DE60213626T2

DE60213626T2 - Verfahren zur Herstellung von glykosylierten Proteinen in Bryophyten Zellen

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Publication number: DE60213626T2
Application number: DE60213626T
Authority: DE
Inventors: Otmar Lienhart; Dr. Anna Norwich Koprivova; Dr. Eva Decker; Prof. Dr. Ralf Reski; Dr. Gilbert Gorr; Dr. Christian Stemmer
Original assignee: Greenovation Biotech GmbH
Current assignee: Eleva GmbH
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: ES2269595T3; EP1431394A1; EP1431394B1; ATE335084T1; PT1431394E; CY1106233T1; EP1431394A8; SI1431394T1; DE60213626D1; DK1431394T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von heterologen glykosylierten Proteinen in Mooszellen, wie beispielsweise in transformierten Physcomitrella patens-Zellen in Kultur. Das Verfahren betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung glykosylierter Proteine, die tierische Glykosylierungsmuster umfassen, wie beispielsweise pharmazeutische Proteine für die Verwendung in Säugern, einschließlich des Menschen, in Mooszellen wie beispielsweise Physcomitrella patens-Zellen, das hierfür notwendige genetische Material, wie beispielsweise DNA and RNA, Vektoren, Wirtszellen, Verfahren zur Einführung von genetischen Materials in dieselben, und Verwendungen davon.
In der Vergangenheit sind heterologe Proteine unter Verwendung einer Vielzahl transformierter Zellsysteme wie solchen hergestellt worden, die abgeleitet sind von Bakterien, Pilzen, wie Hefen, Insekten, Pflanzen- oder Säugerzelllien (Kudo T. 1994, In: Y. Murooka and T. Amanaka (Hrsg.) Recombinant microbes for industrial and agricultural applications, S. 291–299, Marcel Dekker, New York; Harashima S., Bioproc. Technol. 1994, 19: 137–158; Archer D.B. 1994, In: Y. Murooka and T. Amanaka (Hrsg.) Recombinant microbes for industrial and agricultural applications, S. 373–393, Marcel Dekker, New York; Goosen M.F.A. 1993, In: M.F.A. Goosen, A. Baugulis and P. Faulkner (Hrsg.) Insect cell culture engineering, S. 1–16, Marcel Dekker, New York; Hesse F. & Wagner R., Trends in Biotechnol. 2000, 18(4): 173–180).
In prokaryontischen Organismen produzierte Proteine können nicht in einer Weise post-translational modifiziert werden wie eukaryontische Proteine, die in eukaryontischen Systemen produziert werden, z.B. können sie nicht mit geeigneten Zuckern an bestimmten Aminosäureresten glykosyliert werden, wie beispielsweise Asparaginsäure(N)reste (N-verknüpfte Glykosylierung). Ferner kann es bei bakteriell produzierten eukaryontischen Proteinen zu einer ungeeigneten Faltung kommen, was beispielsweise an der Unfähigkeit des Bakteriums zur Bildung von Cystein-Disulfidbrücken liegt. Ferner aggregieren und akkumulieren bakteriell produzierte rekombinante Proteine oft in Form unlöslicher Einschlusskörper.
Eukaryontische Zellsysteme sind besser geeignet für die Herstellung von glykosylierten Proteinen, die in verschiedenen eukaryontischen Organismen gefunden werden, wie beispielsweise in Menschen, da solche Zellsysteme post-translationale Modifikationen bewirken können, wie beispielsweise die Glykosylierung der produzierten Proteine. Jedoch besteht ein Problem bei den eukaryontischen Zellsystemen, die mit geeigneten heterologen Genen zur Produktion von Proteinsequenzen transformiert worden sind, die z.B. als Pharmazeutika verwendet werden können, darin, dass das Glykosylierungsmuster von solchen Proteinen oft ein natives Muster annimmt, welches demjenigen des eukaryontischen Zellsystems entspricht, in dem das Protein produziert worden ist: Es werden also glykosylierte Proteine produziert, die nicht-tierische Glykosylierungsmuster umfassen, und es kann sein, dass diese wiederum immunogen und/oder allergen sein können, falls sie Tieren, einschließlich Menschen, appliziert werden.
Die Verwendung von rekombinanten Glykoproteinen, die von höheren Pflanzen hergestellt sind, ist limitiert durch die pflanzenspezifische N-Glykosylierung, die solchen Proteinen zuteil wird. Verglichen mit von Säugern abgeleiteten Glykoproteinen enthalten für höhere Pflanzen spezifische Glykoproteine zwei zusätzliche Reste. Ferner werden in höheren Pflanzen Glykoproteine mit terminalen Beta-1,4-Galaktosereste nicht gefunden, was darauf hinweist, dass eine Beta 1,4-Galaktosyltransferase in Pflanzen nicht vorhanden ist. Die stabile Integration und Expression dieses Enzyms in Tabakpflanzen (Bakker et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA, 98, 2899–2904) sowie in Tabak-BY2-Zellen (Palacpac et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4692–4697) ist beschrieben worden. Die rekombinante humane Beta-1,4-Galaktosyltransferase war funktional, und aus transgenem Material isolierte Proteine wiesen terminale Beta-1,4-Galaktosereste auf. Gleichwohl wird es bei höheren Pflanzen nicht für möglich gehalten, die Aktivitäten der Beta 1,2-Xylosyltransferase und Alpha-1,3-Fucosyltransferase zu unterdrücken, wobei es sich hier um die beiden Enzyme handelt, die für die Übertragung der zusätzlichen, pflanzenspezifischen Reste als verantwortlich angesehen werden. Es wird davon ausgegangen, dass diese Reste für Menschen allergen sind (Garcia-Cassado et al. (1996) Glycobiology 6, 471–477; van Ree et al. 2000, J. Biol. Chem. 275, Nr. 15, 11451–11458). Sämtliche Daten zur pflanzenspezifischen N-Glykosylierung sind in Studien mit höheren Pflanzen generiert worden.
Die WO 01/29242 A offenbart höhere Pflanzen, die hinsichtlich der Expression einer Säuger-Beta-Galaktosyltransferase (GalT) modifiziert worden sind, um heterologe Proteine mit Säugerähnlichen Glykanen zu produzieren. Für diesen Zweck wurde vorgeschlagen, die pflanzeneigene Xylosyl- oder Fucosyltransferase-Aktivität mittels Antisense-Strategie unter Verwendung von Konstrukten zu reduzieren, die unabhängig und getrennt voneinander für Transformationen eingesetzt worden sind.
Das Moos Physcomitrella patens, eine haploide nicht-vaskuläre Landpflanze, kann auch für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden. Beispielsweise wurde in der WO 01/25456 A und in D.G. Schaefer et al., „Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens", Plant J., Vol. 11, Nr. 6, S. 1195–1206 (1997), gezeigt, dass Moose erfolgreich zur Herstellung funktionaler heterologer Proteine verwendet werden können, und dass die Technologie gut bekannt ist und das Targeting eines bestimmten Gens möglich ist.
Der Lebenszyklus der Moose ist beherrscht von der photoautotrophen Gametophytengeneration. Der Lebenszyklus ist verglichen mit demjenigen höheren Pflanzen völlig verschieden, da dort der Sporophyt die vorherrschende Generation darstellt, und es bestehen bemerkenswert viele Unterschiede zwischen höheren Pflanzen und Moosen.
Der Gametophyt der Moose ist durch zwei verschiedene Entwicklungsstufen charakterisiert. Das Protonema, welches sich durch Apikalwachstum entwickelt, wächst in ein filamentöses Netzwerk mit nur zwei Zelltypen (Chloronema- und Caulonema-Zellen). Die zweite Stufe, die Gametophor genannt wird, differenziert durch caulinäres Wachstum von einem einfachen Apikalsystem. Beide Stufen sind photoautotroph aktiv. Die Kultivierung von Protonema ohne Differenzierung zum eine komplexeren Gametophor ist für Suspensionskulturen in Flaschen als auch für Bioreaktorkulturen gezeigt worden (WO 01/25456). Die Kultivierung vollständig ausdifferenzierter und photoautotroph aktiver multizellulärer Gewebe, welches nur wenige Zelltypen enthält, ist für höhere Pflanzen nicht beschrieben. Die genetische Stabilität des Mooszellsystems stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber pflanzlichen Zellkulturen dar, und die Stabilität photoautotroph aktiver Mooskulturen ist bestätigt worden (Rieck 1996, Strukturaufklärung und stereochemische Untersuchungen von Sesquiterpenen als Inhaltsstoffe ätherischer Öle. Dissertation, Universität Hamburg). In Zellkulturen höherer Pflanzen ist der sekundäre Metabolismus differenzierter, und dies führt zu Unterschieden hinsichtlich der Profile von Sekundärmetaboliten.
Zusätzlich gibt es einige wichtige Unterschiede zwischen Moosen und höheren Pflanzen auf der biochemischen Ebene. Die Sulfat-Assimilation in Physcomitrella patens unterscheidet sich signifikant von derjenigen in höheren Pflanzen. Das Schlüsselenzym der Sulfat-Assimilation in höheren Pflanzen ist die Adenosin-5'-Phosphosulfat-Reduktase. In Physcomitrella patens koexistiert ein alternativer Stoffwechselweg über Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat-Reduktase (Koprivova et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195–32201). Dieser Stoffwechselweg ist in höheren Pflanzen nicht charakterisiert worden.
Ferner produzieren viele Vertreter der Familien der Moose, Algen und Farne eine große Auswahl an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Dembitsky (1993) Prog. Lipid Res. 32, 281–356). Beispielsweise werden Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vermutlich nur von niederen Pflanzen und nicht von höheren Pflanzen produziert. Einige Enzyme des Metabolismus der mehrfach ungesättigten Fettsäuren (der Delta-Desaturase-6-Acylgruppe) (Girke et al. (1998), Plant J., 15, 39–48) und eine Komponente einer Delta-6-Elongase (Zank et al. (2002) Plant J 31, 255–268), sind von Physcomitrella patens kloniert worden. In höheren Pflanzen sind keine korrespondierenden Gene gefunden worden. Diese Tatsache scheint zu bestätigen, dass essentielle Unterschiede zwischen höheren Pflanzen und niederen Pflanzen auf der biochemischen Ebene bestehen.
Weitere Unterschiede zeigen sich bei der Regeneration der Zellwand. Von höheren Pflanzen abgeleitete Protoplasten regenerieren neue Zellwände auf eine schnelle Art und Weise, und zwar unabhängig vom Kulturmedium. Ein direkter DNA-Transfer mittels Polyethylenglykol (PEG) in Protoplasten höherer Pflanzen erfordert eine Vorinkubation bei 4 bis 10 °C, um den Prozess der Zellwandregeneration zu verlangsamen (US-Patent 5508184). Demgegenüber ist die Zellwandregeneration von Protoplasten, die vom Protonema von Physcomitrella patens abgeleitet sind, abhängig vom Kulturmedium. Protoplasten können über längere Zeiträume ohne Regeneration der Zellwand kultiviert werden. Ohne die Absicht, an Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass sich die für die Zellwandregeneration und Proteinglykosylierung essentielle Sekretionsmaschienerie des Moosprotoplasten von derjenigen höherer Pflanzen unterscheidet. Ferner zeigt Physcomitrella patens eine hocheffiziente homologe Rekombination mit ihrer nukleären DNA, eine für Pflanzen einmalige Eigenschaft, wodurch gezielte Genunterbrechungen ermöglicht werden (Girke et al. (1998) Plant J, 15, 39–48; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4368–4373; Koprivova (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195–32201; bewertet von Reski (1999) Planta 208, 301–309; Schaefer und Zryd (2001) Plant Phys 127, 1430–1438; Schaefer (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53, 477–501), ferner illustrierend die fundamentalen Unterschiede zu höheren Pflanzen. Die Nutzung dieses Mechanismus zur Veränderung von Glykosylierungsmustern hat sich jedoch als problematisch erwiesen, wie nachfolgend beispielhaft gezeigt wird. Die Unterbrechung der N-Acetylglucosaminyltransferase I (GNT1) in Physcomitrella patens führte zum Verlust des spezifischen Transkripts, aber lediglich zu geringen Unterschieden des N-Glykosylierungsmusters. Diese Ergebnisse standen in direktem Gegensatz zum Verlust der Golgi-modifizierten komplexen Glykane, der in einer mutierten Arabidopsis thaliana Pflanze ohne GNT1 von v. Schaewen et al. (1993) Plant Physiol 102, 1109–1118) beobachtet wurde. Demnach führte der Knockout in Physcomitrella patens nicht zu den erwarteten Modifikationen des N-Glykosylierungsmusters.
Obwohl die Knockout-Strategie für GNT1 nicht erfolgreich war, versuchten die Erfinder den Knockout der Beta-1,2-Xylosyltransferase (XylT) und der Alpha-1,3-Fucosyltransferase (FucT) in Physcomitrella patens. Spezifische Transkripte konnten in den resultierenden Pflanzen nicht nachgewiesen werden. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die von den transgenen Pflanzen isolierten N-gebundene Glykane in der gewünschten Art und Weise modifiziert waren. Bei den N-gebundenen Glykanen der FucT Knockout-Pflanzen konnten keine 1,3-gebundenen Fucosylreste nachgewiesen werden, während bei den N-gebundenen Glykanen der XyltT Knockout-Pflanzen keine 1,2-gebundenen Xylosylreste nachgewiesen werden konnten. Die isolierten transgenen Linien zeigten normales Wachstum, was überraschend ist, wenn man bedenkt, dass die pflanzenspezifische Glykosylierung hoch konserviert ist und man deshalb erwarten würde, dass sie für die Funktion bedeutsam ist. Doppel-Knockouts sollten deshalb erwartungsgemäß einen schädlichen Einfluss auf das Mooswachstum haben. Außerdem wurde eine Kompensierung erwartet, welche aber überraschenderweise nicht ersichtlich war. Darüber hinaus führte der Doppel-Knockout von FucT und XylT zu modifizierten N-gebundenen Glykanen ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste.
