NO329774B1 - Fremgangsmate for produksjon av heterologe proteinholdige substanser i plantemateriale. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt området produksjon av proteinholdige substanser i plantemateriale. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen en nyskapende fremgangsmåte for produksjon av heterologe proteinholdige substanser i plantemateriale.

Utnyttelsen av bioteknologiske fremgangsmåter til produksjonsformål er en betydelig mulighet for mennesket til å produsere substanser som ikke kan produseres økonomisk, om over hodet, via andre ruter, eksempelvis ved kjemisk syntese, og hvori de mengder som er tilgjengelig naturlig er utilstrekkelig for å fungere som råmaterialer. Selv om over 10.000 sekundære plantemetabolitter er kjent, blir bare noen få av disse forbindelser produsert på en industriell skala ved hjelp av plantecellekulturer. Disse substanser er hovedsakelig farmasøytisk aktive sekundære metabolitter. Eksempler som kan nevnes er a) berberin (produksjon i skalaen 4.000 liter), som har en bakteriostatisk og fungisidal virkning (Y. Fujita og M. Tabata, i: Plant tissue and cell culture, plant science; Vol. 3, side 169, CE. Green et al. (Red.), A.R. Liss Inc., New York, USA (1987)), b) shikonin (skala 750 liter) som har en antibiotisk og antiinflammatorisk virkning (M. Tabata og Y. Fujita, i: Biotechnology in plant science; side 207-218, P. Day et al. (Red.), Academic Press, Orlando, USA (1985)), og c) paclitaxel (skala 75.000 liter), bedre kjent under navnet taxol, som har antitumorvirkning (M. Jaziri et al., Taxus sp. cell, tissue and organ cultures as alternative sources for taxoids production: a literature survey, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 46, sidene 59-75 (1996)).

Nok en betydelig bioteknologisk fremgangsmåte, hvori plantecellekulturer utnyttes, er biotransformasjonen av digitoxin til digoxin, et hjerte- og kretsløps-virkestoff. Denne stereospesifikke hydroksyleringsreaksjonen utføres med fremgang i bioreaktor-kulturer av Digitalis lanata (E. Reinhard og W. Kreis, Kultivierung von pflanzlichen Zellen im Bioreaktor [Plant cell culture in the bioreactor], Bio. Engin., 5, sidene 135-136 (1989)) i høye utbytter. En oppdatert og omfattende gjennomgang av anvendelsen av plantecellekulturer i bioteknologi kan finnes i H.-P. Muhlbach, Use of plant cell cultures in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 4, sidene 113-176(1998).

Utviklingen av genetiske transformasjonsmetoder for høyere planter ved begynnelsen av åttiårene gjorde det mulig i vesentlig grad å øke produktiviteten av planter for spesifikke sekundære bestanddeler ved å transformere genene for spesifikke nøkkelenzymer til de aktuelle metaboliske reaksjonsveier. Ikke bare transgenisk intakte planter men også plantecellekulturer ble utnyttet. Eksempler som kan nevnes er overekspresjonen av en bakteriell lysin-dekarboksylase i transgenet rothår-kulturer av Nicotiana tabacum, som økte utbyttene av de biogene aminer Cadaverin og Anabasin med en faktor på opptil 14 (J. Berlin et al., Genetic modification of plant secondary metabolism: Alteration of product levels by overexpression of amino acid decarboxylases, i: Advances in Plant Biology, Studies in Plant Science, Vol. 4, sidene 57-81, D.D.Y. Ryu and S. Furasaki (Red.), Elsevier, Amsterdam, Nederland (1994)).

Imidlertid åpnet muligheten for å overføre DNA inn i planter ikke bare opp kvantitative og kvalitative endringer av plantebestanddeler; dessuten ble planter og plantecellekulturer mer interessante for produksjonen av heterologe proteiner (A.S. Moffat, High-Tech plants promise a bumper crop of new products, Science 256, sidene 770-771 (1992)), hvorav i det vesentlige to ulike tilnærminger velges.

