KR100671217B1 - 단백질성 물질의 생산을 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물 재료에서 이종 단백질성 물질의 새로운 생산 방법에 관한 것이다. 바람직한 방법에서, 선택된 온전한 이끼 식물은 재배되어 지고, 필수적으로 생산된 조직이나 세포를 깨뜨림 없이 배양액으로부터 얻어내는 것이다.
본발명은 표준화된 조건하에서 각각의 활성화 형태로 모든 종류의 이종 단백질의 비용 효과적인 생산을 허용한다.
단백질성 물질, 이끼, VEGF, 전구 펩티드
Description
본 발명은 일반적으로 식물에서 단백질성 물질을 생산하는 분야에 관련된다. 구체적으로, 본 발명은 이끼에서 원하는 단백질성 물질의 생산을 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
생산 목적을 위한 생물공학 방법의 활용은, 예로 화학적 합성과 같은 다른 방법에 의해 경제적으로 생산되지 않는 물질 및 원료로 사용하기에는 천연적으로 불충분한 양의 물질을 생산할 수 있는 중요한 가능성을 인간에게 제공한다. 비록 10,000 이상의 식물 2차 대사물이 알려져 있지만, 단지 일부 조성물만이 식물 세포 배양의 도움으로 산업적 범위로 생산된다. 상기 물질은 대부분 약제학적으로 활성적인 2차 대사물이다. 언급되어질 수 있는 예들은 a) 정균 및 살진균 작용을 갖는 베르베린(berberin) (4,000 리터의 용랑으로 생산) (Y. Fujita and M. Tabata, in: Plant tissue and cell culture, plant science; Vol. 3, p. 169, C.E Green et al. (Ed.), A.R. Liss Inc., New York (1987)), b) 항생제 및 항염증 작용을 갖는 쉬코난(shikonin) (750 리터 용량으로 생산) (M. Tabata and Y. Fujita, in: Biotechnology in plant science; p. 207-218, P. Day et al. (Ed.), Academic Press, Orlando (1985)), 및 c) 항종양 작용을 갖는, 텍솔로 더 잘 알려진 파클리탁셀 (paclitaxel) (75,000 리터 용량) (M. Jaziri et al., Taxus sp. cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoids production: a literature survey, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46. pp. 59-75 (1996)) 등이 언급될 수 있다.
식물 세포 배양이 이용되는 한층 더 중요한 생물공학 방법은 디지톡신을 디곡신으로 생물학적 변환하는 것으로서, 상기 디곡신은 심장 및 순환계 약물이다. 이런 입체 특이적 수산화 반응은 생반응기 내에서 디지탈리스 이아나타(Digitalis lanata)의 배양을 통해 높은 수득율을 가지고 성공적으로 수행될 수 있다(E. Reinhard and W. Kreis, Kultivierung von pflanzlichen Zellen im Bioreaktor [Plant cell culture in the bioreactor], Bio. Engin., 5, pp. 135-136 (1989)). 생물공학에서 식물 세포 배양의 활용에 관한 현재까지의 광범위한 개관은 H.-P. Muhlbach, Use of plant cell cultures in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 4. pp. 113-176 (1998)에서 발견될 수 있다.
1980년대에 시작된 고등 식물의 유전적 형질전환의 발전은 원하는 대사경로에 관여하는 특성 주요 효소에 대한 유전자의 형질전환에 의해 식물 내에서 특정 2차 조성물의 생산성을 괄목할만하게 증가시킬 수 있게 했다. 형질 전환된 식물 전체뿐만 아니라 식물 세포 배양도 또한 이용되어졌다. 언급되어질 수 있는 예들은 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)의 형질 주입된 뿌리털 배양을 통해 생원체적 아민인 카다베린 (Cadaverin) 및 아나바신 (Anabasin)의 수득율을 14배 까지 증가시키는 세균의 리신 디카르복실라아제의 과발현 (J. Berlin et al., Genetic modification of plant secondary metabolism; Alteration of product levels by overexpression of amino acid decarboxylase, in: Advances in Plant Biology, Studies in Plant Science, Vol. 4, pp. 57-81, D.D.Y. Ryu and S. Furasaki (Ed.), Elsevier, Amsterdam (1994))이다.
식물 내로 DNA를 형질전달 할 수 있는 가능성은 식물 구성요소의 양적 및 질적인 변화를 가속했으며; 또한, 식물 및 식물 세포 배양은 이종 단백질의 생산을 위해 더욱 관심이 집중되었고(A.S Moffat, high-Tech plants promise a bumper crop of new products, Science
256, pp. 770-771 (1992)), 이론적으로 두 개의 다른 접근이 선택되어졌다.
첫 번째 접근 방법은 형질 전달된 식물전체에서 이종 단백질을 생산함을 포함한다. 형질 전달된 담배나무에서 항체를 생산 (J.K.-C.Ma et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science
268, pp. 716-719 (1995))하는 것 외에, 형질 전달된 담배나무 및 형질 전달된 감자나무에서 인간 혈청 알부민의 발현과 정상적인 프로세싱 (P.C. sijmons et al., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Bio/Techn., 8, pp. 217-221 (1990))이 언급되어 졌다. 인간 표피 성장 인자 (hEGF)는 형질 주입 담배나무에서 발현되어졌다 (A.-H. Salmanian et al., Syntesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett., 18, pp. 1095-1098 (1996)). 그 외에 다른 식물들도 사용되 어 졌다. Leu-엔세팔린 (Leu-encephalin)은 아라비도시스 탈리아나(Arabidosis thaliana) 및 브라시카 나퍼스(Brassica napus)를 사용하여 성공적으로 생산되어졌다 (E. Krebbers and J. Vandekerckhove, Production of peptides in plant seeds, Tibtech., 8, pp. 1-3. (1990)). 더군다나, 형질 주입된 비그나 운귀큘라타(Vigna unguiculata) 식물은 백신처럼 작용하는 키메릭 바이러스 입자의 발현을 위해 사용되어졌다 (K. Dalsgaard et al., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, pp. 248-252 (1997)).
