JP2003511035A - タンパク質性物質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物材料で異種タンパク質性物質を産生するための新規な方法に関する。好ましい方法では、選択された完全な蘚類植物を培養し、産生された組織および細胞を本質的に乱さずに、所望の標的物質を培地から得る。本方法を使用することにより、標準化された条件で、異種タンパク質のそれぞれの活性形を、全様式で費用効果的に産生することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、一般に、植物材料におけるタンパク質性物質産生の分野に関する。
特に、本発明は、蘚類において所望のタンパク質性物質を産生する新規な方法に
関する。

【０００２】 産生するためのバイオテクノロジー方法を開発することには、他の経路で、た
とえあるとしても、たとえば化学合成では経済的に製造することができない物質
や、原材料の役割を果たすのに十分な量を自然には入手することができない物質
を、人が産生する上で重要な可能性がある。１００００を超える植物二次代謝産
物が知られているが、これらの化合物の中で、植物細胞培養を用いて工業規模で
製造されるものは少ない。これらの物質は、広く薬学的に活性な二次代謝産物で
ある。名前を挙げることができる例は、ａ）静菌作用および殺菌作用を有するべ
ルベリン（Ｙ．Ｆｕｊｉｔａ ａｎｄ Ｍ．Ｔａｂａｔａ，Ｐｌａｎｔ ｔｉｓ
ｓｕｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｖ
ｏｌ．３，ｐ．１６９、Ｃ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），Ａ．Ｒ
．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））（４０００リットル規
模で産生）、ｂ）抗生物質作用および抗炎症作用を有するシコニン（Ｍ．Ｔａｂ
ａｔａ ａｎｄ Ｙ．Ｆｕｊｉｔａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｌ
ａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ；ｐ．２０７−２１８、Ｐ．Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｅ
ｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ（１９８５））（７５
０リットル規模）、およびｃ）抗腫瘍作用を有する（Ｍ．Ｊａｚｉｒｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｔａｘｕｓ ｓｐ．ｃｅｌｌ，ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ａｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｔ
ａｘｏｉｄｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｓｕｒｖｅ
ｙ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．，４６，ｐｐ．５９
−７５（１９９６））、タキソールの名称の方がよく知られているパクリタキセ
ル（７５０００リットル規模）である。

【０００３】 植物細胞培養を利用する、さらなる重要なバイオテクノロジー方法は、ジギト
キシンの、ジゴキシン（心臓および血液循環の薬である）への生体内変換である
。この立体特異的ヒドロキシル化反応は、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａの
バイオリアクター培養で、高収率で首尾よく実行される（Ｅ．Ｒｅｉｎｈａｒｄ
ａｎｄ Ｗ．Ｋｒｅｉｓ，Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ ｐｆｌａｎｚ
ｌｉｃｈｅｎ Ｚｅｌｌｅｎ ｉｍ Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒ，Ｐｌａｎｔ ｃｅ
ｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｉｏ．Ｅｎｇｉｎ．，５，ｐｐ．１３５−１３６（１
９８９））。バイオテクノロジーにおける植物細胞培養の使用に関する、最新の
広範囲におよぶ総説は、Ｈ．−Ｐ．Ｍｕｈｌｂａｃｈ，Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｌａｎ
ｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，４，ｐｐ．１１３−１７６（１９９８）に
見られる。

【０００４】 ８０年代初頭に高等植物の形質転換方法が開発され、当該代謝経路の特異的主
要酵素に関する遺伝子を形質転換することにより、特異的二次構成成分に関する
植物の生産性をかなり高めることが可能になった。トランスジェニック無傷植物
のみならず植物細胞培養も利用した。言及できる例は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍトランスジェニック毛根培養における細菌性リシンデカルボキシラ
ーゼの過剰発現であり、これによって生体アミンカダベリンおよびアナバシンの
収率が１４までのファクターで上昇した（Ｊ．Ｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｅｃｏｎｄａ
ｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃ
ｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ
．４，ｐｐ．５７−８１，Ｄ．Ｄ．Ｙ．Ｒｙｕ ａｎｄ Ｓ．Ｆｕｒａｓａｋｉ
（Ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９４））。

【０００５】 しかし、植物へのＤＮＡ移入の可能性は、植物構成成分の量的変化および質的
変化を拡大するだけではなく、さらに、植物および植物細胞培養は、異種タンパ
ク質の産生にとってさらに興味深くなり（Ａ．Ｓ．Ｍｏｆｆａｔ，Ｈｉｇｈ−Ｔ
ｅｃｈ ｐｌａｎｔｓ ｐｒｏｍｉｓｅ ａ ｂｕｍｐｅｒ ｃｒｏｐ ｏｆ
ｎｅｗ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，ｐｐ．７７０−７７１（
１９９２））、原則として２種の異なるアプローチが選択される。

【０００６】 １つのアプローチは、トランスジェニック無傷植物における異種タンパク質の
産生を含む。トランスジェニックタバコ植物における抗体の産生（Ｊ．Ｋ．−Ｃ
．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏ
ｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６８，ｐｐ．７１６−７１９（１９９５））に加えて、トランスジ
ェニックタバコ植物とトランスジェニックジャガイモ植物の両者における、ヒト
血清アルブミンの発現および正確なプロセッシングが記載されている（Ｐ．Ｃ．
Ｓｉｊｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔ
ｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ．，８，ｐｐ．２１
７−２２１（１９９０））。ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）も、トランスジ
ェニックタバコ植物で発現させた（Ａ．−Ｈ．Ｓａｌｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅ
ｎｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１８，ｐｐ．１０９５−１０９８（１９９６））。しかし
、その他の植物も使用した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａおよび
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓを使用して、ロイエンセファリン（Ｌｅｕ−ｅｎ
ｃｅｐｈａｌｉｎ）を首尾よく産生させた（Ｅ．Ｋｒｅｂｂｅｒｓ ａｎｄ Ｊ
．Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｅｅｄｓ，Ｔｉｂｔｅｃｈ．，８，ｐｐ．１−３．
（１９９０））。さらに、トランスジェニックＶｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａ
ｔａ植物を、ワクチンの役割を果たすキメラウイルス粒子の発現に使用した（Ｋ
．Ｄａｌｓｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｃｃ
ｉｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔａｒｇｅｔ ａｎｉｍａｌｓ ａｇａｉｎｓｔ
ａ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５，ｐｐ．２
４８−２５２（１９９７））。

【０００７】 例として上述したような無傷植物を使用したときの主な不都合は、それらを栽
培すること（それには多大な時間を要し且つ高価である）および工業規模製造に
必要な大きい栽培区域の必要性である。さらに、無傷植物から所望の標的物質を
単離するためには、特に、医薬向けまたは栄養向けに使用される物質の場合のよ
うに、製品の一貫性および品質が高い要件を満たさなければばらないとき、通例
、複雑な工程段階が必要である。

