PL200252B1 - Sposób wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania heterologicznych substancji bia lkowych w materiale ro slinnym, w którym kultywuje si e tkank e spl atku mszaka stransformowan a konstruktem koduj acym heterologiczn a sub- stancj e bia lkow a i wytwarzane i uwalniane substancje bia lkowe wyodr ebnia si e z po zywki hodowlanej bez potrzeby uszkadzania tkanek lub komórek wytwarzaj acych te substancje. PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym, w szczególności w mszakach.

Wykorzystanie biotechnologicznych sposobów w celach produkcyjnych jest dla ludzkości istotną możliwością wytwarzania substancji, których wytwarzanie w inny sposób, na przykład na drodze syntezy chemicznej, nie jest możliwe lub nieopłacalne ekonomicznie i których dostępne surowce naturalne są niewystarczające. Mimo, że znanych jest ponad 10000 wtórnych metabolitów roślinnych, tylko kilka z tych związków wytwarza się na skalę techniczną przy pomocy hodowli komórek roślinnych. Większość z tych substancji stanowią metabolity wtórne o działaniu farmaceutycznym. Przykładowo można tutaj wymienić: a) berberynę (wytwarzanie w skali 4000 l), która wykazuje działanie bakteriostatyczne i grzybobójcze (Y. Fujita i M. Tabata, w: Plant tissue and cell culture, Plant Science; Vol. 3, str. 169, C. E. Green i in. (Ed.), A. R. Liss Inc., New York (1987)), b) szikoninę (skala 750 l), która wykazuje działanie antybiotyczne i przeciw zapaleniowe (M. Tabata i Y. Fujita, w: Biotechnology in plant science; str. 207-218, P. Day i in. (Ed.), Academic Press, Orlando (1985)), oraz c) paklitaksel (skala 75000 l), powszechnie znany pod nazwą taksol, który ma działanie przeciwguzowe (M. Jaziri i in., Taxus sp. cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoids production: a literature survey, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46, str. 59-75 (1996)).

Dalszym ważnym sposobem biotechnologicznym, w którym wykorzystuje się hodowlane komórki roślinne, jest biotransformacja digitoksyny w digoksynę, lek nasercowy i krążeniowy. Tę stereospecyficzną reakcję hydroksylacji przeprowadza się z powodzeniem z wysoką wydajnością w hodowli bioreaktorowej Digitalis lanata (E. Reinhard i W. Kreis, Kultivierung von pflanzlichen Zellen im Bioreaktor, Bio. Engin., 5, str. 135-136 (1989)). Aktualny i obszerny przegląd zastosowania hodowli komórek roślinnych w biotechnologii można znaleźć w H.-P. Mϋhlbach, Use of plant cell cultures in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 4, str. 113-176 (1998).

Rozwój sposobów transformacji genetycznej roślin wyższych na początku lat osiemdziesiątych umożliwił znaczący wzrost produktywności roślin w odniesieniu do specyficznych składników wtórnych dzięki transformacji genów pewnych kluczowych enzymów w odpowiednich szlakach metabolicznych. Stosowano nie tylko kompletne rośliny transgeniczne, ale również hodowle komórek roślinnych. Przykładem godnym przytoczenia jest nadekspresja bakteryjnej dekarboksylazy lizynowej w hodowlach transgenicznych włośników korzeni Nicotiana tabacum, która prowadziła do 14-krotnego zwiększenia wydajności wytwarzania biogennych amin kadaweryny i anabazyny (J. Berlin i in., Genetic modification of plant secondary metabolism: Alteration of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, w: Advances in Plant Biology, Studies in Plant Science, Vol. 4, str. 57-81, D. D. Y. Ryu i S. Furasaki (Ed.), Elsevier, Amsterdam (1994)).

Możliwość transferu DNA w roślinach niewątpliwie umożliwiła nie tylko ilościowe i jakościowe zmiany składników roślin. Rośliny i hodowle komórek roślinnych stały się ponadto interesujące z punktu widzenia wytwarzania białek heterologicznych (A.S. Moffat, High-Tech plants promise a bumper crop of new products, Science 256, str. 770-771 (1992)), przy czym wybrano zasadniczo dwa różne podejścia.

Jedno podejście obejmuje wytwarzanie białek heterologicznych w kompletnych roślinach transgenicznych. Opisano nie tylko wytwarzanie przeciwciał w transgenicznych roślinach tytoniu (J. K. -C. Ma i in., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science 268, str. 716-719 (1995)), ale również ekspresję i prawidłowe przetwarzanie albuminy surowicy człowieka w transgenicznych roślinach zarówno tytoniu, jak i ziemniaków (P.C. Sijmons i in., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Bio/Techn., 8, str. 217-221 (1990)). Również w transgenicznych roślinach tytoniu poddano ekspresji ludzki epidermalny czynnik wzrostowy (hEGF) (A. -H. Salmanian i in., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett., 18, str. 1095-1098 (1996)). Wykorzystano jednak także inne rośliny. Wytwarzanie leu-enkefaliny przeprowadzono z powodzeniem w Arabidopsis thaliana i Brassica napus (E. Krebbers i J. Vandekerckhove, Production of peptides in plant seeds, Tibtech., 8, str. 1-3. (1990)). Ponadto wykorzystano transgeniczne rośliny Vigna unguiculata do ekspresji chimerycznych cząsteczek wirusowych, które służą do szczepień (K. Dalsgaard i in., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, str. 248-252 (1997)).

Podstawową wadą stosowania kompletnych roślin w sposób opisany przykładowo powyżej jest konieczność ich długotrwałej i kosztownej kultywacji oraz duży areał, niezbędny dla ich kultywacji na skalę przemysłową. Ponadto oczyszczanie pożądanych substancji docelowych z kompletnych roślin

PL 200 252 B1 wymaga z reguły skomplikowanych etapów przetwarzania, szczególnie w przypadku wysokich wymagań w stosunku do właściwości i jakości produktów, jakie stawia się substancjom stosowanym jako środki farmaceutyczne lub jako fizjologiczne środki żywieniowe.