상기 예의 방법으로 언급된 것처럼 식물 전체를 사용할 때의 주요한 단점은 식물을 성장시켜야 하기 때문에 시간과 비용이 많이 소요되고, 산업적 규모의 생산을 위해서 넓은 재배면적이 요구된다는 것이다. 더군다나, 식물 전체에서 원하는 물질을 분리하는 것은 약제학적 또는 영양보급의 목적으로 사용되어지는 것처럼 높은 일관성 및 질이 요구되어지는 특정 경우, 일반적으로 복잡한 공정 단계들을 요구한다.
두 번째 접근 방법에서, 형질 주입 담배 세포 배양은 항체 생산을 위해 사용되어졌다. 예로 언급되는 것은 항체의 발현 및 배양액으로 분비이다 (N.S. Magnuson et al., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tabacco cells. Prot. Expr. Pur., 7, pp. 220-228 (1996)). 세포로부터 이종 단백질을 정제하는 것은 복잡하기 때문에, 원하는 단백질의 배양액 내로 분비는 주목할 만한 향상을 야기한다. 더군 다나, 형질 주입 식물이 생반응기 내에서 독립적으로 자랄 수 있고, 분비되어 질 필요가 없기 때문에 세포 배양에서 약제에 관련된 재조합 단백질의 생산은 또한 안전 측면에서 관심사이다. 필요한 대량 배양은 종속영양의 식물 세포 배양을 위한 대량 범위의 생반응기의 발전으로 가능해졌다 (예, M.L. Shuler et al., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity; The case of taxol., Ann, N. Y. Acad. Sci., 745, pp 455-461 (1994)).
식물 현탁 배양이 사용되어지는 두 번째 접근 방법의 주요한 단점은 낮은 성장률, 2차 대사물의 비교적 늦은 형성, 높은 세포 밀도에서 생산물 형성의 방해, 결과적으로 부피당 낮은 생산성, 응집의 형성 및 세포벽 조성물, 및 표면 장력에 대해 세포의 증가된 민감성이다. 종속영양 세포 배양에 필수적으로 첨가되어져야 하는, 일부는 고가인 복합 배양액 내의 조성물의 복합성도 고려되어져야 한다. 하지만, 언급되어져야 할 가장 심각한 단점은 이종 단백질의 생산에서 양적 및 질적인 변화를 야기하는 in vitro 식물 세포 배양 내에서 체세포 클론의 다양성이다 (예, M.G.K. Jones and K. Lindsey, Plant biotechnology, in: Molecular biology and biotechnology, J.M. Walker and E.w. Gingold (Eds.), 2nd Ed., Royal Soc. of Chem., Burlington House, London (1998). 생산물 및 기능의 이질성은 특히, 약제학적 생산물 및 신뢰할만한 질과 표준화된 생산 방법들을 요구하는 공식적인 승인이 요구되는 다른 물질과 연관될 때 받아들여질 수 없다.
따라서 본 발명의 목적은 상술한 전체 식물을 사용할 때의 불이익 뿐만 아니라 세포 배양 시스템을 사용할 때의 불이익을 필수적으로 제거한 식물 내의 이종 단백질성 물질의 표준화된 생산 방법을 제공한다.
이러한 목적은 본 발명에 따라 완전히 분화된 이끼가 표준 상태 하에서 재배되고, 생산된 단백질성 물질은 필수적으로 생산 조직 또는 세포를 파열시킴 없이 배양 배지로부터 얻어지는 식물 내의 이종 단백질성 물질의 신규한 생산 방법을 제공함으로써 이루어진다.
본 명세서에 사용된 "단백질성 물질 (proteinaceous substance)"이라는 용어는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 그리고 이들의 단편을 포함하며, 특히 진단적, 치료적, 약제학적 및 영양학적 목적에 적합하다. 또한, 식물 재료에 의해 번역된 펩타이드 결합을 갖는 분자도 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 소망하는 이종 단백질성 물질은 생물학적으로 활성적인 형태로 상기 배양 배지로 방출된다.
본 명세서에 사용된 "생물학적으로 활성적인 (biologically active)"이라는 용어는 이러한 특성이 부여된 목표 물질이 각각의 목적에 소망되고 요구되는 기능적 특성을 가졌음을 의미한다. 예컨대, 만약 항체 생산을 소망한다면, 상기 항체와 결합하는 기대의 물질을 초래할 수 있는 생산된 단백질 또는 이들의 기능성 단편이 생물학적으로 활성적이다. 이러한 목적에 완전한 단백질이 항상 요구되지는 않는다는 것은 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상의 지식을 가진 자에게 명백하지만, 소망하는 생물학적 활성 또는 기능성을 보증하는 항원 결정기 (epitope) 또는 저-분자량 구조를 찾는 것도 가능하다. 예컨대, 효소는 그것의 목표 기질을 변환할 수 있을 때 생물학적으로 활성적이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 식물 재료는 필수적으로 당분, 비타민 및 식물 성장 호르몬 또는 이들의 기능성 단편이 없는 배양 배지 내에서 완전한 이끼의 형태로 재배된다.
본 발명에 따른 방법은 표준화될 수 있는 광독립영양 상태, 즉 종래 이종영양 현탁액 세포 배양 시스템에서 요구되었던 당분, 비타민 및 식물 성장 호르몬 등의 첨가를 요구하지 않는 상태 하에서 완전하고 충분히 분화된 식물의 재배를 가능하게 한다. 저렴하고 간단한 배양 배지가 사용되기 때문에, 소망하는 목표 물질을 얻고 정제하는 단계는 상당하게 촉진된다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 식물 재료는 바람직하게는 피스코미트렐라 (Physcomitrella), 퓨나리아 (Funaria), 스파그눔 (Sphagnum
) 및 세라토돈 (Ceratodon) 속의 종을 갖는 우산이끼를 포함하는 이끼의 그룹으로부터 선택된 완전한 이끼이며, 또한 특히 마르칸티아 (Marchantia) 및 스파에로카르포스 (Sphaerocarpos)가 필수적으로 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법은 피스코미트렐라 이끼를 사용하여 수행되는 것이 가장 바람직하다.
