UA72552C2 - A method for production of heterologous proteinaceous substances in plant material - Google Patents
A method for production of heterologous proteinaceous substances in plant material Download PDFInfo
- Publication number
- UA72552C2 UA72552C2 UA2002043701A UA2002043701A UA72552C2 UA 72552 C2 UA72552 C2 UA 72552C2 UA 2002043701 A UA2002043701 A UA 2002043701A UA 2002043701 A UA2002043701 A UA 2002043701A UA 72552 C2 UA72552 C2 UA 72552C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- protein
- culture
- moss
- cells
- mese
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 claims description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 4
- 235000016626 Agrimonia eupatoria Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000196323 Marchantiophyta Species 0.000 claims description 3
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 claims description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 abstract description 4
- 241000227166 Harrimanella hypnoides Species 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 14
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 8
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 8
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 241000398616 Chloronema Species 0.000 description 5
- 241001102832 Meseres Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 5
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- NGPGDYLVALNKEG-UHFFFAOYSA-N azanium;azane;2,3,4-trihydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O NGPGDYLVALNKEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- MTXSIJUGVMTTMU-JTQLQIEISA-N (S)-anabasine Chemical compound N1CCCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 MTXSIJUGVMTTMU-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NEZONWMXZKDMKF-JTQLQIEISA-N Alkannin Chemical compound C1=CC(O)=C2C(=O)C([C@@H](O)CC=C(C)C)=CC(=O)C2=C1O NEZONWMXZKDMKF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 241001614291 Anoplistes Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 244000102216 Crateva tapia Species 0.000 description 1
- 235000003495 Crateva tapia Nutrition 0.000 description 1
- WDJUZGPOPHTGOT-OAXVISGBSA-N Digitoxin Natural products O([C@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@@](C)([C@H](C6=CC(=O)OC6)CC5)CC4)CC3)CC2)C[C@H]1O)[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 WDJUZGPOPHTGOT-OAXVISGBSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 101100291267 Drosophila melanogaster Miga gene Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000087799 Koma Species 0.000 description 1
- 241001071917 Lithospermum Species 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000690745 Neides Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- UNNKKUDWEASWDN-UHFFFAOYSA-N alkannin Natural products CC(=CCC(O)c1cc(O)c2C(=O)C=CC(=O)c2c1O)C UNNKKUDWEASWDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- WZSUOQDIYKMPMT-UHFFFAOYSA-N argon krypton Chemical compound [Ar].[Kr] WZSUOQDIYKMPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 description 1
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000009529 body temperature measurement Methods 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010277 boron hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- QDPOHAYYMHVFMI-UHFFFAOYSA-N boron;hydrate Chemical compound [B].O QDPOHAYYMHVFMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- 239000001752 chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960000648 digitoxin Drugs 0.000 description 1
- WDJUZGPOPHTGOT-XUDUSOBPSA-N digitoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)CC5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O WDJUZGPOPHTGOT-XUDUSOBPSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002073 mitogenetic effect Effects 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Даний винахід загалом відноситься до одержання білкових речовин з рослинного субстрату. Зокрема, даний винахід відноситься до нового способу одержання бажаних білкових речовин з мохів.
Використання біотехнологічних методів у виробничих цілях дає людині можливість одержувати речовини, які не можуть бути одержані економічними або іншими шляхами, наприклад, хімічним синтезом, і які не доступні в природі в кількості, достатній для взаємодії як сировина. Хоч відомо більше за 10000 вторинних метаболітів рослин, за допомогою культур рослинних клітин на промисловому рівні одержують тільки декілька таких сполук. Ці сполуки є переважно фармацевтично активними вторинними метаболітами.
Прикладами, які можуть бути приведені, є а) берберин (обсяг виробництва становить 4000л), який володіє бактеріостатичною і фунгіцидною дією
ГМ.Ршійа і М.Табрагца в: Ріапі (із5це апа сеї! сийиге, ріапі зсіепсе; том 3, стор.169, С.Е.Огееп еї аї. (Еа.), А.К. І і55
Іпс., Нью-Йорк (1987), р) шиконін (обсяг виробництва 750л), який діє як антибіотик і володіє протизапалювальною активністю
ІМ.Табвагйа їі М.Рційа в: Віотесппооду іп ріапі зсіепсе; стор.207-218, Р.Оау еї аї. (Еа.), Асадетіс Рге55, Орландо (1985))| і с) паклитаксел (обсяг виробництва 75000л), більш широко відомий під назвою таксол, який має протипухлинну активність ІМ.аігі еї аї., Тахиз 5р, сеїІ, їізвце апа огдап сийигез5 аз апегпайме зоцигсев ог їахоїаз ргодисійоп: а Іпегаїге зигуеу, Ріапі Сеї! Тіз5. Огд. Си, 46, стор.59-75 (1996)|.
Більш важливим біотехнологічним методом, в якому використовуються культури рослинних клітин, є біотрансформація дигитоксину в дигоксин, серцевий і циркуляторний лікарського препарат. Таку стереоспецифічну реакцію гідроксилювання успішно проводять в біореакторній культурі Оіднаї5 Іапаїа
ІЕ.Кеїппага і М/.Кгеїз, Кийіміегипд моп рІапліїснеп 2еїПеп іт Віогеакиюог (Ріапі сеї! сийиге іп (пе Бріогеасіог), Віо.
Епдіп.,5, стор.135-136 (1989)| з високим виходом. Сучасні докладні огляди по використанню культур рослинних клітин в біотехнології можуть бути знайдені у ІН.--Р. МипіІрасп, О5е ої ріапі сеї сийиге5 іп Біотесппоіоду,
Віотесппої. Аппи. Кем.,4, стор.113-176 (1998)).
Розробка, методів генетичної трансформації вищих рослин на початку вісімдесятих дозволила значно збільшити продуктивність рослин для специфічних вторинних конструкцій шляхом трансформації генів специфічних ключових ферментів метаболічних шляхів, що розглядаються. Використовувалися не тільки трансгенні інтактні рослини, але також культури рослинних клітин. Приклади, які можуть бути приведені, включають надмірну експресію бактерійної лізиндекарбоксилази в трансгенній культурі кореневих волосків
Місоїапа їарасит, яка збільшує вихід біогенних амінів кадаверину і анабазину до 14 разів І9У.Вегіп еї аї.,
Сепеїййс тоайсайоп ої ріапі зесопдагу теїароїїзт: АкКегайоп ої ргодисі Іємеі5 Бу омегехргевзвіоп ої атіпо асій десагрохуїазев5, в: Адмапсез іп Ріапі Віоіоду, зіцдієев іп Ріапі Зсіепсе, том 4, стор.57-81, О0.0.М. Куц і 5.Ригазакі (Е4.), ЕІвеміег, Амстердам (1994).
Однак можливість перенесення ДНК в рослини не тільки робить можливою кількісні і якісні зміни рослинних конструкцій; крім того, рослини і культури рослинних клітин стають більш цікавими для одержання гетерологічних білків (А.5.Моїаї, Нідп-Тесп ріапів рготіве а битрег сгор ої пем/ ргодисів, Зсієпсе 256, стор.770- 771 (1992)|, за основу були взяті два різних підходи.
Перший підхід включає в себе одержання гетерологічних білків з трансгенних інтактних рослин. Крім одержання антитіл з трансгенних тютюнових рослин |У.К.-С.Ма еї аї., Сбепегайоп апа аззетбріу ої зесгеюгу апіїродіе5 іп ріапі5, Зсіепсе 268, стор.716-719 (1995)), були описані експресія і точний процесінг альбуміну сироватки людини як в трансгенних рослинах тютюну, так і в трансгенних рослинах картоплі (Р.С.5і)топз еї аї.,
Ргодисійп ої соїтесцу ргосеззей питап зегит аІритіп іп їгапздепіс ріапі5, Віо/Теспп.,8, стор.217-221 (19909)|. В трансгенних рослинах тютюну експресувався також епідермальний фактор зростання людини (ПЕСБЕ) (А.-Н.