W drugim podejś ciu wykorzystano hodowle transgenicznych komórek tytoniu do wytwarzania przeciwciał. Opisano na przykład ekspresję przeciwciał i ich wydzielanie do pożywki (N. S. Magnuson i in., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells, Prot. Expr. Pur., 7, str. 220-228 (1996)). Ponieważ oczyszczanie białek heterologicznych z komórek wymaga większego nakładu pracy, wydzielanie białka docelowego do pożywki stanowi wyraźne udoskonalenie. Ponadto z punktu widzenia bezpieczeństwa korzystniejsze jest wytwarzanie rekombinacyjnych białek o znaczeniu farmaceutycznym w hodowlach komórkowych, ponieważ transgeniczne komórki roślinne można kultywować wyłącznie w bioreaktorach i nie istnieje potrzeba ich kultywacji w naturze. Rozbudowa bioreaktorów do hodowli heterotroficznych komórek roślinnych na dużą skalę (na przykład M. L. Shuler i in., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity: The case of taxol., Ann. N. Y. Acad. Sci., 745, str. 455-461 (1994)) umożliwiła wprowadzenie koniecznej hodowli masowej.

Zasadniczymi wadami drugiego podejścia, w którym stosuje się roślinne hodowle zawiesinowe, są powolny wzrost, stosunkowo powolne tworzenie metabolitów wtórnych, hamowanie wytwarzania produktu przy wysokiej gęstości komórek i w wyniku tego niska produktywność na jednostkę objętości, tworzenie agregatów i składników ścian komórkowych, jak również podwyższona wrażliwość komórek na siły tnące. Należy ponadto brać pod uwagę, że dla zastosowanych w hodowli komórek heterotroficznych niezbędne jest przygotowanie złożonych pożywek, zawierających szereg składników, część których jest kosztowna. Jako najpoważniejszą wadę należy jednak wymienić występowanie wariacji somaklonalnych w hodowlach komórek roślinnych in vitro, które prowadzą do zmian ilościowych i jakościowych w wytwarzaniu białek heterologicznych (patrz na przykład M. G. K. Jones i K. Lindsey, Plant biotechnology, w: Molecular biology and biotechnology, J. M. Walker i E. W. Gingold (Eds.), 2nd Ed., Royal Soc. of Chem., Burlington House, London (1988)). Heterologiczność wytworzonych produktów i ich właściwości funkcjonalnych jest nie do zaakceptowania, szczególnie w powiązaniu z wytwarzaniem środków farmaceutycznych i innych pożądanych substancji, których urzędowe dopuszczenie wymaga niezawodnego zapewnienia jakości i znormalizowanego sposobu wytwarzania.

Stąd też zadaniem niniejszego wynalazku jest dostarczenie takiego sposobu znormalizowanego wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym, który zasadniczo nie wykazuje opisanych powyżej wad, związanych zarówno z zastosowaniem kompletnych roślin, jak i z zastosowaniem układów hodowli komórek roślinnych.

Zadanie to wypełniono zgodnie z wynalazkiem przez dostarczenie nowego sposobu wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym, w którym kultywuje się rośliny stransformowane konstruktem kodującym peptyd sygnałowy przyłączony operacyjnie do heterologicznej substancji białkowej charakteryzuje się tym, że w pożywce hodowlanej kultywuje się odpowiednio stransformowaną tkankę splątku mszaka i wyodrębnia się wytwarzane i uwalniane substancje białkowe z pożywki hodowlanej bez potrzeby uszkadzania tkanek lub komórek wytwarzających te substancje.

Korzystnie, z pożywki hodowlanej wyodrębnia się uwolnioną substancję białkową, która jest aktywna biologicznie.

W jednej z odmian sposobu stosuje się poż ywkę hodowlaną wolną od cukrów, witamin i hormonów roślinnych lub ich funkcjonalnych fragmentów.

Korzystnie, kultywuje się tkankę mszaka wybraną z grupy obejmującej mchy i wątrobowce, przy czym korzystnie mchy pochodzą z grupy składającej się z Physcomitrella, Funaria, Sphagnum oraz Ceratodon, natomiast wątrobowce obejmują Marchantia i Sphaerocarpos.

Stosowane tutaj określenie „substancja białkowa” obejmuje peptydy, polipeptydy i białka, jak również ich fragmenty, odpowiednie w szczególności dla celów diagnostycznych, klinicznych, farmaceutycznych lub stosowane jako fizjologiczne środki żywieniowe. Ponadto włączone są takie cząsteczki, które posiadają wiązania peptydowe i które ulegają translacji w materiale roślinnym.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „aktywny biologicznie” oznacza, że substancje docelowe, którym tę cechę przypisano, posiadają właściwości funkcjonalne pożądane lub wymagane dla odpowiedniego celu. Jeżeli przykładowo pożądane jest wytworzenie przeciwciał, wytworzone białko, lub jego funkcjonalny fragment, jest wtedy biologicznie aktywne, kiedy jest ono zdolne do utworzenia

PL 200 252 B1 oczekiwanego specyficznego wiązania z antygenem. Dla specjalisty w dziedzinie oczywiste jest, że do tego celu nie zawsze wymagane jest kompletne białko, ale że można wyszukać epitopy lub struktury niskocząsteczkowe, które zapewniają pożądaną aktywność biologiczną lub funkcjonalność. Przykładowo, enzym jest aktywny biologicznie, jeżeli jest zdolny do przekształcenia swojego substratu docelowego.

Jak już wspomniano, w korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, materiał roślinny w postaci kompletnych roś lin mszaka kultywuje się w poż ywce hodowlanej zasadniczo wolnej od cukrów, witamin i hormonów roślinnych lub ich funkcjonalnych fragmentów.

Sposób według wynalazku umożliwia kultywację kompletnych i zróżnicowanych roślin w warunkach fotoautotroficznych możliwych do znormalizowania, tj. bez potrzeby dodawania cukrów, witamin i fitohormonów lub tym podobnych, czego wymagały znane w dziedzinie ukł ady hodowli zawiesinowych komórek heterotroficznych. Ze względu na zastosowanie niekosztownej i prostej pożywki hodowlanej, zabiegi otrzymywania i oczyszczania pożądanej substancji docelowej są zdecydowanie ułatwione.

Korzystnym materiałem roślinnym do zastosowania w sposobie według wynalazku jest kompletna roślina mszaka, wybrana z grupy składającej się z mchów i wątrobowców, przy czym szczególnie korzystne do zastosowania są gatunki Physcomitrella, Funaria, Sphagnum i Ceratodon, jak również Marchantia i Sphaerocarpos. W najkorzystniejszym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się mech Physcomitrella patens.