다른 바람직한 실시예에서, 형질 전환에 사용되는 핵산 구조는 소망하는 단백질성 물질 뿐만 아니라 숙주 세포로부터 상기 배양 배지로 물질을 분비하는 수송 펩타이드를 코딩한다. 공지된 자가종 (autolous) 및 이종 핵산 서열이 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 생산 조직을 형질 전환하는 발현 카세트 (cassette)를 제조 하는 데 사용될 수 있다. 소포체 또는 세포 수송을 위한 시그널 펩타이드를 필수적으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명을 위해 수행된 연구는 상술한 세포 배양에서 직면하는 체세포 클론의 다양성의 문제가 이끼의 광독립영양 액체 배양에서는 존재하지 않음을 증명한다. 게다가, 본 발명에 따라 사용된 이끼는 정확하게 정의된 분화 단계 (클로로네마 (chloronema), 콜로네마 (caulonema), 버드, 배우자)가 명확히 연속되는 다른 시스템에 대해 이점을 가지며, 식물 호르몬을 첨가함으로써 영향을 받을 수 있다 (인돌-3-아세트산은 콜로네마 발달을 유도하고, 이소펜테닐아데닌은 버드의 발달을 유도한다) (예컨대, N. W. Ashton et al., Analysis of gametophytic development in the moss, Physcimicrella patens, using auxin and cytokinin resistant mutants, Planta, 144:427-435(1979) 참조). 따라서, 생물 반응기 배양에서의 이종 단백질의 지시된 분화-특이 발현이 가능하며, 동시 분할되고, 순수하며 따라서 동종인 클로로네마 배양이 본 발명에 따라 특히 바람직하게 적합한데, 이것은 생물 배양기 내의 통제 가능한 단일의 단백질 생산 및 호르몬-의존 또는 분화-특이 프로모터의 사용에 대한 안정성 때문이다.
이러한 발현 시스템 외에도, 유도 프로모터 시스템 또한 본 발명에 따라 사용되며, 특히 짧은 반감기를 갖거나 세포 독성인 단백질의 생산에 사용되는데, 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agarobacterium tumefaciens) 1'-프로모터가 특히 바람직하게 사용된다.
경제적인 면에서, 본 발명의 이종 단백질의 생산 방법에 따라 제안된 이끼의 배양은 예컨대, 부피로 20 ㎖ 내지 6 ℓ이상 10 ℓ이하의 크기 순서로 피스코미트렐라를 상기 진동 배양 (shake cultures) 또는 공기 글라스 컨테이너에서 사용함으로써 영향을 받을 수 있다 (예컨대, R. Reski, Zell- und molekularbiologische Untersuchungen der cytokinin-induzierbaren Gewebe differenzierung und Chloroloasternteilung bei Physcomiterlla patens (Hedw.) B. S. G., [Cell- and molecularbiological studies of the cytokinin-induced tissue differentiation and chloroplast diversion in Physcomiterlla patens (Hedw.) B. S. G.], Ph. D. thesis, University of Hamburg (1990) 참조). 이는 분화된 광자가독립영양 식물의 배양이기 때문에, 상기 배지는 식물 호르몬, 비타민 또는 당분의 보충을 필요로 하지 않는다. 동물 세포 배양에서와 같이 이들이 요구되는 복합 배지와 비교하여, 비용이 100배 정도 싸다. 본 발명에서는 배양 배지 내의 생물학적으로 활성적인 이종 단백질의 수득이 PVP의 존재 하에서 35배 정도 증가될 수 있음이 나타났고, 이것이 본 발명에 따른 방법에서 배양 배지에 PVP를 사용하는 것이 바람직한 이유가 된다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 다른 이끼, 예컨대, 렙토브리움 피리포르메 (Leptobryum pyriforme) 및 스파그눔 마겔라니쿰 (Sphagnum magellanicum)의 생물 배양기 내에서의 배양에 관한 상세한 정보는 종래 기술에 개시되어 있다 (예컨대, E. Wilbert, Biotechnologishe Studien zur Massenkulur von Moosen unter besonderer Berucksichtigung des Arachidonsaurestoffwechsels [Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolisim], Ph. D. thesis, University of Mainz (1991); H. Rudolph and S. Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3:67-73(1992) 참조). 특히 본 발명의 목적에는 피스코미트렐라를 사용하는 것이 바람직한데, 이것은 특히 보통의 분자 생물학적 기술의 모두가 이 유기체에 대해 확립되어 있기 때문이다 (R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111:1-15(1998) 참조).
적합한 형질 전환 시스템이 이종 단백질의 생산을 위한 피스코미트렐라의 생명공학적 사용을 위해 발달되었다. 예컨대, 성공적인 형질 전환은 입자 총을 사용한 프로토네마 조직으로의 직접적 DNA 운반에 의해 수행되었다. 또한, 이끼 프로토플라스트로의 PEG-매개 DNA 운반도 성공적이었다. 이러한 형질 전환 방법은 티스코미트렐라에도 반복적으로 개시되어 왔으며, 일시적 및 안정적 피형질전환체 모두를 초래한다 (예컨대, K. Reutter and R. Reski, Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture, Biotech., 2:142-147(1996) 참조).
본 발명은 주로 단백질성 물질의 생산에 적합하지만, 인간 혈관 내피 성장 요소 (vascular endothelial growth factor (VEGF))에 관한 약제학적으로 관련 있는 단백질의 생산도 하기 본 명세서에 설명될 것이다.
VEGF는 N. Ferrara 및 W. J. Henzel에 의해 최초로 분리되었고 (Pituitary follicular cells secrete a novel geparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851-858(1989)), 정상 생리학적 상태 하의 조절된 맥관 형성 및 내피 세포 분열에 대한 조절 요소로서 특징되었다 (N. Ferrara et al., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J. Cell. Biochem., 47:211-218(1991)). 또한, 상기 저자들은 이러한 성장 요소가 혈관 내피 세포에 매우 특이적으로 작용하고, 다른 세포 타입에서는 불활성적임을 증명하였다. VEGF는 이황화다리에 의해 연결된 동종이합체이다. 인간 VEGF의 네 가지 다른 종류가 알려져 있다. 상기 네 가지 이소 화합물은 121, 165, 189 및 206 길이 아미노산이며, VEGF RNA의 선택적 스플라이싱에 의해 형성된다. VEGF206은 태아의 간 cDNA에서만 나타나지만, VEGF121, VEGF165 및 VEGF189의 전사는 많은 종양 세포 및 종양 조직에서 나타난다. 모든 VEGF 이소 화합물은 분비를 위한 리더 서열을 가지지만, 단지 두 개의 가장 작은 종류만이 효과적으로 분비된다 (예컨대, G. Martiny-Baron and D. Marme, VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Biotechol., 6:675-680(1995) 참조).