【０００８】 第２のアプローチでは、トランスジェニックタバコ細胞培養を抗体産生に利用
する。たとえば、抗体の発現およびそれらの培地中への分泌に関する記載がある
（Ｎ．Ｓ．Ｍａｇｎｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｏｖｅ
ｒｙ ｏｆ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆ
ｒｏｍ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌ
ｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐ
ｕｒ．，７，ｐｐ．２２０−２２８（１９９６））。異種タンパク質を細胞から
精製するのは複雑なため、培地に標的タンパク質が分泌されることは、顕著な改
良である。さらに、トランスジェニック植物細胞は、バイオリアクター内で排他
的に成長させることができ、また放出させる必要がないため、薬学的に適切な組
換えタンパク質を細胞培養で産生することは、安全性の観点からも興味深い。大
規模で従属栄養植物細胞培養するためのバイオリアクターを開発することによっ
て、必要な大量培養が可能になった（たとえばＭ．Ｌ．Ｓｈｕｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｓ ａｎ ｅｎａｂ
ｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔａｐ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：
Ｔｈｅ ｃａｓｅ ｏｆ ｔａｘｏｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，７４５，ｐｐ．４５５−４６１（１９９４））。

【０００９】 植物懸濁培養を使用する、この第２のアプローチの主な不都合は、成長速度が
低いこと、二次代謝産物の形成が比較的遅いこと、高細胞密度にて生成物形成が
阻害されるため、結果として、体積当たりの生産性が低いこと、凝集体および細
胞壁構成要素の形成、および剪断力に対する細胞の高い感受性である。従属栄養
細胞培養を使用するとき、様々な構成要素（そのうちの幾つかは高価である）を
含む複雑な培地を常に提供しなければならないことも、考慮に入れなければなら
ない。しかし、言及すべき最も重大な不都合は、異種タンパク質の産生を量的お
よび質的に変化させる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養における植物の体細胞繁殖系
の変化の発生である（たとえば、Ｍ．Ｇ．Ｋ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｋ．Ｌｉｎ
ｄｓｅｙ，Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ
ａｎｄ Ｅ．Ｗ．Ｇｉｎｇｏｌｄ（Ｅｄｓ．），２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｙａｌ
Ｓｏｃ．ｏｆ Ｃｈｅｍ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｏｕｓｅ，Ｌｏｎｄｏｎ
（１９８８）を参照）。特に、医薬品、および信頼できる品質保証および標準化
産生方法を必要とする公認の他の所望の物質の産生に関して、形成された生成物
およびそれらの機能特性の異質性は、受け入れられない。

【００１０】 従って、本発明の目的は、上述の、無傷植物を使用する不都合をのみならず、
細胞培養システムを使用する不都合も本質的に排除する、植物材料における異種
タンパク質性物質の標準化産生方法を提供することである。

【００１１】 この目的は、十分に分化した蘚類植物を標準条件で成長させ、生じる組織また
は細胞を本質的に破壊せずに、産生されたタンパク質性物質が培地から得られる
、植物材料で異種タンパク質性物質を産生するための新規な方法を提供すること
により、本発明に従って達成される。

【００１２】 本明細書で使用される用語「タンパク質性物質」は、特に、診断用、臨床用、
医薬向けおよび栄養向けに適した、ペプチド類、ポリペプチド類およびタンパク
質ならびにこれらの断片を含む。ペプチド結合を有し、且つ植物材料によって翻
訳される分子も含まれる。

【００１３】 本発明の好ましい実施形態では、所望の異種タンパク質性物質が、その生物学
的に活性な形で培地中に放出される。

【００１４】 本明細書で使用される用語「生物学的に活性な」は、この特性を備えた標的物
質が、それぞれの目的に望まれた、または必要な機能特性を有することを意味す
る。たとえば、抗体を産生することが望まれる場合、産生されたタンパク質、ま
たはその機能的断片は、抗原との予期される特異的結合を確立することができる
とき、生物学的に活性である。このような目的に、完全なタンパク質が常に必要
なわけではないが、エピトープまたは所望の生物活性または機能性を保証する低
分子量構造を検索することが可能なことは、熟練者には明白である。たとえば、
酵素は、その標的基質を転換することができるとき、生物学的に活性である。

【００１５】 本発明のさらなる好ましい実施形態では、糖類、ビタミン類および植物ホルモ
ン類またはこれらの機能的断片を本質的に含まない培地中で、無傷蘚類植物の形
の植物材料を成長させる。

【００１６】 本発明による方法を使用すると、標準化することができる光独立栄養的条件で
、すなわち、従来技術の従属栄養懸濁細胞培養システムでは必要な糖類、ビタミ
ン類および植物ホルモン類等々を添加する必要なしに、無傷で十分に分化した植
物を成長させることが可能である。安価で簡単な培地を使用するため、所望の標
的物質を獲得し、精製する工程は、かなり促進される。

【００１７】 本発明による方法で使用される植物材料は、ゼニゴケ類を含む蘚類と、Ｐｈｙ
ｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ属、Ｆｕｎａｒｉａ属、Ｓｐｈａｇｎｕｍ属およびＣｅ
ｒａｔｏｄｏｎ属からの種の群から選択される無傷蘚類植物であることが好まし
く、ＭａｒｃｈａｎｔｉａおよびＳｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓも特に好ましく使
用される。本発明による方法は、蘚類Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅ
ｎｓを使用して、最も好ましく実行される。

【００１８】 さらなる好ましい実施形態では、形質転換に使用される核酸構築物は、所望の
タンパク質性物質のみならず、タンパク質性物質を宿主細胞から培地に分泌する
ための輸送ペプチドもコードする。熟練者に知られている自己核酸配列および異
種核酸配列のいずれかを、本発明に従って使用することが可能であり、また、産
生株組織を形質転換するための発現カセットの作製に使用することができる。小
胞体または細胞輸送にシグナルペプチドを使用することは特に好ましい。

【００１９】 本発明のために行われた研究で、細胞培養で遭遇する、上述の体細胞繁殖系の
変化の問題は、蘚類の光独立栄養的液体培養には存在しないことが証明された。
さらに、本発明に従って使用される蘚類は、植物ホルモン類を加えることによっ
て影響を及ぼすことができる（インドール−３−酢酸は、ｃａｕｌｏｎｅｍａ成
長を誘導し、イソペンチルアデニンンは、芽の成長を誘導する）、精密に確定さ
れた明瞭な一連の分化ステップ（ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ、ｃａｕｌｏｎｅｍａ、
芽、ｇａｍｅｔｏｐｈｏｒｅｓ）という、他のシステムより優れた利点を有する
（たとえば、Ｎ．Ｗ．Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ
，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ，ｕｓｉｎｇ ａｕｘｉｎ ａ
ｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ
ａ，１４４，ｐｐ．４２７−４３５（１９７９）参照）。従って、バイオリアク
ター培養における異種タンパク質の指定された分化特異的発現が可能になり、同
調して分裂している、純粋な、従って均質なｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ培養は、バイ
オリアクターで制御可能に一定のタンパク質を産生するため、また、ホルモン依
存的プロモーターもしくは分化特異的プロモーターの使用に適しているため、本
発明に従えば特に好適である。