Konstrukcja kwasu nukleinowego zastosowana do transformacji koduje nie tylko pożądaną substancję białkową, ale również peptyd tranzytowy, umożliwiający wydzielanie substancji z komórek gospodarza do pożywki hodowlanej. Zgodnie z wynalazkiem można zastosować dowolne, znane fachowcom w dziedzinie, autologiczne i heterologiczne sekwencje kwasów nukleinowych, z których można utworzyć kasety ekspresyjne do transformacji tkanki organizmu wytwarzającego. Szczególnie korzystne jest zastosowanie peptydów sygnałowych dla retikulum endoplazmatycznego lub transportu komórkowego.

Prace przeprowadzone w zakresie niniejszego wynalazku wskazują, że wyżej opisany problem zmienności somaklonalnej, który występuje w hodowlach komórkowych, nie istnieje w fotoautotroficznych hodowlach cieczowych mchów. Ponadto mszaki stosowane zgodnie z wynalazkiem mają w porównaniu z innymi układami zaletę wyraźnej kolejności precyzyjnie zdefiniowanych etapów różnicowania splątku (chloronema, kaulonema, pąki, gametofity), na które można wpływać przez dodanie hormonów roślinnych (kwas indolilooctowy indukuje rozwój kaulonemy, izopentenyloadenina indukuje rozwój pąków) (patrz np. N.W. Ashton i in., Analysis of gametophytic development in the moss, Physcomitrella patens, using auxin and cytokinin resistant mutants, Planta, 144, str. 427-435 (1979)). Dzięki temu możliwa jest ukierunkowana i specyficzna dla różnicowania ekspresja białek heterologicznych w hodowlach bioreaktorowych, przy czym szczególnie korzystna według wynalazku jest hodowla synchronicznie dzielącej się, czystej i przez to jednorodnej chloronemy ze względu na sterowne i równomierne wytwarzanie białek w bioreaktorze oraz możliwość użycia promotorów zależnych od hormonów lub specyficznych dla różnicowania.

Oprócz takiego układu ekspresji można zastosować zgodnie z wynalazkiem indukowalny układ promotorowy, szczególnie do wytwarzania białek o krótkim okresie półtrwania lub o działaniu cytotoksycznym, przy czym szczególnie korzystnie stosuje się promotor 1' z Agrobacterium tumefaciens.

Zaproponowaną zgodnie z wynalazkiem kultywację mszaków do wytwarzania białek heterologicznych można prowadzić z ekonomicznego punktu widzenia stosując przykładowo Physcomitrella w objętościach rzędu od 20 ml do 6 l, do 10 l i powyżej, w hodowlach wytrzą sanych lub w gazowanych pojemnikach szklanych (patrz np. R. Reski, Zell- und molekularbiologische Untersuchungen der cytokinin-induzierbaren Gewebedifferenzierung und Chloroplastenteilung bel Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., praca doktorska, Uniwersytet Hamburg (1990)). Ponieważ chodzi tutaj o hodowlę zróżnicowanych roślin fotoautotroficznych, nie istnieje potrzeba uzupełniania pożywki hormonami roślinnymi, witaminami czy cukrami. W porównaniu ze złożonymi pożywkami, wymaganymi przykładowo w hodowli komórek zwierzę cych, koszty są niż sze 100-krotnie. Zgodnie z wynalazkiem wykazano, ż e wydajność biologicznie aktywnego białka heterologicznego w pożywce hodowlanej może ulec 35-krotnemu zwiększeniu w obecności PVP i dlatego też zastosowanie PVP w pożywce hodowlanej w sposobie wedł ug wynalazku jest korzystne.

Dokładne informacje o kultywacji w bioreaktorach innych mchów, odpowiednich według wynalazku, takich jak na przykład Leptobryum pyriforme i Sphagnum magellanicum, znane są w dziedzinie (patrz np. E. Wilbert, Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer

PL 200 252 B1

Beriicksichtigung des Arachidonsaurestoffwechsels, praca doktorska, Uniwersytet Mainz (1991); H. Rudolph i S. Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, str. 67-73 (1992)). W zakresie niniejszego wynalazku szczególnie korzystne jest zastosowanie Physcomitrella, zwłaszcza że wszystkie powszechne techniki biologii molekularnej ustalono dla tego organizmu (patrz przegląd R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, str. 1-15 (1998)).

Dla biotechnologicznego wykorzystania Physcomitrella do wytwarzania białek heterologicznych opracowano odpowiednie układy transformacyjne. Udane transformacje przeprowadzono przykładowo przez bezpośrednie przeniesienie DNA do tkanki splątka z zastosowaniem pistoletu (particle gun). Uwieńczone powodzeniem było również przeniesienie DNA do protoplastów mszaków za pośrednictwem PEG. Ten sposób transformacji opisano wielokrotnie dla Physcomitrella i prowadzi on do otrzymania zarówno przejściowych jak i stabilnych transformantów (patrz np. K. Reutter i R. Reski, Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture, @ Biotech., 2, str. 142-147 (1996)).

Chociaż niniejszy wynalazek jest zasadniczo odpowiedni dla wytwarzania dowolnej substancji białkowej, poniżej przedstawiono wytwarzanie białka istotnego farmaceutycznie na przykładzie ludzkiego czynnika wzrostowego naczyniowych komórek śródbłonkowych (VEGF).

Izolację VEGF opisano po raz pierwszy w N. Ferrara i W. J. Henzel (Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, str. 851-858 (1989)) i scharakteryzowano jako czynnik regulujący kontrolowany rozwój naczyń i podziały komórek śródbłonka w normalnych warunkach fizjologicznych (N. Ferrara i in., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J. Cell. Biochem., 47, str. 211-218 (1991)). Autorzy wykazali także, że ten czynnik wzrostowy działa bardzo specyficznie na naczyniowe komórki śródbłonka i nie wykazuje aktywności dla innych rodzajów komórek. VEGF jest glikoproteidem występującym w postaci homodimeru połączonego mostkami dwusiarczkowymi. Znane są cztery różne formy ludzkiego VEGF. Te cztery izoformy powstają przez alternatywny splicing RNA kodującego VEGF i zawierają 121, 165, 189 oraz 206 aminokwasów. Obecność VEGF206 stwierdzono jedynie w cDNA wątroby płodowej, natomiast produkty transkrypcji VEGF121, VEGF165 i VEGF189 wykryto w szeregu komórek i tkanek guzowych. Wszystkie izoformy VEGF posiadają sekwencje liderowe dla ich wydzielania, ale tylko dwie najmniejsze izoformy ulegają efektywnie wydzielaniu (patrz np. G. Martiny-Baron i D. Marme, VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Biotechnol., 6, str. 675-680 (1995)).