Die Integration der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase in das Genom einer Doppel-Kockout Physcomitrella patens-Pflanze resultierte in einem Säuger-ähnlichen N-gebundenen Glykosylierungsmuster ohne die pflanzenspezifische Fucosyl- und Xylosylreste und mit Säuger-ähnlichen terminalen 1,4 Galaktosylresten. Die Galaktosyltransferase erwies sich als aktiv. Eine derartige Modifikation der N-gebundenen Glykane ohne Verlust der Viabilität war nicht erwartet worden, weil die N-Glykosylierung sehr komplex und gut reguliert ist. Sie ist nicht nur abhängig von Entwicklungsstadien (für Pflanzen: Elbers et al. (2001) Plant Phys 126, 1314–1322), sondern auch von Kulturbedingungen (für Säugerzellkultur: Hills et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75, 239–251).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines effizienteren Verfahrens für die Herstellung tierischer Proteine mit tierischen Glykosylierungsmustern, und insbesondere glykosylierter humaner Proteine, die humane Glykosylierungsmuster umfassen. Ein weiteres Ziel betrifft die Bereitstellung eines effizienten Verfahrens für die Herstellung heterologer tierischer Proteine, die tierische Glykosylierungsmuster umfassen, insbesondere humaner Proteine, die humane Glykosylierungsmuster umfassen, in Moosen wie Physcomitrella patens.
Diese und andere Ziele werden in der folgenden Beschreibung und den vorliegenden Beispielen verdeutlicht.
Detaillierte Beschreibung
Erfindungsgemäß wird eine transformierte Mooszelle bereitgestellt, die ein Doppel-Knockout der Fucosyltransferase und Xylosyltransferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren.
Die erfindungsgemäße Mooszelle gehört zu einem Moos, ausgewählt aus der Gruppe der Moose einschließlich Lebermoose, aus Spezies der Gattungen Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia und Sphaerocarpos. Die Mooszelle ist bevorzugt von Physcomitrella patens.
Die Mooszelle, wie beispielsweise eine Physcomitrella patens-Zelle, kann irgendeine Zelle sein, die für eine Transformation nach dem vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, und kann eine Moosprotoplastenzelle oder eine andere Zelle sein, die in Protonemagewebe oder einem anderen Zelltyp gefunden wird.
Tatsächlich wird der Fachmann erkennen, dass die vorliegende Erfindung ebenfalls Moospflanzengewebe mit Populationen erfindungsgemäß transformierter Mooszellen wie beispielsweise transformiertes Protonemagewebe umfasst.
Der vorliegend verwendete Begriff „dysfunktional" bedeutet, dass die nominierten Transferase-Nukleotidsequenzen der Fucosyltransferase (fucT) und Xylosyltransferase (xylT) im Wesentlichen unfähig sind zur Kodierung von mRNA, die für funktionale FucT- und XylT-Proteine kodiert, welche zur Modifikation pflanzlicher N-gebundener Glykane mit pflanzenähnlichen Glykosylierungmustern einschließlich 1,3-gebundener Fucosyl- und 1,2-gebundener Xylosylreste befähigt sind. Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die pflanzlichen dysfunktionalen fucT- und xyltT Transferase-Nukleotidsequenzen zielgerichtete Insertionen exogener Nukleotidsequenzen in die endogenen, d.h. genomischen nativen FucT und Xylt-Gene des nukleären Moosgenoms (betreffend sowohl ein wirklich natives Moosgenom, wie es in Mooszellen vorliegt, die zuvor nicht mit anderen Nukleinsäuresequenzen transformiert worden sind, als auch ein transformiertes nukleäres Moosgenom, in das man zuvor gewünschte Nukleinsäuresequenzen insertiert hat, wodurch die Transkription der mRNA, die für funktionale FucT- und XylT-Transferaseaktivität kodiert, wesentlich inhibiert oder reprimiert wird.
Erfindungsgemäße Mooszellen oder Vorläufer davon können irgendwelche sein, die vorher mit interessierenden heterologen Zielgenen transformiert worden sind, die für Proteinprimärsequenzen kodieren, die mit Säuger-Glykosylierungsmustern gemäß vorliegender Beschreibung glykosyliert sind. Vorzugsweise sind die Glykosylierungsmuster menschlichen Typs. Alternativ kann die Mooszelle mehrfach, d.h. gleichzeitig oder nacheinander, mit Nukleotidsequenzen transformiert werden, die für mindestens eine interessierende primäre Proteinsequenz kodieren, typischerweise für mindestens ein interessierendes pharmazeutisches Protein zur Verwendung für Menschen oder Säuger, wie beispielsweise für Nutztierspezies einschließlich Rind, Schaf, Pferd und Schwein, wofür sie den vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren mit Säuger-Glykosylierungsmustern versehen werden müssen. Derartige pharmazeutische Glykoproteine zur Verwendung für Säuger einschließlich des Menschen schließen Proteine ein wie Insulin, Präproinsulin, VEGF, Proinsulin, Glukagon, Interferone wie Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, Blutgerinnungsfaktoren ausgewählt aus Faktor VII, VIII, IX, X, XI, und XII, Fertilitätshormone einschließlich luteinisierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon, Wachstumsfaktoren einschließlich epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor und dergleichen, Prolaktin, Oxytocin, Thyroid-stimulierendes Hormon, adrenokortikotropes Hormon, Calcitonin, Parathyroid-Hormon, Somatostatin, Erythropoietin (EPO), Enzyme wie Beta-Glukocerebrosidase, Hämoglobin, Serumalbumin, Kollagen, Fusionsproteine wie das Fusionsprotein aus der Liganden-Bindungsdomäne des TNF-alpha-Rezeptors und dem Fc-Teil eines IgG und dergleichen, ohne auf sie beschränkt zu sein. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren für die Herstellung von Antikörpern wie spezifischen monoklonalen Antikörpern oder aktiven Fragmenten davon angewendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird eine transformierte Mooszelle bereitgestellt, die ein Doppel-Knockout der Fucosyltransferase und Xylosyltransferase, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren und eine Nukleotidsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in der Mooszelle steuert, wobei die Nukleotidsequenz eine funktionale Säuger-Galaktosyltransferase kodiert, die in der Mooszelle exprimiert wird.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz für die Säuger-Galaktosyltransferase- eine solche für die Beta-1,4 Galaktosyltransferase (Beta-1,4 galT), und am meisten bevorzugt für die humane Beta-1,4 Galaktosyltransferase. Dem Fachmann wird bewusst sein, dass die Beta-1,4 galT-Nukleotidsequenz eine cDNA-Sequenz oder eine genomische DNA-Sequenz sein und eine degenerativ äquivalente Beta-1,4 galT-Nukleotidsequenz umfassen kann, solange das N-Glykan-Glykosylierungsmuster irgendeines gewünschten, in den erfindungsgemäß transformierten Mooszellen oder Moosgeweben produzierten glykosylierten exogenen Proteins im Wesentlichen, wenn nicht vollständig ein Säugermuster aufweist, welches in geeigneten Fällen am meisten bevorzugt ein humanes Muster ist.
Detaillierte Informationen über die Kultivierung erfindungsgemäß geeigneter Moose wie beispielsweise Leptobryum pyriforme und Sphagnum magellanicum in Bioreaktoren sind im Stand der Technik beschrieben (siehe z.B. E. Wilbert, Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Berücksichtigung des Arachidonsäurestoffwechsels, Dissertation, Universität Mainz (1991); H. Rudolph und S. Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, S. 67–73 (1992)). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt ist die Verwendung von Physcomitrella, insbesondere, deshalb weil alle gängigen molekularbiologischen Techniken für diesen Organismus etabliert sind (Übersicht bei R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, S. 1–15 (1998)).
Für die biotechnologische Nutzung von Physcomitrella zur Produktion heterologer Proteine wurden geeignete Transformationssysteme entwickelt. Erfolgreiche Transformationen wurden beispielsweise durch den direkten DNA-Transfer in Protonemagewebe mit der "Particle gun" durchgeführt. Ebenfalls erfolgreich war der PEG-vermittelte DNA-Transfer in Moosprotoplasten. Die PEG-vermittelte Transformationsmethode wurde für Physcomitrella mehrfach beschrieben und führt sowohl zu transienten als auch zu stabilen Transformanten (siehe z.B. K. Reutter und R. Reski, Production of a heterologous Protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture, und Biotech., 2, S. 142–147 (1996)).
Nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung mindestens einer Mooszelle bereitgestellt, die ein Doppel-Knockout von Fucosyl-Transferase und Xylosyl-Transferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren, umfassend das Einführen in die Zelle von i) einer ersten Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Fucosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist und ii) das Einführen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Xylosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist.
Dementsprechend wird durch die vorliegende Erfindung auch ein Satz von Nukleinsäurevektoren bereitgestellt, die geeignet sind zur Herstellung mindestens einer transformierten Mooszelle, die ein Doppel-Knockout von Fucosyl-Transferase und Xylosyl-Transferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren, wobei der Satz von Nukleinsäurevektoren i) eine erste Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Fucosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist, und ii) eine zweite Nukleinsäuresequenz umfasst, die spezifisch auf eine endogene Xylosyltransferase-Nukleinsäuresequenz gerichtet ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Satz von Nukleinsäurevektoren außerdem ein Polynukleotid ein, welches ein glykosyliertes Polypeptid kodiert. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt der Satz von Nukleinsäurevektoren außerdem ein Polynukleotid ein, welches eine funktionale Säuger-Glykosyltransferase wie vorzugsweise eine Säuger-Glykosyltransferase kodiert, wobei ein für eine humane Beta 1,4-Galaktosyltransferase kodierendes Polynukleotid am meisten bevorzugt ist.
Auf der Basis des Satzes von Nukleinsäurevektoren werden zudem erfindungsgemäß auch Wirtszellen, die einen derartigen Satz von Nukleinsäurevektoren enthalten, Verfahren zur Herstellung solcher Wirtszellen einschließlich der Einführung des Satzes von Nukleinsäurevektoren in die Zelle mittels Transformation, Verwendungen des Satzes von Nukleinsäurevektoren für die Herstellung einer transgenen Mooszelle bereitgestellt.
Dem Fachmann wird bewusst sein, dass die Reihenfolge der Einführung der ersten und zweiten Transferase-Nukleinsäuresequenzen in die Mooszelle nicht wichtig ist, denn sie kann in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
Die ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen können gezielt auf spezifische Bereiche der endogenen, nativen fucT- und xylT-Gene gerichtet im nukleären Genom der Mooszelle sein, was anhand spezifischer Restriktionsenzym-Schnittstellen festgelegt wird, wie es zum Beispiel in den vorliegenden Beispielen beschrieben wird. Durch spezifisches Targeting der Sequenzen der nativen fucT- und xylT-Transferase-Gene mit Nukeotidsequenzen, die spezifisch in die interessierenden nativen Transferasegene integrieren, wird die Expression der Sequenzen wesentlich gestört, wenn nicht vollständig unterbunden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung mindestens eines heterologen oder exogenen glykosylierten Säugerproteins in einer transformierten Mooszelle bereitgestellt, umfassend:

i) das Einführen einer ersten isolierten Nukleinsäure in die Zelle, die eine erste Nukleinsäuresequenz umfasst, welche spezifisch auf eine endogene Fucosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist; und
ii) das Einführen einer zweiten Nukleinsäuresequenz in die Zelle, die spezifisch auf eine endogene Xylosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist; und
iii) das Einführen einer dritten isolierten Nukleinsäuresequenz in die Zelle, die eine Nukleinsäure umfasst, welche funktionsfähig mit einem exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in einer Mooszelle steuert, wobei die Nukleotidsequenz mindestens ein Säuger-Galaktosyltransferase-Polypeptid kodiert.

In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das mindestens eine Säuger-Galaktosyltransferase-Polypeptid bevorzugt von einer Beta-1,4 Galaktosyltransferase-(Beta-1,4 galT) und am meisten bevorzugt von einer humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Nukleotidsequenz kodiert.
Vorzugsweise sind alle hier erwähnten Säugerproteine humanen Typs. Andere Proteine, die für die erfindungsgemäße Herstellung in Betracht kommen, schließen Proteine zur tiermedizinischen Verwendung ein und können mit tierischen Homologen der hier genannten humanen Proteine korrespondieren.
Ein exogener Promotor bezeichnet einen Promotor, der vor eine Ziel-Nukleinsäuresequenz eingeführt und funktionsfähig mit dieser verknüpft ist. Folglich ist ein exogener Promotor ein Promotor, der vor eine der vorliegend definierten ausgewählten Nukleinsäure-Komponenten platziert worden ist, und er ist nicht der natürliche oder native Promotor, der üblicherweise wie z.B. unter Wildtyp-Bedingungen, mit der interessierenden Nukleinsäurekomponente verbunden ist. Daher kann es sich um einen für eine interessierende Mooszelle nativen Promotor handeln, aber er darf sich in Wildtyp-Mooszellen nicht vor der interessierenden Nukleinsäure befinden und funktionsfähig mit dieser verknüpft sein. Typischerweise ist ein exogener Promotor ein Promotor, der von einer anderen Quelle als derjenigen der Wirtszelle in eine Wirtsmooszelle übertragen wird.
Die für die vorliegend beschriebenen galT-Proteine, glykosylierten und Säuger-Proteine kodierenden cDNAs enthalten mindestens einen in einer Mooszelle funktionsfähigen Promotor-Typ, wie beispielsweise einen induzierbaren oder einen konstitutiven Promotor, der funktionsfähig mit einer galT-Nukleinsäuresequenz und/oder einer zweiten Nukleinsäuresequenz für ein glykosyliertes Säuger-Protein verknüpft ist, wie vorliegend definiert und erfindungsgemäß bereitgestellt wird. Wie beschrieben, ermöglicht dies die Kontrolle der Expression des bzw. der Gene.