【００２０】 このような発現システムのほかにも、本発明に従って、誘導可能なプロモータ
ーを使用してもよく、特に、短い半減期を有するか、または細胞障害性であるタ
ンパク質の産生には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ１
′−プロモーターが特に好ましく使用される。

【００２１】 経済的な観点の下で異種タンパク質を産生するために、本発明に従って推奨さ
れる蘚類の培養は、たとえば、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａを使用し、２０ｍ
ｌから、６リットルを超えて１０リットルまでの範囲の量で、振盪培養または通
気したガラス容器内で、行うことができる（たとえば、Ｒ．Ｒｅｓｋｉ，Ｚｅｌ
ｌ−ｕｎｄ ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈ
ｕｎｇｅｎ ｄｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎｄｕｚｉｅｒｂａｒｅｎ Ｇｅ
ｗｅｂｅｄｉｆｆｅｒｅｎｚｉｅｒｕｎｇ ｕｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｅｎｔｅｉｌｕｎｇ ｂｅｉ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（
Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．［Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓにお
けるサイトカイニン誘導性組織分化および葉緑体分裂に関する細胞−および分子
生物学的研究（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．］，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈａｍｂｕｒｇ（１９９０）を参照）。これは、分化し
た光独立栄養植物の培養であるため、植物ホルモン類、ビタミン類または糖類を
培地に補足する必要がない。たとえば、動物細胞培養に必要な複合培地と比較し
て、１００のファクターで低価格である。ＰＶＰの存在下では、培地中の生物学
的に活性な異種タンパク質の収量を３５のファクターで増加できることが、本発
明に基づいて明らかにされており、これが、本発明による方法でＰＶＰを培地に
使用することが好ましい理由である。

【００２２】 本発明に基づく、適当なさらなる蘚類、たとえば、Ｌｅｐｔｏｂｒｙｕｍ ｐ
ｙｒｉｆｏｒｍｅおよびＳｐｈａｇｎｕｍ ｍａｇｅｌｌａｎｉｃｕｍ等のバイ
オリアクター内での培養に関する詳細な情報は、従来技術に記載されている（た
とえば、Ｅ．Ｗｉｌｂｅｒｔ，Ｅ．Ｗｉｌｂｅｒｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｓｃｈｅ Ｓｔｕｄｉｅｎ ｚｕｒ Ｍａｓｓｅｎｋｕｌｔｕｒ ｖｏｎ Ｍ
ｏｏｓｅｎ ｕｎｔｅｒ ｂｅｓｏｎｄｅｒｅｒ Ｂｅｒｕｃｋｓｉｃｈｔｉｇ
ｕｎｇ ｄｅｓ Ａｒａｃｈｉｄｏｎｓａｕｒｅｓｔｏｆｆｗｅｃｈｓｅｌｓ［
アラキドン酸代謝を特に考慮した蘚類の大量培養に関するバイオテクノロジー的
研究］，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ（
１９９１）；Ｈ．ＲｕｄｏｌｐｈおよびＳ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｓｔｕｄｉｅ
ｓ ｏｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｓｐｈａｇｎｕ
ｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，Ｃｒｙｐｔ．Ｂｏ
ｔ．，３，ｐｐ．６７−７３（１９９２）を参照）。本発明の目的に特に好まし
いのは、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａの使用であるが、特に通常の分子生物学
的技法の全てが、この微生物用に確立されているためである（総説については、
Ｒｅｓｋｉ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｓｓｅｓ，Ｂｏｔ．Ａｃｔａ，１１１，
ｐｐ．１−１５（１９９８）を参照）。

【００２３】 異種タンパク質を産生するために、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａのバイオテ
クノロジー的利用に適した形質転換システムが開発された。たとえば、粒子ガン
を使用した原糸体組織への直接ＤＮＡ移入によって、形質転換が成功裡に実行さ
れた。蘚類プロトプラストへのＰＥＧ仲介ＤＮＡ移入も上首尾であった。Ｐｈｙ
ｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａに関しては、この形質転換方法が繰り返し記載されてお
り、一過性の形質転換体および安定した形質転換体につながる（たとえば、Ｒｅ
ｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｒｅｓｋｉ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅ
ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｃｕｌ
ｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｏｓｓ ｐ
ｌａｎｔｓ，Ｐｌ．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，@ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２
，ｐｐ．１４２−１４７（１９９６）を参照）。

【００２４】 本発明は、主としてタンパク質性物質の産生に適するが、医薬的に適切なタン
パク質の産生を、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に関連して後述する。

【００２５】 ＶＥＧＦは、Ｎ．ＦｅｒｒａｒａおよびＷ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌによって初めて
単離され（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒ
ｅｔｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．，１６１，ｐｐ．８５１−８５８（１９８９））、正常な生理学的条件下で制
御された血管形成および内皮細胞分裂に対する調節因子として特性決定された（
Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７，ｐｐ．２１１−２１８
（１９９１））。著者は、この成長因子が、血管内皮細胞に対して極めて特異的
に作用し、また他の細胞型には不活性であることも証明した。ＶＥＧＦは、ジス
ルフィド架橋によって連結されたホモ二量体糖タンパク質である。４つの異なる
形のヒトＶＥＧＦが知られている。この４つのアイソフォームは、１２１、１６
５、１８９および２０６アミノ酸の長さであり、ＶＥＧＦ ＲＮＡの代替スプラ
イシングによって形成される。ＶＥＧＦ_２０６は、胎児肝ｃＤＮＡで証明されて
いるにすぎないが、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５およびＶＥＧＦ_１８９の転
写物は、多数の腫瘍細胞および腫瘍組織で証明されている。全てのＶＥＧＦアイ
ソフォームが分泌に関するリーダー配列を有するが、２つの最小の形だけが効率
よく分泌される（たとえば、Ｇ．Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｍ
ａｒｍｅ，ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ：Ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，ｐｐ．６７５−６８０（１９９
５）を参照）。