En tilnærming omfatter produksjonen av heterologe proteiner i transgent intakte planter. Ved siden av produksjonen av antistoffer i transgene tobakksplanter (J.K.-C.Ma et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants, Science 268, sidene 716-719 (1995)), har ekspresjonen og korrekt bearbeiding av humant serumalbumin både i transgene tobakksplanter og i transgene potetplanter vært beskrevet (P.C. Sijmons et al., Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants, Bio/Techn., 8, sidene 217-221 (1990)). Human epidermal vekstfaktor (hEGF) ble også uttrykt i transgene tobakksplanter (A.-H. Salmanian et al., Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants, Biotechnol. Lett., 18, sidene 1095-1098 (1996)). Imidlertid ble andre planter også benyttet. Leu-enkefalin vellykket produsert ved anvendelse av Arabidopsis thaliana og Brassica napus (E. Krebbers og J. Vandekerckhove, Production of peptides in plant seeds, Tibtech., 8, sidene 1-3

(1990)). Videre ble transgene Vigna unguiculata- p\ anter benyttet til ekspresjon av kimære virale partikler hvilke fungerer som vaksiner (K. Dalsgaard et al., Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease, Nat. Biotech., 15, sidene 248-252 (1997)).

En prinsipiell ulempe ved anvendelse av intakte planter i likhet med de eksempelvise som er beskrevet i det foregående er nødvendigheten av å dyrke dem, noe som tar lang tid og kostbart, og det store dyrkningsområdet som kreves for produksjonen i industriell skala. Videre krever isolasjonen av de ønskede målsubstanser fra intakte planter vanligvis komplekse bearbeidingstrinn, særskilt når produktenes konsistens og kvalitet må tilfredsstille strenge krav, i likhet med det som er tilfelle med substanser som skal benyttes for farmasøytiske eller næringsmessige formål.

I den andre tilnærming, ble transgene tobakkcellekulturer utnyttet til produksjon av antistoffer. Eksempelvis er ekspresjonen av antistoffer og deres sekresjon inn i mediet beskrevet (N.S. Magnuson et al., Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspensjon culture of genetically modified tobacco cells, Prot. Expr. Pur., 7, sidene 220-228 (1996)). Siden rensingen av heterologe proteiner fra celler er komplisert, utgjør utskillelsen av målproteinet inn i mediet en markert forbedring. Videre er produksjonen av rekombinante farmasøytiske relevante proteiner i cellekulturer også av interesse fra synspunktet sikkerhet siden de transgene planteceller kan dyrkes utelukkende i bioreaktorer og ikke behøver å frigjøres. Den nødvendige massekultur ble gjort mulig ved utviklingen av bioreaktorer for heterotrope plantecellekulturer på en større skala (eksempelvis M.L. Shuler et al., Bioreactor engineering as an enabling technology to tap biodiversity: The case of taxol., Ann. N. Y. Acad. Sei., 745, sidene 455-461 (1994)).

De prinsipielle ulemper ved denne andre tilnærming, hvori plantesuspensjonskulturer benyttes, er den lave veksthastighet, den relativt lave dannelse av sekundære metabolitter, inhiberingen av produktdannelse ved høye celletettheter og, som en konsekvens, lav produktivitet pr. volum, dannelse av aggregater og cellevegg-bestanddeler, og cellenes økte følsomhet overfor skjærkrefter. Det må også tas i betraktning at komplekse medier med en multiplisitet av bestanddeler, hvorav noen er kostbare, alltid må frembringes ved anvendelse av heterotrope cellekulturer. Imidlertid er den alvorligste ulempe som bør nevnes forekomsten av somaklonale variasjoner i in vitro plantecellekulturer, som medfører kvantitative og kvalitative endringer i produksjonen av heterologe proteiner (sek eksempelvis M.G.K. Jones og K. Lindsey, Plant biotechnology, i: Molecular biology and biotechnology, J.M. Walker og E.W. Gingold (Red.), 2. utg., Royal Soc. of Chem., Burlington House, London, England (1988). Heterogeniteten av de produkter som dannes og av deres funksjonelle egenskaper kan ikke aksepteres, særskilt i samband med produksjonen av farmasøytiske produkter og andre ønskede substanser hvis offisielle godkjenning krever pålitelig kvalitetssikring og en standardisert produksjonsmetode.

Produksjon av heterologe polypeptider ved utskilling er kjent blant annet fra WO 9938990A. Her beskriver hvordan dette kan gjøres i ulike plantedeler som røtter, vesikler ol. til høyere utviklete planter. Produksjon fra ulike encellekulturer er også kjent. Men dette er svært forskjellig fra produksjon ved utskilling fra mose, som er planter men ikke komplekse . Man kan ikke lett overføre slik teknologi fra et system (som høyere plante eller encellecultur) til et annet (som mose).