Der einem Promotor zugeordnete Begriff „induzierbar" ist dem Fachmann gut bekannt. Im Wesentlichen wird die Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors in Reaktion auf einen gegebenen Stimulus (der innerhalb einer Zelle generiert oder exogen bereitgestellt werden kann) „angeschaltet" oder gesteigert. Die Art des Stimulus variiert zwischen Promotern. Einige induzierbare Promotoren bewirken in Abwesenheit des entsprechenden Stimulus eine geringe oder nicht nachweisbare Expressionsrate (oder keine Expression). Andere induzierbare Promotoren bewirken in Abwesenheit des Stimulus eine nachweisbare konstitutive Expression. Unabhängig von der Expressionsrate in Abwesenheit des Stimulus wird, die Expression eines jeden induzierbaren Promotors in Anwesenheit des richtigen Stimulus gesteigert. Die bevorzugte Situation ist, wenn die Expressionsrate nach Bereitstellung des relevanten Stimulus auf einen Wert steigt, durch den eine phänotypische Eigenschaft wirksam verändert werden kann. Demnach kann ein induzierbarer („schaltbarer") Promotor verwendet werden, der in Abwesenheit des Stimulus eine Basis-Expressionsrate bewirkt, wobei diese Rate zu gering ist, um einen gewünschten Phänotyp hervorzurufen (und tatsächlich Null sein kann). Nach der Bereitstellung des Stimulus wird die Expression auf ein Niveau gesteigert (oder angeschaltet), welches den gewünschten Phänotyp hervorruft.
Wie bereits erwähnt, sind die Moos-Expressionssysteme dem Fachmann ebenso bekannt. Ein Moos-Promotor, insbesondere ein Promotor von Physcomitrella patens, ist irgendeine DNA-Sequenz, die eine DNA-abhängige RNA-Polymerase eines Wirtes binden und die eine stromabwärts (3') gerichtete Transkription einer kodierenden Sequenz (z.B. eines Strukturgens) in eine mRNA initiieren kann. Ein Promotor wird einen Bereich der Transkriptionsinitiation haben, der sich üblicherweise nah am 5'-Ende der kodierenden Sequenz befindet. Dieser Bereich der Transkriptionsinitiation schließt üblicherweise eine RNA- Polymerase-Bindungsstelle (die „TATA-Box") und eine Transkriptionsinitiationstelle ein. Ein Moos-Promotor kann auch eine zweite Domäne haben, die als stromaufwärtsgelegene Aktivatorsequenz („upstream activator sequence", UAS) bezeichnet wird und sich falls vorhanden, üblicherweise distal vom Strukturgen befindet. Die UAS ermöglicht eine regulierte (induzierbare) Expression. Eine konstitutive Expression erfolgt in Abwesenheit einer UAS. Eine regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder verstärkt oder reduziert wird.
Der Fachmann weiß, dass Moos-Promotorsequenzen, die Enzyme der Stoffwechselwege in Moosen kodieren, besonders nützliche Promotorsequenzen bereitstellen können.
Zusätzlich können auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als Moos-Promotoren fungieren. Beispielsweise können UAS-Sequenzen eines Moos-Promotors mit dem Bereich der Transkriptionsaktivierung eines anderen Moos-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybrid-Promotor entsteht. Ein Beispiel für einen geeigneten Promotor betrifft denjenigen, der in dem TOP 10 Expressionssystem für Physcomitrella patens von Zeidler et al. ((1996) Plant. Mol. Biol. 30, 199–205) verwendet worden ist. Ferner kann ein Moos-Promotor natürlich vorkommende und nicht vom Moos stammende Promotoren einschließen, die die Fähigkeit haben, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase eines Mooses zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren schließen die beschriebenen ein, u.a. den P-Actin-1-Promotor vom Reis und den RbcS-Promotor von Chlamydomonas (Zeidler et al. (1999) J. Plant Physiol. 154, 641–650), Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1078, 1980; Henikoff et al., Nature, 283: 835, 1981; Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119, 1981; Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timms und A. Puhler), 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene, 11: 163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet., 2: 109, 1980).
Ein DNA-Molekül kann in Moosen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein. In diesem Fall wird die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer Methionin sein, welche durch das Startcodon AUG der mRNA kodiert wird. Sofern gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus durch Inkubation mit Cyanogenbromid in vitro vom Protein abgespalten werden.
Alternativ können Fremdproteine von der Mooszelle auch in das Wachstumsmedium sekretiert werden, in dem chimäre DNA-Moleküle geschaffen werden, die ein Fusionsprotein kodieren, welches ein Leadersequenz-Fragment umfasst, das für eine Sekretion des Fremdproteins in oder aus Mooszellen heraus sorgt. vorzugsweise sind zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen Prozessierungsstellen kodiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment kodiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
Eine für geeignete Signalsquenzen kodierende DNA kann abgeleitet werden von Genen für sekretorische Moosproteine, und es gibt Leadersequenzen, die nicht von Moos stammen, wie beispielsweise eine VEGF-Leadersequenz, die eine Sekretion in Mooszellen ebenfalls ermöglichen.
Terminationssequenzen der Transkription, die in Mooszellen erkannt werden und funktional sind, sind regulatorische Regionen, die 3' vom Translationsstopcodon lokalisiert sind und daher zusammen mit dem Promotor die kodierenden Sequenzen flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert werden kann, welches von der DNA kodiert ist. Ein Beispiel für eine geeignete Terminationssequenz, die in Physcomitrella patens funktioniert, ist der Terminationsbereich des Blumenkohlmosaikvirus.
Typischerweise werden die Komponenten, umfassend einen Promotor, eine Leadersequenz (sofern gewünscht), eine interessierende Kodierungssequenz, und eine Transkriptions-Terminationssequenz, in erfindungsgemäßen Expressionskonstrukten zusammengeführt. Die Expressionskonstrukte werden oft in einem DNA-Plasmid gehalten, das ein extrachromosomales Element darstellt, welches in einem Wirt wie beispielsweise in einem Bakterium stabil aufrecht erhalten werden kann. Das DNA-Plasmid kann zwei Replikationsursprünge haben und somit beispielsweise die Expression in einem Moos und die Klonierung und Amplifikation in einem prokaryotischen Wirt ermöglichen, in einer Mooszelle. Im Allgemeinen ist es ausreichend, wenn das Plasmid einen Replikationsursprung zur Klonierung und Amplifikation in einer prokaryotischen Wirtszelle hat. Ferner kann ein DNA-Plasmid sowohl ein Plasmid mit geringer als auch hoher Kopienanzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl hat in der Regel eine Kopienanzahl von etwa 5 bis etwa 200, und üblicherweise etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl enthält, wird bevorzugt mindestens 10, und besonders bevorzugt mindestens 20 haben. Es kann entweder ein Vektor mit geringer oder mit hoher Kopienanzahl ausgewählt werden, was von der Wirkung des Vektors und vom Fremdprotein auf den Wirt abhängt (siehe z.B. Brake et al., oben).
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Moosgenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine Sequenz mit Homologie zu einem Mooschromosom, wodurch der Vektor integrieren kann, und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionskonstrukt flankieren. Ein integrierender Vektor kann durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz für das Einschleusen auf einen spezifischen Locus im Moos gerichtet sein, wie hier beschrieben und beispielhaft erläutert wird. Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren. Die in den Vektor eingebauten chromosomalen Sequenzen können entweder als einzelnes Segment im Vektor vorliegen, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder sie liegen in Form zweier homologer Segmente zu benachbarten Sequenzen im Chromosom vor und flankieren das Expressionskonstrukt im Vektor, was lediglich zur stabilen Integration des Expressionskonstrukts führen kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um transformierte Mooszellen selektieren zu können.
Selektierbare Marker können biosynthetische Gene einschließen, die in dem Wirtsmoos exprimiert werden können, wie beispielsweise die Resistenzgene G418 oder Hygromycin B, die Mooszellen Resistenz gegen G418 bzw. Hygromycin B verleihen. Ferner kann ein geeigneter selektierbarer Marker Mooszellen auch die Fähigkeit verleihen zum Wachstum in Gegenwart toxischer Stoffe, wie beispielsweise Metall.
Alternativ können einige der oben genannten Komponenten zusammen in Transformationsvektoren eingebracht werden. Transformationsvektoren umfassen üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem DNA-Plasmid verbleibt oder gemäß obiger Darlegung zu einem integrierenden Vektor weiterentwickelt wird.
Methoden zur Einführung exogener DNA in Mooszellen sind im Stand der Technik gut bekannt und u.a beschrieben von D.G. Schaefer, "Principles and protocols for the moss Physcomitrella patens", (May 2001), Institute of Ecology, Laboratory of Plant Cell Genetics, University of Lausanne, Didier.Schaefer@ie-pc.unil.ch; K. Reutter und R. Reski, Plant Tissue Culture and Biotechnology September 1996, Vol.2, Nr.3; M. zeidler et al., (1996), Plant Molecular Biology 30:199–205.
Fachleute sind in der Lage, Vektoren zu konstruieren und Protokolle für die Expression rekombinanter Nukleinsäuresequenzen oder Gene zu erstellen. Geeignete Vektoren können ausgewählt oder konstruiert werden, die geeignete regulatorische Sequenzen einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und gewünschtenfalls andere Sequenzen enthalten. Für weitere Details siehe z.B. "Molecular Cloning: a Laboratory Manual": Zweite Auflage, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle für die Manipulation einer Nukleinsäure wie beispielsweise die Präparation von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, und Proteinanalyse, sind detailliert beschrieben in „Current Protocols in Molecular Biology", Zweite Auflage, Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons, 1992. Die Veröffentlichungen von Sambrook et al. und Ausubel et al. sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Natürlich ist dem Fachmann bewusst, dass jede Nukleinsäuresequenz, die für die geeignete GalT und das zu glykosylierende Polypeptid kodiert, unter der regulatorischen Kontrolle seines eigenen exogenen Promotors und Terminator stehen wird. Wenn zwei oder mehrere Zielproteine von einer einzigen Carrier-RNA produziert werden sollen, ist es bevorzugt, wenn sie leicht zu trennen sind, z.B. durch die Bindung an verschiedene proteinspezifische Antikörper (monoklonal oder polyklonal) in der Erntephase des Mooszellkultursystems.
Wie oben beschrieben, können selektierbare genetische Marker die Selektion transgener Mooszellen erleichtern und aus chimären Genen bestehen, die selektierbare Phänotypen hervorrufen.
Den Fachleuten ist bekannt, dass bei der Einführung ausgewählter Nukleinsäuresequenzen für eine Glykosyltransferase und ein zu glykosylierendes Polypeptid in eine Mooszelle bestimmte Überlegungen angestellt werden müssen. Die einzuführenden Nukleinsäure(n) sollte(n) innerhalb eines Konstrukts bereitgestellt werden, welches wirksame regulatorische Elemente zur Steuerung der Transkription enthält. Es muss ein Verfahren zum Transport des Konstruktes in die Zelle zur Verfügung stehen. Sobald sich das Konstrukt innerhalb der Zellmembran befindet, wird die Integration in das endogene chromosomale Material entweder erfolgen oder nicht.
Die Erfindung umfasst ferner eine mit den zuvor beschriebenen Vektoren oder Konstrukten transformierte Wirtszelle wie insbesondere eine Mooszelle oder eine mikrobielle Zelle. Demnach wird eine Wirtszelle, wie beispielsweise eine Mooszelle, einschließlich der vorliegend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen bereitgestellt. In der Zelle kann die Nukleotidsequenz in das Chromosom eingebaut sein.
Erfindungsgemäß wird auch eine Mooszelle bereitgestellt, in deren Genom mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingebaut ist, wie insbesondere eine heterologe Nukleotidsequenz, die unter der operativen Kontrolle der vorliegend beschriebenen regulatorischen Sequenzen zur Kontrolle der Expression stehen. Die kodierende Sequenz kann funktionsfähig mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen verknüpft sein, welche bezüglich der in der Erfindung eingesetzten Nukleotidsequenzen heterolog oder fremd sind oder hinsichtlich ihrer Expression nicht natürlicherweise mit der bzw. den Nukleinsäuresequenzen assoziiert sind. Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz kann unter die Kontrolle eines extern induzierbaren Promotors gestellt werden, damit die Expression vom Anwender kontrolliert werden kann. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer derartigen Mooszelle wie vorzugsweise einer Zelle von Physcomitrella patens und beinhaltet das Einführen erfindungsgemäß zur Verwendung vorgeschlagener Nukleinsäuresequenzen oder wenigstens eines geeigneten diesen Sequenzen einschließenden Vektors in eine Mooszelle, und das Herbeiführen einer Rekombination zwischen dem Vektor und dem Mooszellgenom, um die Sequenzen in das Genom einzubringen. Die Erfindung erstreckt sich auf Mooszellen wie vorzugsweise Zellen von Physcomitrella patens, die ein GalT-Nukleotid und/oder eine Nukleotidsequenz enthalten, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, der ein Säuger-Glykosylierungsmuster verliehen werden soll, und die infolge der Einführung der Nukleotidsequenz in eine Vorläuferzelle für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet ist.