【００２６】 腫瘍療法の開発および既存のアプローチの改良にも、ＶＥＧＦの特性決定にも
、適量のＶＥＧＦが依然として必要である。本発明と関連して行われた研究の初
期段階の間、記載された全てが、バキュロウイルス発現システムを用いた、昆虫
細胞でのＶＥＧＦの組換え産生であった（たとえばＢ．Ｌ．Ｆｉｅｂｉｃｈ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔ
ｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ｉ
ｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１１，ｐｐ．１９
−２６（１９９３））。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（
Ｓ．Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｅｓｔ ｉｓｏｆｏｒｍ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ
（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ_１２１）ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｏｔｈ ａｎｇｉｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２４３，ｐｐ．１９５−２０２（１９９５
））、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｄ．Ｍｏｈａｎｒａｊ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ
ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，１２，ｐｐ．
１７−２７（１９９５））およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｇ．Ｓｉ
ｅｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ＶＥＧＦ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
，２２２，ｐｐ．２４９−２５５（１９９６））が、さらなる産生微生物として
続く。これらの組換えシステム全てで、生物学的に活性なＶＥＧＦが産生された
。しかし、後者は、封入体内にパッケージされているため、Ｅ．ｃｏｌｉ発現シ
ステムは、タンパク質の精製および再構成に関して複雑である。

【００２７】 実施例 概要 制御可能なＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ大量培養の確立（Ｒ
ｅｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｅｓｋｉ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）および蘚類Ｐｈｙｓｃ
ｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓにＤＮＡを移入する方法（Ｋ．Ｒｅｕｔｔｅ
ｒ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｅｔｅｒｌｏｇｅｒ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐｈｙｓ
ｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．［Ｐｈｙｓｃ
ｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇ．における異種遺
伝子の発現］、Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈａｍ
ｂｕｒｇ（１９９４））は、この植物のバイオテクノロジー的利用の基本的前提
条件を生み出した。

【００２８】 最初に行われた研究で、Ｒｅｕｔｔｅｒ（ｌｏｃ．ｃｉｔ．，１９９４）起源
のトランスジェニックＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ系を使用した組み込みの長
期安定性が証明された。この目的の例として使用した、異種ｎｐｔ ＩＩ遺伝子
およびｇｕｓ遺伝子の発現は、４年後でも検出できた。

【００２９】 Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａバイオリアクター培養を最適化した。３００〜
５００ｒｐｍの連続速度で、原糸体の粉砕をもたらし、従って、必要な、培養の
均一性を確保する、スターラーを開発した。このようにして、標準化されたサン
プリングを可能にした。同時に、流入空気をより一様に液体培養中に分布させた
。これらの条件では、外的ｐＨ調節をしなくても、ｐＨ調節をした場合と同様に
バイオマスおよびタンパク質成長が進行することが証明され、従って、意外にも
、後者は必要ではない。リットル当たり乾燥重量５００ｍｇ、または総タンパク
質２２ｍｇの週間バイオマス産生が、半回分条件で得られた。これは、バイオマ
ス産生が、従来の５リットルガラスフラスコ培養より５のファクターで増大した
ことを意味する。Ｋｎｏｐ培地の塩濃度を１０分の１に低下させることは類似し
たデータにつながり、従って、経費削減につながる。

【００３０】 酒石酸アンモニウム５ｍＭを加えると、ラグ相が減少することにより、バイオ
マス成長が加速した。同時に、酒石酸アンモニウムを加えることによって、実質
的に排他的にｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ細胞を含む培養が得られた。これらの培養の
細胞の実質的に１００％が、細胞周期のＧ２／Ｍ相であることが、フローサイト
メトリーを用いて証明された。この結果は、オーキシンを用いたさらなる生理学
的研究および分化特異的突然変異体ｃａｌ１１２およびｃａｌ１１３を用いた研
究で確認され、ｃａｕｌｏｎｅｍａ細胞は、ほとんど常にＧ１／Ｇ０相であるが
、ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ細胞は主としてＧ２／Ｍ相であると結論が下された。

【００３１】 アグロバクテリウムの１′−プロモーターを使用することにより、蘚類におけ
る可能な誘導性についてプロモーターを試験した。β−グルクロニダーゼ（ｇｕ
ｓ）遺伝子をマーカー遺伝子として使用した。５μＭインドール−３−酢酸で誘
導した後、一時的に形質転換した蘚類プロトプラスト（形質転換率＝３×１０^{− ４} ）で、遺伝子の発現が確認された。対照のいずれでも、発現は確認されなかっ
た。

【００３２】 ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ_１２１）の１２１アミノ酸スプライス型の遺
伝子を、０．５×１０^−５および３．３×１０^−６の形質転換率で、Ｐｈｙｓｃ
ｏｍｉｔｒｅｌｌａに移入した。この目的のために、構成的３５Ｓプロモーター
の後、および植物に適した形質転換ベクターｐＲＴ９９に遺伝子をクローニング
した。第２のアプローチでは、対応するヒトＥＲ輸送ペプチドをコードする配列
をさらにクローニングした。得られた安定した形質転換体をサザン分析に供する
ことにより、異種ＤＮＡの組み込み、および記載の組み込みのタイプを確認した
。ノーザン分析で、これらの形質転換体に、ｎｐｔＩＩおよび２つのＶＥＧＦ転
写物が存在することが確認された。蘚類細胞におけるＶＥＧＦ_１２１発現が、間
接的免疫蛍光法で証明された。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、細胞中のタ
ンパク質を明白に定位した。これらの研究で、輸送ペプチドを含まない形質転換
体の場合、タンパク質は、特に、細胞質中に局在化していることが明らかにされ
た。さらにＥＲ輸送ペプチドを含む形質転換体では、タンパク質が、核領域およ
び先端の細胞の先端領域に、非常に高いＥＲ含量で、認められる。培地から得ら
れたＶＥＧＦタンパク質を用いてＥＬＩＳＡアッセイおよび２つの機能性アッセ
イを実施することによって、本発明に従って産生された異種タンパク質の生物活
性を検証した。

【００３３】 材料および方法 テキストに特に指定がなければ、使用した化学薬品は分析級の品質であり、Ｆ
ｌｕｋａ（Ｎｅｕ−Ｕｌｍ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、Ｒｏｔｈ（
Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、Ｓｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＳｉｇｍａ
（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）から入手した。

【００３４】 溶液を、以後Ｈ_２Ｏと呼ぶ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）からの、精製した無発熱物質水で溶液を作った。

【００３５】 制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素および分子生物学キットは、ＡＧＳ
（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）、Ｂｉｏｍ
ｅｔｒａ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｇｅｎｏｍｅｄ（Ｂａｄ Ｏｅｙｎｈａｕｓ
ｅｎ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ／Ｔ
ａｕｎｕｓ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ
）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）
およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から入手した。特に指定
がなければ、これらは、製造会社の説明書に従って使用した。