Odpowiednie ilości VEGF były i są wciąż wymagane zarówno w celu opracowania i ulepszenia istniejących sposobów leczenia guzów, jak i w celu charakteryzacji VEGF. Podczas wczesnych etapów prac prowadzonych w ramach niniejszego wynalazku opisane było jedynie wytwarzanie rekombinacyjnego VEGF w komórkach owadów z zastosowaniem układu ekspresji bakulowirusa (np. B. L. Fiebich i in., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, str. 19-26 (1993)). Jako organizmy wytwarzające doszły następnie: Saccharomyces cerevisiae (S. Kondo i in., The shortest isoform of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF121) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesis and vascular permeability, Biochim. Biophys. Acta, 1243, str. 195-202 (1995)), drożdże Pichia pastoris (D. Mohanraj i in., Expression of biologically active human vascular endothelial growth factor in Yeast, Growth factors, 12, str. 17-27 (1995)) oraz Escherichia coli (G. Siemeister i in., Expression of biologically active isoforms of the tumor angiogenesis factor VEGF in Escherichia coli, Biochem. Biophys. Res. Commun., 222, str. 249-255 (1996)). We wszystkich układach rekombinacyjnych można wytworzyć aktywny biologicznie VEGF. Układ ekspresji E. coli wymaga jednak dużego nakładu pracy przy oczyszczaniu i rekonstytucji białka, ponieważ występuje ono w postaci ciał wtrętowych.

P r z y k ł a d y

Skrót

Ugruntowanie sterownych hodowli masowych Physcomitrella patens (Reutter i Reski, loc. cit.) i sposobów przenoszenia DNA do mchu Physcomitrella patens (K. Reutter, Expression heterologer Gene in Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., praca doktorska, Uniwersytet Hamburg (1994)) stworzyło podstawowe przesłanki dla biotechnologicznego wykorzystania tej rośliny.

Uprzednio przeprowadzone doświadczenia wykazały na podstawie transgenicznych linii Physcomitrella, pochodzących z prac Reuttera (loc. cit., 1994), długotrwałą stabilność integracji. Przykładowo,

PL 200 252 B1 ekspresję wykorzystanych tutaj heterologicznych genów npt II i gus można wykryć także po upływie czterech lat.

Hodowlę Physcomitrella w bioreaktorze poddano optymalizacji. Opracowano mieszadło, które rozdrabnia splątki i zapewnia w ten sposób niezbędną jednorodność hodowli przy ciągłej szybkości obrotów 300-500 rpm. Umożliwia to znormalizowane pobieranie próbek. Równocześnie zapewnione jest bardziej równomierne rozprowadzenie powietrza w hodowli cieczowej. Warunki te umożliwiły wykazanie, że rozwój biomasy i wytwarzanie białka przebiegają w ten sam sposób niezależnie od zewnętrznej regulacji pH; stąd też regulacja pH nie jest konieczna. W warunkach półciągłych można uzyskać tygodniowo wytwarzanie biomasy w ilości 500 mg masy suchej lub 22 mg białka całkowitego na litr. Oznacza to pięciokrotne zwiększenie wytwarzania biomasy w porównaniu z konwencjonalną hodowlą w kolbach szklanych o pojemności 5 l. Zmniejszenie stężenia soli w pożywce Knopa do jednej dziesiątej prowadzi do podobnych wartości i w konsekwencji do zmniejszenia kosztów.

Dodanie 5 mM winianu amonowego przyspiesza rozwój biomasy przez skrócenie fazy opóźnienia. Jednocześnie dzięki dodaniu winianu amonowego otrzymano hodowle składające się niemal wyłącznie z komórek chloronemy. Przy pomocy cytometrii przepływowej wykazano, że w hodowlach tych prawie sto procent komórek znajdowało się w fazie G2/M cyklu komórkowego. Dalsze badania fizjologiczne przy użyciu auksyny oraz badania nad specyficznymi mutantami różnicowania call112 i call113 potwierdziły ten wynik i doprowadziły do wniosku, że przez większość czasu komórki kaulonemy znajdują się w fazie G1/G0, a komórki chloronemy znajdują się głownie w fazie G2/M.

Przeprowadzono badania nad promotorem 1' Agrobakterium w celu stwierdzenia, czy promotor ten ulega indukcji w mszakach. Gen β-glukuronidazy (gus) służył jako gen markerowy. Stwierdzono ekspresję genu gus w protoplastach mchu poddanych transformacji przejściowej (wydajność transformacji = 3x10^-4), po indukcji kwasem indolilooctowym o stężeniu 5 μM. Nie stwierdzono ekspresji w żadnych próbach kontrolnych.

Gen kodujący 121-aminokwasową formę splicingową ludzkiego czynnika wzrostowego naczyniowych komórek śródbłonkowych (VEGF121) poddano transferowi do Physcomitrella przy wydajności transformacji wynoszącej 0.5x10^-5 i 3.3x10^-6. W tym celu umieszczono gen za promotorem konstytutywnym 35S i klonowano w odpowiednim dla roślin wektorze transformacyjnym pRT99. W drugim podejściu klonowano dodatkowo sekwencję kodującą odpowiedni ludzki peptyd tranzytowy ER. Za pomocą analizy Southern otrzymanych stabilnych transformantów potwierdzono wbudowanie heterologicznego DNA i opisano rodzaj tego wbudowania. Analiza Northern potwierdziła istnienie transkryptów nptll i obydwu VEGF w tych transformantach. Ekspresję VEGF121 w komórkach mszaków wykazano przy użyciu immunofluorescencji pośredniej. Białko zlokalizowano przy pomocy współogniskowego laserowego mikroskopu skaningowego jednoznacznie w komórkach. W transformantach nie posiadających peptydu tranzytowego badania te wykazały, że białko umiejscowione jest szczególnie w cytoplazmie. W transformantach zawierających dodatkowo peptyd tranzytowy ER obecność białka stwierdzono w obszarze jądrowym oraz w komórkach apikalnych obszarów wierzchołkowych, czyli w miejscach o bardzo wysokiej zawartości ER. Przy zastosowaniu testu ELISA oraz dwóch testów na aktywność biologiczną potwierdzono, że heterologiczne białko VEGF wytworzone zgodnie z wynalazkiem i otrzymane z pożywki hodowlanej jest aktywne biologicznie.

Materiały i sposoby

O ile nie zaznaczono odmiennie, stosowano odczynniki o stopniu czystości do analizy zakupione w następujących firmach: Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) oraz Sigma (Deisenhofen).