Der Begriff „heterolog" wird verwendet, um darauf hinzuweisen, dass das fragliche Gen bzw. die Nukleotidsequenz unter Anwendung gentechnischer Verfahren, d.h. durch Einwirkung des Menschen in Mooszellen oder eine Vorläuferzelle davon eingebracht worden ist. Es wird eine transgene Mooszelle bereitgestellt wobei sich diese Eigenschaft auf die fragliche Nukleotidsequenz bezieht. Das Transgen kann sich auf einem extragenomischen Vektor befinden oder in das Genom eingebaut, bevorzugt stabil, eingebaut sein. Ein heterologes Gen kann ein endogenes äquivalentes Gen ersetzen, d.h. ein Gen, welches normalerweise die gleiche oder eine ähnliche Funktion erfüllt, oder die eingeführte Sequenz kann zusätzlich zum endogenen Gen oder einer anderen Sequenz vorhanden sein. Ein Vorteil der Einführung eines heterologen Gens liegt in der Möglichkeit, die Expression einer Sequenz unter die Kontrolle eines gewünschten Promotors zu stellen, um die Expression wunschgemäß beeinflussen zu können. Nukleotidsequenzen, die für eine Mooszelle heterolog, exogen oder fremd sind, können in Zellen dieses Typs, Stamms oder dieser Spezies in nicht natürlicher Weise vorkommen. Demnach kann eine Nukleotidsequenz eine kodierende Sequenz einschließen, die von einem besonderen Typ einer Mooszelle stammt oder von ihr abgeleitetet ist, wie beispielsweise eine Zelle von Physcomitrella patens, und die in den Kontext einer Mooszelle eines anderen Typs oder einer anderen Spezies eingebracht worden ist. Eine weitere Möglichkeit betrifft das Einbringen einer Nukleotidsequenz in eine Mooszelle, in welcher sie oder ein Homolog derselben natürlicherweise vorkommt, wobei die Nukleotidsequenz aber mit einer Nukleinsäure verknüpft und/oder ihr benachbart ist, die natürlicherweise nicht in der Zelle vorkommt, oder in Zellen dieses Typs oder dieses Spezies oder dieses Stamms, wie beispielsweise bei funktionsfähiger Verknüpfung mit einer oder mehreren, die Expression kontrollierenden regulatorischen Sequenzen, wie einer Promotorsequenz. Eine Sequenz in einer Moos- oder anderen Wirtszelle kann identifizierbar heterolog, exogen oder fremd sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch das gewünschte Polypeptid-Expressionsprodukt aus der Kombination der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, wie sie vorliegend offenbart werden bzw. wie sie in Übereinstimmung mit den vorliegenden Informationen und Vorschlägen erhältlich sind. Ferner werden Verfahren zur Herstellung eines derartigen Expressionsprodukts mittels Expression dafür kodierender Nukleotidsequenzen unter geeigneten Bedingungen in geeigneten Wirtszellen wie z.B. E. coli bereitgestellt. Der Fachmann kann Vektoren konstruieren und Protokolle sowie Systeme für die Expression und Gewinnung der Produkte aus der rekombinanten Genexpression erstellen.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein Allel, eine Variante, ein Fragment, ein Derivat, eine Mutante oder ein Homolog des bzw. eines vorliegend genannten Polypeptids sein. Das Allel, die Variante, das Fragment, das Derivat, die Mutante oder das Homolog kann im Wesentlichen die gleiche Funktion der oben erwähnten Polypeptide haben oder eine funktionale Mutante davon betreffen. Im Kontext pharmazeutischer Proteine, wie sie hier für die Verwendung beim Menschen beschrieben worden sind, wird dem angesprochenen Fachmann bewusst sein, dass die Primärsequenz derartiger Proteine und deren Glykosylierungsmuster die- bzw. dasjenige des Menschen nachempfunden oder vorzugsweise mit dem des Menschen identisch ist.
Der in Beziehung zu einer erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz verwendete Begriff „Homologie" bezieht sich auf die Identität oder Ähnlichkeit, vorzugsweise jedoch auf die Identität. Wie bereits oben erwähnt, kann eine hohe Identität der Aminsäure beschränkt sein auf funktional signifikante Domänen oder Bereiche, z.B. auf irgendeine der vorliegend genannten Domänen.
Insbesondere werden erfindungsgemäß Homologe der vorliegend bereitgestellten besonderen und vom Moos abgeleiteten Polypeptidsequenzen als auch Mutanten, Varianten, Fragmente und Derivate derartiger Homologe bereitgestellt. Derartige Homologe sind anhand der vorliegenden Offenbarung einfach erhältlich. Natürlich umfasst die vorliegende Erfindung auch Homologe der glykosylierten Proteinsequenzen an sich und damit solche Homologe, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes Aminosäuresequenzen hervorbringen, die wirkliche Kopien (d.h. zu 100 identisch) der interessierenden Säugerproteine, und insbesondere der interessierenden humanen Proteine sind. Demnach erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf Polypeptide, die Aminosäuresequenzen mit GalT-Funktion einschließen, wie sie vorliegend definiert und unter Verwendung der vorliegenden Sequenzinformationen erhältlich sind. Die GalT-Homologe können auf der Ebene der Aminosäuren Homologie aufweisen, d.h. identisch sein mit den im erwähnten Stand der Technik und im Beispielteil unter Angabe der Daten-Zugangsnummern beschriebenen Aminosäurensequenzen, d.h. sie können eine Homologie von vorzugsweise mindestens etwa 50%, oder mindestens etwa 55%, oder mindestens etwa 60%, oder mindestens etwa 65%, oder mindestens etwa 70%, oder mindestens etwa 75%, oder mindestens etwa 80%, oder mindestens etwa 85%, oder mindestens etwa 88%, oder mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt eine Homologie von mindestens etwa 95% oder höhere unter der Voraussetzung aufweisen, dass derartige Proteine eine GalT-Aktivität aufweisen, die im erfindungsgemäßen Zusammenhang angemessen ist.
Nach bestimmten Ausführungsformen kann ein Allel, eine Variante, ein Derivat, ein Mutantenderivat, eine Mutante oder ein Homolog der spezifischen Sequenz gegenüber der spezifischen Sequenz lediglich eine geringe Gesamt-Homologie aufweisen, wie etwa 20%, oder etwa 25%, oder etwa 30%, oder etwa 35%, oder etwa 40%, oder etwa 45%. Hingegen kann die Aminosäure-Homologie in den funktional signifikanten Domänen oder Bereichen sehr viel höher sein. Mutmaßlich funktional signifikante Domänen oder Bereiche können unter Anwendung von Methoden der Bioinformatik einschließlich des Vergleichs der Sequenzen von Homologen identifiziert werden.
Funktional signifikante Domänen oder Bereiche verschiedener Polypeptide können kombiniert werden für die Expression einer kodierenden Nukleinsäure in Form eines Fusionsproteins. Beispielsweise können besonders vorteilhafte oder wünschenswerte Eigenschaften verschiedener Homologe zu einem Hybridprotein kombiniert werden, so dass das resultierende Expressionsprodukt mit GalT-Funktion geeignetenfalls Fragmente verschiedener Stammproteine einschließen kann.
Ähnlichkeiten von Aminosäuresequenzen können definiert und bestimmt werden mittels des TBLASTN-Programms von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10, das im Stand der Technik standardmäßig verwendet wird. Insbesondere kann TBLASTN 2.0 mit Matrix BLOSUM62 und den GAP-Penalitäten: Existenz: 11, Extension: 1 verwendet werden. Ein anderes Standardprogramm, das verwendet werden kann, ist BestFit, das Teil des Wisconsin-Pakets ist, Version 8, September 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). BestFit leistet ein optimales Alignment des besten Ähnlichkeitssegments zweier Sequenzen. Optimale Alignments werden durch Einführung von Lücken gefunden, um die Anzahl der Übereinstimmungen unter Anwendung des lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482–489) zu maximieren. Andere Algorithmen schließen GAP ein und nutzen den Algorithmus von Needleman und Wunsch zum Alignment zweier vollständiger Sequenzen, wobei hier die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl der Lücken minimiert werden. wie bei jedem Algorithmus werden üblicherweise die Standardparameter verwendet, die für die GAP-Penalitäten folgendermaßen lauten: Existenz 12 und Extension 4. Alternativ können GAP-Penalitäten von 3 (Existenz) bzw. 0,1 (Extension) verwendet werden. Der Algorithmus FASTA (der die Methode von Pearson und Lipman nutzt (1988) PNAS USA 85: 2444–2448) ist eine weitere Alternative.
Die Verwendung der beiden hier genannten Begriffe „Homologie" und „homolog" impliziert keine notwendige evolutionäre Beziehung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen und erfolgt damit beispielsweise in Übereinstimmung mit der standardmäßigen Verwendung von Begriffen wie „homologe Rekombination", was lediglich voraussetzt, dass zwei Nukleotidsequenzen ausreichend ähnlich sind, um unter den geeigneten Bedingungen zu rekombinieren.
Es versteht sich, dass die Inhalte aller hier zitierten Referenzen von der vorliegend offenbarten Lehre eingeschlossen sind.
Beispiele
Material und Methoden
Pflanzenmaterial
Eingesetzt wurde der Wildtypstamm von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., der charakterisiert worden ist von Reski et al. (1994) „Genome analysis of the moss Physcomitrella patens" (Hedw.) B.S.G.. Mol Gen Genet 244, 352–359). Er ist eine Subkultur des Stammes 16/4 aus der Sammlung von H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (GB), nach Vermehrung von Engel (1968) Am J Bot 55, 438–446.).
Herstellung von pRT101VEGF C3
Die cDNA des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 121 (VEGF₁₂₁) ohne Leadersequenz wurde als NdeI-SalI-Fragment aus pCYTEXP-VEGF₁₂₁ (erhältlich von GBF, Braunschweig, Deutschland) herausgeschnitten. Dieses Fragment hatte durch die Klenow-Reaktion blunt-ends und wurde an der SmaI-Restriktionsstelle in pRT101 (Töpfer et al. (1987) NAR 15, 589) eingeführt (unter Bildung des Plasmids pRT101VEGF C3). In dieses Konstrukt wurde die VEGF₁₂₁ cDNA ohne Leadersequenz stromabwärts des CaMV-Promotors eingeführt und durch den CaMV-Terminator terminiert worden (Gorr (1999) Biotechnologische Nutzung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.. Dissertation, Universität Hamburg).
Herstellung von pRT101TPVEGF C3
Die Sequenz für das VEGF-Signalpeptid (Sekretionssignal) wurde in pRT101VEGF C3 kloniert. Die Signalpeptid-cDNA wurde aus dem Plasmid pRT101 P21 amplifiziert (Gorr (1999), oben) unter Verwendung des eine XhoI-Restriktionsstelle enthaltenden 5' Primers MoB323 5'-ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT TGG-3'(SEQ ID NO 1) und des eine NcoI-Restriktionsstelle enthaltenden 3' Primers MoB349 5'-CTG CCA TGG GTG CAG CCT GGG ACC AC-3' (SEQ ID NO 2). Die amplifizierte DNA wurde mit XhoI und NcoI geschnitten und in pRT101VEGF C3 (geschnitten mit XhoI/NcoI) ligiert, wodurch pRT101TPVEGF C3 entstand. Das resultierende Plasmid enthielt die kodierenden Sequenzen für das VEGF-Signalpeptid und VEGF₁₂₁ im Leserahmen unter Kontrolle des CaMV 35 S-Promotors.
Standard-Kulturbedingungen
Die Pflanzen wuchsen axenisch unter sterilen Bedingungen in vollständig anorganischem flüssigen modifizierten Knop-Medium (1000 mg/l Ca(NO₃)₂ × 4H₂O, 250 mg/l KCl, 250 mg/l KH₂PO4, 250 mg/l MgSO₄ × 7 H₂O und 12.5 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O; pH 5,8 (Reski und Abel (1985) Planta 165, 354–358). Die Pflanzen wuchsen in 200 ml Kulturmedium enthaltenden 500 ml Erlenmeyerkolben, die auf einem Certomat R Schüttler (B. Braun Biotech International, Deutschland) mit 120 U.p.M. geschüttelt wurden. Die Temperatur in der Wachstumskammer betrug 25 +/– 3°C bei einem Verhältnis zwischen Licht- und Dunkelphase von 16:8 Stunden. Die Kolben wurden von oben mit zwei Fluoreszenzröhren (Osram L 58 W/25) beleuchtet, die 35 Mikromol pro Sekunde und Quadratmeter lieferten. Die Kulturen wurden einmal pro Woche durch Zerkleinern unter Verwendung eines Ultra-Turrax Homogenisators (IKA, Staufen, Deutschland) und durch Animpfen von zwei neuen 500 ml Erlenmeyerkolben mit je 100 ml frischem Knop-Medium subkultiviert.
Protoplasten-Isolierung
Nach der Filtrierung wurden die Moos-Protonemata in 0,5 M Mannitol präinkubiert. Nach 30 Minuten wurden der Suspension 4 % Driselase (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) hinzugefügt. Die Driselase wurde in 0,5 M Mannitol (pH 5,6–5,8) gelöst, 10 Minuten lang bei 3600 U.p.M zentrifugiert und mittels Passage durch einen 0,22 µm Filter (Millex GP, Millipore Corporation, USA) sterilisiert. Die 1% Driselase (Endkonzentration) enthaltende Suspension wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und behutsam geschüttelt (die besten Protoplasten-Ausbeuten wurden nach zweistündiger Inkubation erzielt) (Schaefer "Principles and protocols for the moss Physcomitrella patens", (Mai 2001) Institute of Ecology, Laboratory of Plant Cell Genetics, University of Lausanne Didier.Schaefer@ie-pc.unil.ch). Die Suspension wurde durch Siebe (Wilson, CLF, Deutschland) mit Porengrößen von 100 µm und 50 µm abfiltriert. Die Suspension wurde in sterilen Zentrifugenröhrchen zentrifugiert, und die Protoplasten wurden bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 55 g sedimentiert (Beschleunigung 3; Abbremsen 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Deutschland) (Schaefer, oben). Die Protoplasten wurden behutsam in W5-Medium (125 mM CaCl₂ × 2H₂O; 137 mM NaCl; 5,5 mM Glukose; 10 mM KCl; pH 5,6; 660–680 mOsm; steril filtriert) resuspendiert. Die Suspension wurde erneut bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 55 g zentrifugiert (Beschleunigung 3; Abbremsen 3; Multifuge 3 S-R, Kendro, Deutschland). Die Protoplasten wurden behutsam in W5-Medium resuspendiert (Rother et al. (1994) J Plant Physiol 143, 72–77). Für das Zählen der Protoplasten wurde ein kleines Volumen der Suspension in eine Fuchs-Rosenthal-Kammer überführt.