【００３６】 ベクターおよび構築物 プラスミドｐＣＹＴＥＸＰ−ＶＥＧＦ_１２１は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させるた
めに、ヒトＶＥＧＦ_１２１のｃＤＮＡが組込まれている、ｐＣＹＴＥＸＰ１の誘
導体である（Ｔ．Ｎ．Ｂｅｌｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｆｕｌｌｙ ｍｏｄｕｌ
ａｒ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ，Ｐｌａｓｍｉｄ，２６，ｐｐ．１４７−１５０（１９９１））。制限
エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＮｄｅ Ｉを使用して、ＶＥＧＦ_１２１ｃ
ＤＮＡをｐＣＹＴＥＸＰ−ＶＥＧＦ_１２１から切除し、精製し、平滑末端化し、
ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターとポリアデニル化配列との間の、ｐＲＴ１０１の
Ｓｍａ Ｉ切断部位にクローニングした（Ｒ．Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ
ｓｅｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆ
ｕｓｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，ｐ．５８９０（
１９８７））。Ｈｉｎ ｄＩＩＩを使用して、このようにして得られたカセット
を再度切除し、形質転換ベクターｐＲＴ９９のＨｉｎ ｄＩＩＩ制限切断部位に
クローニングした。ｐＲＴ９９は、多重クローニング部位のみならず、ＣａＭＶ
の３５Ｓプロモーターおよび対応するポリアデニル化の制御下にあるネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む（Ｒ．Ｔｏｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｌｏｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉ
ｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１６，ｐ．８７２５（１９８８））。しっかりと形質転換された
植物では、この遺伝子は、抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性を与える。Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αで、プラスミドを複製した（Ｊ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））。

【００３７】 制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＢｇｌ ＩＩを使用して、初めは、昆虫細胞でＶ
ＥＧＦ_１２１を発現させるために構築され、且つＶＥＧＦ_１２１配列のほかにも
、動物細胞システムで、小胞体を介して培地への分泌を仲介する天然の輸送ペプ
チドをコードするＤＮＡを含むベクターｐＶＥ−１２１からｃＤＮＡを切除し（
Ｆｉｅｂｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌ
ｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕ
ｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｄｉ
ｍｅｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２１１，ｐｐ．１９−２６（１９９３））、ｐＲＴ１０１を使用してｐＲＴ９９
にクローニングし、検証する。

【００３８】 プラスミドｐＮＡ２０１は、二元ベクターｐＢＩ１０１の誘導体である（Ａ．
Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓａｙｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：Ｔｈｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｒｅｐ．，５，ｐｐ．３８７−４０５（
１９８７））。プラスミドｐＮＡ２０１は、植物に関する選択マーカーとして、
ノパリンシンターゼプロモーターの制御化下にあるｎｐｔＩＩ遺伝子を含む。や
はり存在するｇｕｓ遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ由来の１′−プロモーターにより制御される。ｐＮＡ２０１は、Ｐｈｙｓ
ｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓの直接形質転換に適する。

【００３９】 抗体 ＶＥＧＦタンパク質に対する２種の異なる抗体を使用する。第１の抗体は、ウ
サギ抗ＶＥＧＦ抗体であり、未変性のヒトＶＥＧＦのアミノ酸１〜２０に対応す
る合成ペプチドに対する（Ｆｉｅｂｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．（
１９９３））。第２の抗体は、ヒトＶＥＧＦ_１２１タンパク質に対するモノクロ
ーナルマウス抗体である（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）。

【００４０】 植物材料 Ｈａｍｂｕｒｇ大学Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｏｔａｎｙ学部Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇ
ｒｏｕｐのコレクションに起源がある、蘚類Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐ
ａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂ．Ｓ．Ｇの野生型菌株を使用する。この起源は、Ｇ
ｒａｎｓｄｅｎ Ｗｏｏｄ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎｓｈｉｒｅ（Ｅｎｇｌａｎｄ
）のＨ．Ｌ．Ｋ．Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅにより収集され、胞子から継代培養され
た、菌株１６／１４である。

【００４１】 Ｋｎｏｐ培地を含む液体培養中（Ｒ．Ｒｅｓｋｉ ａｎｄ Ｗ．Ｏ．Ａｂｅｌ
，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｄｄｉｎｇ ｏｎ ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａｔ
ａ ａｎｄ ｃａｕｌｏｎｅｍａｔａ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｓ，Ｐｈｙｓｃｏ
ｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ，ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅ
ｎｉｎｅ，Ｐｌａｎｔａ，１６５，ｐｐ．３５４−３５８（１９８５））または
１%オキソイド寒天を含む固体Ｋｎｏｐ培地上（Ｕｎｉｐａｔｈ，Ｂａｓｉｎｇ
ｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のいずれかで、野生型菌株を成長させる。Ｒｅｓ
ｋｉによる記載（ｌｏｃ．ｃｉｔ．，１９９０）通りに、液体培養を実施した。

【００４２】 バイオリアクター培養 大量培養のために、二重のジャケットを備えた７リットル丸底ガラスフラスコ
バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｋ，Ｋｎｕｌｌｗａｌｄ）に
植物材料を導入する。このバイオリアクターシステムで、排気冷却機、通気管、
ｐＨ電極（Ｃｏｎｄｕｃｔａ，Ｇｅｒｌｉｎｇｅｎ）、温度センサー、攪拌装置
、サンプリング管、および酸、塩基および培地用の注入口を、上から蓋の穴を通
って培養に導入する。２５℃で培養を実施し、二重ジャケットに連結された適当
に調節した水浴で制御する。ｐＨ制御しながら実施する実験では、滴定ユニット
を用いてｐＨを５．８にて一定に保つ。Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＡＤＩ
１０３０（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｋ，Ｋｎｕｅｌｌｗａｌｄ）を用いて
、温度測定およびｐＨ制御を行う。モーターコントローラーＡＤＩ １０１２（
Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｋ，Ｋｎｕｅｌｌｗａｌｄ）で、スターラーの速
度を変えることができる。多孔性注入要素を介して、１ｂａｒの空気を絶えず培
地に通気する。培養容器内の無菌性を確保するために、注入口ラインおよび排出
ラインの全てにフィルター滅菌ユニット（Ｍｉｄｉｓａｒｔ，０．２μｍ；Ｓａ
ｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）を備えつける。制御された環境キャビ
ネット内で、側方照明（白色光；Ｏｓｒａｍ Ｌ ４０ Ｗ／２０；最大１００
μｍｏｌ^−１ｍ^−２）しながら、バイオリアクター培養を実施する。無菌条件
下で、バイオリアクター培養リットル当たり０．５〜１ｇ湿重量の植物材料を培
養に接種する。サンプリング管はスターラーと同じレベルにあり、従って、攪拌
しながら一様なサンプリングが確保できる。少量のサンプル（＜１００ｍｌ）は
、滅菌注射器を使用し、Ｌｕｅｒロックコネクションを介して採取し、大量のサ
ンプルは、たとえば、ヘッド５０１ ＲＩを備えた蠕動ポンプ３０２／３Ａ型（
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）を使用して、採取する。