VEGF의 적합한 양은 여전히 종양 치료 및 VEGF의 특성에 대한 현재의 접근에 대해 발전과 개선을 요구한다. 본 발명의 배경에서 수행된 연구의 초기 단계 동안에, 개시된 모든 것은 바쿨로바이러스 (baculovirus) 발현 시스템의 수단에 의한 곤충 세포에서의 VEGF 재조합 생산이었다 (예컨대, E. L. Fiebich et al., Synthesis and assembly of funtionally actibe human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211:19-26(1993)). 추가적인 생산 유기체로서 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) (S. Kondo et al., The shortest isoform of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF121) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesis and vascular permeability, Biochem. Biophys. Acta, 1243:195-202(1995)), 효모, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (D. Mohanraj et al., Expression of biologically active human vascular endothelial growth factor in yeast, Growth factors, 12:17-27(1995)) 및 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) (G. Siemeister et al., Expression of biologically active isoforms of the tumor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem. Biophys. Res. Commun., 222:249-255(1996))가 있다. 생물학적으로 활성적인 VEGF는 모든 이러한 재조합 시스템으로 생산되었다. 그러나, 상기 E. coli 발현 시스템은 E. coli가 봉입체 내로 패키징되기 때문에 상기 단백질의 정제 및 재구성에 관하여 복잡하게 된다.
요약
피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens) 의 조절 가능한 대랑 배양의 확립 (Reutter and Reski, loc. cit.) 및 Physcomitrella patens 내로 DNA를 전 달하는 방법 (K. Reutter, Expression hetegologer Gene in Physxomitrella patens (Hedw.) B.S.G. [Expression of heterologous genes in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.], Ph.D. thesis, University of Hamburg (1994))은 Physcomitrella patens 의 생물 공학적 이용을 위한 기본적인 전제조건을 설립했다.
초기에 수행된 연구는 Reutter로부터 기원한 형질전환 피스코미트렐라(Physcomitrella) 식물주 (loc. cit., 1994)를 사용한 형질주입 (integration)의 장기간 안정성을 입증했다. 형질주입의 안정성에 대한 예로서 사용되었던 이종 npt II 및 gus 유전자의 발현은 4년이 지난 뒤에도 여전히 관찰 되었다.
피스코미트렐라(Physcomitrella)의 생반응기 배양을 적합화 하였다. 우산이끼의 분쇄를 초래하고, 따라서 300-500 rpm의 일정 속도에서 배양물의 동질성 을 확보할 수 있는 교반기를 개발하였다. 이로 인해 표준화된 샘플링이 가능해졌다. 이와 동시에, 액체 배양무레 유입된 공기를 더욱 균일하게 분배시켰다. 이런 조건하에서, 외부의 pH 조절 없이 바이오매스 및 단백질의 형성이 pH 조절하의 조건에서처럼 계속 되어짐이 증명되었고; 놀랍게도, pH 조절은 필요하지 않다. 세미-배취 조건 하에서, 매 주에 리터 당 건조중량 500 mg 의 바이오매스 또는 22 mg 의 전체 단백질을 수득하였다. 이 사실은 기존의 5 리터 유리 플라스크 배양에 대해 5 배의 바이오매스 생산 증가를 의미한다. 크놉 배양액 내에서 10 분의 1 로 소금 농도의 감소로도 유사한 결과를 보였고 따라서, 경비 절감을 가져왔다.
5 mM 의 암모늄 주석산염의 첨가는 성장 지체기를 감소시켜 바이오매스의 형성을 촉진시켰다. 동시에, 암모늄 주석산염의 첨가는 클로로네마 세포의 사실상 독점적인 배양을 가능하게 했다. 유세포 분석을 통해, 배양세포 100% 가 G2/M 기에 존재한다는 것이 증명되었다. 상기 결과는 옥신을 사용한 생리학적 연구 및 분화-특이적 돌연변이인 cal112 및 cal113의 연구에 의해 확증되어졌고, 클로로네마 세포는 우월하게 G2/M 기에 존재하는 반면에, 코울로네마 세포는 대부분 G1/G0 기에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이끼 내에서 가능한 발현 유도를 위한 프로모터는 아그로박테리아의 1'-프로모터를 이용해 연구되어졌다. β-글루코로니다아제 (gus) 유전자는 표지유전자로 사용되어졌다. 일시적으로 형질전환된 이끼의 원형질체 (형질전환 율 = 3 x 10-4) 내에서, gus 유전자의 발현은 5 μM 의 인돌-3-아세트산으로 유도한 후 관찰되었다. 대조군 에서는 발현이 관찰되지 않았다.
121 아미노산으로 접합 (splice)된 인간의 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF121)의 유전자를 0.5 x 10-5 및 3.3 x 10-6 의 형질전환 율로 Physcomitrella에 형질주입 하였다. 결론적으로, 이 유전자는 연속발현 35S 프로모터 뒤에 재조합 되어 형질전환 식물용 벡터인 pRT99에 재조합 되어졌다. 두 번째 시도로, 인간 소포체 전구 펩타이드에 상응하는 DNA 사슬이 추가적으로 재조합 되어졌다. 이종 DNA의 삽입이 확인된 후, 삽입의 형태는 수득된 영구 형질전환 세포를 서던 분석을 통해 확인하였다. 노던 분석을 통해 상기 형질전환 체 내에 nptII 및 두 가지 의 VEGF 전사체가 존재함이 밝혀졌다. 이끼 세포에서 VEGF121 의 발현은 간접 면역형광법에 의해 확인되었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 상기 단백질이 정상적으로 세포 내에 위치함이 밝혀졌다. 이 연구는 전구 펩타이드를 갖지 않는 형질전환 체에서 단백질이 특히 세포질에 존재한다는 것을 개시하였다. 소포체 전구 펩타이드를 추가적으로 포함하는 형질전환 체에서, 단백질은 핵 주위 및 많은 소포체를 함유하고 있는 정단세포 (apical cell)의 끝 부분에서 관찰되어졌다. 본 발명에 의해 생산된 이종 단백질의 생물학적 활성은 배양액에서 수득된 VEGF로 ELISA 및 두가지 기능 검사를 통해 평가되어졌다.