Заїтапіап сеї аї., Зупіпеві5 апа ехргезвіоп ої Ше депе г питап ерідепта! дгоуми Тасіог іп ігапздепіс роїаю ріапі5, Віоїесппої, Ген.,18, стор.1095-1098 (1996)Ї. Проте, також використовували і інші рослини.
Використовуючи Агарідорзі5 ІШаїйапа і Вгаззіса пари5, успішно одержували Іеи-енцефалін, (Е.Кгеррег» і
У.Мапаекегскпоме, Ргодисійоп ої реріідез5 іп ріапі зееаз, Тіріесп.,8, стор.1-3. (1990)). Крім того, для експресії химерних вірусних часток, які діють як вакцини, використали трансгенні рослини Мідпа ипдиїсціага ІК. Раіздаага еї аї., Ріапі-дегмеа массіпе ргоїесів їагдеї апіта!5 адаїпві а міга! аізеазе, Маї. Віотесп.,15, стор.248-252 (1997)|.
Основною незручністю при роботі з інтактними рослинами, у випадках, описаних вище як приклад, є необхідність їх вирощування, що віднімає багато часу і дорого коштує, а також великий об'єм культивування, необхідний для виробництва в промислових об'ємах. Крім того, для виділення бажаної цільової речовини з інтактних рослин звичайно потрібний складний багатостадійний процес, особливо, коли стабільність і якість продуктів повинні відповідати високим Вимогам, як у випадку з речовинами, що використовуються для фармацевтичних і харчових цілей.
У другому підході для одержання антитіл використовуються культури трансгенних клітин тютюну. Описані, наприклад, експресія антитіл і їх секреція в середовище |ІМ.5.Мадпизоп еї а!І., Еппапсеа гесомегу ої а зесгеївей татктаїйіап ргоївеіп їот 5изрепвзіоп сийиге ої депеїїсаПу тоаїйеа їорассо сеїїв5, Ргої. Ехрг. Риг.,7, стор.220-228 (1996))Ї. Оскільки гетерологічні білки складно виділити з клітин, секреція цільового білка в середовище є значним удосконаленням. Крім того, продукція рекомбінантних фармацевтично важливих білків в культуру клітин також викликає інтерес з точки зору збереження, оскільки трансгенні рослинні клітини можна вирощувати виключно в біореакторах і їх не треба виділяти. Одержання необхідної масової культури можливе завдяки розробці біореакторів для культур гетеротрофних рослинних клітин у великих масштабах Інаприклад,
М.І. 5пшег єї аї., Віогеасіог епдіпеегіпд ах ап епабіїпд Тесппоіоду Юю (ар БіодімегеПйу: Те сазе ої їахої., Апп,
М.У.Асай. 5сі., 745, стор.455-461 (1994)).
Основною незручністю другого підходу, в якій використовуються рослинні суспензійні культури, є низька швидкість росту, відносна низьке утворення вторинних метаболітів, інгібування утворення продукту при високій щільності клітин і, як наслідок, низька продуктивність на об'єм, утворення агрегатів і компонентів клітинної стінки, і зростання чутливості клітин до поперечного зсуву. Також необхідно брати до уваги той факт, що при використанні гетеротрофних клітинних культур завжди повинне використовуватися складне середовище з різноманітними компонентами, деякі з яких є такими, що дорого коштують. Однак самою серйозною незручністю, про яку потрібно згадати, є наявність сомаклональних варіацій в клітинних культурах рослин іп міїго, які викликають кількісні і якісні зміни при одержанні гетерологічних білків (див., наприклад,
М.О.К. Чдопез і К.Сіпазеу, Ріапі Бріоїесппоіоду, в: МоїІесціаг ріоюду апа ріотесппоїоду, У.М.ММаїКег ії ЕМ/.біпд сід (Е4д5.), 2па Еа, Коуаї ос. ої Спет, Тигіпоїоп Ноизе, Лондон (1988)). Гетерогенність продуктів, що утворюються і їх функціональних властивостей недопустима, особливо, в зв'язку з виробництвом фармацевтичних препаратів і інших бажаних речовин, для офіційного схвалення яких потрібна надійна гарантія якості і стандартизація способу виробництва.
Метою даного винаходу, таким чином, є спосіб для стандартизованого виробництва гетерологічних білкових речовин з рослинного субстрату, який істотним чином усуне не тільки описані вище труднощі використання інтактних рослин, але також труднощі використання клітинних культурних систем.
Відповідно до винаходу мета досягається розробкою нового способу одержання гетерологічних білкових речовин з рослинного субстрату, згідно з яким повністю диференційовані мохи вирощують при стандартних умовах і одержані білкові речовини виділяють з культурального середовища по суті без руйнування продукуючих тканин або клітин.
Як тут використовується, термін «білкові речовини» охоплює пептиди, поліпептиди і білки, а також їх фрагменти, які є відповідними, зокрема, для діагностичних, фармацевтичних і харчових цілей. Також він охоплює молекули, які містять пептидні зв'язки і які транслюються рослинним субстратом.
У переважному здійсненні згідно з даним винаходом, бажані гетерологічні білкові речовини вивільняються в культуральне середовище в своїй біологічно активній формі.
Як використовується в даному описі, термін «біологічно активні» означає, що цільові речовини з такою ознакою мають бажані або необхідні функціональні властивості для відповідної мети. Наприклад, якщо бажане одержання антитіл, то одержані білки або їх функціональні фрагменти є біологічно активними, якщо вони здатні здійснювати очікуване специфічне скріплення з антигеном. Фахівцеві в даній області очевидно, що для таких цілей не завжди потрібний нативний білок а можна знайти епітопи або низькомолекулярні структури, які забезпечують бажану біологічну активність або дію. Наприклад, фермент є біологічно активним, якщо він здатний перетворювати свій цільовий субстрат.
В іншому переважному втіленні винаходу, в культуральному середовищі, яке по суті не містить цукрів, вітамінів і фітогормонів або їх функціональних фрагментів, вирощують рослинний субстрат у вигляді інтактних мохів.
Спосіб згідно з винаходом дозволяє вирощувати інтактні і повністю диференційовані рослини в фотоавтотрофних умовах, які можуть бути Стандартизовані, тобто не вимагають додавання цукрів, вітамінів, фітогормонів і тому подібне, як це потрібно для попередньої гетеротрофної суспензійної клітинної системи.
Оскільки використовується недороге і просте поживне середовище, стадії одержання і очищення бажаних цільових речовин значно полегшені.
У способі згідно з винаходом рослинним субстрат, що використовується переважно є інтактний мох, вибраний з групи мохів, включаючи печіночники, з видами родів Рпузсотігеїаг Ропагіа, Зрпадпит і Сегаїодоп, а також Магспапійа і 5рпаегосагро5, які є особливо переважними для використання. Спосіб згідно з даним винаходом найбільш переважно проводити з використанням моху ПТузсотіїгеїЇа раїепв.
У наступному переважному втіленні, конструкція нуклеїнової кислоти, що використовується для трансформації, кодує не тільки бажану білкову речовину, а і транспортний білок для секреції речовини з клітини-хазяїна в культуральне середовище. Відповідно до винаходу можна використати будь-яку аутологічну і гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти, відому фахівцеві в даній області, і її можна використати для одержання експресійної касети для трансформації Продукуючої тканини. Особливо переважним є використання сигнальних пептидів ендоплазматичного ретикулуму сітки або клітинного транспорту.
