный продукт;
(b) поддержание трансформированных хозяйских клеток в течение временного периода и в условиях культивирования, подходящих для экспрессии слитого белка и отложения экспрессируемого слитого белка в подобных белковым тельцам (ОРБПБТ) отложениях рекомбинантного белка, и
(c) извлечение экспрессированного слитого белка, где хозяйская эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающих или насекомых, где индуцирующая белковые тельца последовательность получена из γ-зеина (γ-зеина (50 кДа)), и где 3′-конец последовательности первой нуклеиновой кислоты связан с 5′-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты.
(а) трансформацию эукариотических хозяйских клеток последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей первую нуклеиновую кислоту (i), кодирующую последовательность, индуцирующую белковые тельца (ПИБТ), которая оперативно связана в рамке со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (ii), содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептидный продукт;
(b) поддержание трансформированных хозяйских клеток в течение временного периода и в условиях культивирования, подходящих для экспрессии слитого белка и отложения экспрессируемого слитого белка в подобных белковым тельцам (ОРБПБТ) отложениях рекомбинантного белка, и
(c) извлечение экспрессированного слитого белка, где хозяйская эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающих или насекомых, где индуцирующая белковые тельца последовательность получена из γ-зеина (γ-зеина (50 кДа)), и где 3′-конец последовательности первой нуклеиновой кислоты связан с 5′-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты.
5. Способ по п.4, где указанная нуклеиновая кислота кодирует линкерную последовательность между ПИБТ и представляющим интерес полипептидным продуктом.
6. Способ по п.4, где последовательность нуклеиновой кислоты, использованной для трансформации хозяйских клеток, присутствует в экспрессионном векторе, содержащем одну или более регуляторных последовательностей.
7. Способ по п.6, где указанные одна или более регуляторных последовательностей включают в себя промотор.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0426160.8A GB0426160D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-11-29 | Production of proteins |
GB0426160.8 | 2004-11-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007124369A RU2007124369A (ru) | 2009-01-10 |
RU2429243C2 true RU2429243C2 (ru) | 2011-09-20 |
Family
ID=33561506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007124369/10A RU2429243C2 (ru) | 2004-11-29 | 2005-11-29 | Производство белков |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8822181B2 (ru) |
EP (1) | EP1819725B1 (ru) |
JP (1) | JP2008521391A (ru) |
KR (1) | KR101430081B1 (ru) |
CN (1) | CN101098886B (ru) |
AR (1) | AR051837A1 (ru) |
AU (1) | AU2005308921B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0517121A (ru) |
CA (1) | CA2589164C (ru) |
GB (1) | GB0426160D0 (ru) |
RU (1) | RU2429243C2 (ru) |
WO (1) | WO2006056483A1 (ru) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
GB0426161D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Protein isolation and purification |
US8163880B2 (en) | 2006-02-23 | 2012-04-24 | Era Biotech S.A. | Production of biologically active proteins |
KR20110084906A (ko) | 2008-10-10 | 2011-07-26 | 에라 바이오테크, 에스.에이. | 면역원-특이적 면역보강제로서의 재조합 단백질체들 |
EP2418284A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-15 | ERA Biotech, S.A. | Protein body-inducing polypeptide sequences |
EP2468872A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Philip Morris Products S.A. | Method for producing mullerian inhibitor substance in plants |
CN103502455A (zh) | 2011-01-17 | 2014-01-08 | 菲利普莫里斯生产公司 | 用于在植物中核酸表达的载体 |
JP6037395B2 (ja) | 2011-01-17 | 2016-12-07 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物におけるタンパク質発現 |
FI20115704L (fi) | 2011-07-01 | 2013-01-02 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy | Vierasproteiinien tuoton parantaminen |
GB201514648D0 (en) * | 2015-08-18 | 2015-09-30 | Univ Cape Town | Synthetic BTV VP2 fusion protein |
GB201514652D0 (en) * | 2015-08-18 | 2015-09-30 | Univ Cape Town | Synthetic BTV VP2 multiepitope peptide vaccine |
CA3023025A1 (en) * | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Method of producing a recombinant protein |
CN112048518B (zh) * | 2020-08-22 | 2022-06-24 | 江西农业大学 | 一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用 |
US10894812B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-01-19 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant milk proteins |
CA3191387A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4215040A (en) * | 1978-12-22 | 1980-07-29 | The Procter & Gamble Company | Density separation process |
US5650554A (en) * | 1991-02-22 | 1997-07-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