Målet for den foreliggende oppfinnelse er derfor å frembringe en fremgangsmåte for standardisert produksjon av heterologe proteinholdige substanser i plantematerialer som i det vesentlige eliminerer ikke bare de ovennevnte ulemper med å benytte intakte planter, men også ulempene med å benytte cellekultursystemer.

Dette mål oppnås i samsvar med oppfinnelsen ved frembringelse av en nyskapende fremgangsmåte for produksjon av heterologe proteinholdige substanser i plantemateriale hvori fullt differensierte moseplanter dyrkes under standardbetingelser og de proteinholdige substanser som produseres tilveiebringes fra dyrkningmediet i det vesentlige uten å rive opp det produserende vev eller cellene.

Termen "proteinholdig substans" omfatter ved anvendelse heri peptider, polypeptider og proteiner og dessuten fragmenter av disse som er egnet særskilt for diagnostiske, kliniske, farmasøytiske og næringsmessige formål. De molekyler som har peptidbindinger og som translateres ved plantematerialer omfattes også.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at protonemamose-vev benyttes som plantemateriale og at de produserte proteinholdige substanser tilveiebringes fra dyrkningsmediet uten opprivning av det produserende vev eller av cellene.

I en foretrukken utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, frigjøres den ønskede heterologe proteinholdige substans inn i kulturmediet i dens biologiske aktive form.

Termen "biologisk aktiv" betyr ved anvendelse i den foreliggende beskrivelse at de målsubstanser som frembringes med denne attributt har de funksjonelle egenskaper som ønskes eller kreves til respektive formål. Dersom det eksempelvis er ønsket å produsere antistoffer, er det protein som produseres, eller et funksjonelt fragment derav, biologisk aktivt når det er i stand til å etablere den forventede spesifikke binding med antigenet. For fagfolk er det opplagt at det fullstendige protein ikke alltid kreves for slike formål, men at det er mulig å søke etter epitoper eller lavmolekylvekt-strukturer som sikrer den ønskede biologiske aktivitet eller funksjonalitet. Eksempelvis er et enzym biologisk aktivt når det er i stand til å omdanne sitt målsubstrat.

I en ytterligere foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen, dyrkes plantematerialet i form av intakte moseplanter i et dyrkningsmedium som i det vesentlige er fritt for sukkere, vitaminer og fytohormoner eller funksjonelle fragmenter fra disse.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen åpner også for muligheten av å dyrke intakte og fullt differensierte planter under fotoautotropiske betingelser som kan standardiseres, d.v.s. uten å kreve tilsatsen av sukkeret, vitaminer og fytohormoner og liknende, slik det kreves i kjent tekniks heterotropiske suspensjons-cellekultursystemer. Fordi et lite kostbart og enkelt dyrkningsmedium benyttes, blir trinnene med å tilveiebringe og rense de ønskede målsubstanser lettet betydelig.

I følge en foretrukket utførelse av oppfinnelsen utvelges mosevevet fra den gruppe av moser som inkluderer levermoser og ekte moser. Særlig foretrukket er arter fra slektene Physcomitrella, Funaria, Sphagnum og Ceratodon. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres mest ønskelig ved anvendelse av mosen Physcomitrella patens. Det er også særlig foretrukket at mosevevet utvelges fra levermoser av den gruppe som består av Marchantia og Sphaerocarpos.

Det plantematerialet som skal benyttes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ønskelig en intakt moseplante.

Nukleinsyrekonstruksjonen som benyttes for transformasjonen koder gjerne ikke bare den ønskelige proteinholdige substans, men også et overgangspeptid for utskillelse av substansen fra vertscellen inn i dyrkningsmediet. Enhver av de autologe og heterologe nukleinsyresekvenser som er kjent for fagfolk kan benyttes for å generere en ekspresjonskassett for transformasjon av produsentvevet. Anvendelsen av signalpeptider for det endoplasmiske retikulum eller den cellulære transport foretrekkes særskilt.