실험 재료 및 실험 방법
본 명세서에서 특정하게 언급되지 않은 경우, 시약들은 분석용-등급이고, Fuluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) 및 Sigma (Deisenhofen)으로부터 구입되었다.
용액들은 Milli-Q 물 정제 시스템 (Millipore, Eschborn)으로 정제된, 파이로젠-불포함 물, 하기 H2O로 표기, 로 제조되어졌다.
제한 효소, DNA-변형 효소 및 분자 생물학 키트는 AGS (Heidelberg), Amersham (braunschweig), Applied Biosystems (Weiterstadt), Biometra (Gottingen), Boehringer mannheim GmbH (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), new England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) 및 Stratagene (Heidelberg)로부터 구입되어졌다. 특정하게 언급되지 않은 경우, 제조사의 사용 설명서에 따라 사용되어졌다.
벡터 및 벡터의 제작
플라스미드 pCYTEXP-VEGF121 는 인간 VEGF121 의 cDNA를 E. coli 에서 발현하도록 재조합된 pCYTEXP1 (T.N. Belev et al., A fully modular vector system for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, pp. 147-150 (1991))의 변형된 형태이다. 인간 VEGF121 cDNA 는 pCYTEXP-VEGF121 로부터 제한효소인 Nde I 및 Sal I 으로 잘려지고, 정제되어 졌으며, 블런트-말단으로 처리되고, pRT101 (R. Topfer et al., A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 15, p. 5890 (1987)) 벡터의 35S 프로모터 및 CaMV의 폴리아데닐레이션 사슬사이에 Sma I 절단 부위로 재조합 되어졌다. HindIII를 사용하여 재조합된 카세트는 잘라내어 지고, 형질전환 벡터인 pRT99에 HindIII 절단 부위로 재조함 되어졌다. pRT99 벡터는 다중 클로닝 부위 뿐만 아니라 35S 프로모터 조절하에 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 및 CaMV의 폴리아데닐레이션 사슬을 포함한다 (R. Topfer et al., Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells, Nucleic Acids Res., 16, p. 8725 (1988)). 상기 플라스미드는 Escherichia coli 종인 DH5α 내에서 복제되어 졌다 (J. Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)).
제한효소 Bam HI 및 Bgl II를 이용하여, 상기 cDNA는 예초에 곤충 세포에 사용할 목적으로 제작되었고, 동물세포에서 VEGF121 외에 소포체를 통해 배양액으로 분비를 유도하는 원래의 전구 펩타이드를 인코딩하는 DNA를 추가적으로 포함하는 pVE-121 벡터 (Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, pp. 19-26 (1993))로부터 절단되어졌고, pRT101을 이용하여 pRT99 벡터에 재조합 된 후 확인되어졌다.
플라스미드 pNA201은 바이너리 벡터 pBI101 의 변형체다 (A.R. Jefferson et al., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, pp. 387-405 (1987)). pPI101 벡터는 식물에서 선택 표지자로서 nopalin synthase 프로모터의 조절하에 nptII 유전자를 포함한다. 추가적으로 존재하는 gus 유전자는 아르로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 의 1'-프로모터에 의해 조절된다. pNA201 벡터는 피스코미트렐라(Physcomitrella)의 직접적 형질전환에 적합하다.
항체
VEGF 단백질에 대해 두 가지 다른 항체들을 이용하였다. 첫 번째 항체는 자연상태의 인간 VEGF의 1-20 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드로 유도된 토끼- 항-VEGF 항체이다 (Fiebich et al., loc. cit. (1993)). 두 번째 항체는 인간 VEGF121 단백질으로 유도된 단일 클론 마우스 항체이다 (R&D Systems, Wiesbaden).
식물 재료
Hamburg 대학의 일반식물학과에 있는 Genetics Group이 보유하고 있는 이끼 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) (Hedw.) B.S.G. 의 야생형이 사용되어졌다. 상기 이끼 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 는 영국 Huntingdondhire의 Gransden Wood에 있는 H.L.K. Whitehouse에 보유된 16/14 계통을 기원으로 하고 포자로부터 계대배양 되어져 왔다.
야생형 계통은 노프 배양액 (R. Reski and W.O. Abel, Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine, Planta, 165, pp. 354-358 (1985)) 으로 액체 배양 되거나 또는 고체 1%의 옥소이드 한천을 포함하는 고체 크놉 배양물 위에서 배양되어 졌다 (Unipath, Basingstoke, England). 액체 배양은 Reski 에 의한 방법으로 이루어졌다 (loc. cit., 1990).
생반응기 배양
대량 배양을 위해, 식물 재료는 이중 자켓을 설비한 7 리터용 둥근 밑바닥 유리 플라스크 생반응기 내에 담겨졌다 (Applikon Biotek, Knullwald). 이 생반응기 시스템내에, 배기 공기 압축기 (waste air condenser), 공기 폭기 관, pH 감지봉 (Conducta, Gerlingen), 온도 센서, 교반기, 샘플링 관 및 산, 염기 및 배 양액 주입관 등이 덮개의 구멍들을 통해 배양액내로 연결되었다. 배양은 25℃에서 수행되었고, 이중 자켓에 연결되어 적절히 조절된 중탕기내에서 일정하게 유지되어졌다. pH 조절 하에서의 실험에 있어, pH는 적정 유닛에 의해 5.8로 일정하게 유지됐다. 온도 측정 및 pH 조절은 Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Knullwald)에 의해 수행되었다. 교반기 속도는 모터 조절기 ADI 1012 (Applikon Biotek, Knullwald)에 의해 조절됐다. 배양액은 다공성 유입기에 의해 1 bar로 일정하게 폭기 되어졌다. 배양 용기 내의 무균화를 위해, 모든 유입 및 배기관들은 필터 멸균 유닛(Midisart, 0.2 μm; Sartorius, Gottingen)이 장착됐다. 생반응기 배양은 측면 조명(백광; Osram L 40 W/20; max. 100 μmols-1m-2)하에 조절된 환경의 케비넷 내에서 수행됐다. 배양은 무균 조건 하에서 생반응기 배양 1 리터당 0.5 - 1g 의 습중량 식물 재료를 접종했다. 샘플링 관은 교반기와 같은 높이에 위치됐고, 따라서, 교반동안 일정한 샘플링이 가능했다. 소량의 샘플량(< 100 ㎖)은 Luer lock 연결을 통해 멸균된 주사기로 취해졌고, 반면에, 대량의 샘플량은, 예컨대, 501 RI 헤드 (Sartorius, Gottingen)이 장착된 진동 펌프 타입 302/3A을 이용해 취했다.