【００４３】 野生型のＣｈｌｏｒｏｎｅｍａ培養は、Ｋｎｏｐ培地に５ｍＭ酒石酸アンモニ
ウムを加えることによって作成される。

【００４４】 安定剤ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が培地中に存在するとき、分泌される
生物学的に活性な異種タンパク質の収量を著しく増加させることができる。

【００４５】 生理学的量のオーキシンを外因的に添加することによって、原糸体成長中に起
こるｃａｕｌｏｎｅｍａの分化を誘導し且つ亢進させることができ、適当な濃度
は、たとえば、５μｍｏｌ／リットルのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）である
。

【００４６】 形質転換体の液体培養を選択圧で実施する場合、５０ｍｇ／ｌの抗生物質Ｇ４
１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ）をＫｎｏｐ培地に加える。
この目的を達成するために、１０日毎に、粉砕の直前に無菌の１００μｍ篩（Ｗ
ｉｌｓｏｎ Ｓｉｅｖｅｓ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で濾過す
ることによって培養を取り出し、選択培地で満たしたエルレンマイヤーラスコに
移す。

【００４７】 栄養元素実験の場合、Ｋｎｏｐ培地をＨ_２Ｏで１：１０希釈する。

【００４８】 形質転換 選択した形質転換方法は、Ｒｅｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｅｓｋｉ（ｌｏｃ．ｃ
ｉｔ．，１９９６）によって記載されたプロトプラストへのＰＥＧ仲介直接ＤＮ
Ａ移入である。各形質転換で、プラスミドＤＮＡ ５０μｇを３×１０^５プロト
プラストに使用する。特に指定がなければ、Ｒｅｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｅｓｋ
ｉ（ｌｏｃ．ｃｉｔ．，１９９６）による記載通りに、原形質体再生および好適
形質転換体の選択を実施する。

【００４９】 間接免疫蛍光法 緩衝液： ＭＳＢ： １００ｍＭ ＰＩＰＥＳ；５〜１０ｍＭ ＥＧＴＡ、 ５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ｐＨ６．８ Ｆ−ＭＳＢ：ＭＳＢ+５%ＤＭＳＯ Ｅ−ＭＳＢ：ＭＳＢ+５%ＤＭＳＯ+５%Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｗ−ＭＳＢ：Ｈ_２Ｏで１：２希釈したＭＳＢ（洗浄用緩衝液） 酵素液：１％セルラーゼ、１％ペクチナーゼ、ＭＳＢ中２％Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ
、 ｐＨ５．６（全てＳｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎから）

【００５０】 蘚類原糸体を、１０分以下インキュベートし、Ｗ−ＭＳＢで簡単に洗浄するこ
とによって、１．２５％グルタルアルデヒドを含むＦ−ＭＳＢ（ｖ／ｖ）で固定
する。次いで、原糸体を、２％パラホルムアルデヒドを含むＭＳＢ（ｖ／ｖ）と
共に４０分間インキュベートし、Ｗ−ＭＳＢで３回洗浄する（すすぎ１回；洗浄
２回５分間）。

【００５１】 ＭＳＢおよびスパーテルの先端一杯の固体水素化ホウ素を加え、１０分間イン
キュベートすることによって、洗浄で排除できない遊離アルデヒドを還元する。
Ｗ−ＭＳＢで３回洗浄することによって、水素化ホウ素を除去する。

【００５２】 次のステップで、酵素溶液を１０分間加えることによって、細胞壁を透過性に
する。ｐＨを変えることによって（ＭＳＢ、ｐＨ６．８）、酵素反応を停止させ
る。再度、混合物をＷ−ＭＳＢで３回洗浄する。

【００５３】 デタージェント溶液と共に１２０分以上インキュベートすることによって、葉
緑素を抽出する。次いで、Ｗ−ＭＳＢで３回洗浄することにより、溶液を除去す
る。

【００５４】 この調製後、蘚類原糸体を一次抗体（抗ＶＥＧＦ；希釈１／５０）とインキュ
ベートしてもよい。これを、３７℃で４５分間行う。Ｗ−ＭＳＢで３回洗浄した
後、標識二次 抗体（抗ウサギまたは抗マウス；希釈１／３０；フルオレセイン
イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉ
ｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で標識）を、３７℃にて４５分間添加する。
上記３回の洗浄ステップに加えて、この混合物をＷ−ＭＳＢ+０．１％トリトン
（Ｔｒｉｔｏｎ）で１回洗浄する。続いて、原糸体をＷ−ＭＳＢ中に回収し、４
℃にて少なくとも一晩保存する。

【００５５】 共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）ＴＣＳ ４Ｄ型（Ｌｅｉｃａ Ｌａｓ
ｅｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびソフトウェアＳｃａｎｗａ
ｒｅ ５．０（Ｌｅｉｃａ Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
）を用いて、この材料を評価する。

【００５６】 サンプルをＣＬＳＭで分析するために、サンプルをスライド上の検鏡溶液（Ｄ
ａｂｃｏ，Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）に入れる。アルゴン−クリプ
トンレーザーを４８８ｎｍの波長で用いて、二次抗体にカップリングした蛍光色
素ＦＩＴＣの励起を行う。ＦＩＴＣは、５２８ｎｍの波長を放射する。

【００５７】 ＥＬＩＳＡアッセイ 適切に形質転換された蘚類植物内で形成される、培地中のＶＥＧＦタンパを、
ＥＬＩＳＡアッセイおよび上記抗体を使用した従来の方法で、定性的および定量
的に決定する。２００μｌの量の培地をＥＬＩＳＡアッセイで直接使用する。

【００５８】 機能性アッセイ 培地から得られる、組換え形成されたＶＥＧＦの生物活性を、分裂促進アッセ
イ（Ｍｉｙａｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，ｐｐ．４０９８−４１０３（１９８７））およびＤ
ａｙ１３ 絨毛尿膜血管形成アッセイ（Ｗｉｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍ
ｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｒ
ｎｅａｌ ａｓｓａｙ，Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．，１８３，ｐｐ．１１６７
−１１７４（１９９１））で確認する。培地を事前に限外濾過に供し、次いで、
凍結乾燥し、続いて緩衝液中に懸濁させる。必要に応じて、陽イオンカラムを使
用したさらなる精製ステップを実施してもよい。