Проведена згідно з даним винаходом робота показала, що вищезгадана проблема сомаклональних змін, з якою стикаються в клітинних культурах, в фотоавтотрофних рідких культурах мохів не виникає. Крім того, мохи, що використовуються відповідно до винаходу, мають перевагу над іншими системами своєю чіткою зміною суворо визначених стадій диференціювання (хлоронема, каулонема, бруньки, гаметофори), на які можна впливати доданням рослинних гормонів (індол-3-оцтова кислота стимулює розвиток каулонеми, ізопентеніладенін стимулює розвиток бруньок) І(див., наприклад, М.УМ.Азпіоп еї аї., Апаїузіз ої датеїрпуїіс демеюртепі іп Ше то55, РпузсотіїгеЇПа раїепв, изіпд айхіп апа суїокіпіп гезібтапі тшапів, Ріапіа, 144, стор.427- 435 (1979))|. Таким чином, в біореакторних культурах можлива направлена експресія гетерологічних білків в визначеній стадії диференціювання, і особливо переважним відповідно до винаходу є синхронний розподіл чистої і, таким чином, гомогенної культури хлоронеми внаслідок продукції, що контролюється однакового білка в біореакторі і зручності використання гормоно-залежного промотору або промотору визначеної стадії диференціювання.
У доповнення до такої експресійної системи, також відповідно до винаходу можна використати індуцибельну промоторну систему, зокрема, для одержання Ділків з коротким періодом напіврозпаду або які є цитотоксичними, особливо переважним є використання 1"-промотору Адгорасіег чт іштегїасіепв.
Культивування мохів, запропонованих відповідно до винаходу для виробництва гетерологічних білків в економічних перспективах, може здійснюватися, наприклад, з використанням РПузсотйгенйа в об'ємах з порядками величини від 20мл до бл-10л і вище у культурах, що струшуються або в аерованих скляних ємностях |див., наприклад, К.Кезкі, 2еїІ-ипа тоіеКкшагтіоіодізспе Опіеггиспипдеп аег суюкКіпіп-іпаигієграгеп
Семжереадійетгепліепипуд па СПіогоріазієпієїшпу беі РПпузсотійейа раїєп5 (Нейм.) В.5.25., (СеїІ- апа тоїіесшміагтіоіодіса! зішаїев ої Те суюкКіпіп-іпдисіріе їїззце айегепбайноп апа спіогоріаві аїмівіоп іп Рпузсотітгейна раїеп5 (Нейм/.) В.5.5.), Р.О. ІПпевзі5, Університет Гамбурга (1990))Ї. Оскільки використовується культура диференційованих фотоаутотрофних рослин, середовище не потребує ні додання рослинних гормонів, ні вітамінів, ні цукрів. У порівнянні зі складним середовищем, яке потрібно, наприклад, для культур тваринних клітин, вартість знижується в 100 раз. Відповідно до винаходу було з'ясовано, що вихід біологічно активного гетерологічного білка в культуральному середовищі може бути збільшений в 35 раз в присутності ПВП, ось чому в способі згідно з винаходом переважне використання ПВП в культуральному середовищі.
Докладна інформація по культивуванню в біореакторах інших мохів, які є придатними відповідно до винаходу, таких як, наприклад, І еріобгут ругіютте і Зрпадпит тадеїІапісит, описана в попередньому рівні техніки (див., наприклад, Е.УМІреп, Віоїесппоіодізспе 5іщшаїєп 2йиг Маззепкийшг моп Моозеп ипіег резопаегег
Вепісквіспіїдипод дев Агаспідопзацйгевіоїпмеснзе!5 (Віотесппоіодіса! вішаїез сопсегпіпуд (Ше тав5 сиЇшге ої тов5ев м/п рапісцшіаг сопзідегайоп ої їШе агаспідопіс асій теїтароїїзт), РП.О. (Шпевзі5, Університет Майнца (1991);
Н.Еодоїірп і 5.Казтивзеп, Зіцадіе5 оп зесопдагу теїароїїзт ої 5Зрпадпит сийімасей іп Біогеасіог5, Сгурі. Вої,3, стор.67-73 (1992))Ї. Особливо переважно для цілей згідно з даним винаходом використання Рпузсотіїге|Іа, зокрема, оскільки всі стандартні молекулярно-біологічні методи створені для цього організму (див. огляд
Е.Кезвкі, ОемеІортепі, депеїїс5 апа тоїесшіаг рБіоіоду ої то55ев, Вої. Асіа, 111, стор.1-15 (1998)).
Відповідні трансформуючі системи були розроблені для біотехнологічного використання РпузсотіїгеІа для одержання гетерологічних білків. Наприклад, проводилися успішні трансформації за допомогою прямого перенесення ДНК в протонемну тканину, використовуючи бомбардуючу частками гармату. Також може успішно застосовуватися перенесення ДНК в протопласти моху, зумовлене ПЕГ. Цей метод трансформації був неодноразово описаний для РПузсоптійгейа і приводить як до тимчасових, так і до стабільних трансформантів |див., наприклад, К, Кешцег апа ЕК. Кезкі, Ргодисіоп ог а пеїегоїодои5 ргоївіп іп Біогеасіюг сийигез ої ТиПу айегепііата тов5 ріапів, РІ. Тізвце сийиге, (Ф Віотесп.,2, стор.142-147 (1996)|.
Хоча даний винахід головним чином підходить для одержання будь-якої білкової речовини, одержання фармацевтично важливого білка тут демонструється на прикладі людського фактора росту ендотелію судин (МЕС).
МЕСБЕ був уперше виділений М.Ре!тага і МУ.9У. Непге! (Рішйагу тоПісцшіаг сеї зесгеге а поме! перагіп-ріпаїпоа дгоулй Тасіог зресійс гог мазсшаг епадоїНеїа! сеїіз, Віоспет. Віорпуз. Вез5. Соттип.,161, стор.851-858 (1989)| і описаний як регуляторний фактор, контролюючий ангіогенез і розподіл ендотеліальних клітин при нормальних фізіологічних умовах (М. Реїтага еї аїЇ,, Тпе мазсшаг епаоїпеїйа! дгоулп Тасіог Ттатіу ої роїуреріїде5, .СеїЇ.
Віоспет.,47, стор.211-218 (1991)). Автори також продемонстрували, що цей фактор росту володіє високою специфічністю до ендотеліальних клітин судин і неактивний по відношенню до інших типів клітин. МЕСЕ являє собою гомодимерний глікопротеїн, пов'язаний дисульфідними містками. Відомі чотири різних форми людського МЕС. Чотири ізоформи мають протяжність в 121, 165, 189 і 206 амінокислот і утворюються альтернативним сплайсінгом РНКуєсє, МЕСЕгов виявлений тільки в кКДНК печінці зародка, а транскрипти
МЕС 21, МЕРЕ ів5 і МЕСЕ:в5 виявлені в більшості пухлинних клітин і пухлинних тканинах. Хоча все ізоформи
МЕСЕ мають лідерну послідовність для секреції, ефективно секретується тільки дві найменші форми (див., наприклад, б.Магіпу-Вагоп і О.Магте, МЕСЕ-теаіагеа шШтог апдіодепезвів: А пем/ їагдєї г сапсег Шегару, Ст.
Оріп. Віотесппої!.,б, стор.675-680 (19953).
Досі потрібні адекватні кількості МЕСЕ як для розвитку і удосконалення існуючих підходів в терапії пухлин, так і для вивчення МЕСБЕ. На ранніх стадіях роботи, проведеної в контексті даного винаходу, єдиним описаним було рекомбінантне одержання МЕСЕ в клітинах комах за допомогою бациловірусної експресійної системи
Інаприклад, В.І..Ріерісп еї аїІ., Зупіпезі5 апа аззетбріу ої Тшпс(опаПу асіме питап мазсшціаг епдотеїа! дгоУли тасіог потодітегз іп іпзесі сеїІ5, Ецг. У.Віоспет., 211, стор.19-26 (1993)). (Засспаготусев сегемівіає (5.Копао еї аі.,, Те в5Погезі ізоїопт ої питап мазсшаг епдоїнеїа! дгомли Тасіог/хазсшаг реппеарійу тасіог (МЕСЕ/УР Еі21) ргодисеа ру Засспаготусез сегемізіає рготоїез Броїп апдіодепевзів апа мазсшаг регтєабіїйу, Віоспіга. Віорпуз.