Transformationsprotokoll
Für die Transformation wurden die Protoplasten auf Eis im Dunkeln 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Protoplasten durch Zentrifugation bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 55 g sedimentiert (Beschleunigung 3; Abbremsen 3; Multifuge 3 S-R, Kendro). Die Protoplasten wurden in 3M-Medium (15 mM CaCl₂ × 2H₂O; 0,1 % MES; 0,48 M Mannitol; pH 5,6; 540 mOsm; steril filtriert, Schaefer et al. (1991) Mol Gen Genet 226, 418–424) mit einer Konzentration von 1,2 × 10⁶ Protoplasten/ml resuspendiert (Reutter und Reski (1996) „Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants", P1. Tissue culture and Biotech., 2, S. 142–147). 250 Mikroliter dieser Protoplastensuspension wurden in ein neues steriles Zentrifugenröhrchen gegeben, bevor 50 Mikroliter der DNA-Lösung (Säulen-gereinigte DNA in H₂O (Qiagen, Hilden, Deutschland); 10–100 Mikroliter; optimale DNA-Menge von 60 Mikrogramm) und schließlich 250 Mikroliter einer PEG-Lösung (40% PEG 4000; 0,4 M Mannitol; 0,1 M Ca(NO₃)₂; pH 6 nach Autoklavierunng) zugegeben wurden. Die Suspension wurde sofort behutsam gemischt und danach 6 Minuten lang bei Raumtemperatur mit gelegentlichem vorsichtigen Mischen inkubiert. Die Suspension wurde stufenweise durch Zugabe von 1, 2, 3 und 4 ml des 3M-Mediums verdünnt. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 20°C und 55 g zentrifugiert (Beschleunigung 3; Abbremsen 3; Multifuge 3 S-R, Kendro). Das Pellet wurde wie folgt resuspendiert:

a) Für transiente Transformationsexperimente in 300 Mikroliter oder 400 Mikroliter 3M-Medium. Die Kultivierung der transfomierten Protoplasten erfolgte in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen (300 Mikroliter, Nunclon, Nunc GmbH, Wiesbaden, Deutschland) oder 48 Vertiefungen (400 Mikroliter, Cellstar, Greiner Bio-one, Frickenhausen, Deutschland).
b) Für eine stabile Transformation in 3 ml Regenerationsmedium (modifiziertes Knop-Medium; 5% Glukose; 3% Mannitol; 540 mOsm; pH 5,6–5,8). Die Regeneration und Selektion erfolgten wie von Strepp et al. beschrieben (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4368–4373). Für die Selektion wurden die Knop-Medien entweder mit 50 Mikrogramm/ml G418 oder mit 30 Mikrogramm/ml Hygromycin B angereichert. Die Co-Transformation in die Protoplasten erfolgte durch paralleles Überführen von 10 Mikrogramm ungeschnittenem pRT99 (Töpfer et al. (1988) „Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells" NAR 16, 8725) enthaltend das nptII-Gen als Selektionsmarker, und von 10 Mikrogramm linearisierter DNA eines jeden Knockout- und/oder Integrationkonstrukts.

MALDI-Tof MS von Moosglykanen
Das Pflanzenmaterial wurde in flüssiger Kultur kultiviert, durch Filtrierung isoliert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert. Die Proteinbanden wurden aus Coomassie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen herausgeschnitten. Das Material wurde auf Trockeneis verschickt. Die MALDI-TOF MS-Analysen erfolgten im Labor von Prof. Dr. F. Altmann, Abteilung Glykobiologie am Institut für Chemie, Universität für Bodenkultur, Wien, Österreich.
0,2 bis 9 g Frischgewicht von Physcomitrella patens wurden mit Pepsin verdaut. Die N-Glykane wurden aus dem Ansatz erhalten, gemäß Darlegung Wilson et al. (2001) erhalten. Im Wesentlichen wurden die Glykane durch die Behandlung mit Peptid:N-Glykosidase A freigesetzt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie auf einem DYNAMO (Thermo BioAnalysis, Santa Fe, NM) analysiert.
Beispiele
1. Klonierung der 1,2-N-Acetylglucosaminyltransferase I aus Physcomitrella patens und Analyse der Knockout-Pflanzen
1.1 Klonierung der cDNA und genomischen DNA für GNTI
Ein Fragment der cDNA für das GNTI wurde erhalten mittels Durchführung von zwei PCR-Runden mit degenerierten Primern auf der cDNA von P. patens WT. Diese Primer wurden auf der Basis eines Protein-Alignments bekannter GNTIs von Pflanzen erstellt. In der ersten Runde wurden die Primer GNT(d)1 (5'-GTNGCNGCNGTNGTNGTNATGGC-3', SEQ ID NO 3) und GTN(d)3 (5'-CCYTTRTANGCNGCNC(TG)NGGNACNCC-3', SEQ ID NO 4) verwendet, und danach wurde das Produkt dieser PCR einer nachfolgenden PCR mit den Primern GTN(d)2 (5'-TAYAARATN(CA)GNCAYTAYAARTGG-3', SEQ ID NO 5) und GTN(d)4 (5'-ARRTAYTGYTTRAARAAYTGNCC-3', SEQ ID NO 6) zugeführt. Die PCR führte zu einem Produkt mit 500 Bp, das in pCR 4 TOPO kloniert und von beiden Enden sequenziert wurde.
Um das fehlende 5'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 5'-RACE durchgeführt mit den Primern: 5RACEG3 (5'-GTCCGTGTCCAATAAAGGAG-3', SEQ ID NO 7), 5RACEG4 (5'-GTCGGGAGAGATTTCCATGTC-3', SEQ ID NO 8), 5RACEG5 (5'-CTAAGATGACGRCCCTTCGG-3', SEQ ID NO 9), wodurch ein zusätzliches der cDNA-Fragment mit 300 Bp erhalten wurde, das jedoch immer noch nicht das initiale Methionin enthielt. Deshalb wurde auf der Basis der neuen Sequenz noch eine weitere 5'-RACE-Runde durchgeführt mit den Primern: 5RACE6 (5'-CATCCTGAGAAACAAAAAGTGG-3', SEQ ID NO 10), 5RACE7 (5'-AGTTACAGACTTCAATGTACG-3', SEQ ID NO 11), und 5RACE8 (5'-AATCAGGACGGTTGCAAGCC-3', SEQ ID NO 12), was zu einem zusätzlichen Fragment mit 400 Bp führte, welches das Initiationcodon enthielt.
Um das fehlende 3'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 3'-RACE entsprechend durchgeführt mit den Primern: 3RACEG1 (5'-TTATCCGACCTGAAGTTTGC-3', SEQ ID NO 13), 3RACEG2 (5'-GACCTACAATTTTGGAGAGC-3', SEQ ID NO 14), was zu einem Fragment mit etwa 450 Bp und dem Stopcodon und schließlich zur kompletten cDNA für GNTI mit 1416 Bp (GenBank: AJ429143) führte.
Die entsprechenden 5788 Bp der genomischen Sequenz wurden erhalten durch Klonierung des GNTI-Gens in drei Stücken mittels PCR von genomischer DNA des WT P.patens mit den spezifischen Primern: GNT5F (5'-TGGGCTTTAACACAACTTTT-3', SEQ ID NO 15) und GTN6R (5'-GCCCTAAGCTTGATCCCTG-3', SEQ ID NO 16), GNT21F (5'-ATGGCAGATATGGCTCGATTG-3', SEQ ID NO 17) und 5RACEG5 (5'-CTAAGATGACGACCCTTCGG-3', SEQ ID NO 9), 3RACEG1 (5'-TTATCCGACCTGAAGTTTGC-3', SEQ ID NO 13) und GNT15R (5'-AGTTTCTATGGTATCTAACTGC-3', SEQ ID NO 18), die mittels Primer Walking sequenziert wurden.
1.2 Herstellung des Knockout-Konstrukts für GNTI
Um das Knockout-Konstrukt zu generieren, wurden zwei Fragmente mittels PCR auf der genomischen DNA synthetisiert mit den Primern für das 5'-Ende des Konstrukts GNTHT7 (5'-GAGCATCCAAGCTTGACCTGG-3', SEQ ID NO 19) und GNTET7 (5'-GCACCGTGAATTCTTCTAGCTT-3', SEQ ID NO 20), und entsprechend für das 3'-Ende GNTHT3 (5'-GGAAGAACAAGCTTCAAAGTGGC-3', SEQ ID NO 21) und GNTPT3 (5'-GATCCCTGCAGATCTCAAACG-3', SEQ ID NO 22). Die so erhaltenen Fragmente der genomischen DNA mit 469 Bp und 835 Bp wurden zuerst in das Plasmid TOPO-pCR (Invitrogen, USA) kloniert. Die Fragmente wurden danach aus diesem Vektor mit EcoRI/HindIII bzw. PstI/HindIII ausgeschnitten und in den mit EcoRI and PstI geschnittenen pCRII-Vektor kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit HindIII geschnitten, und die durch Spaltung mit demselben Restriktionsenzym aus dem Vektor pRT101neo (Girke et al. 1998) erhaltene nptII-Selektionskassette wurde eingeführt.
Für die Transformation wurde das Knockout-Plasmid mit den Restriktionsenzymen EcoRI and BcuI geschnitten, und 30 Mikrogramm wurden für die Transformation verwendet.
1.3 Vorscreening der transgenen Pflanzen
Für das Vorscreening der resistenten Pflanzen wurden kleine Teile der Gametophoren (1–5mg) 30 Minuten lang bei 45°C in 75mM Tris-HCl, pH 8, enthaltend 20 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,1% Tween 20 behandelt, und 3 Mikroliter dieses Extrakts wurden verwendet für eine PCR mit den folgenden vier Primerpaaren: GNT7F (5'-GTTCSATGGTTTGAGCAGG-3', SEQ ID NO 23) und GNT8R (5'-GCGACCTTTCCTATTCTCC-3', SEQ ID NO 24) zum Nachweis einer Unterbrechung des ursprünglichen gntI-Gens, N1 (5'-TACCGACAGTGGTCCCAAAG-3', SEQ ID NO 25) und N2 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3', SEQ ID NO 26) zum Nachweis des Vorhandenseins der nptII-Kassette, GNT5F (5'-TGGGCTTTAACACAACTTTT-3', SEQ ID NO 27) und N3 (5'-TGTCGTGCTCCACCATGTT-3', SEQ ID NO 28) zur Kontrolle der Integration des Transgens am 5'-Ende, und N4 (5'-GTTGAGCATATAAGAAAC-3', SEQ ID NO 29) und GNT10R (5'-CACATTGTTCAATTTGATAGAC-3', SEQ ID NO 30) zur Kontrolle der Integration am 3'-Ende. Diejenigen Pflanzen, die die erwarteteten Fragmente in allen vier PCR-Reaktionen erbrachten, wurden als mutmaßliche Knockouts betrachtet und für weitere Analysen ausgewählt.
Schließlich wurden 9 transgene Pflanzen für weitere molekulare und biochemische Analysen ausgewählt.
1.4 Northern-Analyse
Die Gesamt-RNA wurde aus Moosgewebe mit dem RNeasy-Kit (Qiagen, Deutschland) isoliert. Für die Northern-Analyse wurden 5 Mikrogramm der Gesamt-RNA einer Elektrophorese mit Formaldehyd-Agarosegelen bei 120 V zugeführt, auf Hybond-N Nylonmembranen (Amersham Biosciences) übertragen, und mit einer ³²P-markierten cDNA-Sonde hybridisiert, die mit der 3' gntI-cDNA korrespondiert einschließlich eines Teils des für den Knockout verwendeten homologen Bereichs und eines Teils in den der Knockout-Konstrukten nicht vorhandenen cDNA.
Die Membranen wurden vier Mal mit verschiedenen SSC-Konzentrationen gewaschen (für den letzten Waschschritt wurde verwendet: 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C) und 2 bis 3 Tage lang bei –80°C einem Röntgenfilm (Kodak Bio-Max MS) ausgesetzt.
Eine Nothern-Analyse mit der Sonde [erhalten mittels PCR auf der cDNA mit den Primern: 3RACEG1 (5'-TTATCCGACCTGAAGTTTGC-3', SEQ ID NO 13) und GNT15R (5'-AGTTTCTATGGTATCTAACTGC-3', SEQ ID NO 18)] führten lediglich im Wildtyp zur Detektion des richtigen GNTI-Transkripts. Das Fehlen des richtigen Transkripts in den Knockout-Pflanzen bestätigten die Unterbrechung des gntI-Gens in P. patens.
Die Expression des Kontrollgens L21 wurde in den Transformanten nicht beeinflusst.
1.5. Southern-Analyse der transgenen Pflanzen
Für die Southern-blot Analyse wurden 5 Mikrogramm der genomischen DNA verwendet. Für den Nachweis der Anzahl an Integrationsstellen für die nptII-Kassette wurde die genomische DNA mit PvuII geschnitten, wodurch die nptII-Kassette in zwei Fragmente geteilt wird, und mit der nptII-Kassette als Sonde hybridisiert. Diese Analyse zeigte, dass einige Pflanzen eine sehr hohe Anzahl integrierter Selektionskassetten aufwiesen, wohingegen die Pflanze Nr. 6 ein einziges Integrationsereignis aufwies. Die Pflanzen Nr. 4 und 8 besaß ebenfalls eine geringe Anzahl an Integrationen, nämlich zwischen 4–5 pro Pflanze.