Det for den foreliggende oppfinnelse utførte arbeid viser at det i det foregående beskrevne problem med somoklonal variasjon, som opptrer i cellekulturer, ikke eksisterer i fotoautotropiske væskekulturer av moser. Videre har de moser som benyttes i samsvar med oppfinnelsen, sammenliknet med andre systemer, fordelen med en klar sekvens av nøyaktig definerte differensieringstrinn (chloronema, caulonema, knopper, gametoforer), som kan influeres ved tilsetning av plantehormoner (indol-3-eddiksyre induserer caulonema-utvikling, isopentenyladenin induserer utviklingen av knopper) (se eksempelvis N.W. Ashton et al., Analysis of gametophytic development in the moss, Physcomitrella patens, using auxin and cytokinin resistant mutants, Planta, 144, sidene 427-435 (1979)). Direkte differensierings-spesifikk ekspresjon av heterologe proteiner i bioreaktorkulturer blir derfor gjort mulig, og en synkront delende, ren og således homogen chloronema-kultur er særskilt ønskelig egnet i samsvar med oppfinnelsen p.g.a. dens kontrollerbare ensartede proteinproduksjon i bioreaktoren og dens egnethet for anvendelsen av hormonavhengige eller differensierings-spesifikke promotorer.

I tillegg til et slikt ekspresjonssystem, kan et induserbart promotorsystem også benyttes, særskilt til produksjonen av proteiner som har en kort halveringstid eller som er cytotoksiske, idet Agrobacterium tumefaciens 1'-promotoren særskilt ønskelig benyttes.

Dyrkningen av moser som foreslått i samsvar med oppfinnelsen til produksjon av heterologe proteiner under økonomiske aspekter kan gjennomføres eksempelvis ved anvendelse av Physcomitrella i volumer innen størrelsesorden fra 20 ml til over 6 I opptil 10 I og over i rystekulturer eller i luftede glassbeholdere (se eksempelvis R. Reski, Zell- und molekularbiologische Untersuchungen der cytokinin-induzierbaren Gewebedifferenzierung und Chloroplastenteilung bei Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., [Cell- and molecular-biological studies of the cytokinin-inducible tissue differentiation and chloroplast division in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.], Ph.D. thesis, University of Hamburg (1990)). Siden dette er en kultur av differensierte fotoautotropiske planter, behøver dyrkningsmediet verken supplering av plantehormoner eller vitaminer eller sukkeret. I sammenlikning med det komplekse medium som kreves eksempelvis for dyrecellekulturer, er kostnadene en faktor på 100 mindre. Det har i samsvar med oppfinnelsen kommet frem at utbyttet av biologisk aktivt heterologt protein i dyrkningsmediet kan økes med en faktor på 35 i nærvær av polyvinylpyrrolidon (PVP), noe som er årsaken til at anvendelsen av PVP i dyrkningsmediet foretrekkes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Detaljert informasjon om dyrking av ytterligere moser som er egnet i samband med oppfinnelsen som eksempelvis Leptobryum pyriforme og Sphagnum magellanicum i bioreaktorer er beskrevet i kjent teknikk (se eksempelvis E. Wilbert, Biotechnologische Studien zur Massenkultur von Moosen unter besonderer Berucksichtigung des Arachidonsåurestoffwechsels [Biotechnological studies concerning the mass culture of mosses with particular consideration of the arachidonic acid metabolism], Ph.D. thesis, University of Mainz (1991); H. Rudolph og S. Rasmussen, Studies on secondary metabolism of Sphagnum cultivated in bioreactors, Crypt. Bot., 3, sidene 67-73 (1992)). Særskilt foretrukket til formål i samband med den foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av Physcomitrella, særskilt siden alle de vanlige molekulærbiologiske teknikker er etablert for den organisme (for et gjennomsyn se R. Reski, Development, genetics and molecular biology of mosses, Bot. Acta, 111, sidene 1-15 (1998)).

Egnede transformasjonssystemer ble utviklet for den bioteknologiske utnyttelse av Physcomitrella for produksjon av heterologe proteiner. Eksempelvis ble vellykkede transformasjoner utført ved direkte DNA-overføring inn i protonemavev ved anvendelse av partikkel kanonen. Den PEG-formidlede DNA-overføring inn i moses protoplaster var også vellykket. Denne transformasjonsmetode har vært beskrevet gjentatte ganger for Physcomitrella og fører både til transiente og til stabile transformanter (se eksempelvis K. Reutter og R. Reski, Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants, Pl. Tissue culture, @ Biotech., 2, sidene 142-147 (1996)).