Асіа, 1243, стор.195-202 (1995)), дріжджі Ріспіа равіогіз (О.Мопапга)ї еї а!І., Ехргезвіоп ої ріоіодісаПу асіме питап мазсшаг епаоіїпеїїа! доли Тасіюг іп Уеаві, СтгоумА Тасіогв5, 12, стор.17-27 (1995)) і (Езспегіспіа сої (5. Зіетеівіег еї аї., Ехргезвіоп ої ріоіодісаву асіїме ізоїогтв ої (Ше Штог апдіодепевів Тасіог МЕСЕЕ іп ЕзсПегіснпіа соїї, Віоспет.
Віорпуз. Ке5. Соттип., 222, стор.249-255 (1996) є додатковими продукуючими організмами. У всіх цих рекомбінантних системах був одержаний біологічно активний МЕСЕ. Однак експресійна система Е.соїї ускладнена у відношенні очищення і відновлення білка, оскільки останній упакований в тільця включення.
Приклади
Короткий виклад
Розробка масових культур, що контролюються Рпузсотіїге Іа раїеп5 (Кешнег апа Резкі, Іос. сії.) і способів перенесення ДНК в мох РпузсотіїгеПйа рагепз (К.Кешег, Ехргезвіоп пейгегоіїодег Сепе іп РпузсотіїгеїПа расгеп5 (Неайм.) 8.5.2. (Ехргезвіоп ої Пефегоїюдои5 депеб5 іп РПузсотійеМйа раїеп5 (Нейм.) В.5.2.), РИ.О. (Певів,
Університет Гамбурга (1994)| створює основні передумови для біотехнологічного використання цієї рослини.
Робота, проведена спочатку, показала довготривалу стабільність інтеграції, використовуючи трансгенні лінії РпузсотійгеПйаї одержані від КешНег (ос. сії, 1994). Експресія гетерологічних генів прі І ї див, які використовувалися як приклад для цієї мети, після чотирьох років досі виявляється.
Була оптимізована біореакторна культура РпузсотігеМПа. Була розроблена мішалка, яка здійснювала подрібнення протонем і, таким чином, забезпечувала необхідну гомогенність культури при постійних швидкостях 300-50006./хв. Таким чином, стало можливим стандартизувати взяття зразків. У той же час, поступаюче повітря розподілялося більш рівномірно в рідкій культурі. При цих умовах було показано, що утворення біомаси і білка без регуляції рН ззовні проходило так само, як при регуляції рН; несподівано виявилося, що регуляція, отже, не потрібна. Щотижневу продукцію біомаси, 500мг сухої ваги або 22мг загального білка на літр, одержували в напівсерійних умовах. Це означає збільшення продуктивності біомаси в п'ять разів в порівнянні із звичайними культурами в 5-літрових скляних колбах. Зниження концентрації солі середовища Кноп на одну десяту частину приводило до тих же даних і, таким чином, до зниження вартості.
Додання 5мМ тартрату амонію прискорювало розвиток біомаси через скорочення лаг-періоду. Одночасно, додання тартрату амонію давало культури, які включали фактично тільки хлоронемні клітини. Було показано при допомозі проточної цитометрії, що фактично сто процентів клітин в цих культурах знаходилися в 52/М фазі клітинного циклу. Цей результат був підтверджений додатковими фізіологічними дослідженнями з ауксином і дослідженнями з мутантами визначеної стадії диференціювання гаї! 12 і саї! 13, і були зроблені висновки, що каулонемні клітини велику частину часу знаходяться в (31/50 фазі, в той час як хлоронемні клітини знаходяться переважно в 52/М фазі.
Як можливий індуцибельний промотор моху розглядався 1'-промотор агробактерій. Як маркерний ген використовувався ген р-глюкоронідази (ди5). У тимчасово трансформованих протопластах моху (рівень трансформації - Зх107), після індукції 5хмкМ індол-З-оцтовою кислотою спостерігалася експресія гена див. В жодному контролі експресії не спостерігалося.
Ген 121 амінокислотної сплайсованої форми людського фактора росту ендотелію судин (МЕСЕ121) трансформували в РПузсотйгейа з рівнем трансформації 0,5х109 їі 3,3х105, Потім, ген клонували за конструктивним промотором 355 і в трансформуючий вектор рКТ99, який придатний для рослин. У другому підході, додатково клонували послідовність, що кодує відповідний транспортний білок ЕК людини. Піддаючи одержані стабільні трансформанти Зоцшіпегп-аналізу, підтверджували інтеграцію гетерологічної ДНК і описували тип інтеграції. Моїпегп-аналіз підтвердив присутність прі! і двох транскриптів МЕСЕ в цих трансформантах. Експресія МЕОР 121 в клітинах моху була показана опосередкованою імунофлуоресценцією.
Білок однозначно локалізувався в клітинах, що було показано за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа. Для трансформантів без транспортного пептиду ці дослідження показали, що білок локалізований, зокрема, в цитоплазмі. У трансформантах, що містять транспортний пептид ЕЕ, білок може знаходитися в області ядра і в апікальних областях апікальних клітин, областях з дуже високим вмістом ЕВ.
Біологічну активність гетерологічного білка, одержаного відповідно до винаходу, перевіряли за допомогою аналізу ЕГІЗА і двох аналізів на функціональну активність, використовуючи білок МЕСЕ, одержаний з поживного середовища.
Матеріали і методи:
Якщо інакше не указано в тексті, хімічні сполуки, що використовуються були чисті для аналізу і їх одержували від Ріка (Меи-ШІт), Мегск (Оагтеїадю, Коїп (Кагізгипе), зегма (Неїде!рего) і зідта (Оеєізеппотеп).
Розчини готували на очищеній, апірогенній воді, тут позначеній як НгО, з системи водного очищення МіїЇ-
О (МіПроге, Евспрогп).
Рестрикційні ендонуклеази, ферменти, що модифікують ДНК, і біологічні набори одержували від АС5 (Неїдеірего), Атегепат (ВгайпесНпмеїд), Арріїей Віозузієте (УУейегеїтай), Віотеїйа (Соціпдеп), Воепгіпдег
Маппнєїт СтьЬН (Мапппєїт), сСепотеа (Вай Оєупнаизеп), Мем Епдіапа Віоїабз (Зспмаірасп/Тайпив), Момадеп (Мадізоп, М/ізсопвіп, ОА), Рпагтасіа (Ргеіригоу), Оіадеп (Ніідеп) і зігаїадепе (НеїідеІрегд). Якщо не визначено інакше, їх використовували відповідно до інструкцій виробника.
Вектори і конструкції
Плазміда РСУТЕХР-МЕСЕЕ 21 є похідною плазміди Ресуїехр!1 |Т.М.Веїем сеї а!., А пу тоадшіаг месіог зувіет ог
Ше оріїтігайноп ої депе ехргезвіоп іп ЕзсПегісніа соїї, Ріазтійд, 26, стор.147-150 (1991)), в яку інтегрували КкКДНК людського МЕСЕ т для експресії в Е. соїї. Використовуючи рестрикційні ендонуклеази Маєе І і за! І з РСМТЕХР-
МЕС 21 вирізали КкКДНК МЕСЕ 21, очищали, робили їй тупі кінці і клонували в рестрикційний сайт Зта | рКТ101
ІА. Торгег еї аї., А зеї ої ріапі ехргевзвіоп месіогз5 г (гапзсгіріопаї! апа ігапзіайопаї! тивіоп5, Мисієїс Асіаз Нев., 15, стор.5890 (1987)| між промотором 355 і поліаденільованою послідовністю Саму. Одержану таким чином касету знов розрізали Ніп аїйІ, ії клонували в сайт рестрикції Ніп аїїї трансформуючого вектора ркТ99. рКкт99 містить не тільки полілінкерний сайт рестрикції, але також ген фосфотрансферази неоміцину під регуляцією промотору 355 і відповідну поліаденільовану послідовність Саму (ГЕК.Торгег еї аї., Мегзайе сіопіпуд месіог5 Тог
Ігапзіепі депе ехргеззіоп апа аігесі депе ігапвтег іп ріапі сеїІ5, Мисіеїс Асіаз Кев., 16, стор.8725 (1988)). Цей ген дає стійкість до антибіотика 5418 стабільно трансформованим рослинам. Плазміди реплікувалися в штамі
ОН5бБо Езспеїпсніа сої (У.Затьгоок еї аї., МоІесціаг сіопіпд: а Іарогаїюгу тапиа!, Соїй бріїпд Натбог І арогагу
Ргезз, Нью-Йорк (1989)).