Im Rahmen einer zweiten Southern-Analyse wurde die genomische DNA mit EcoRI geschnitten und mit einer gntI-Sonde hybridisiert, die am 3'-Ende des Gens und damit außerhalb des Bereiches lokalisiert, der zur Herstellung des Knockout-Konstrukts verwendet wurde. In diesem Fall wurde erwartet, dass die transgenen Pflanzen eine Bande aufweisen, die aufgrund der Größe der nptII-Kassette (1500 Bp) größer ist als der WT. Der WT weist ein einziges Signal bei 4500 Bp auf, wohingegen die transgenen Pflanzen Banden von 6000 Bp oder anderer Größe aufweisen, aber sie enthalten nicht die WT-Bande, wodurch die Unterbrechung des WT-Locus bestätigt wird.
1.6 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001) Glycobiology 11, 261–274). Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei GNTI Knockout-Pflanzen wurden analysiert. Die N-Glykane der GNTI Knockout-Pflanzen zeigten im Vergleich mit dem WT dieselben Strukturen (Tab. 1), was bestätigt, dass der Knockout nur auf molekularer aber nicht auf biochemischer Ebene erfolgreich war. Deshalb wird vermutet, dass in Physcomitrella patens eine andere GNTI existiert.
2. Klonierung der Alpha-1,3-Fucosyltransferase aus P. patens und Analyse der Knockout-Pflanzen
2.1. Klonierung der cDNA und genomischen DNA für Alpha-1,3-Fucosyltransferase (Alpha-1,3-FT)
Ein Teil der cDNA für die Alpha-1,3-FT wurde erhalten mittels Durchführung von zwei PCR-Runden mit degenerierten Primern auf der cDNA von P. patens WT. Diese Primer wurden auf der Basis eines Protein-Alignments bekannter Alpha-1,3-FTs von Vigna radiata und Arabidopsis thaliana erstellt. In der ersten Runde wurden die Primer FD4F (5'-TGGGCNGARTAYGAYATGATG-3', SEQ ID NO 31) und FDR1 (5'-TGNGTNARNCCNADNGGRTADAT-3', SEQ ID NO 32) verwendet, und danach wurde das Produkt dieser PCR einer nachfolgenden PCR mit den Primern FD4F und FDSR (5'-TGNACNGCNGCCATRTC-3', SEQ ID NO 33) zugeführt. Die zweite PCR führte zu einem Produkt mit 510 Bp, das in pCR 4 TOPO kloniert und von beiden Enden sequenziert wurde.
Um das fehlende 5'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 5'-RACE durchgeführt mit den Primern: 5FT4 (5'-GTAACATTCGCATAATGG-3', SEQ ID NO 34), 5FT5 (5'-CGATCATTATGCGCACCAC-3', SEQ ID NO 35), und 5FT6 (5'-GGAAATAAAAGCAGCTCC-3', SEQ ID NO 36) wodurch ein zusätzliches cDNA-Fragment mit 200 Bp erhalten wurde, das jedoch immer noch nicht das initiale Methionin enthielt. Deshalb wurde auf der Basis der neuen Sequenz eine zweite 5'-RACE-Runde durchgeführt mit den Primern: 5FT7 (5'-AGGGTGAATCTCCATAGCC-3', SEQ ID NO 37), 5FT8 (5'-CATCTGCCTGACCCTCACC-3', SEQ ID NO 38), und 5FT9 (5'-GCCTTGAACACGCATGGC-3', SEQ ID NO 39), was zu einem zusätzlichen Fragment mit 150 Bp führte, das aber immer noch nicht das Initiationscodon aufwies. Schließlich wurde eine dritte Runde durchgeführt mit den Primern: 5FT9, 5FT10 (5'-CGATACAACCAGCACAGG-3', SEQ ID NO 40), und 5FT11 (5'-CTTCTCTAGCCATTCTGCC-3', SEQ ID NO 41), was zu einer zusätzlichen Sequenz mit 400 Bp führte, welches das Initiationcodon enthielt.
Um das fehlende 3'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 3'-RACE entsprechend durchgeführt mit den Primern: 3FT1 (5'-GCAGTGGAAGTTTAATGGTC-3', SEQ ID NO 42) und 3FT2 (5'-TCGTTTCTAGCTCTAGTAGAC-3', SEQ ID NO 43), was zu einem Fragment mit etwa 550 Bp und dem Stopcodon und schließlich zur vollständigen cDNA für Alpha-1,3-FT mit 1711 Bp (GenBank: partielle cDNA: AJ429145) führte.
Die entsprechenden 3083 Bp der genomischen Sequenz wurden erhalten durch Klonierung des Alpha-1,3-FT-Gens in drei Stücken mittels PCR von genomischer DNA des WT P. patens mit den spezifischen Primern: FTA9F (5'-ATGCTCCCAGCCCAAGAC-3', SEQ ID NO 44) und FTA10R (5'-TGTCTACTAGAGCTAGAAACG-3', SEQ ID NO 45), FT18F (5'-TAGGGA GTAAATATGAAGGG-3', SEQ ID NO 46) und 5FT5 (5'-CGATCATTATGCGCACCAC-3', SEQ ID NO 35), 3FT1 (5'-GCAGTGGAAGTTTAATGGTC-3', SEQ ID NO 42) und FTA12R (5'-TACTTCCAATTGAAGACAAGG-3', SEQ ID NO 47), die mittels Primer Walking sequenziert wurden.
2.2. Herstellung des Knockout-Konstrukts für Alpha-1,3-FT
Um das Knockout-Konstrukt zu generieren, wurde eine PCR mit der genomischen DNA und den folgenden Primern durchgeführt: FT15F (5'-AATGTTCTGTGCCATGCG-3', SEQ ID NO 48) und FT16R (5'-TGCTTCAAATGGGCTAGGG-3', SEQ ID NO 49). Das so erhaltene Fragment mit 2156 Bp wurde in den Vektor pCR4 TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Die NptII-Kassette wurde mittels PCR mit einer Proofreading-Polymerase auf dem Plasmid pRT101neo (Girke et al. 1998) synthetisiert mit den Primern: nptII/NdeI-F (5'-ATGCCATATGGCATGCCTGCAGGTCAAC-3', SEQ ID NO 50) zur Schaffung einer NdeI-Restriktionsstelle, und nptII/BstZ17I-R (5'-GCATGTATACGCATGCCTGCAGGTCACTG-3', SEQ ID NO 51) zur Schaffung einer BstZ17I-Stelle. Das PCR-Produkt wurde ebenfalls in pCR4 TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Beide Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und BstZ17I geschnitten. Durch diese Restriktion wurde ein Fragment mit 195 Bp, das einen Teil des vierten Introns und einen Teil des fünften Exons enthält, aus dem genomischen Alpha 1,3-FT-Fragment ausgeschnitten und durch die nptII-Kassette ersetzt.
Für die Transformation von P. patens wurde das resultierende Knockout-Konstrukt mit den Restriktionsenzyme NotI und MssI geschnitten, und 25 Mikrogramm wurden für die Transformation verwendet.
2.3. Vorscreening der transgenen Pflanzen
Für das Vorscreening der resistenten Pflanzen wurden kleine Stücke der Gametophoren (1–5mg) 30 Minuten lang bei 45°C in 75mM Tris-HCl, pH 8, enthaltend 20 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,1% Tween 20, behandelt, und 3 Mikroliter dieses Extrakts wurden verwendet für eine PCR mit den folgenden vier Primerpaaren: FT14F (5'-ACAAAGTTACATACTCGCG-3', SEQ ID NO 52) und FTA12R (5'-TACTTCCAATTGAAGACAAGG-3', SEQ ID NO 47) zum Nachweis einer Unterbrechung des ursprünglichen ft-Gens, N1 (5'-TACCGACAGTGGTCCCAAAG-3', SEQ ID NO 25) und N2 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3', SEQ ID NO 26) zum Nachweis des Vorhandenseins der nptII-Kassette, FT14F (5'-ACAAAGTTACATACTCGCG-3', SEQ ID NO 52) und N3 (5'-TGTCGTGCTCCACCATGTT-3', SEQ ID NO 28) zur Kontrolle der Integration des Transgens am 5'-Ende, FTA12R (5'-TACTTCCAATTGAAGACAAGG-3', SEQ ID NO 47) und N4 (5'-GTTGAGCATATAAGAAAC-3', SEQ ID NO 29) zur Kontrolle der Integration am 3'-Ende. Diejenigen Pflanzen, die die erwarteteten Fragmente in allen vier PCR-Reaktionen erbrachten, wurden als mutmaßliche Knockouts betrachtet und für weitere Analysen ausgewählt.
Schließlich wurden 9 transgene Pflanzen für weitere molekulare und biochemische Analysen ausgewählt.
2.4. RT-PCR
Die Gesamt-RNA wurde aus Moosgewebe mit dem RNeasy-Kit (Qiagen, Deutschland) isoliert. Die Reverse-Transkription-PCR erfolgte nach einem Standardprotokoll. Für die RT-PCR wurden die im zentralen Bereich der cDNA für die Alpha-1,3-FT liegenden Primer FTA9F (5'-ATGCTCCCAGCCCAAGAC-3', SEQ ID NO 44) und FTA10R (5'-TGTCTACTAGAGCTAGAAACG-3', SEQ ID NO 45) verwendet. Bei der Verwendung dieser Primer wurde nur im WT ein Transkript mit 475 Bp nachgewiesen, wohingegen alle transgenen Pflanzen keine PCR-Produkte produzierten.
Die Abwesenheit eines nachweisbaren Transkripts mit den an beiden Seiten der integrierten nptII-Kassette liegenden Primern bestätigt, dass alle analysierten Pflanzen Knockouts darstellen.
Als Kontrolle wurde eine RT-PCR mit Primern für die APS-Reduktase durchgeführt (Koprivova et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 32195–32201): R10 (5'-TCTTTCACTATTCGGTGACG-3', SEQ ID NO 53) und R11 (5'-CGACCACAACATTAGATCC-3', SEQ ID NO 54), wodurch bei allen Pflanzen ein Fragment mit 900 Bp amplifiziert wurde.
2.5 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001), siehe oben. Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei Alpha-1,3-FT Knockout-Pflanzen wurden analysiert. Bei den N-Glykanen der Alpha-1,3-FT Knockout-Pflanzen konnten keine mit dem Asngebundenen GlcNAc verknüpften Alpha-1,3-Fucosereste nachgewiesen werden (Tab. 1), was bestätigt, dass der Knockout der Alpha-1,3-Fucosyltransferase in Physcomitrella patens vollständig erfolgreich war.
3. Klonierung der Beta 1,2-Xylosyltransferase aus P. patens und Analyse der Knockout-Pflanzen
3.1. Klonierung der cDNA und genomischen DNA für Beta-1,2-Xylosyltransferase (Beta-1,2-XT)
Ein Teil der cDNA für die Beta-1,2-XT wurde erhalten mittels Durchführung von zwei PCR-Runden mit degenerierten Primern auf der cDNA von P. patens WT. Diese Primer wurden auf der Basis eines Protein-Alignments bekannter Beta-1,2-XTs von Pflanzen erstellt. In der ersten Runde wurden die Primer XDF1 (5'-TGYGARGSNTAYTTYGGNAAYGG-3', SEQ ID NO 55) und XDR1 (5'-GCNCKNAYCATYTCNCCRAAYTC-3', SEQ ID NO 56), verwendet und danach wurde das Produkt dieser PCR einer nachfolgenden PCR mit den Primern XDF2 (5'-GGNGGNGARAARYTNGARRANGT-3', SEQ ID NO 57) und XDR1 zugeführt. Die zweite PCR führte zu einem Produkt mit 610 Bp, das in pCR 4 TOPO (Invitrogen, USA) kloniert und von beiden Enden sequenziert wurde.
Um das fehlende 5'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 5'-RACE durchgeführt mit den Primern: 5XT1 (5'-TCCTCCTTCTCTGGGACC-3', SEQ ID NO 58), 5XT2 (5'-AGCTCCAGTTGTGAAATATGG-3', SEQ ID NO 59) und 5XT3 (5'-TTCTTCCTCATTTCGTCCC-3', SEQ ID NO 83), wodurch ein zusätzliches cDNA-Fragment mit 360 Bp erhalten wurde, das jedoch immer noch nicht das initiale Methionin enthielt. Deshalb wurde auf der Basis der neuen Sequenz eine zweite 5'-RACE-Runde durchgeführt mit den Primern: 5XT4 (5'-CTTCCTTCACCACACTAC-3', SEQ ID NO 60), 5XT5 (5'-TAGCATGACTGTGTGGCC-3', SEQ ID NO 61) und 5XT6 (5'-AAAGGCTTGAGTGTAGCC-3', SEQ ID NO 62), was zu einem zusätzlichen Fragment mit 390 Bp führte, welches das Initiationcodon enthielt.
Um das fehlende 3'-Ende der cDNA zu erhalten, wurde eine 3'-RACE entsprechend durchgeführt mit den Primern: 3XT1 (5'-GCCTTTCTTGCACGGGTTG-3', SEQ ID NO 63) und 3XT2 (5'-GGACATTCCAAATAATCCC-3', SEQ ID NO 64), was zu einem Fragment mit etwa 940 Bp und dem Stopcodon und schließlich zur vollständigen cDNA für Beta-1,2-xT mit 2300 Bp (GenBank: 1788 Bp entsprechend dem kodierenden Bereich: AJ 429144) führte. Die 2388 Bp der genomischen Sequenz wurden erhalten durch Klonierung des Beta-1,2-XT-Gens in drei Stücken mittels PCR von genomischer DNA des WT P.patens mit den spezifischen Primern: XT14F (5'-TTACGAAGCACACCATGC-3', SEQ ID NO 82) und XT15R (5'-GTCCTGTTAAATGCCTTGC-3', SEQ ID NO 65), XT-M1F (5'-AGGTTGAGCAATCATATGGC-3', SEQ ID NO 66) und 5XT2, 3XT1 und XT11R (5'-ATCCCAGAAATATCTGATCC-3', SEQ ID NO 67), die mittels Primer Walking sequenziert wurden.