Selv om den foreliggende oppfinnelse prinsipielt er egnet til produksjonen av enhver proteinholdig substand, vil produksjonen av et farmasøytisk relevant protein bli demonstrert i det følgende under henvisning til den humane vaskulære endotele vekstfaktor (VEGF).

VEGF ble først isolert av N. Ferrara og W.J. Henzel (Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, sidene 851-858 (1989)) og kjennetegnet som regulatorisk faktor for den styrte angiogenese og endotele celledeling under normale fysiologiske betingelser (N. Ferrara et al., The vascular endothelial growth factor family of polypeptides, J. Cell. Biochem., 47, sidene 211-218 (1991)). Forfatterne viste også at denne vekstfaktor fungerer i høy grad spesifikt på vaskulære endotele celler og er inaktiv for andre celletyper. VEGF er et homodimert glycoprotein som er forbundet ved disulfidbroer. Fire ulike former av humant VEGF er kjent. De fire isoformer er 121, 165, 189 og 206 aminosyrer i lengde og er dannet ved alternativ spleising av VEGF RNA. VEGF206ble bare påvist i en føtal lever cDNA, mens transkripter av VEGF121, VEGF165og VEGFieg ble påvist i et antall tumorceller og tumorvev. Alle VEGF-isoformer har førersekvenser for utskilling, men bare de to minste former utskilles effektivt (se eksempelvis G. Martiny-Baron og D. Marmé, VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy, Curr. Opin. Biotechnol., 6, sidene 675-680 (1995)).

Egnede mengder VEGF var og er fremdeles påkrevet både for utviklingen og forbedringen av eksisterende tilnærminger for tumorterapi og for kjennetegning av VEGF. I løpet av de tidlige trinn av arbeid som ble utført i samband med den foreliggende oppfinnelse, var alt som var beskrevet den rekombinante produksjon av VEGF i insektsceller ved hjelp av baculovirus ekspresjonssystem (eksempelvis B.L. Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, sidene 19-26 (1993)). Saccharomyces cerevisiae (S. Kondo et al., The shortest isoform of human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF121) produced by Saccharomyces cerevisiae promotes both angiogenesis and vascular permeability, Biochim. Biophys. Acta, 1243, sidene 195-202 (1995)), gjæren Pichia pastoris (D. Mohanraj et al., Expression of biologically active human vascular endothelial growth factor in Yeast, Growth factors, 12, sidene 17-27 (1995)) og Eschehchia coli (G. Siemeister et al., Expression of biologically active isoforms of Biophys. Res. Commun., 222, sidene 249-255 (1996)) fulgte som ytterligere produksjonsorganismer. Biologisk aktivt VEGF ble produsert med alle disse rekombinantsystemer. Imidlertid er E. coli ekspresjonssystemet komplisert med hensyn til rensing og rekonstitusjon av proteinet siden sistnevnte er pakket sammen til inklusjonslegemer.

Eksempler

Oppsummering

Etableringen av styrbar Physcomitrella patens massekulturer (Reutter og Reski, loe. eit.) og fremgangsmåter for å overføre DNA inn i mosen Physcomitrella patens (K. Reutter, Expression heterologer Gene in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

[Expression of heterologous genes in Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.], Ph.D.

thesis, University of Hamburg (1994)) dannet de grunnleggende forutsetninger for den bioteknologiske utnyttelse av denne plante.

Arbeid som ble utført i begynnelsen demonstrerte langtids-stabiliteten av integreringen ved anvendelse av transgene Physcomitrella-\\ n\ ex som stammet fra Reutter (loe. eit., 1994). Ekspresjonen av de heterologe npt II og gus-gener, som ble benyttet som eksempel til dette formål, var fremdeles påvisbar etter fire år.