Використовуючи рестрикційні ферменти Ват НІ і Воді ІІ, кКДНК вирізали з вектора рМЕ-121, який був спочатку створений для експресії МЕОР 121 в клітинах комах і який крім послідовності МЕСЕ 21 включає ДНК, що кодує природний транспортний пептид, який, в свою чергу, в системі тваринних клітин опосередковує секрецію в середовище з ендоплазматичного ретикулуму (ІРіерісп еї аї., Зупіпезіз апа аззетбріу ої псійопаПу асіїме
Ппитап мазсшіаг епаоїПпеїїа! дгоули Тасіог потодітегв іп іпвзесі сеї, Еиг. )У.Віоспет., 211, стор.19-26 (1993) і, використовуючи рКТ101, клонували в рКТ99 і перевіряли.
Плазміда рМА201 є похідним бінарного вектора рВІ101 ГА.Е.ОУейПегзоп еї аї!., Аззауїпд спітегіс депез іп ріапіє: Те БИ5 депе Ти5іоп зузіет, Ріапі Мої, Кер., 5, стор.387-405 (1987)). Як селективний маркер рослин вона містить ген прі під нопалінсинтазним промотором. Ген ди5, який також присутній, регулюється 1'- промотором Адгобасіегічт (штегасіеп5. РМА201 зручний для прямої трансформації РпузсотіїгеПа раїепв.
Антитіла
Використали два різних антитіла проти білка МЕСЕ. Першим антитілом було кроляче анти-МЕСЕ антитіло, направлене проти синтетичного пептиду, відповідного 1-20 амінокислотам нативного людського МЕСЕ (Рієерісп еї аї., Іос. сії. (1993)). Другим антитілом було моноклональне мишаче антитіло проти людського білка МЕОЕ 121 (880 бБузієетв, У/езрадеп).
Рослинний субстрат
Використовувався штам дикого типу моху Рпузсотіїгеїа раїепз5 (Нейм/.) В.5.0., який був взятий з колекції
Сепеїййсз Сгоир при Оерагтепі ої Сепега! Воїапу, Університет Гамбурга. Його джерелом є штам 16/14, який знаходиться в колекції Н.Г.К. УМпйепоцбзе в Сгапзаеп Умосйа, Нипііпддопзпіге (Англія) і був субклонований з спори.
Штам дикого типу вирощували або у вигляді рідкої культури із середовищем Кпор ІК.Кезкі і УМ.О.Абеї,
Іпаисіоп о ої Ббидапо опо спіогопетайа апа саціопетайа ої Ше ото55, РНузсотійгейа раїєпв5, ивіпд ізорепіепуЇІадепіпе, Ріапіа, 165, стор.354-358 (1985)), або на твердому середовищі з 195 агаром Охоїа (Опірайй,
ВазіпозіоКке, Англія). Рідкі середовища одержували, як описано у Кезкі (ос. сії., 1990)|.
Біореакторна культура
Для масової культивації, рослинний матеріал вміщували в 7-л круглодонні скляні колби біореактора,
оснащеного подвійною обшивкою (Арріїкоп Віоїек, Кпиїїм"аІ(й). У системі біореактора зверху через отвір в кришці в об'єм культури вводили конденсатор з повітряним охолоджуванням для відведення газу, аераційну трубку, рН-електрод (Сопашсіа, Сепіпдеп), температурний датчик, пристрій для перемішування, трубку для взяття проб і входу для кислоти, основи і середовища. Для культур встановлювали температуру 25"С і контролювали її за допомогою відповідно відрегульованої водяної бані, яка приєднувалася до подвійної обшивки. ВУ експерименті, який проводили з регулюванням рН, рН підтримували постійним при 5,8 за допомогою одиниці титрування. Температурні вимірювання і регулювання рН проводили за допомогою
ВіосопігоПег АСІ 1030 (Арріїкоп Віоїек, Кпиїїм'а(4). Швидкість мішалки можна змінювати регулювальником частоти обертання А0І 1012 (Арріїкоп Віоїек, Кпиїм'а(4). Поживне середовище постійно аерували 1 баром повітря через пористий вдуваючий елемент. Для забезпечення стерильності в колбі з культурою всі трубки, що відводять, і всі, що підводять були забезпечені пристроєм для стерилізації фільтрацією (міаізат, 0,2мкм;
Бапогіх, Сойціпдеп). Біореакторну культуру вміщували в камеру з контролем клімату і бічним освітленням (біле світло; Озгат І. 40 М//20; максимально 100мкмоль"м). Культуру інокулювали 0,5-1г сирого рослинного субстрату на літр культури біореактора в стерильних умовах. Трубка для взяття зразків знаходилася на одному рівні з мішалкою, таким чином, гарантуючи одноманітність відбору зразків під час перемішування.
Невеликі по кількості зразки («100мл) відбирали стерильним шприцом через з'єднання типу І цег-іосК, в той час як великі зразки відбирали з допомогою, наприклад, перистальтичного насоса типу З 02/3А, оснащеного головкою 501 КІ (Запогіи5, соніпдеп).
Хлоронемну культуру дикого типу одержували при доданні в середовище Кпор 5мММ тартрату амонію.
Вихід біологічно активного секретованого гетерологічного білка може бути істотно підвищений в присутності в поживному середовищі стабілізатора полівінілпіролідону (ПВП).
Диференціювання каулонеми, яке починається в процесі розвитку протонеми, може бути індуковане і посилене доданням ззовні фізіологічних кількостей ауксину, у відповідних концентраціях, що становлять, наприклад, 5мкмоль/л індол-3-оцтової кислоти (ІК).
Для забезпечення тиску відбору в рідкій культурі трансформантів додавали 5Омг/л антибіотику 5418 (СаІріоспет, Вай Зодеп) в середовище Кпор. Нарешті, безпосередньо перед подрібненням кожні десять днів культуру видаляли фільтрацією через стерильний 100мкм решітковий фільтр (М/Іб5оп Зіеме5, Моціпдпат,
Англія) і переносили в колби Ерленмейера, наповнені селективним середовищем.
Для експериментів з одержанням поживних елементів, середовище Кпор розводили 1:10 водою.
Трансформація
Вибраний спосіб трансформації являє собою ПЕГ-опосередковане пряме перенесення ДНК в протопласти, як описано у Решйцег і Резкі (Іос. сії, 1996). Для кожної трансформації на 3х105 протопластів використовували 5О0мкг плазмідної ДНК. Оновлення протопласта і відбір стабільних трансформантів проводили, якщо не указано іншого, як описано у Кешйцег і Кезвкі (Іос. сії, 1996).
Опосередкована імунофлуоресценція
Буфер: М5В: 100мМ РІРЕ5; 5-10ММ ЕСТА, 5мМ Мао», рнеб,в
Е-М5В: М5В-595 ДМСО
Е-М5В: М5В-596 ДМСО 595 Мопідеї
МІ-М5В: М5В розбавлений 1:2 НгО (промивальний буфер)
Ферментний розчин: 195 целюлоза, 195 пектинази, 295 дризелази в М5В, рН5,б (все від 5ідта,
Овєїзеппоїеп)
Протонему моху фіксували в 1,2595 глутаровому альдегіді з Е-М5В (об/об), інкубували більше 10 хвилин і швидко промивали М/-М5В. Потім протонему інкубували 40 хвилин з 2906 параформальдегідом в МОВ (об/об) і
З рази промивали МУ-М5В (1 раз полоскали; 2 рази промивали по 5 хвилин).