3.2. Herstellung des Knockout-Konstrukts für Beta-1,2-XT
Um das Knockout-Konstrukt zu erstellen, wurde eine PCR mit der genomischen DNA und den folgenden Primern durchgeführt: XT12F (5'-TGTGAGGCGTTCTTTGGC-3', SEQ ID NO 68) und XT11R (5'-ATCCCAGAAATATCTGATCC-3', SEQ ID NO 67). Das so erhaltene Fragment mit 2066 Bp wurde in den Vektor pCR4 TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Die NptII-Kassette wurde mittels PCR mit einer Proofreading-Polymerase auf dem Plasmid pRT101neo (Girke et al. 1998) synthetisiert mit den Primern: nptII/SalI-F (5'-ATGCGTCGACGTCAACATGGTGGAGCACG-3'. SEQ ID NO 69) zur Schaffung einer SalI-Restriktionsstelle, und nptII/NdeI-R (5'-GCATCATATGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3', SEQ ID NO 70) zur Schaffung einer NdeI-Stelle. Das PCR-Produkt wurde ebenfalls in pCR4 TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Beide Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und SalI geschnitten. Aus dem Plamid mit der genomischen DNA wurde ein Fragment mit 380 Bp, das einen Teil des zweiten Exons und einen Teil des zweiten Introns enthält, ausgeschnitten und durch die nptII-Kassette ersetzt.
Für die Transformation von P. patens wurde das resultierende Knockout-Konstrukt mit den Restriktionsenzyme NotI und SpeI geschnitten, und 25 Mikrogramm wurden für die Transformation verwendet.
3.3. Vorscreening der transgenen Pflanzen
Für das Vorscreening der resistenten Pflanzen wurden kleine Stücke der Gametophoren (1–5mg) 30 Minuten lang bei 45°C in 75mM Tris-HCl, pH 8, enthaltend 20 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,1% Tween 20, behandelt, und 3 Mikroliter dieses Extrakts wurden verwendet für eine PCR mit den folgenden vier Primerpaaren: XT-M1F (5'-AGGTTGAGCAATCATATGGC-3', SEQ ID NO 66) und XT13R (5'-ACGATCCAAAATCTGGACGC-3', SEQ ID NO 71) zum Nachweis einer Unterbrechung des ursprünglichen xt-Gens, N1 (5'-TACCGACAGTGGTCCCAAAG-3', SEQ ID NO 25) und N2 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3', SEQ ID NO 26) zum Nachweis des Vorhandenseins der nptII-Kassette, XT-M1F (5'-AGGTTGAGCAATCATATGGC-3', SEQ ID NO 66) und N3 (5'-TGTCGTGCTCCACCATGTT-3', SEQ ID NO 28) zur Kontrolle der Integration des Transgens am 5'-Ende, XT13R (5'-ACGATCCAAAATCTGGACGC-3', SEQ ID NO 71) und N4 (5'-GTTGAGCATATAAGAAAC-3', SEQ ID NO 29) zur Kontrolle der Integration am 3'-Ende. Diejenigen Pflanzen, die die erwarteteten Fragmente in allen vier PCR-Reaktionen erbrachten, wurden als mutmaßliche Knockouts betrachtet und für weitere Analysen ausgewählt.
Schließlich wurden 9 transgene Pflanzen für weitere molekulare und biochemische Analysen ausgewählt.
3.4. RT-PCR
Die Gesamt-RNA wurde aus Moosgewebe mit dem RNeasy-Kit (Qiagen, Deutschland) isoliert. Die Reverse-Transkription-PCR wurde nach einem Standardprotokoll durchgeführt. Für die RT-PCR wurden die im zentralen Bereich der cDNA für die Beta-1,2-XT und an beiden Seiten der nptII-Kassette liegenden Primer XT14F (5'-TTACGAAGCACACCATGC-3', SEQ ID NO 82) und XT15R (5'-GTCCTGTTAAATGCCTGC-3', SEQ ID NO 65) verwendet. Bei der Verwendung dieser Primer wurde nur im WT ein Transkript mit 290 Bp nachgewiesen, wohingegen alle transgenen Pflanzen keine PCR-Produkte produzierten. Die Abwesenheit des Transkripts mit den an beiden Seiten der integrierten nptII-Kassette liegenden Primern bestätigt, dass alle analysierten Pflanzen Knockouts darstellen.
Als Kontrolle wurde eine RT-PCR mit Primern für die APS-Reduktase durchgeführt (Koprivova et al. (2002), siehe oben): R10 (5'-TCTTTCACTATTCGGTGACG-3', SEQ ID NO 53) und R11 (5'-CGACCACAACATTAGATCC-3', SEQ ID NO 54), wodurch bei allen Pflanzen ein Fragment mit 900 Bp amplifiziert wurde.
3.5 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001), siehe oben). Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei Beta-1,2-XT Knockout-Pflanzen wurden analysiert. Bei den N-Glykanen der Beta-1,2-XT Knockout-Pflanzen konnten keine mit dem Beta-Mannosylrest verknüpften Beta-1,2-Xylosylreste nachgewiesen werden (Tab. 1), was bestätigt, dass der Knockout der Beta-1,2-Xylosyltransferase in Physcomitrella patens vollständig erfolgreich war.
4. Klonierung der cDNA für die humane Beta-1,4-Galaktosyltransferase
Für die Isolierung der cDNA der Beta-1,4-Galaktosyltransferase (GalT, GenBank: X55415) wurde eine cDNA aus menschlicher Leber verwendet. Unter Verwendung des 5'-Primers GalTxh-F (5'-TTCTCGAGACAATGAGGCTTCGGGAGCCGCTC-3', SEQ ID NO 72), der eine XhoI-Restriktionstelle enthält, und des 3'-Primers GalTXb-R (5'-GGTCTAGACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCC-3', SEQ ID NO 73), der eine XbaI-Restriktionsstelle enthält, wurde mittels PCR und einem Elongase-Enzymmix (Invitrogen, USA) ein 1,2 Kb langes DNA-Fragment amplifiziert. Das Fragment mit 1,2 Kb wurde in pCR4-TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Das Fragment wurde aus diesem Vektor mit XhoI und XbaI herausgeschnitten und in das mit XhoI und XbaI geschnittene Plamid pRT101 (Töpfer et al. (1987) NAR 15, 5890) kloniert. Das resultierende Plasmid pRT101-GalT enthielt die cDNA der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und des CaMV-Terminators.
5. Herstellung des Knockout-Konstrukts für die Beta-1,2-Xylosyltransferase und Integration der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase
Ein Fragment mit 1,56 Kb des Gens für die Beta-1,2-Xylosyltransferase wurde von der genomischen DNA von Physcomitrella patens amplifiziert unter Verwendung des Primers XTB-F (5'-TTGGATCCTCAATTACGAAGCACACCATGC-3', SEQ ID NO 74) und des Primers XTB-R (5'-TTGGATCCTCCTCCCAGAAACATCTGATCCAG-3', SEQ ID NO 75), wobei beide Primer für die Einführung von BamHI-Restriktionsstellen sorgten. Das Amplifikationsprodukt wurde in pCR4-TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Das klonierte Beta-1,2-Xylosyltransferase-Genfragment enthielt eine einzige HindIII-Restriktionsstelle. Die cDNA der Beta-1,4-Galaktosyltransferase unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und des CaMV-Terminators wurde durch Ligation in die HindIII-Restriktionsstelle eingeführt, was zum Plasmid pCR4-XTko-GalTki führte. Ein Verdau von pCR4-XTko-GalTki mit BamHI führte zu einem Fragment, welches die cDNA der Beta-1,4-Galaktosyltransferase unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors und des CaMV-Terminators enthielt, flankiert 5' and 3' von Sequenzen, die homolog zum Beta-1,2-Xylosyltransferase-Gen von Physcomitrella patens sind. Dieses Fragment wurde für Knockout-Experimente verwendet.
5.1 PCR
Für PCR-Analysen wurde genomische DNA verwendet, die von den mutmaßlichen Knockout-Pflanzen isoliert wurde. Die Primer MoB 521 (5'-TTGCCGCTATCTACTTGTATGCTAACGT-3', SEQ ID NO 76) und MoB 575 (5'-TGCCGTGGATGTGCTAGATAATCTT-3', SEQ ID NO 77) befanden sich entsprechend den homologen Sequenzen der Beta-1,2-Xylosyltransferase auf beiden Seiten der Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette. Ein mit der erwarteten Beta-1,2-Xylosyltransferase-Sequenz korrespondierendes Fragment mit 339 Bp wurde vom WT amplifiziert. Von den Knockout-Pflanzen wurde ein mit der eingeführten Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette korrespondierendes Fragment mit 2,1 Kb amplifiziert, und es konnte kein Fragment mit 339 Bp nachgewiesen werden, was den Knockout der Beta-1,2-Xylosyltransferase als auch die Integration der Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette bestätigte.
5.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001), siehe oben. Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei Pflanzen mit Beta-1,2-XT-Knockout und Beta-1,4GT-Integration wurden analysiert. Bei den N-Glykanen dieser Pflanzen konnten keine Beta-1,2-Xylosylreste, die mit dem Beta-Mannosylrest verknüpft sind, nachgewiesen werden. Der im WT gefundene Peak bei 2235, der die (GF)(GF)XF-Struktur beschreibt, wurde im N-Glykanmuster der transgenen Pflanzen verschoben, was die Aktivität der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase in Physcomitrella patens bestätigte.
6. Herstellung des Knockout-Konstrukts für die Alpha-1,3- Fucosyltransferase und Integration der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase
Ein Fragment mit 2,66 Kb des Gens für Alpha-1,3-Fucosyltransferase wurde von der genomischen DNA von Physcomitrella patens amplifiziert unter Verwendung des Primers FTB-F (5'-TAGGATCCAGATGATGTCTGCTCGGCAGAATGG-3', SEQ ID NO 78) und des Primers FTB-R (5'-CTGGATCCTTGTAGATCCGAAGGTCTGAGTTCC-3', SEQ ID NO 79), wobei beide Primer für die Einführung von BamHI-Restriktionsstellen sorgten. Das Amplifikationsprodukt wurde in pCR4-TOPO (Invitrogen, USA) kloniert. Das klonierte Alpha-1,3-Fucosyltransferase-Genfragment enthielt zwei HindIII-Restriktionsstellen. Die cDNA der Beta-1,4-Galaktosyltransferase unter der Kontrolle des CaMV 355-Promotors und des CaMV-Terminators wurde durch Ligation in diese HindIII-Restriktionsstellen eingeführt, was zum Plasmid pCR4-FTko-GalTki führte. Ein Verdau von pCR4-FTko-GalTki mit BamHI führte zu einem Fragment, welches die cDNA der Beta-1,4-Galaktosyltransferase unter der Kontrolle des CaMV 355-Promotors und des CaMV-Terminators enthielt, flankiert 5' and 3' von Sequenzen, die homolog zum Beta-1,3-Fucosyltransferase-Gen von Physcomitrella patens sind. Dieses Fragment wurde für Knockout-Experimente verwendet.
6.1 PCR
Für PCR-Analysen wurde genomische DNA verwendet, die von den mutmaßlichen Knockout-Pflanzen isoliert wurde. Die Primer MoB 435 (5'-TCCTACCTGCGGAGCAACAGATATTG-3', SEQ ID NO 80) und MoB 495 (5'-GTGGACCCAGATTTGCTGGTGCACTTG-3', SEQ ID NO 81) befanden sich entsprechend den homologen Sequenzen der Alpha-1,3-Fucosyltransferase auf beiden Seiten der Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette. Ein mit der erwarteten Alpha-1,3-Fucosyltransferase-Sequenz korrespondierendes Fragment mit 2 Kb wurde vom WT amplifiziert. Von den Knockout-Pflanzen wurde ein mit der eingeführten Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette korrespondierendes Fragment mit 2,8 Kb amplifiziert, und es konnte kein Fragment mit 2 Kb nachgewiesen werden, was den Knockout der Alpha-1,3-Fucosyltransferase als auch die Integration der Beta-1,4-Galaktosyltransferase-Kassette bestätigte.
6.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001), siehe oben. Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei Pflanzen mit Alpha-1,3-FT-Knockout und Beta-1,4GT-Integration wurden analysiert. Bei den N-Glykanen dieser Pflanzen konnten keine Alpha-1,3-Fucosylreste, die mit dem Asn-gebundenen GlcNAc verknüpft sind, nachgewiesen werden. Der im WT gefundene Peak bei 2235, der die (GF)(GF)XF-Struktur beschreibt, wurde im N-Glykanmuster der transgenen Pflanzen verschoben, was die Aktivität der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase in Physcomitrella patens bestätigte.
7. Generierung von Pflanzen mit Knockouts der Alpha-1,3- Fucosyltransferase und Beta-1,2-Xylosyltransferase und Integration der Beta-1,4-Galaktosyltransferase
Für die Generierung von Pflanzen ohne Alpha-1,3-Fucosyl- und Beta-1,2-Xylosylreste und mit Beta-1,4-gebundenen Galaktosylreste wurden von Physcomitrella patens Protonema abgeleitete Protoplasten mit den in Kapitel 5 und 6 beschriebenen Konstrukten transformiert. Die Transformation konnte sowohl nacheinander als auch in Form einer Co-Transformation mit beiden Konstrukten durchgeführt werden.