【００５９】 １′−プロモーターの誘導 ５μｍｏｌ／ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を用いて、オーキシンによ
る１′−プロモーターの誘導可能性を分析する。形質転換の５日後、ｐＮＡ２０
１との形質転換反応の原形質体アリコート１００μｌを９６ウェル微量滴定プレ
ート（Ｎｕｎｃ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）のウェルに移す。原形質体懸濁液をＩＡ
Ａ（最終濃度＝５μＭ）と共に５時間インキュベートする。インキュベーション
後、誘導実験を定性的β−グルクロニダーゼアッセイで直接評価する。

【００６０】 定性的β−グルクロニダーゼアッセイ β−グルクロニダーゼ活性を定性的アッセイ（Ａ．Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，
Ａｓｓａｙｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：Ｔｈ
ｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｒ
ｅｐ．，５，ｐｐ．３８７−４０５（１９８７））で決定した。 基質緩衝液： ５０ｍＭ Ｋ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ５０ｍＭ Ｋ_４Ｆｅ（ＣＮ）_６、 １％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０ 、 ４ｍｇ／ｍｌ ＰＶＰ（ＭＷ １００００） 染色溶液： Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０μｌ／基質緩衝液５０ ｍｌに溶解した、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグ ルクロン酸（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ）１２．５ｍｇ

【００６１】 Ｋｎｏｐ培地または再生培地中の蘚類原糸体および蘚類プロトプラストを、同
体積の染色溶液中で３７℃にて７２時間までインキュベートし、その後直ちに顕
微鏡を使用して評価する。

【００６２】 結果 バイオリアクター培養の均一性；サンプリング 均質な培養のみが、細胞培養からのサンプリングが標準化されていることを保
証する。長期培養後、長い細胞フィラメント内への原糸体成長は、往々にして細
胞凝集体を招来し、従って、液体培養における植物材料の不均質な分布につなが
る。このような凝集を避けるために、高速スターラー／ホモジナイザーを使用し
て、原糸体を特定の間隔で（バイオリアクタの場合には、隔日〜１０日毎、振盪
培養の場合には、１２日毎に）粉砕する。バイオリアクター内で可能な連続した
条件を作り、同時に、長期培養期間にわたって、サンプリングを標準化するため
には、スターラーブレードのエッジを研磨し、その結果、剪断ブレードに変形さ
せることによって、スターラーブレード３個を有するタービンスターラーを改変
することが推奨される。３００〜５００ｒｐｍで連続的に「攪拌」することによ
り、均質なバイオリアクター培養の操作が可能である。

【００６３】 タービンスターラーを用いた対照培養で、５００ｒｐｍにて３５日間（８４０
時間）にわたるバイオマス成長（ＤＷ［ｍｇ／ｌ］）は、剪断ブレードスターラ
ーで攪拌したバイオリアクター培養の場合と同じである。

【００６４】 その都度、６つの並行サンプルを比較することにより、培養均一性を評価する
。サンプル体積１００ｍｌからの植物材料の乾燥重量を、比較パラメータとして
決定する。未改変タービンスターラーを使用するとき、バイオマス濃度が上昇す
るにつれて標準偏差が増加する。剪断ブレードスターラーで攪拌する結果として
、採取したサンプルの標準偏差は低いままである。このことから、改変したスタ
ーラーを用いることによって、３５日間にわたって一様に均質な培養を得ること
ができるという結論を下すことが可能である。

【００６５】 １′−プロモーターの誘導可能性の調査 プラスミドｐＮＡ２０１では、１′−プロモーターはｇｕｓ遺伝子の上流に位
置し、対照エレメントの役割をする。既知のβ−グルクロニダーゼアッセイは、
蘚類を用いた誘導実験用の検出アッセイとして適する。実験トランスジェニック
タバコを用いた実験では、１′−プロモーターは、オーキシン含量が高い組織に
おけるβ−グルクロニダーゼ発現に導くことが明らかにされ、従って、このプロ
モーターは、オーキシン依存的であると想定される。Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌ
ｌａ ｐａｔｅｎにおける、オーキシンによる１′−プロモーターの誘導可能性
を、一時的に形質転換されたプロトプラストで試験する。

【００６６】 形質転換反応を、５μＭインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）とインキュベートす
る（５時間）β−グルクロニダーゼアッセイおよびインキュベートしないβ−グ
ルクロニダーゼアッセイに供する。ＩＡＡを加えない対照の場合、顕微鏡下での
評価で、いかなる反応でも青色プロトプラストは現れない。対照的に、オーキシ
ンと共にインキュベートしたプロトプラストの評価で、ｇｕｓ遺伝子の発現が確
認される。青色プロトプラストに基づけば、３×１０^−４という形質転換率が達
成される。このことから、１′−プロモーターは、一時的に形質転換された蘚類
プロトプラストで、植物ホルモンオーキシンにより誘導可能なことが明らかに窺
い知れる。

【００６７】 ＶＥＧＦ形質転換用ベクターの作成 以後ＶＥＧＦＣと呼ぶリーダー配列を含まないＶＥＧＦ_１２１のｃＤＮＡ、お
よび以後ＶＥＧＦＰと呼ぶリーダー配列を含むＶＥＧＦ_１２１のｃＤＮＡを、Ｐ
ｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａに形質転換するためには、植物に適したするプロモ
ーター／ターミネーターユニットの配列をクローニングすることが必要である。
このために、３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターおよび対応するポリアデニル化シグ
ナルを選択する。適切に調製されたＶＥＧＦｃＤＮＡ配列を、ベクターｐＲＴ１
０１の多重クローニング部位のＳｍａ Ｉ制限切断部位にクローニングする。

【００６８】 このようにして得られるベクター（ｐＲＴ１０１ＶＥＧＦＣ ３およびＶＥＧ
ＦＰ ２１）３５Ｓプロモーターの末端領域由来のプライマーを用いて配列決定
し、プロモーターとポリアデニル化部位との間への正確な組み込みを検証する。

【００６９】 結果として得られるカセットを制限酵素Ｈｉｎ ｄＩＩＩで切除し、実際の形
質転換ベクターｐＲＴ９９のＨｉｎ ｄＩＩＩ切断部位にクローニングする（ｐ
ＲＴ９９ＶＥＧＦＣ３およびＶＥＧＦＰ２１）。Ｓｍａ ＩおよびＨｉｎｃＩＩ
で制限することにより、ＮＰＴＩＩカセットに対するカセットの方向を決定する
ことができる。プロモーターからポリアデニル化シグナルへの方向では、５２５
０ｂｐ（ＶＥＧＦＣ）および５３８０ｂｐ（ＶＥＧＦＰ）の断片が得られ、逆方
向は、１１００（ＶＥＧＦＣ）／１２３０（ＶＥＧＦＰ）および４１５０ｂｐ（
ＶＥＧＦＣおよびＰ）の断片を与える。制限分析では５２５０／５３８０ｂｐの
断片のみが明らかにされ、従って、ＶＥＧＦＣ／Ｐカセットは、ｐＲＴ９９のｎ
ｐｔＩＩ遺伝子を基準にして、プロモーターからポリアデニル化シグナル方向で
組込まれている。