Roztwory przygotowano przy użyciu wody oczyszczonej i wolnej od pirogenów, otrzymanej z zastosowaniem układu oczyszczania wody Milli-Q (Millipore, Eschborn) i określonej poniżej jako H2O.

Endonukleazy restrykcyjne, enzymy modyfikujące DNA i zestawy molekularno-biologiczne zakupiono od firm: AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Applied Biosystems (Weiterstadt), Biometra (Gottingen), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) oraz Stratagene (Heidelberg). O ile nie zaznaczono odmiennie, stosowane je zgodnie ze wskazówkami producenta.

Wektory i konstrukcje genowe

Plazmid pCYTEXP-VEGF121 jest produktem pochodnym pCYTEXP1 (T. N. Belev i in., A fully modular vector system for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, str. 147-150 (1991)), w który wbudowano cDNA VEGF121 człowieka do ekspresji w E. coli. cDNA koduPL 200 252 B1 jący VEGF121 wycina się z pCYTEKP-VEGF121 przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych Nde I i Sal I, oczyszcza, poddaje stępianiu końców i klonuje w pRT101 w miejscu rozszczepienia Sma I (R. Topfer i in., A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 15, str. 5890 (1987)) między promotorem 35S a sekwencją poliadenylacji CaMV. Tak otrzymaną kasetę wycina się przy użyciu Hind III i klonuje w wektorze transformacyjnym pRT99 w miejscu rozszczepienia restrykcyjnego Hind III. pRT99 zawiera nie tylko wielokrotne miejsca klonowania, ale także gen fosfotransferazy neomycyny regulowany przez promotor 35S oraz odpowiednią sekwencję poliadenylacji CaMV (R. Topfer i in., Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells, Nucleic Acids Res., 16, str. 8725 (1988)). Taki gen nadaje oporność na antybiotyk G418 roślinom stabilnie transformowanym. Plazmidy replikowano w szczepie Escherichia coli DH5a (J. Sambrook i in., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)).

Z wektora pVE-121, który początkowo skonstruowano dla ekspresji VEGF121 w komórkach owadów i który zawiera oprócz sekwencji VEGF121 również DNA kodujące naturalny peptyd tranzytowy, odpowiedzialny w układach komórek zwierzęcych za wydzielanie do pożywki za pośrednictwem retikulum endoplazmatycznego (Fiebich i in., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, str. 19-26 (1993)), wycinano cDNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych Bam HI i Bgl II, a następnie klonowano w pRT99 za pośrednictwem pRT101 i sprawdzano.

Plazmid pNA201 jest pochodną wektora binarnego pB101 (A. R. Jefferson i in., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, str. 387-405 (1987)). Zawiera on gen nptll pod promotorem syntazy nopalinowej jako marker selekcyjny dla roślin. Obecny również gen gus podlega regulacji przez promotor 1' z Agrobacterium tumefaciens. pNA201 nadaje się do bezpośredniej transformacji Physcomitrella patens.

Przeciwciała

Stosowano dwa różne przeciwciała przeciw białku VEGF. Pierwszym przeciwciałem jest przeciwciało królika przeciw VEGF, skierowane przeciwko peptydowi syntetycznemu o sekwencji odpowiadającej aminokwasom 1-20 natywnego VEGF człowieka (Fiebich i in., loc. cit. (1993)). Drugim przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało myszy skierowane przeciw białku VEGF121 człowieka (R&D Systems, Wiesbaden).

Materia ł ro ś linny

Stosowano szczep typu dzikiego mchu Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G., pochodzący ze zbioru Grupy Genetycznej w Zakładzie Botaniki Ogólnej Uniwersytetu w Hamburgu. Pochodzi on od szczepu 16/14, zebranego przez H. L. K. Whitehouse w Gransden Wood, Huntingdonshire (Anglia) i wyhodowanego z jednej spory.

Szczep typu dzikiego hodowano albo w hodowli cieczowej z pożywką Knopa (R. Reski i W. O. Abel, Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine, Planta, 165, str. 354-358 (1985)), albo na stałej pożywce Knopa z 1% agarem oksoidowym (Unipath, Basingstoke, England). Hodowle cieczowe prowadzono zgodnie z opisem Reski (loc. cit., 1990).

Hodowla w bioreaktorze

Materiał roślinny do hodowli masowej hodowano w bioreaktorowej okrągłodennej kolbie szklanej o pojemności 7 l z płaszczem wodnym (Applikon Blotek, Knϋllwald). Kondensator zużytego powietrza, rurę napowietrzającą, elektrodę pH (Conducta, Gerlingen), czujnik temperatury, mieszadło, rurkę poboru próbek jak również wloty dla kwasu, zasady i pożywki wprowadza się w takim układzie bioreaktorowym do obszaru hodowlanego od góry przez otwory w pokrywie. Hodowlę prowadzono w temperaturze 25°C, którą kontrolowano przy użyciu odpowiednio nastawionej łaźni wodnej, połączonej z płaszczem wodnym kolby. Podczas doświadczeń prowadzonych z regulacją pH, stałą wartość pH 5.8 utrzymywano przy pomocy jednostki miareczkującej. Pomiary temperatury i regulację pH zapewniano z zastosowaniem jednostki Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Knϋllwald). Szybkość obrotów mieszadła można zmieniać za pośrednictwem regulatora silnika ADI 1012 (Applikon Biotek, Knϋllwald). Pożywkę hodowlaną napowietrzano w sposób ciągły przez porowaty element wdmuchujący przy ciśnieniu 1 bar. Aby zapewnić sterylność pojemnika hodowlanego, wszystkie przewody doprowadzające i odprowadzające powietrze zaopatrzono w filtry sterylizujące (Midisart, 0.2 μm; Sartorius, Gottingen). Hodowlę w bioreaktorze prowadzono w inkubatorze z oświetleniem bocznym (światło białe; Osram L 40 W/20; max. 100 μmols^-1m^-2). Hodowle inokulowano w warunkach sterylnych

PL 200 252 B1 materiałem roślinnym w ilości 0.5 - 1 g mokrej masy na litr hodowli bioreaktorowej. Rurka poboru próbek znajduje się na wysokości mieszadła, zapewniając pobranie jednorodnych próbek podczas mieszania. Próbki o małej objętości (< 100 ml) pobierano przy pomocy sterylnej strzykawki poprzez połączenie luer lock, natomiast próbki o dużej objętości pobierano przykładowo z zastosowaniem pompy perystaltycznej typu 302/3A z głowicą 501 RI (Sartorius, Gottingen).