7.1 PCR
Für die PCR-Analysen wurden die in 5.1 und 6.1 beschrieben Verfahren durchgeführt.
7.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die N-Glykane des WT von Physcomitrella patens zeigen die typischen strukturellen Eigenschaften pflanzlicher N-Glykane, wie sie z.B. beschrieben werden von Wilson et al. (2001), siehe oben. Das heißt, Fucose in Alpha-1,3-Verknüpfung mit dem Asn-gebundenen GlcNAc, Xylose in Beta-1,2-Verknüpfung mit dem Beta-Mannosylrest, Lewis A-Epitope (Alpha-1,4-Fucosyl- und Beta-1,3-Galaktosylreste verknüpft mit GlcNAc) als nicht-reduzierende terminale Elemente (Tab. 1). Drei transiene Pflanzen wurden analysiert. Bei den N-Glykanen dieser Pflanzen konnten weder Alpha-1,3-Fucosylreste, die mit dem Asn-gebundenen GlcNAc verknüpft sind, noch Beta-1,2-Xylosylreste nachgewiesen werden. Der im WT gefundene Peak bei 2235, der die (GF)(GF)XF-Struktur beschreibt, wurde im N-Glykanmuster der transgenen Pflanzen zu einem Massen-Peak von 1665 verschoben, was die Aktivität der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase in Physcomitrella patens als auch den Verlust der 1,3-gebundenen Fucosyl- und 1,2-gebundenen Xylosylreste bestätigte.
8.1 Aufreinigng und Analyse des in transient transformierten Physcomitrella Protoplasten exprimierten rekombinanten humanen VEGF₁₂₁
Protoplasten, die vom Protonema transgener Physcomitrella Pflanzen mit humaner Beta-1,4-Galaktosyltransferase und ohne Alpha-1,3-Fucosyltransferase sowie ohne Beta-1,2-Xylosyltransferase (7.2) abgeleitet wurden, wurden mit pRT101TPVEGF C3 transformiert. Exprimiertes VEGF₁₂₁ wurde ins Medium sekretiert. Nach zwei, drei und vier Tagen wurde das Kulturmedium gesammelt und durch frisches Medium ersetzt. Die Proben wurden durch eine 0,22 µm Millex GP Filtereinheit (Millipore) abfiltriert. Rekombinantes VEGF₁₂₁ wurde durch eine FPLC (Äktaexplorer 100, Amersham Biosciences, Deutschland) unter Verwendung einer Sp-Sepharose-Säule (Amersham Biosciences, Deutschland) aufgereinigt. Die Elution erfolgte mit Natriumchlorid in 25 mM Natriumacetat, pH 5,0. Die eluierten Fraktionen wurden durch Zentrifugation unter Verwendung der Amicon Ultra-Filtereinheiten (Ausschluss 10.000, Millipore) konzentriert. Den Proben wurde SDS/PAGE-Ladepuffer hinzugegeben, und die Proteine wurden mittels eines SDS/PAGE mit 15% Acrylamid und 0,4% Bisacrylamid fraktioniert. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt. Die VEGF121-Bande wurde aus dem Coomassie-gefärbten SDS/PAGE ausgeschnitten und mit Trypsin (Sequenzierungsgrad) verdaut. Die Glykane wurden durch die Behandlung mit Peptid:N-Glykosidase A freigesetzt und durch MALDI-TOF Massenspektrometrie auf einem DYNAMO (Thermo BioAnalysis, Santa Fe, NM) analysiert.
Das nachgewiesene N-Glykanmuster des sekretierten rekombinanten VEGF₁₂₁ war ähnlich zu dem, welches in transgenen GalT-Pflanzen (mit Knockouts der FucT und XylT, siehe 7.2) beobachtet wurde, was die Aktivität der humanen Beta-1,4-Galaktosyltransferase in Physcomitrella patens als auch den Verlust der 1,3-gebundenen Fucosyl- und 1,2-gebundenen Xylosylreste bestätigte.
Tabelle 1: N-Glykan-Strukturen des Physcomitrella patens-Wildtyps (WT) und der Knockout-Pflanzen. Die Isolierung der N-Glykan erfolgte aus Pflanzenmaterial, welches unter gleichen Bedingungen kultiviert wurde (500 ml Kolben, modifiziertes Knop-Medium). F = Fucosylreste, G = Galaktosylreste, Gn = N-Acetylglucosaminylreste, M/Man = Mannosylreste, X = Xylosylreste. (GF)(GF)XF bezeichnet den komplexsten N-Glykan-Type, die sogenannte Lewis A-Struktur. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transformierte Mooszelle, die ein Doppel-Knockout von Fucosyl-Transferase und Xylosyl-Transferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren.
Transformierte Mooszelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ferner eine Nukleotidsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in der Mooszelle steuert, wobei die Nukleotidsequenz ein glykosyliertes Polypeptid kodiert, das in der Mooszelle exprimiert wird.
Transformierte Mooszelle nach Anspruch 2, wobei das glykosylierte Polypeptid tierische Glykosylierungsmuster umfasst.
Transformierte Mooszelle nach Anspruch 3, wobei das glykosylierte Polypeptid Säuger-Glykosylierungsmuster umfasst.
Transformierte Mooszelle nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend eine Nukleotidsequenz, die funktionsfähig mit einen exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in der Mooszelle steuert, wobei die Nukleotidsequenz eine funktionale Säuger-Galaktosyltransferase kodiert, die in der Mooszelle exprimiert wird.
Transformierte Mooszelle nach Anspruch 5, wobei die exprimierte Säuger-Galaktosyltransferase eine Beta-1,4 galT ist.
Transformierte Mooszelle nach Anspruch 6, wobei die exprimierte Säuger-Galaktosyltransferase eine humane Beta-1,4 galT ist.
Mooszelle nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Mooszelle ausgewählt ist aus Spezies der Gattungen Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia und Sphaerocarpos.
Mooszelle nach Anspruch 8, wobei die Mooszelle aus Physcomitrella ausgewählt ist.
Mooszelle nach Anspruch 9, wobei die Mooszelle von Physcomitrella patens ist.
Mooszelle nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend ein Polypeptid mit einer primären Aminosäuresequenz eines humanen glykosylierten Polypeptids, einer primären Aminosäuresequenz eines nicht-humanen glykosylierten Säugerproteins, einer primären Aminosäuresequenz eines Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon, und/oder einer primären Aminosäuresequenz eines glykosylierten Nicht-Säugerpolypeptids.
Mooszelle nach Anspruch 11, wobei das glykosylierte Polypeptid ein humanes Polypeptid ist.
Mooszelle nach Anspruch 11 oder 12, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Insulin, Präproinsulin, VEGF, Proinsulin, Glukagon, Interferonen wie Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, Blutgerinnungsfaktoren ausgewählt aus Faktor VII, VIII, IX, X, XI, und XII, Fertilitätshormonen einschließlich luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon, Wachstumsfaktoren einschließlich epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, Prolaktin, Oxytocin, Thyroid-stimulierendem Hormon, adrenokortikotropem Hormon, Calcitonin, Parathyroid-Hormon, Somatostatin, Erythropoietin (EPO), und Enzymen wie Beta-Glukocerebrosidase, Hämoglobin, Serumalbumin und Kollagen.
Verfahren zur Herstellung mindestens einer Mooszelle, die ein Doppel-Knockout von Fucosyl-Transferase und Xylosyl-Transferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren, umfassend das Einführen in die Zelle von i) einer ersten Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Fucosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist und ii) das Einführen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Xylosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die transformierte Mooszelle ferner eine Nukleotidsequenz umfasst, die funktionsfähig mit einem exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in der Mooszelle steuert, wobei die Nukleotidsequenz ein glykosyliertes Polypeptid kodiert, das in der Mooszelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das glykosylierte Polypeptid tierische Glykosylierungsmuster umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das glykosylierte Polypeptid Säuger-Glykosylierungsmuster umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, ferner umfassend das Einführen in die Zelle einer isolierten Nukleinsäuresequenz, welche eine Nukleinsäure umfasst, die funktionsfähig mit einem exogenen Promotor verknüpft ist, der die Expression in einer Mooszelle steuert, wobei die Nukleinsäure ein funktionales Säuger-Galaktosyltransferase-Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Galaktosyltransferase-Nukleotidsequenz eine Beta-1,4 Galaktosyltransferase (Beta-1,4 galT)-Nukleotidsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Galaktosyltransferase-Nukleotidsequenz eine humane Beta-1,4 Galaktosyltransferase (Beta-1,4 galT)-Nukleotidsequenz ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 20, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ein Protein mit einer primären Aminosäuresequenz eines humanen Proteins, einer primären Aminosäuresequenz eines nicht-humanen Säugerproteins, einer primären Aminosäuresequenz eines Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon, und/oder einer primären Aminosäuresequenz eines Nicht-Säugerproteins.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 21, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus humanem Insulin, Präproinsulin, VEGF, Proinsulin, Glukagon, Interferonen wie Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, Blutgerinnungsfaktoren ausgewählt aus Faktor VII, VIII, IX, X, XI, und XII, Fertilitätshormonen einschließlich luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon, Wachstumsfaktoren einschließlich epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, Prolaktin, Oxytocin, Thyroid-stimulierendem Hormon, adrenokortikotropem Hormon, Calcitonin, Parathyroid-Hormon, Somatostatin, Erythropoietin (EPO), und Enzymen wie Beta-Glukocerebrosidase, Hämoglobin, Serumalbumin, Kollagen, und humanen sowie nicht-humanen Proteinen ausgewählt aus Amidasen, Amylasen, Carbohydrasen, Cellulase, Dextranase, Esterasen, Glucanasen, Glucoamylase, Lactase, Lipasen, Pepsin, Peptidasen, Phytasen, Proteasen, Pektinasen, Kasein, Molkeproteinen, Sojaproteinen, Gluten und Ovalbumin.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die Mooszelle ausgewählt wird aus Spezies der Gattungen Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon, Marchantia und Sphaerocarpos.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Mooszelle aus Physcomitrella ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Mooszelle von Physcomitrella patens ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 25, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend ein Polypeptid mit einer primären Aminosäuresequenz eines humanen glykosylierten Polypeptids, einer primären Aminosäuresequenz eines nicht-humanen glykosylierten Säugerproteins, einer primären Aminosäuresequenz eines Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon, und/oder einer primären Aminosäuresequenz eines glykosylierten Nicht-Säugerpolypeptids.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das glykosylierte Polypeptid ein humanes Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei das glykosylierte Polypeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus humanem Insulin, Präproinsulin, VEGF, Proinsulin, Glukagon, Interferonen wie Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, Blutgerinnungsfaktoren ausgewählt aus Faktor VII, VIII, IX, X, XI, und XII, Fertilitätshormonen einschließlich luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon, Wachstumsfaktoren einschließlich epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, Granulozyten-Koloniestimulierender Faktor, Prolaktin, Oxytocin, Thyroidstimulierendem Hormon, adrenokortikotropem Hormon, Calcitonin, Parathyroid-Hormon, Somatostatin, Erythropoietin (EPO), und Enzymen wie Beta-Glucocerebrosidase, Hämoglobin, Serumalbumin und Kollagen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 28, wobei der exogene Promotor aus induzierbaren, chemisch regulierten, konstitutiven oder zellspezifischen Promotoren ausgewählt wird.
Satz von Nukleinsäurevektoren, die geeignet sind zur Herstellung mindestens einer transformierten Mooszelle, die ein Doppel-Knockout von Fucosyl-Transferase und Xylosyl-Transferase umfasst, woraus modifizierte N-gebundene Glykane ohne nachweisbare 1,3-gebundene Fucosyl- und 1,2-gebundene Xylosylreste resultieren, wobei der Satz von Nukleinsäurevektoren i) eine erste Nukleinsäuresequenz, die spezifisch auf eine endogene Fucosyltransferase-Nukleotidsequenz gerichtet ist, und ii) eine zweite Nukleinsäuresequenz umfasst, die spezifisch auf eine endogene Xylosyltransferase-Nukleinsäuresequenz gerichtet ist.
Satz von Nukleinsäurevektoren nach Anspruch 30, ferner umfassend ein Polynukleotid, das ein glykosyliertes Polypeptid kodiert.
Satz von Nukleinsäurevektoren nach Anspruch 30 oder 31, ferner einschließend ein Polynukleotid, das eine funktionale Säuger-Glykosyltransferase kodiert, zur Verwendung in einem Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 29.
Satz von Nukleinsäurevektoren nach Anspruch 32, wobei das Polynukleotid eine Säuger-Galaktosyltransferase kodiert.
Satz von Nukleinsäurevektoren nach Anspruch 33, wobei das Polynukleotid eine humane Beta-1,4 Galaktosyltransferase kodiert.
Wirtszelle, die den Satz von Nukleinsäurevektoren gemäß irgendeinem der Ansprüche 30 bis 34 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 35, die eine Mooszelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 35, die eine Prokaryontenzelle ist.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 35 bis 37, wobei das Verfahren das Einführen des Satzes von Nukeinsäurevektoren in die Zelle mittels Transformation einschließt.
Verwendung des Satzes von Nukleinsäurevektoren gemäß irgendeinem der Ansprüche 30 bis 34 bei der Herstellung einer transgenen Mooszelle.
Wirtszelle nach Anspruch 35 oder 36, welche von einem Moos oder einem Moosteil oder einem Extrakt oder Derivat eines Mooses oder einer Mooszellkultur umfasst ist.
Moospflanze oder Moosgewebe, umfassend eine Mooszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, 36 und 40.
Verfahren zur Herstellung einer Moospflanze, wobei das Verfahren das Einführen des Satzes von Nukleinsäurevektoren nach irgendeinem der Ansprüche 30 bis 34 in eine Mooszelle und das Regenerieren eines Mooses aus dieser Zelle einschließt.