선택된 압력 하에서 형질 전환체의 액체 배양을 수행하기 위해, 50 mg/ℓ 의 G418 (Calbiochem, Bad Soden)을 크놉 배양액에 첨가하였다. 마지막으로, 상기 배양물은 매 10 일 마다 분쇄 바로 직전에 100 ㎛ 멸균 시브 (Wilson Sieves, Nottingham, England)의 여과에 의해 제거되어지고, 선택 배양액으로 채워진 Erlenmyer 플라스크로 옮겨졌다.
영양 요소 실험들을 위해서, 상기 크놉 배양액을 1:10으로 H2O에 희석하였다.
형질 전환
본 발명에서 선택된 형질전환 방법은 Reutter 와 Reski (loc. cit., 1996)에 언급된 것처럼 원형질체에 PEG를 이용한 직접적 DNA 주입이다. 각각의 형질전환에서 50 ㎍의 플라스미드 DNA를 3x105 원형질체를 위해 사용하였다. 만약 특정하게 언급하지 않으면, 원형질체의 재생 및 영구 형질전환체의 선택은 Reutter 및 Reski (loc. cit. 1996)에 의해 언급된 것처럼 수행했다.
간접 면역형광
완충용액: MSB: 100 mM PIPES; 5-10 mM EGTA, 5 mM MgSO4, pH 6.8
F-MSB: MSB + 5% DMSO
E-MSB: MSB + 5% DMSO + 5% Nonidet
W-MSB: 1:2의 비율로 H2O에 희석된 MSB (세척 완충용액)
효소 용액: pH 5.6의 MSB 속에 포함된 1% 셀룰라아제, 1% 펙틴나아제, 2% 드리셀라아제 (Sigma 제품, Deisenhofen)
이끼 프로토네마타를 F-MSB 내 1.25% 글루타알데히드 (v/v)으로 10분 이하로 반응시켜 고정하고, 간단하게 W-MSB로 세척하였다. 다음에, 상기 프로토네마타를 MSB 내 2% 파라포름알데히드 (v/v)로 40 분 동안 반응시키고 W-MSB로 세 번 세척하였다 (린스 1회; 세척 매 5분씩 2회).
세척에 의해 제거되지 않은 여분의 알데히드는 MSE 및 액수저-한수저 분량의 고체 보론 히드리드를 첨가 후 10 분간 반응시켜 환원시켰다. 상기 보론 히드리는 W-MSB로 3회 세척하여 제거하였다.
다음 단계에서, 세포벽을 효소 용액을 10 분 동안 첨가하여 투과 가능하게 만들었다. 효소 반응을 pH (MSB, pH 6.8)를 변화하여 억제하였다. 다시, 상기 혼합물을 W-MSB로 3회 세척하였다.
엽록소들을 120 분 동안 세정제 용액에 반응시켜 추출하였다. 상기 용액은 W-MSB으로 3회 세척하여 제거하였다.
상기 준비 이후에, 이끼 프로토네마타를 일차 항체 (항-VEGF; 1/50 희석)에 반응시켰다. 상기 반응은 37 ℃에서 45 분간 실시했다. W-MSB로 3회 세척한 후, 표시된 2차 항체 (항-토끼 또는 항-마우스; 1/30 희석; 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC) (Molecular Probes, Leiden, Netherlands))를 37 ℃에서 45 분 동안 첨가되어졌다. 상기와 같은 3회 세척 외에, 상기 혼합물을 W-MSB + 0.1% Triton으로 1회 세척하였다. 상기 프로토네마타를 순차적으로 W-MSB에서 추출하고 적어도 하룻밤 동안 4 ℃에서 저장하였다.
상기 준비된 재료를 공초점 레이저 스캔닝 현미경 (CLSM) 타입 TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) 및 Scanware 5.0 소프트웨어 (Leica Lasertechnik, Heidelberg)를 이용해 평가하였다.
CLSM 하에서 샘플을 분석하기 위하여, 샘플들을 슬랄이드 위의 마운틴 용액 (Deisenhofen, Sigma, Deisenhofen)속에 올려놓았다. 2차 항체와 연결된 FITC 형광 염료의 흥분은 488 nm 파장의 아르곤-크립톤 레이저를 사용하여 수행했다. FITC는 파장 528 nm를 발산한다.
ELISA 분석
적절하게 형질전환된 이끼에서 형성된 배양액 내의 VEGF 단백질을 일반적인 ELISA 분석 및 상기 언급한 항체들을 이용하여 질적 및 양적으로 분석하였다. 200 ㎕의 배양액을 바로 ELISA 분석에 사용하였다.
기능성 분석
배양액에서 얻은 재조합 VEGF의 생물학적 활성은 신호물질성 분석 (Miyazono et al., Purification and properties of an endothelial cell growth factor from human platelets, J. Biol. Chem., 262, pp. 4098-4103 (1987)) 및 'Day-13 chorioallantoic-membrane angiogenesis assay' (Wilting et al., Amorphological study of the rabbit corneal assay, Anat. Embryol., 183, pp. 1167-1174 (1991))을 이용하여 측정하였다. 상기 배양액은 미리 초고속원심분리를 하였고, 냉동건조 하였으며, 순차적으로 완충 용액으로 다시 녹였다. 만약 필요시, 양이온성 컬럼을 이용해서 더 진보된 정제 과정을 술행할 수 있다.
1'-프로모터의 발현 유도
옥신에 의한 1'-프로모터의 유도성은 5 μmol/ℓ의 인돌-3-아세트산 (IAA)를 이용해 측정하였다. 형질전환 5일 후, pNA201에 의한 형질전환 반응의 100 ㎕의 원형질 일부분을 96-웰 마이크로적정 플레이트 (Nunc, Wiesbaden)로 옮겼다. 원형질 부유액은 IAA (최종 농도 = 5 μM)와 5 시간동안 반응시켰다. 유도 실험은 질적 β-글루코로니다아제 분석을 이용하여 반응 후에 직접 측정하였다.