Hodowle chloronemy typu dzikiego wytwarzano przez dodanie do pożywki Knopa 5 mM winianu amonowego.

Obecność stabilizatora pirolidonu poliwinylu (PVP) w pożywce hodowlanej może znacząco zwiększyć uzysk wydzielonego, aktywnego biologicznie białka heterologicznego.

Zachodzące podczas rozwoju splątka różnicowanie kaulonemy można indukować i wzmacniać przez egzogenne dodanie fizjologicznych ilości auksyny, przy czym odpowiednie są stężenia np. 5 μmol/l kwasu indolilooctowego (IAA).

Do hodowli cieczowej transformantów pod presją selekcyjną do pożywki Knopa dodaje się 50 mg/l antybiotyku G418 (Calbiochem, Bad Soden). W tym celu co dziesięć dni, bezpośrednio przed rozdrobnieniem, hodowle odsączano na sterylnych sączkach 100 μm (Wilson Sieves, Nottingham, England) i przenoszono do kolb Erlenmeyera napełnionych pożywką selekcyjną.

Do doświadczeń z solami odżywczymi pożywkę Knopa rozcieńczano w proporcji 1:10 stosując H2O.

Transformacja

Wybranym sposobem transformacji jest bezpośredni transfer DNA do protoplastów za pośrednictwem PEG zgodnie z opisem Reutter i Reski (loc. cit., 1996). W każdej transformacji stosowano 50 μg DNA plazmidu na 3x10⁵ protoplastów. Regenerację protoplastów i selekcję stabilnych transformantów prowadzono, o ile nie zaznaczono inaczej, zgodnie z opisem Reutter i Reski (loc. cit., 1996).

Immunofluorescencja pośrednia

Bufory:

MSB: 100 mM PIPES; 5-10 mM EGTA, 5 mM MgSO4, pH 6.8

F-MSB: MSB +5% DMSO

E-MSB: MSB + 5% DMSO + 5% Nonidet

W-MSB: MSB rozcieńczony 1:2 przy użyciu H2O (bufor przemywający)

Roztwór enzymatyczny: 1% celulaza, 1% pektynaza, 2% drizelaza w MSB, pH 5.6 (wszystkie zakupione w Sigma, Deisenhofen)

Utrwalanie splątków mchu prowadzono w roztworze 1.25% aldehydu glutarowego w F-MSB (obj./obj.) stosując inkubację nie dłuższą niż 10 minut i krótkie przemycie buforem W-MSB. Następnie prowadzono inkubację w roztworze 2% paraformaldehydu w MSB (obj./obj.) przez 40 minut i przemywano 3x buforem W-MSB (1 x przepłukać; 2 x przemywać przez 5 min.).

Redukcję wolnych aldehydów, nieusuniętych podczas przemywania, przeprowadzono przez inkubację przez 10 minut w MSB zawierającym szczyptę stałego borowodoru. Borowodór usuwano przez trzykrotne przemywanie W-MSB.

Podczas następnego etapu podnoszono przepuszczalność ścian komórkowych przez inkubację w roztworze enzymatycznym przez 10 minut. Reakcję zatrzymywano przez zmianę pH (MSB, pH 6.8). Ponownie przemywano 3 x W-MSB.

Chlorofile ekstrahowano przez inkubację z roztworem detergentu przez 120 minut. Roztwór usuwano przez trzykrotne przemycie buforem W-MSB.

Po takim przygotowaniu splątki mchu można inkubować z pierwszym przeciwciałem (przeciw VEGF; rozcieńczenie 1/50). Inkubację prowadzono w temperaturze 37°C przez 45 minut. Po trzykrotnym przemyciu buforem W-MSB dodawano znakowane drugie przeciwciało (skierowane przeciw królikowi lub przeciw myszy; rozcieńczenie 1/30; znacznik izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) (Molecular Probes, Leiden, Netherlands)) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut. Po trzykrotnym przemyciu jak powyżej stosowano dodatkowo jednokrotne przemycie buforem W-MSB + 0.1% Triton. Następnie splątki przenoszono do W-MSB i przechowywano w temperaturze 4°C przynajmniej przez noc. Ocenę materiału przeprowadzono przy pomocy współogniskowego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) typu TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg) i oprogramowania Scanware 5.0 (Leica Lasertechnik, Heidelberg).

Próbki do analizy mikroskopowej CLSM umieszczano na szkiełku podstawowym w roztworze „mounting solution” (Dabco, Sigma, Deisenhofen). Wzbudzenie znacznika fluorescencyjnego FITC, związanego z drugim przeciwciałem, zachodzi przy użyciu lasera argon-krypton przy długości fali 488 nm. FITC emituje światło o długości fali 528 nm.

PL 200 252 B1

Test ELISA

Oznaczenia ilościowe i jakościowe wytworzonego w odpowiednio transformowanych roślinach mchu białka VEGF przeprowadzono w pożywce hodowlanej zgodnie z konwencjonalnymi sposobami za pomocą testu ELISA i wyżej opisanych przeciwciał. 200 μΐ pożywki hodowlanej stosowano bezpośrednio w teście ELISA.

Test na aktywność biologiczną

Aktywność biologiczną rekombinacyjnie wytworzonego VEGF, otrzymanego z pożywki hodowlanej, sprawdzono z zastosowaniem testu mitogenicznego (Miyazono i in., Purification and properties of an endothelial celi growth factor from human platelets, J. Biol. Chem., 262, str. 4098-4103 (1987)) oraz testu „rozwoju naczyń w błonie kosmówkowo-omoczniowej w dniu 13” (Wilting i in., A morphological study of the rabbit corneal assay, Anat. Embryol., 183, str. 1167-1174 (1991)). Pożywkę hodowlaną poddawano najpierw ultrafiltracji i liofilizacji, a następnie powtórnemu zawieszaniu w buforze. O ile pożądane, można przeprowadzić dodatkowy etap oczyszczania z zastosowaniem kolumny kationowej.

Indukcyjność promotora 1'

Indukcyjność promotora 1' pod wpływem auksyny analizowano z zastosowaniem 5 μmol/1 kwasu indolilooctowego (IAA). Pięć dni po transformacji z pNA201 próbki protoplastów o objętości 100 μl przenoszono do studzienek płytek mikromiareczkowych o 96 studzienkach (Nunc, Wiesbaden). Zawiesiny protoplastów inkubowano przez pięć godzin z IAA (stężenie końcowe = 5 μM). W celu oceny doświadczeń indukcyjnych przeprowadzano jakościowe oznaczenie β-glukuronidazy bezpośrednio po zakończeniu inkubacji.