Вільні альдегіди, які можуть бути не видалені промивкою, видаляли доданням М5В і твердого гідрату бору на кінчику шпателя і інкубували протягом 10 хвилин. Три рази промивали М/У-М5В для видалення гідриду бору.
На наступній стадії, для проникності клітинних стінок додавали ферментний розчин і інкубували 10 хвилин.
Ферментну реакцію переривали зміною рН (М5В, рнб,8). Суміш знов промивали З рази М/-М5В.
Хлорофіли екстрагували інкубацією з розчином детергенту протягом 120 хвилин. Розчин потім видаляли, промиваючи три рази МУ-М5В.
Після такої підготовки, протонему моху можна інкубувати з першим антитілом (анти-МЕСЕ; розбавлення 1/50). Інкубували при 37"С протягом 45 хвилин. Після трьох промивок МУ-М5В, додавали мічені другі антитіла (антикролячі або анти-мишачі; розведення 1/30; мічені флуоресцентним ізотіоціанатом (ФІТЦ) (Моїіесшаг
Ргобрев, І еідеп, Меїпепіапав5)), і інкубували протягом 45 хвилин при 37"С. Додатково до стадії 3-х промивок, описаної вище, суміш один раз промивали М/-М5В--0,195 Тгйоп. Протонеми потім переносили в М/-М5В і зберігали при 4"С, принаймні, протягом ночі.
Речовину оцінювали за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа (СІ ЗМ) типу ТОо5 40 (Геїіса І азепесппік, Неїдеїрего) і програмного забезпечення Зсапулаге 5,0 (І еіса І азепесппік, НеїдеІрего).
Для аналізу зразків з допомогою СІ ЗМ, їх вміщували на предметне скло в закріпляючий розчин (Оарсо, бідта, Оеїзеппоїеп). Збудження флуоресцентного барвника ФІТЦ, приєднаного до другого антитіла, здійснювали аргон-криптоновим лазером при довжині хвилі 488нм. ФІТЦ випускає світло при довжині хвилі 528НнмМ.
Аналіз ЕГІЗА
МЕСЕ білок в культуральному середовищі, який утворюється у відповідно трансформованих рослинах моху, якісно і кількісно визначали звичайними методами, використовуючи аналіз ЕГ І5А і вищезгадані антитіла.
У аналізі ЕГІЗА безпосередньо використали 200мкл культурального середовища.
Аналізи функціональної активності
Біологічна дія рекомбінантного МЕСЕ, одержаного з культурального середовища, перевіряли в мітогенетичному аналізі (Міуагопо еї аї., Ригітісайоп апа ргорепіє5 ої ап епдоїпеїїа! сеїЇ дгоуЖи Тасіог тот питап ріасеїеї5, У. Віої. Спет., 262, стор.4098-4103 (1987)| і в «аналізі ангіогенезу 13-денної хоріон-алантоїдной мембрани» (ММікіпд еї аІ., А тогрпоіодіса! зішау ої Ше гаррії согпеа! аззау, Апаї. Етбгуо!., 183, стор.1167-1174 (1991)). Культуральне середовище заздалегідь піддавали ультрафільтрації, потім ліофілізували і згодом ресуспендували в буфері. Якщо бажано, як додаткову стадію очищення можна використати катіонну колонку.
Індукція 1-промотора
Здатність до індукції ауксином 1"-промотору аналізували 5мкмоль/л індол-3-оцтової кислоти (ОК). Через п'ять днів після трансформації 100мкл протопластних аліквот з реакції трансформації з РМА2О1 переносили в 96-лунковий мікротитрувальний планшет (Мипс, У/езрадеп). Протопластні суспензії культивували протягом п'яти годин з ІОК (кінцева концентрація «5мМкМ). Експерименти з індукцією оцінювали безпосередньо після періоду інкубації якісним аналізом р-глюкуронідази.
Якісний аналіз ВД-глюкуронідази
В якісному аналізі визначали активність В-глюкуронідази (А.К. Уепегзоп, А5зауїпд спітегіс депевз іп ріапів:
Тпе 6И5 депе Тизіоп зузіет, Ріапі Мої. Кер.,5, стор.387-405 (1987)|.
Субстратний буфер: 50ММ КзБе(СМ)є воММ МагНРО»Х 50мММ КАРе(СМ)е 1965 (06/06) Топ Х-100 50мММ МанНгРО4 10мММ ЕОТА, рН 7,0 4мг/млІ ВП(М.м. 10000)
Забарвлюючий розчин: 12,5мг 5-бром-4-хлор-3-індоліл-люкуронової кислоти (Віотої, Гамбург) розчиняли в 250мкл М,М- диметилформамід/50мл субстратного буфера
Протонеми моху і протопласти моху в середовищі Кпор або відновлювальному середовищі інкубували до 72 годин при 37"С з рівним об'ємом забарвлюючого розчину і після цього негайно оцінювали під мікроскопом.
Результати
Гомогенність біореакторної культури; взяття зразків
Тільки гомогенні культури забезпечують стандартизацію відбору зразків з клітинної культури. Після тривалого культивування, зростання протонеми в довгих клітинних філаментах часто приводить до агрегації клітин і, таким чином, до негомогенного розподілу рослинного субстрату в рідких культурах. Щоб уникнути такої агрегації, протонеми подрібнюють через певні проміжки часу - в біореакторі через день, починаючи з 10 дня, а у культурі що струшується через кожні 12 днів - використовуючи високошвидкісні мішалки/гомогенізатори. Для здійснення постійних умов в біореакторі поряд зі стандартизацією відбору зразків навіть після тривалого періоду культивації, рекомендується модифікувати трилопатеву турбінну мішалку шляхом заточування граней лопатей мішалки, таким чином перетворюючи їх в ножову поверхню. Постійне «перемішування» при 300-500о06./хв., таким чином, робить можливим роботу з гомогенними біореакторними культурами.
Розвиток біомаси (в ОМ/ (мг/лІ) понад 35 днів (840 годин) при 500об./хв. в контрольних культурах з турбінною мішалкою і в біореакторних культурах, що перемішуються мішалкою з ножовою поверхнею, однакове.
У кожному разі гомогенність культури оцінювалася порівнянням шести паралельних зразків. Суху вага рослинного субстрату із зразків об'ємом 100мл визначали як параметр порівняння. При використанні немодифікованої турбінної мішалки, середньоквадратичне відхилення збільшувалося при збільшенні концентрації біомаси. Як наслідок перемішування мішалкою з ножовою поверхнею, середньоквадратичне відхилення взятих зразків залишалося низьким. Це дозволяє зробити висновок, що одноманітна гомогенна культура, зростаюча більше 35 днів, може бути одержана при використанні модифікованої мішалки.
Дослідження здатності до індукції 1--промотору
В плазміді ОМА201, 1"-промотор знаходиться перед геном диз і діє як регулюючий елемент. Відомий аналіз
В-глюкуронідази є придатним як детекторний аналіз для експериментів по індукції з мохом. Експерименти з трансгенним тютюном показують, що в тканині з високим вмістом ауксину 1"-промотор приводить до експресії
В-глюкуронідази, і тому робиться висновок, що цей промотор є ауксин-залежним. Здатність до індукції ауксином 1-промотору в РПузсоптйгейа раїеп5 досліджувалася в транзисторних протопластних трансформантах.