DE69836552T3 (de) * | 1997-09-30 | 2014-10-09 | The Regents Of The University Of California | Herstellung von proteinen in pflanzensamen |
WO2002086077A2 (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Co-expression of zein proteins |
ATE452137T1 (de) * | 2002-05-24 | 2010-01-15 | Restoragen Inc | Verfahren und konstrukte zur expression von clostripain mit hoher ausbeute |
EP1532261B1 (en) * | 2002-05-24 | 2010-02-10 | Medtronic, Inc. | Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides |
ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
GB0426161D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Protein isolation and purification |
US8163880B2 (en) * | 2006-02-23 | 2012-04-24 | Era Biotech S.A. | Production of biologically active proteins |
KR20110084906A (ko) * | 2008-10-10 | 2011-07-26 | 에라 바이오테크, 에스.에이. | 면역원-특이적 면역보강제로서의 재조합 단백질체들 |
EP2418284A1 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-15 | ERA Biotech, S.A. | Protein body-inducing polypeptide sequences |
-
2004
- 2004-11-29 GB GBGB0426160.8A patent/GB0426160D0/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-11-29 JP JP2007541877A patent/JP2008521391A/ja active Pending
- 2005-11-29 KR KR1020077014382A patent/KR101430081B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-29 EP EP05812587A patent/EP1819725B1/en active Active
- 2005-11-29 AU AU2005308921A patent/AU2005308921B2/en not_active Ceased
- 2005-11-29 RU RU2007124369/10A patent/RU2429243C2/ru active
- 2005-11-29 BR BRPI0517121-0A patent/BRPI0517121A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-11-29 AR ARP050104995A patent/AR051837A1/es not_active Application Discontinuation
- 2005-11-29 CN CN2005800461115A patent/CN101098886B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-29 CA CA2589164A patent/CA2589164C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-29 WO PCT/EP2005/012877 patent/WO2006056483A1/en active Application Filing
- 2005-11-29 US US11/288,853 patent/US8822181B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KIM C.S. et al., Zein protein interactions, rather than the asymmetric distribution of zein mRNAs on endoplasmic reticulum membranes, influence protein body formation in maize endosperm, Plant Cell, 2002, V.14, N.3, P.655-672. RICHARD G. et al., Transport and Deposition of Cereal Prolamins, Plant Physiol., 1996, Biochem., V.34. N.2, P.237-243. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2589164C (en) | 2014-10-28 |
RU2007124369A (ru) | 2009-01-10 |
GB0426160D0 (en) | 2004-12-29 |
US20060121573A1 (en) | 2006-06-08 |
JP2008521391A (ja) | 2008-06-26 |
EP1819725A1 (en) | 2007-08-22 |
AU2005308921B2 (en) | 2011-11-24 |
CA2589164A1 (en) | 2006-06-01 |
AU2005308921A1 (en) | 2006-06-01 |
EP1819725B1 (en) | 2013-03-27 |
AR051837A1 (es) | 2007-02-14 |
CN101098886B (zh) | 2012-09-26 |
KR20070091156A (ko) | 2007-09-07 |
BRPI0517121A (pt) | 2008-09-30 |
KR101430081B1 (ko) | 2014-08-13 |
US8822181B2 (en) | 2014-09-02 |
CN101098886A (zh) | 2008-01-02 |
WO2006056483A1 (en) | 2006-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2429243C2 (ru) | Производство белков | |
KR102022662B1 (ko) | 식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 | |
EP3184640A2 (en) | Protein body-inducing polypeptide sequences | |
RU2420585C2 (ru) | Выделение и очистка белка | |
CA2278523C (en) | Rna binding protein and binding site useful for expression of recombinant molecules | |
KR20100017491A (ko) | 식물 소포체 파생적 단백질체들 내의 축적에 의한 펩티드 및 단백질들의 생산 | |
JP2001512684A (ja) | 新規のpichiapastoris遺伝子配列およびそれらの使用方法 | |
Koganesawa et al. | Expression and purification of a small cytokine growth-blocking peptide from armyworm Pseudaletia separata by an optimized fermentation method using the methylotrophic yeast Pichia pastoris | |
Luo et al. | Improving heterologous expression of porcine follicle-stimulating hormone in Pichia pastoris by integrating molecular strategies and culture condition optimization | |
JP2003511035A (ja) | タンパク質性物質の産生方法 | |
US8067198B2 (en) | Protein expression system | |
US8691530B2 (en) | Process for obtaining aspart insulin using a Pichia pastoris yeast strain | |
CN113924312A (zh) | 重组蓑蛾虫丝蛋白质的大量生产系统 | |
EP0625198B1 (en) | Expression of osteogenic factor op-1 in cells of spodoptera frugiperda infected with recombinant baculovirus | |
CN113683669B (zh) | 基于与醇溶蛋白的互作在植物中积累目标蛋白的方法 | |
MX2007006330A (en) | Production of proteins | |
US6890730B1 (en) | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems | |
CN117024569B (zh) | 生物合成人体结构性材料viii型胶原蛋白的方法 | |
CN116083475A (zh) | 一种在毕赤酵母中表达人igf-1或其类似物lr3 igf-1的方法 | |
Fan et al. | Expression of human β-subunit nerve growth factor (hNGFB) in yeast Pichia pastoris and E. coli | |
EP2369000A1 (en) | Production of peptides and proteins by accumulation in mitochondria | |
Guan | Fluorescent protein reporter for monitoring transgenic plant cell cultures | |
WO2000049044A1 (en) | Expression of helicobacter polypeptides in pichia pastoris |