Jakościowe oznaczenie β-glukuronidazy

Aktywność β-glukuronidazy oznaczano przy użyciu testu jakościowego (A. R. Jefferson, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, str. 387-405 (1987)). Bufor substratowy:

mM K3Fe(CN)6 50 mM Na2HPO4 mM K4Fe(CN)6 1% (obj./obj.) Triton X-100 mM NaH2PO4 10 mM EDTA, pH 7.0 mg/ml PVP (MW 10 000)

Roztwór barwiący: 12.5 mg kwasu 5-bromo-4-chloro-3-indoliloglukuronidowego (Biomol, Hamburg) rozpuszczone w roztworze 250 μl N,N-dimetyloformamidu w 50 ml buforu substratowego.

Splątki i protoplasty mchu w pożywce Knopa lub pożywce regeneracyjnej inkubowano z równą objętością roztworu barwiącego przez okres czasu do 72 godzin w temperaturze 37°C i natychmiast po zakończeniu barwienia oceniano pod mikroskopem.

Wyniki

Jednorodność hodowli w bioreaktorze; pobieranie próbek.

W hodowlach komórkowych można zapewnić znormalizowane pobieranie próbek tylko w przypadku hodowli jednorodnych. Rozrost splątków do długich nici często prowadzi po dłuższym okresie hodowania do powstawania agregatów komórek i zatem niejednorodnego rozkładu materiału roślinnego w hodowlach cieczowych. W celu uniknięcia takiej agregacji, splątki poddaje się rozdrabnianiu przy użyciu wysokoobrotowych mieszadeł/homogenizatorów w określonych odstępach czasu - w bioreaktorze od dnia 10 co drugi dzień, w hodowlach wytrząsanych co 12 dni. Aby zapewnić ciągłe warunki w bioreaktorze przy jednoczesnym pobieraniu próbek w sposób znormalizowany również przy długich czasach kultywacji, poleca się zmodyfikowanie trójłopatkowego mieszadła turbinowego przez oszlifowanie brzegów łopatek do otrzymania mieszadła nożycowego. Dzięki temu ciągłe „mieszanie” przy 300-500 rpm umożliwia utrzymanie jednorodnych hodowli bioreaktorowych.

Rozwój biomasy (sucha masa [mg/1]) w ciągu 35 dni (840 godz.) przy 500 rpm w hodowlach kontrolnych z mieszaniem przy użyciu mieszadła turbinowego jest taki sam, jak w hodowlach bioreaktorowych mieszanych przy użyciu mieszadła nożycowego.

Jednorodność hodowli ocenia się przez każdorazowe porównanie sześciu równolegle pobranych próbek. Jako parametr porównawczy przyjęto suchą masę materiału roślinnego próbki o objętości 100 ml. Przy zastosowaniu niezmodyfikowanego mieszadła turbinowego, odchylenie standartowe zwiększa się w miarę wzrostu stężenia biomasy. W następstwie mieszania z zastosowaniem mieszadła nożycowego, odchylenia standartowe pobranych próbek pozostają niskie. Pozwala to na wyciągnięcie wniosku, że przy użyciu zmodyfikowanego mieszadła nożycowego można równomiernie utrzymać jednorodność hodowli przez okres czasu obejmujący 35 dni.

PL 200 252 B1

Badania indukcyjności promotora 1'

W plazmidzie pNA201 promotor 1' znajduje się jako element regulujący przed genem gus. Jako potwierdzenie ekspresji w doświadczeniach nad indukcją w mchu odpowiedni jest test na β-glukuronidazę. W doświadczeniach nad transgenicznym tytoniem obserwowano, że promotor 1' prowadzi do ekspresji β-glukuronidazy w tkankach o wysokiej zawartości auksyny i na tej podstawie przypuszcza się, że promotor ten jest zależny od auksyny. Zdolność auksyny do indukowania promotora 1' badano w Physcomitrella patens w protoplastach przejściowych transformantów.

Transformacyjne mieszaniny reakcyjne poddawano testowi na β-glukuronidazę albo bez inkubacji, albo po inkubacji z 5 μΜ kwasem indolilooctowym (IAA) przez 5 godz. Badanie mikroskopowe kontroli nie poddanych działaniu IAA wykazało nieobecność niebieskich protoplastów we wszystkich mieszaninach reakcyjnych. Natomiast badanie protoplastów poddanych inkubacji z auksyną potwierdziło ekspresję genu gus. W oparciu o niebieskie protoplasty uzyskano wydajność transformacji 3x10^-4. Wynik ten sugeruje wyraźnie, że hormon roślinny auksyną indukuje promotor 1' w protoplastach przejściowych transformantów mchu.

Wytwarzanie wektorów do transformacji VEGF.

W celu przeprowadzenia transformacji cDNA VEGF121 bez sekwencji liderowej, nazywanego poniżej VEGFC, oraz cDNA VEGF121 wraz z sekwencją liderową, nazywanego poniżej VEGFP, do Physcomitrella, należy sklonować sekwencje w odpowiednią dla roślin jednostkę promotor/terminator. Do tego celu wybrano promotor 35S CaMV i odpowiedni dla niego sygnał poliadenylacji. Właściwie przygotowane sekwencje cDNA kodujące VEGF klonowano w restrykcyjnym miejscu rozszczepienia Sma I miejsca wielokrotnego klonowania wektora pRT101.

Powstałe wektory (pRT101VEGFC 3 i VEGFP 21) poddawano sekwencjonowaniu przy pomocy startera pochodzącego z końcowego obszaru promotora 35S i sprawdzano prawidłową integracje między promotorem a miejscem poliadenylacji.

Powstałe kasety wycinano przy użyciu enzymu restrykcyjnego Hind III i klonowano we właściwym wektorze transformacyjnym pRT99 w miejscu rozszczepienia Hind III (pRT99VEGFC 3 i VEGFP 21). Orientację kaset w stosunku do kasety NPTII można określić przez podwójną restrykcję przy użyciu Sma I i Hinc II. W przypadku orientacji promotor-sygnał poliadenylacji otrzymuje się fragmenty o rozmiarach 5250 bp (VEGFC) lub 5380 bp (VEGFP), podczas gdy odwrotna orientacja daje w wyniku fragmenty o rozmiarach 1100 (VEGFC)/1230 (VEGFP) jak również 4150 bp (VEGFC i P). W analizach restrykcyjnych wykryto tylko fragment 5250/5380 bp, stąd też kasety VEGFC/P uległy inkorporacji w orientacji promotor-sygnał poliadenylacji w stosunku do genu npt ll w pRT99.