【００７０】 ＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａへのＶＥＧＦＣ形質転換 Ｋｎｏｐ培地から選択培地へ繰り返し変わった後、野生型プロトプラストにお
けるＶＥＧＦＣ構築物の形質転換に関する絶対形質転換率は０．５×１０^−５で
あり、形質転換体は常に安定している。

【００７１】 形質転換プラスミドの組み込みの証明 植物ゲノムへの好首尾の組み込みがサザンハイブリダイゼーションで証明され
ている。使用されるプローブは、まず第１に、ｐＲＴ９９由来のｎｐｔ ＩＩ遺
伝子のＮｃｏＩ断片であり、第２にｐＣＹＴＥＸＰ−ＶＥＧＦ_１２１由来のＮｄ
ｅ Ｉ／Ｎｄｅ Ｉ ＶＥＧＦＣ断片である。

【００７２】 形質転換体の未切断全ＤＮＡで検出されるシグナルによって、プラスミドＤＮ
Ａが植物ゲノムに首尾よく組み込まれたことが確認される。組み込み後でも３５
Ｓ ＶＥＧＦＣ ＰｏｌｙＡカセットの全てが得られるかどうかを、Ｈｉｎ ｄ
ＩＩＩによる制限で試験する。組み込みの際に、カセットが無傷のままであれば
、この制限酵素は、１１００ｂｐの断片を全ＤＮＡから切除する。

【００７３】 ＶＥＧＦＣプローブを用いたハイブリダイゼーションパターンで、全ての形質
転換体について、１１００ｂｐの断片が明らかにされる。従って、蘚類における
ＶＥＧＦ_１２１の正しい転写および発現の前提条件である、完全なＶＥＧＦＣ発
現ユニットの組み込みが証明される。

【００７４】 異種遺伝子の転写の証明 ＶＥＧＦプローブおよびＮＰＴ ＩＩプローブを使用した非放射性ＤＩＧ検出
システムで、形質転換体の異種遺伝子ＶＥＧＦＣおよびＮＰＴＩＩの転写物が検
出される。ＶＥＧＦＣ転写物には７６０ヌクレオチドを使用し、またＮＰＴ Ｉ
Ｉ転写物には１１００ヌクレオチドを使用した場合、フルオログラムで検出され
る転写物のサイズは、それぞれの場合に予期される大きさの範囲内である。予想
通り、ＷＴ対照では、２種の異種転写物は、いずれも検出されない。

【００７５】 ヒト輸送ペプチドを含む形質転換体の分析 形質転換反応当たり５０μｇのｐＲＴ９９Ｐ２１プラスミドＤＮＡをＰＥＧ仲
介ＤＮＡ移入することにより、選択培地上に、永久的に安定な形質転換体を生成
する。３．３×１０^−６という安定な形質転換率が得られる。

【００７６】 形質転換プラスミドの組み込みの証明 輸送ペプチドを含む上記形質転換体の組み込みは、上記の通り、記載のプロー
ブを使用したサザンハイブリダイゼーションで証明され、ＶＥＧＦプローブを用
いたＨｉｎ ｄＩＩＩ切断した全ＤＮＡのハイブリダイゼーションで、１２３０
ｂｐの断片が明らかにされ、組み込まれた３５Ｓ ＶＥＧＦＰ ＰｏｌｙＡカセ
ットの完全性が証明される。

【００７７】 異種遺伝子の転写の証明 ＮＰＴＩＩ転写物およびＶＥＧＦＰ転写物の両者を、上述の方法で検出するこ
とができる。

【００７８】 共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、トランスジェニック蘚類細胞におけるヒ
トＶＥＧＦ_１２１の検出 この方法では、スライドグラスに載せた細胞の被験タンパク質を直接標識する
。普通の光学顕微鏡と比較して改良された解像力を有する、共焦点レーザー走査
顕微鏡で、評価を行う。

【００７９】 組換えＶＥＧＦ_１２１タンパク質（蘚類細胞で検出可能な場合）は、ＶＥＧＦ
Ｃ形質転換体の細胞質中に蓄積するはずである。ＶＥＧＦＰ形質転換体において
、輸送ペプチドが、蘚類におけるシグナルとして機能するのであれば、組換えＶ
ＥＧＦ_１２１タンパク質は、ＥＲシステムで検出できるはずである。

【００８０】 間接免疫蛍光法および共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたコンピューター援用
評価で、トランスジェニック蘚類細胞におけるヒトＶＥＧＦ_１２１の発現が首尾
よく証明されている。さらに、トランスジェニック蘚類において、ＶＥＧＦ_{１２ １} は、対応するヒト輸送ペプチドの存在下で、小胞体に首尾よく輸送されること
が証明される。

【００８１】 培地中にＶＥＧＦが存在することに関するアッセイ ＰＶＰの存在下、培地の２００μｌアリコートをＥＬＩＳＡで分析し、輸送ペ
プチドコード配列を含む発現カセットを用いて形質転換した蘚類植物は、ＶＥＧ
Ｆを培地中に放出できることを示す。陽性の結果から、機能的ＶＥＧＦタンパク
質が存在するという結論を導くことが可能である。

【００８２】 生物活性のアッセイ 培地中に放出されるＶＥＧＦタンパク質の生物活性を検証するために使用され
る両アッセイで、陽性の結果が得られ、本発明に従って産生されるＶＥＧＦは、
所望の生物活性を有する培地から得られることが確認される。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年１月１８日（２００２．１．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 DA01 EA01 FA02 FA17 GA11 HA03 4B064 AG01 CA11 CA19 CC24 DA01 DA11 DA20

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蘚類組織が植物材料として使用されること、および産生され
   たタンパク質性物質が、産生組織または産生細胞を本質的に破壊せずに培地から
   得られることを特徴とする、植物材料における異種タンパク質性物質を産生する
   方法。
2. 【請求項２】 前記培地中に放出される前記タンパク質性物質が、生物学的
   に活性なことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 糖類、ビタミン類および植物ホルモンまたはこれらの機能的
   断片を本質的に含まない培地が使用されることを特徴とする、請求項１又は２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 前記蘚類組織が、ゼニゴケ類を含む蘚類の群から選択される
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記蘚類組織が、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｆｕｎａ
   ｒｉａ、ＳｐｈａｇｎｕｍおよびＣｅｒａｔｏｄｏｎからなる群の蘚類から選択
   されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記蘚類組織が、ＭａｒｃｈａｎｔｉａおよびＳｐｈａｅｒ
   ｏｃａｒｐｏｓからなる群のゼニゴケ類から選択されることを特徴とする、請求
   項４に記載の方法。