정성적 β-글루쿠로니다아제 분석
상기 β-글루쿠로니다아제 활을 정성적 분석 (A.R. Jefferson, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, pp. 387-405 (1987))을 이용해 측정하였다.
기질 용액 : 50 mM K3Fe(CN)6 50 mM Na2HPO4
50 mM K3Fe(CN)6 1% (v/v) Triton X-100
50 mM Na2HPO4 10 mM EDTA, pH 7.0
4 mg/ml PVP (MW 10,000)
염색 용액 : 250 ㎕의 N,N-디메틸포름아미드/50 ml의 기질 용액에 녹여진 12.5 mg의 5-브로모-4-클로로-3-인도일글루쿠론산 (Biomol, Hamburg)
크놉 또는 재생 배양액에 포함된 이끼 프로토네마타 및 이끼 원형질은 동량의 염색 용액을 가하여 37 ℃에서 72 시간까지 반응시켰고, 현미경을 이용하여 즉시 축정하였다.
결과
생반응기 배양의 동질성; 샘플링
오직 동질성 배양만이 세포 배양으로부터의 샘플링을 표준화 시킨다. 장기 배양 후, 장 세포 필라멘트 내에서 프로토네마의 성장은 종종 세포 응집을 초래하고, 따라서, 액상 배양에서 식물의 비동질화 분포를 야기한다. 상기 응집을 피하기 위해, 상기 프로토네마타를 고속 교반기/동질기를 이용하여 특정 간격으로 분쇄하였다-생반응기의 경우 10 일 이후 매일 및 쉐이킹 배양의 경우 12 일 이후. 장기 배양 기간의 경우에도 일시에 표준화된 샘플링 동안 생반응기 내의 연속적 조건의 유지를 위해, 터빈 교반기의 3개의 교반날의 끝 부분을 마모시켜 쉬어(shear)날로 변형하는 것이 바람직하다. 300-500 rpm에서의 일정한 "교반"은 동질화 생반응기 배양의 작동을 가능하게 해준다.
터빈 교반기를 장착한 조절된 배양 조건하에서 500 rpm에서 35일 (840 시간)동안의 배양에 의한 바이오매스의 형성 (DW [mg/ℓ]내])은 쉬어(shear)날 교반기에 의해 교반되는 생반응기 배양과 동일하다.
배양 동질화는 각각의 6개의 샘플들의 비교를 통해 측정하였다. 식물 100 ml 샘플의 건조 중량은 비교 모집단으로 측정되었다. 비변형 터빈 교반기를 사용했을 때, 바이오매스의 농도가 증가할수록 상기 표준 편차도 증가하였다. 쉬어(shear)날 교반기로 교반한 결과, 샘플의 표준 편차는 낮게 유지됐다. 상기 결과는, 상기 변형된 교반기는 35 일 동안 일정하게 동질화된 배양을 가져올 수 있다는 결론을 가능하게 한다.
1'-프로모터의 유도성에대한 연구
플라스미드 pNA201에서, 1'-프로모터는 gus 유전자의 위쪽에 위치하고, 조절 요소로 작용한다. 공지된 β-글루쿠로니다아제 측정은 이끼에서 유도 실험을 위한 측정 분석방법으로서 적합하다. 형질전환 담배에서의 실험은 1'-프로모터가 높은 옥신 함량을 가진 조직에서 β-글루쿠로니다아제의 발현을 초래하고, 따라서, 상기 프로모터는 옥신 의존성임을 예측하게 한다. 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens)에서 옥신에 의한 1'-프로모터의 유도성은 일시적으로 형질전환된 원형질에서 연구됐다.
상기 형질전환 반응은 5 μM 인돌-3-아세트산 (IAA)의 존재 또는 비존재하에서 β-글루쿠로니다아제 분석 (5 시간)을 통해 측정했다. IAA의 추가가 없는 대조군에서, 현미경하에서 평가는 어떤 반응에서도 푸른 원형질을 볼 수 없었다. 반대로, 옥신 존재하에 배양된 원형질의 평가에서는 gus 유전자의 발현을 확인했다. 푸른 원형질에 근거하여, 3x10-4의 형질전환율이 얻어졌다. 일시적으로 형질전환 된 이끼 원형질에서 식물 호르몬인 옥신에 의해 1'-프로모터가 유도될 수 있음이 명확히 제시됐다.
VEGF 형질전환을 위한 벡터의 생성
피스코미트렐라 (Physxomitrella)에서 선도서열 (leader sequence)이 없는 VEGF121의 cDNA, 이하에서 VEGFC로 표기, 및 선도서열을 가진 VEGF121의 cDNA, 이하에서 VEGFP로 표기,의 형질전환을 위해, 식물에서 적당한 프로모터/종결사슬 사이의 염기사슬을 재조합 해야한다. 35S CaMV 프로모터 및 상응하는 폴리아데닐레이션 신호를 상기 목적을 위해 선택했다. 적절히 준비된 VEGF의 cDNA 사슬은 pRT101 벡터의 다중 클로닝 부위의 Sma I 제한효소 절단위치에 재조합 시켰다.
수득된 벡터 (pRT10VEGFC 3 및 VEGFP 21)은 35S 종결사슬을 인식하는 프라이머를 사용하여 시퀀싱 하였고, 프로모터와 폴리아데닐레이션 위치 사이에 정확히 삽입된 것을 확인하였다.
수득된 카셋트를 제한효소인 Hin dIII로 절단하고 실제 형질전환 벡터인 pRT99에 Hin dIII 위치를 이용해서 재조합 시켰다 (pRT99VEGFC 3 and VEGFP 21). NPTII 카셋트에 비교해서 상기 카셋트의 방향성은 제한효소 Sma I 및 Hinc II를 이용해 확인할 수 있다. 프로모터-to-폴리아데닐레이션 신호 방향의 경우에는, 하나의 5250 (VEGFC) 및 하나의 5380 bp (VEGFP) 절편이 수득되며 반면, 반대 방향의 경우에는 하나의 1100 (VEGFC)/1230 (VEGFP) 및 하나의 4150 bp (VEGFC and P) 절편을 얻을 수 있다. 제한 분석은 단지 하나의 5250/5380 bp 절편을 나타냈고, 따라서, VEGFC/P 카셋트는 pRT99의 nptII 유전자에 대하여 프로모터-to-폴리아데닐레이션 신호 방향으로 삽입됐다.