Transformacje VEGFC do Physcomitrella

Absolutna wydajność transformacji dla transformacji konstruktu VEGFC do protoplastów typu dzikiego po wielokrotnych zmianach pożywki Knopa na pożywkę selekcyjną wynosi 0.5x10^-5 przy ciągłej stabilności transformantów.

Potwierdzenie integracji transformowanego plazmidu

Dowodu na integrację z genomem roślinnym dostarczono z zastosowaniem hybrydyzacji Southern.

Jako sondy stosuje się z jednej strony fragment Nco I genu npt II z pRT99, a z drugiej strony fragment Nde I/Sal I VEGFC z pCYTEXP-VEGF121.

Sygnały wykryte w nie trawionym, całkowitym DNA transformantów potwierdzają udaną integrację DNA plazmidu z genomem roślinnym. Utrzymanie całości kasety 35S VEGFC poliA po integracji badano przez restrykcję przy użyciu Hind III. Ten enzym restrykcyjny wycina z całkowitego DNA fragment o rozmiarach 1100 bp, o ile kaseta pozostała nienaruszona podczas integracji.

Obraz hybrydyzacji z sondą VEGFC wykazuje obecność fragmentu 1100 bp we wszystkich transformantach. W ten sposób udowodniono integrację całkowitej jednostki ekspresji VEGFC, co stanowi warunek wstępny dla prawidłowej transkrypcji i ekspresji VEGF121 w mchu.

Potwierdzenie transkrypcji genów heterologicznych

Transkrypty genów heterologicznych VEGFC i NPTII z transformantów wykrywano z zastosowaniem nie radioaktywnego układu wykrywania DIG przy użyciu sond VEGF i NPT II. Rozmiary transkryptów wykrytych na fluorogramie wynoszą 760 nukleotydów dla transkryptu VEGFC i 1100 nukleotydów dla transkryptu NPT II i znajdują się w oczekiwanych granicach wielkości. Zgodnie z oczekiwaniami nie wykryto żadnego z dwóch transkryptów heterologicznych w kontroli WT.

PL 200 252 B1

Analiza transformantów zawierających peptyd tranzytowy człowieka

Transfer DNA za pośrednictwem PEG przy użyciu 50 μg DNA plazmidu pRT99P 21 w transformacyjnej mieszaninie reakcyjnej daje w wyniku transformanty, które trwale pozostają stabilne na pożywce selekcyjnej. Daje to w wyniku wydajność stabilnej transformacji 3.3x10^-6.

Potwierdzenie integracji transformowanego plazmidu

Integrację wyżej opisanych transformantów z peptydem tranzytowym sprawdzono w sposób opisany powyżej przez hybrydyzację Southern z zastosowaniem opisanych sond, a hybrydyzacja całkowitego DNA, rozszczepionego przez Hind III, z sondą VEGF pozwala na wykrycie fragmentu o rozmiarach 1230 bp: dowód na integrację całkowitej kasety 35S VEGFP poliA.

Potwierdzenie transkrypcji genów heterologicznych

Obydwa transkrypty NPTII i VEGFP można wykryć z zastosowaniem sposobu opisanego powyżej.

Wykrywanie VEGF121 człowieka w transgenicznych komórkach mchu przy pomocy współogniskowego laserowego mikroskopu skaningowego.

W sposobie tym białko badane znakuje się bezpośrednio w utrwalonych komórkach. Oceny dokonuje się przy zastosowaniu współogniskowego laserowego mikroskopu skaningowego, którego rozdzielczość jest wyższa niż rozdzielczość normalnego mikroskopu świetlnego.

Rekombinacyjne białko VEGF121 - o ile jest ono wykrywalne w komórkach mchu - powinno gromadzić się w cytoplazmie transformantów VEGFC. W transformantach VEGFP białko to powinno być wykrywalne w układzie ER jeżeli peptyd tranzytowy działa jako sygnał w komórkach mchu.

Ekspresję VEGF121 człowieka w transgenicznych komórkach mchu potwierdzono z zastosowaniem sposobu immunofluorescencji pośredniej w połączeniu z obserwacjami przy pomocy współogniskowego laserowego mikroskopu skaningowego o sterowaniu wspomaganym komputerowo. Ponadto wykazano, że VEGF121 z odpowiednim ludzkim peptydem tranzytowym z powodzeniem ulega transportowi do retikulum endoplazmatycznego w transgenicznym mchu.

Test na obecność VEGF w pożywce hodowlanej

Próbkę pożywki hodowlanej w obecności PVP o objętości 200 μl analizowano w teście ELISA i wykazano, że rośliny mchu transformowane kasetą ekspresyjną, włączającą sekwencję kodującą peptyd tranzytowy, są zdolne do uwalniania VEGF do pożywki. Pozytywne wyniki pozwalają na wyciągnięcie wniosku, że białko VEGF jest funkcjonalne.

Test na aktywność biologiczną

Obydwa testy, zastosowane dla potwierdzenia aktywności biologicznej białka VEGF uwolnionego do pożywki hodowlanej, dają pozytywne wyniki i potwierdzają, że VEGF wytworzony zgodnie z wynalazkiem można otrzymać z pożywki hodowlanej z pożądaną aktywnością biologiczną.

Claims (6)

1. Sposób wytwarzania heterologicznych substancji białkowych w materiale roślinnym, w którym kultywuje się rośliny stransformowane konstruktem kodującym peptyd sygnałowy przyłączony operacyjnie do heterologicznej substancji białkowej, znamienny tym, że w pożywce hodowlanej kultywuje się odpowiednio stransformowaną tkankę splątku mszaka i wyodrębnia się wytwarzane i uwalniane substancje białkowe z pożywki hodowlanej bez potrzeby uszkadzania tkanek lub komórek wytwarzających te substancje.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że z pożywki hodowlanej wyodrębnia się uwolnioną substancję białkową, która jest biologicznie aktywna.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną wolną od cukrów, witamin i hormonów roślinnych lub ich funkcjonalnych fragmentów.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że kultywuje się tkankę mszaka wybraną z grupy obejmującej mchy i wątrobowce.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że kultywuje się tkankę mszaka wybraną spośród mchów grupy składającej się z Physcomitrella, Funaria, Sphagnum oraz Ceratodon.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że kultywuje się tkankę mszaka wybraną z grupy wątrobowców składającej się z Marchantia i Sphaerocarpos.