Реакції трансформації піддавали аналізу ВД-глюкуронідази при (5год.) і без інкубації з 5ММ індол-3-оцтовою кислотою (ОК). У контролях без додання ІОК не виявлялося синіх протопластів в будь-якій з реакцій. Навпаки, оцінка протопластів, інкубованих з ауксином, підтверджувала експресію гена ди5. Засновуючись на підрахунку синіх протопластів, рівень трансформації досягає Зх107, Очевидно передбачити, що у тимчасово трансформованих протопластах моху 1"-промотор індукується рослинним гормоном ауксином.
Одержання трансформуючих векторів для продукції МЕСЕ
У РПузсотійгеМПйа для трансформації К«ДНК МЕСЕ 21 без лідерної послідовності, позначеної тут і далі як
МЕСЕС, і кКДНК МЕС 21 з лідерною послідовністю, позначеною тут і далі як МЕСЕР, необхідно клонувати послідовності між промотор/термінаторною одиницею, відповідною для рослин. Для цієї мети вибрані промотор 355 Самм і відповідний сигнал поліаденілювання. Відповідним чином одержана послідовність
КОМА»Уєсе клонується в рестрикційний сайт Зта І полілінкерного сайту рестрикції вектора рКТ101.
Одержані вектори (рКТ101МЕСЕС 3 і МЕСЕР 21) секвенували з праймером, одержаним з термінальної області промотору 355, і перевіряли правильність інтеграції між промотором і сайтом поліаденілювання.
Одержані касети вирізали ферментом рестрикції Ніп ай! ії клонували в функціональний трансформуючий вектор рКТ99 в Ніп аї! сайт (РЕТ99МЕСЕС З і МЕСЕР 21). Орієнтація касет відносно МРТІЇ касети може бути визначена рестрикцією Зта І! і Ніпс ІІ. У разі орієнтації промотор-сигнал поліаденілювання одержували фрагменти 5250 (МЕСЕС) і 5380 п.н. (МЕОРЕР), в той час як у випадку зворотної орієнтації одержували фрагменти 1100 (МЕСРС)/1230 (МЕСЕР) і 4150п.н. (МЕСЕ і Р). Ретстрикційний аналіз показав тільки 5250/5380п.н. фрагмент, і, тобто, МЕСЕ/Р касети відносно гена прі! реЕТ99 були вбудовані з орієнтацією промотор-сигнал поліаденілювання.
Трансформація МЕСЕС в РпузсотійгеПа
Після неодноразової заміни середовища Кпор селекційним середовищем абсолютний рівень трансформації для трансформації конструкції МЕСЕС в протопласти дикого типу з постійними стабільними трансформантами дорівнював 0,5х105.
Демонстрація інтеграції трансформуючої плазміди
Успішна інтеграція в геном рослини демонструвалася ЗошПегп-гібридизацією.
Використовували зонди, по-перше, фрагмента Мсо І гена прі ІІ з рКкТ99 і, по-друге, фрагмента пае 1/заї
МЕСЕС рСУТЕХР-ЮЖХЕСЕ 21.
Для підтвердження успішної інтеграції плазмідної ДНК в геном рослини визначали сигнали у всієї нерозрізаної ДНК трансформантів. Будь-яку з всіх одержаних касет 355 МЕСЕС РОЇУА, навіть після інтеграції, тестували рестрикцією Ніп аїІї. Якщо касета залишилася непошкодженою при інтеграції, цей фермент вирізав з всієї ДНК фрагмент з 1100п.н.
Для всіх трансформантів профіль гібридизації із зондом МЕСЕС виявляв фрагмент з 1100п.н. Таким чином, була показана інтеграція повної одиниці експресії МЕСЕС, необхідної для правильної транскрипції і експресії МЕОГР 21 у моху.
Демонстрація транскрипції гетерологічних генів
Транскрипти гетерологічних генів МЕСЕС і МРТІЇ трансформантів виявляли нерадіоактивною системою детекції РОЕТ, використовуючи зонди МЕСЕ і МРТ ІІ. Виявлені на флуорограмі розміри транскриптів, 760 нуклеотидів для МЕСЕС транскрипту і 1100 нуклеотидів для МРТ ІЇ транскрипту, знаходяться в межах порядку величини, очікуваної для кожного випадку. Як і очікувалося, жоден з двох гетерологічних транскриптів не був виявлений в М/Т контролі.
Аналіз трансформантів з людським транспортним пептидом
При ПЕГ-опосередкованому перенесенні ДНК, 50мкг рКТ99Р 21 плазмідна ДНК на реакцію трансформації, одержували постійно стабільні на селекційному середовищі трансформанти. Рівень стабільних трансформантів становив 3,3х1075,
Демонстрація інтеграції трансформуючої плазміди
Інтеграція вищеописаних трансформантів з транспортним білком демонструється з допомогою Зошпет- гібридизації, як описано вище, з використанням описаних зондів, а гібридизацією всієї ДНК, розрізаної Ніп ап, із зондом МЕСЕ виявляється фрагмент 1230п.н.: демонстрація повної інтеграції касети 355 МЕСЕР РоО/уА.
Демонстрація транскрипції гетерологічних генів
Як МРТІЇ, так і МЕСЕР транскрипти можуть бути виявлені методом, описаним вище.
Виявлення людського МЕОР 121 в трансгенних клітинах моху з використанням конфокального лазерного скануючого мікроскопа
У цьому методі білок, що тестується був мічений безпосередньо в закріплених клітинах. Оцінку проводили під конфокальним лазерним скануючим мікроскопом, який має поліпшену розрізнювальну здатність в порівнянні із звичайним оптичним мікроскопом.
Рекомбінантний білок МЕСР 121, якщо він виявляється в клітинах моху, повинен скупчуватися в цитоплазмі
МЕСЕС трансформантів. Якщо транспортний пептид у моху працює як сигнальний, то в трансформантах
МЕСБРЕР він повинен виявлятися в ЕК системі.
Експресія людського МЕС 121 в трансгенних клітинах моху була успішно продемонстрована методом опосередкованої імунофлуоресценції і оцінкою, що виконується за допомогою комп'ютера, конфокальним лазерним скануючим мікроскопом. Крім того, було показано, що в трансгенному моху, в присутності відповідного людського транспортного пептиду МЕСР1і21і1 успішно транспортується в ендоплазматичний ретикулюм.
Аналіз на присутність МЕСЕ в культуральному середовищі
За допомогою ЕГІБА аналізували 200мкл аліквоту культурального середовища з доданням ПВП і показали, що рослини моху, трансформовані експресійною касетою, що включає послідовність, що кодує транспортний пептид, здатні до вивільнення МЕСЕ в середовище. Позитивні результати дозволили зробити висновок про присутність функціонального білка МЕСЕ.
Аналіз біологічної активності
Обидва аналізи, що використовуються для перевірки біологічної активності МЕСЕ білка, що вивільняється в культуральне середовище, дають позитивні результати і підтверджують, що МЕСЕ, одержаний відповідно до винаходу, може бути одержаний з поживного середовища з бажаною біологічною дією.
Claims (6)
1. Спосіб одержання гетерологічних білкових речовин з рослинного матеріалу, який відрізняється тим що, як рослинний матеріал використовують протонему тканини моху, причому білкові речовини одержують з культурального середовища без пошкодження продукуючих тканин або клітин.
2. Спосіб за п. І, який відрізняється тим, що білкові речовини, що вивільняються в культуральне середовище, є біологічно активними.
3. Спосіб за п. І або 2, який відрізняється тим, що культуральне середовище, що використовується, не містить цукрів, вітамінів і фітогормонів або їх функціональних фрагментів.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що тканина моху вибрана з групи, що складається з мохів і печіночників.
5. Спосіб за п, 4, який відрізняється тим, що тканина моху вибрана з групи, що складається з РпузсотитеПЦа, Еипагіа, 5Брпагпит 1 Сегасдоп.
6. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що тканина моху вибрана з групи печіночників, що складається з Магсрапва 1 5рпаегосагров.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19947290A DE19947290A1 (de) | 1999-10-01 | 1999-10-01 | Verfahren zur Herstellung proteinöser Substanzen |
| PCT/DE2000/003374 WO2001025456A2 (de) | 1999-10-01 | 2000-09-27 | Verfahren zur herstellung proteinöser substanzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72552C2 true UA72552C2 (en) | 2005-03-15 |
Family
ID=7924139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002043701A UA72552C2 (en) | 1999-10-01 | 2000-09-27 | A method for production of heterologous proteinaceous substances in plant material |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1206561B1 (uk) |
| JP (1) | JP2003511035A (uk) |
| KR (1) | KR100671217B1 (uk) |
| CN (1) | CN1192111C (uk) |
| AT (1) | ATE232904T1 (uk) |
| AU (1) | AU781920B2 (uk) |
| BG (1) | BG65487B1 (uk) |
| BR (1) | BR0014671A (uk) |
| CA (1) | CA2381995C (uk) |
| CZ (1) | CZ293818B6 (uk) |
| DE (2) | DE19947290A1 (uk) |
| DK (1) | DK1206561T3 (uk) |
| EE (1) | EE05093B1 (uk) |
| ES (1) | ES2192545T3 (uk) |
| HK (1) | HK1054053B (uk) |
| HR (1) | HRP20020250B1 (uk) |
| HU (1) | HU228206B1 (uk) |
| IL (2) | IL148638A0 (uk) |
| IS (1) | IS6299A (uk) |
| MX (1) | MXPA02003359A (uk) |
| NO (1) | NO329774B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ517996A (uk) |
| PL (1) | PL200252B1 (uk) |
| PT (1) | PT1206561E (uk) |
| RS (1) | RS50075B (uk) |
| RU (1) | RU2250264C2 (uk) |
| SK (1) | SK287740B6 (uk) |
| TR (1) | TR200200700T2 (uk) |
| UA (1) | UA72552C2 (uk) |
| WO (1) | WO2001025456A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA200202007B (uk) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT1539966E (pt) * | 2002-09-12 | 2010-09-14 | Greenovation Biotech Gmbh | Método de produção de proteínas |
| EP1398383A1 (en) * | 2002-09-12 | 2004-03-17 | greenovation Biotech GmbH | Protein production method |
| ATE335084T1 (de) * | 2002-12-20 | 2006-08-15 | Greenovation Biotech Gmbh | Verfahren zur herstellung von glykosylierten proteinen in bryophyten zellen |
| WO2004057002A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Greenovation Biotech Gmbh | Production of heterologous glycosylated proteins in bryophyte cells |
| EP1502954A1 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-02 | greenovation Biotech GmbH | Utilisation of constructs comprising recombination sequence motifes for enhancing gene expression in moss |
| ES2322140T3 (es) * | 2003-08-11 | 2009-06-17 | Greenovation Biotech Gmbh | Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones. |
| DE602006015195D1 (de) | 2005-07-12 | 2010-08-12 | Greenovation Biotech Gmbh | Verbesserungen der proteinproduktion oder in zusammenhang damit |
| EP1905825A1 (en) | 2006-09-29 | 2008-04-02 | greenovation Biotech GmbH | Galactosyltransferase |
| KR200451866Y1 (ko) * | 2008-07-28 | 2011-01-14 | 구동석 | 휴대폰 및 귀중품 보관함 |
| JP5641232B2 (ja) * | 2010-11-24 | 2014-12-17 | 石川県公立大学法人 | オゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼの遺伝子及び該遺伝子を利用するプロスタグランジン類生産方法 |
| EP2653548A1 (de) | 2012-04-17 | 2013-10-23 | Greenovation Biotech GmbH | Verfahren zur Erhöhung der Sekretion rekombinanter Proteine |
| RU2663131C1 (ru) * | 2017-09-06 | 2018-08-01 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Носитель для культивирования клеток человека и животных |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8901932A (nl) * | 1989-07-26 | 1991-02-18 | Mogen Int | Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen. |
| US6020169A (en) * | 1995-07-20 | 2000-02-01 | Washington State University Research Foundation | Production of secreted foreign polypeptides in plant cell culture |
| DE19629402C2 (de) * | 1996-07-20 | 1998-05-14 | Dirk Dr Voeste | Verwendung von transformierten vaskulären Wasserpflanzen zur Produktion von arteigenen oder artfremden Substanzen |
| WO1998021348A1 (en) * | 1996-11-12 | 1998-05-22 | Battelle Memorial Institute | Method of producing human growth factors from whole plants or plant cell cultures |
| AU746826B2 (en) * | 1997-02-13 | 2002-05-02 | Regents Of The University Of California, The | Production of mature proteins in plants |
| US6096546A (en) * | 1998-01-30 | 2000-08-01 | Board Of Trustees, Rutgers, The State University Of New Jersey | Methods for recovering polypeptides from plants and portions thereof |
-
1999
- 1999-10-01 DE DE19947290A patent/DE19947290A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-09-27 SK SK415-2002A patent/SK287740B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-09-27 NZ NZ517996A patent/NZ517996A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-27 MX MXPA02003359A patent/MXPA02003359A/es active IP Right Grant
- 2000-09-27 HU HU0202628A patent/HU228206B1/hu unknown
- 2000-09-27 JP JP2001528608A patent/JP2003511035A/ja active Pending
- 2000-09-27 BR BR0014671-4A patent/BR0014671A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-27 CN CNB008164967A patent/CN1192111C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 PT PT00972602T patent/PT1206561E/pt unknown
- 2000-09-27 PL PL354716A patent/PL200252B1/pl unknown
- 2000-09-27 ES ES00972602T patent/ES2192545T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 TR TR2002/00700T patent/TR200200700T2/xx unknown
- 2000-09-27 AU AU11295/01A patent/AU781920B2/en not_active Expired
- 2000-09-27 DK DK00972602T patent/DK1206561T3/da active
- 2000-09-27 RU RU2002111666/13A patent/RU2250264C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-09-27 UA UA2002043701A patent/UA72552C2/uk unknown
- 2000-09-27 KR KR1020027004246A patent/KR100671217B1/ko active IP Right Grant
- 2000-09-27 IL IL14863800A patent/IL148638A0/xx unknown
- 2000-09-27 EE EEP200200159A patent/EE05093B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-27 WO PCT/DE2000/003374 patent/WO2001025456A2/de active IP Right Grant
- 2000-09-27 AT AT00972602T patent/ATE232904T1/de active
- 2000-09-27 DE DE50001299T patent/DE50001299D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 CA CA002381995A patent/CA2381995C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 RS YUP-246/02A patent/RS50075B/sr unknown
- 2000-09-27 EP EP00972602A patent/EP1206561B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-27 CZ CZ20021061A patent/CZ293818B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-03-11 ZA ZA200202007A patent/ZA200202007B/en unknown
- 2002-03-12 IL IL148638A patent/IL148638A/en active IP Right Grant
- 2002-03-12 NO NO20021201A patent/NO329774B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-03-13 IS IS6299A patent/IS6299A/is unknown
- 2002-03-22 BG BG106547A patent/BG65487B1/bg unknown
- 2002-03-25 HR HR20020250 patent/HRP20020250B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-09-08 HK HK03106378.6A patent/HK1054053B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2008246928B2 (en) | Large scale disposable bioreactor | |
| UA72552C2 (en) | A method for production of heterologous proteinaceous substances in plant material | |
| ES2624479T3 (es) | Métodos para cultivar células de leucemia mieloide humana y células derivadas de esta | |
| US6740526B1 (en) | Quantitative transient protein expression in plant tissue culture | |
| WO2001020974A1 (en) | Quantitative transient protein expression in plant tissue culture | |
| Yost et al. | Overcoming challenges of hepatitis C virus envelope glycoprotein production in mammalian cells | |
| GIRARD et al. | FM WURM EPFL, Center of Biotechnology, LBTC, 1015 Lausanne, Switzerland | |
| IL229100A (en) | Bioreactor includes a plurality of openings for gas exchange for high-scale work and one-time use |