피스코미트렐라 (Physcomitrella)에서 VEGFC 형질전환
반복적으로 크놉 배양액 으로부터 선택 배양액으로 변환후에 야생형 원형질에서 VEGFC 벡터의 절대적인 형질전환 율은 형질전환체의 지속적 안정도를 유지하 면서 0.5x10-5이다.
형질전환 플라스미드의 삽입(integration)의 확인
식물의 게놈안에 성공적인 삽입은 서던 혼성화에 의해 확인했다.
첫 번째 프로브는 pRT99의 npt II 유전자의 Nco I 절편이고, 두 번째는 pCYTEXP-VEGF121의 Nde I/Sal I VEGFC 절편이다.
형질전환체의 절단되지 않은 전체 DNA에서 감지된 신호는 식물 게놈으로 플라스미드 DNA가 성공적으로 삽입됐음을 확인시킨다. 35S VEGFC 폴리A 카셋트 전체가 삽입이후에도 수득될 수 있는지는 제한효소 Hin dIII로 확인했다. 만약 카셋트가 완전하게 삽입된 경우, 상기 제한효소는 전체 DNA에서 1100 bp를 잘라 낸다.
VEGFC 프로브의 하이브리디제이션은 전체 형질전환체에서 1100 bp를 나타낸다. 이끼에서 VEGF121의 정확한 전사 및 발현을 위한 전제조건인 완전한 VEGFC 발현 유닛의 삽입이 따라서 확인됐다.
이종 유전자의 전사의 확인
형질전환체의 이종 유전자인 VEGFC 및 NPTII의 전사는 상기 VEGF 및 상기 NPTII 프로브를 이용하여 비방사성동위원소 DIG 감지 시스템으로 감지됐다. VEGFC 전사물의 760 뉴클레오티드 및 NPTII 전사물의 1100 뉴클레오티드에서, 형광측정에 의해 감지된 전사물의 크기는 각 경우에서 예상된 정도의 순서이다. 예상 대로, 두 이종 전사물의 어떤것도 야생형에서는 감지돼지 않았다.
인간 전구 펩티드로 형질전환체의 분석
형질전환 반응당 50 ㎍의 pRT99P 21 플라스미드를 상기 PEG-중개 DNA 주입한 것은 선택 배양액에서 영구하게 형질전환을 야기했다. 상기 결과의 영구 형질전환 율은 3.3x10-6이다.
형질전환된 플라스미드의 삽입 확인.
상기 전구 펩티드로 상기된 형질전환체의 삽입은 상기된 프로브(probe)들을 이용해 서던 하이브리디제이션을 통해 확인 했고, VEGF 프로브로 Hin dIII-절단 전체 DNA의 하이브리디제이션은 하나의 1230 bp 절편을 나타냈다: 삽입된 35S VEGFP 폴리A 카셋트의 완전함의 확인.
이종 유전자의 전사 확인
NPTII 및 VEGFP 전사물은 상기 개략된 방법에 의해 감지될 수 있다.
공초점 레이져 스캐닝 현미경을 이용하여 형질전환 이끼 세포에서 인간의 VEGF
121
의 확인
본 방법에서, 시험 단백질은 마운팅 된 세포에서 직접 표지된다. 평가는 일반 광학 현미경보다 향상된 해상도를 갖는 공초점 레이져 스캐닝 현미경하에서 수행했다.
상기 재조합 VEGF121 단백질-만약 이끼 세포에서 발견돼면-은 VEGFC 형질전환체에서 세포질에 축적되어야 한다. VEGFP 형질전환체에서, 만약 전구 펩티드가 이끼에서 신호로소 작용한다면, 소포체에서 감지되어야 한다.
형질전환 이끼 세포에서 인간 VEGF121의 발현은 간접적 면역형광법 및 컴퓨터-장착 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 평가되어 졌다. 추가로, 형질전환 이끼에서, VEGF121는 상응하는 인간 전구 펩티드의 존재하에서 성공적으로 소포체로 운반됨을 확인했다.
배양액 내에 VEGF의 존재를 측정
PVP 존재하에 200㎕의 배양액 부분은 ELISA에 의해 측정되었고, 전구 펩티드 인코딩하는 사슬을 포함한 발현 카셋트로 형질전환 시킨 이끼는 배양액으로 VEGF를 분비할 수 있음을 확인했다. 상기 긍정적인 결과는 기능적인 VEGF 단백질이 발현될 수 있음을 개시하는 결론에 이른다.
생물학적 활성 측정
배양액으로 분비된 VEGF 단백질의 생물학적 활성을 확인하기 위해 사용된 상기 두 가지 측정은 긍정적인 결과를 제공했고, 기대했던 생물학적 활성을 가진 VEGF가 본 발명에 따라 생산된 배양액에서 수득될 수 있음을 확인했다.
Claims (6)
- 식물 재료에서 이종 단백질성 물질의 생산 방법에 있어서, 상기 식물 재료로서 프로토네마 이끼의 조직이 이용되고, 상기 단백질성 물질은 조직 또는 세포의 생성을 방해하지 않으면서 배양액으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 단백질 물질의 생산 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 배양액으로 분비된 상기 단백질성 물질은 생물학적으로 활성적인 것을 특징으로 하는 단백질성 물질의 생산 방법.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 상기 배양액은 당분, 비타민 및 식물 성장 호르몬 또는 상기 물질들의 기능성 절편을 포함하지 않음을 특징으로 하는 단백질성 물질의 생산 방법.
- 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이끼 조직은 우산이끼를 포함하는 이끼 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질성 물질의 생산 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 이끼 조직은 피스코미트렐라 (Physcomitrella), 푸나리아 (Funaria), 스파그넘 (Sphagnum) 및 세라토돈 (Ceratodon) 으로 구성된 군의 이끼로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질성 물질의 생산 방법.
- 제 4 항에 있어서, 이끼 조직이 마르찬티아 (Marchantia) 및 스페로카포스 (Sphaerocarpos)로 구성된 군의 우산이끼로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질성 물질의 생산 방법.
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