Physcomitrella bioreaktor-dyrkingen ble optimalisert. Det ble utviklet en rører som sørger for findeling av protonemata og således sikrer den påkrevde homogenitet av kulturen ved kontinuerlige hastigheter på 300-500 omdreininger/minutt. Standardisert prøvetaking ble således gjort mulig. Samtidig ble den innkommende luft fordelt mer jevnt i den flytende kultur. Under disse betingelser ble det demonstrert at biomasse- og protein-utviklingen uten ekstern pH-regulering fremskrider på samme måte som med pH-regulering; overraskende er sistnevnte derfor ikke nødvendig. En ukentlig biomasseproduksjon på 500 mg tørrvekt, eller 22 mg totalprotein, per liter, ble tilveiebrakt under semi-kontinuerlige betingelser. Dette betyr en økning i biomasseproduksjonen med en faktor på fem sammenliknet med den konvensjonelle 5 liters glasskolbekultur. Reduksjon av knopp-mediets saltkonsentrasjoner til en tiendedel førte til liknende data og således til reduserte kostnader.

Tilsats av 5 mM ammoniumtartrat akselererte biomasse-utviklingen ved å redusere lag-fasen. Samtidig gav tilsatsen av ammoniumtartrat kulturer som omfattet faktisk talt utelukkende kloronema-celler. Ved hjelp av strømningscytometri ble det vist at praktisk talt hundre prosent av disse kulturers celler befant seg i cellesyklusens G2/M-fase. Dette resultat ble bekreftet ved ytterligere fysiologiske studier med auxin og ved studier med de differensieringsspesifikke mutanter ca 1112 og caM 13, og det ble konkludert at caulonema-celler er i G1/G0-fasen mesteparten av tiden, mens chloronemaceller hovedsakelig befinner seg i G2/M-fasen.

En promotor ble studert med hensyn til mulig induserbarhet i mose ved anvendelse av den agrobakterielle 1'-promotor, p-glucuronidase (gus)-genet ble benyttet som markørgen. I transfient transformerte mose-protoplaster (transformasjonsrate = 3x10"<4>), ble ekspresjonen av gus-genet observert etter induksjon med 5 nm indol-3-eddiksyre. Ingen ekspresjon ble observert i noen av kontrollene.

Genet for det 121 aminosyrers spleiseform av den humane vaskulære endotele vekstfaktor (VEGF121) ble overført inn i Physcomitrella ved transformasjonsrater på 0,5x10"5 og 3,3x10"<6>. Til dette formål, ble genet klonet bak den konstitutive 35S promotor og inn i transformasjonsvektoren pRT99, som er egnet for planter. I en andre tilnærming, ble den sekvens som koder for det tilsvarende humane ER transtitpeptid klonet i tillegg. Integrering av det heterologe DNA ble bekreftet og typen integrering ble beskrevet ved å utsette de oppnådde stabile transformanter for Southern analyse. Northern analyse bekreftet eksistensen av nptll og de to VEGF-transkripter i disse transformanter. VEGFi2i-ekspresjon i mosecellene ble vist ved indirekte immunofluorescens. Proteinet ble utvetydig lokalisert i cellene ved hjelp av et konfokalt laserskannende mikroskop. Disse studier viste for transformantene uten transitpeptid at proteinet er lokalisert særskilt i cytoplasmaet. I de transformanter som dessuten inneholder transitpeptidet ER, kan proteinet finnes i de nukleære regioner og i apikalcellenes apikalregioner, regioner med et meget høyt ER-innhold. Den biologiske aktivitet av det heterologe protein som produseres i samsvar med oppfinnelsen ble verifisert ved anvendelse av ELISA og to funksjonalitetstester på det VEGF-protein som ble tilveiebrakt fra dyrkningsmediet.

Materialer og metoder:

Om ikke annet er opplyst i teksten, var de anvendte kjemikalier av p.a.-kvalitet og tilveiebrakt fra Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) og Sigma (Deisenhofen), Tyskland.

Løsningene ble fremstilt med renset, pyrogenfritt vann, i det følgende betegnet H20, fra et Milli-Q-vannrensingssystem (Millipore, Eschborn, Tyskland).

Restriksjons-endonukleaser, DNA-modifiserende enzymer og molekylær biologi-satser ble tilveiebrakt fra AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Applied Biosystems (Weiterstadt), Biometra (Gottingen), Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Tyskland), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) og Stratagene (Heidelberg). Om ikke annet er spesifisert, ble de benyttet i samsvar med produsentens anvisninger.

Vektorer og konstrukter

Plasmidet pCYTEXP-VEGF12ier et derivat av pCYTEXPI (T.N. Belev et al., A fully modular vector system for the optimization of gene expression in Escherichia coli, Plasmid, 26, sidene 147-150 (1991)), hvori cDNAfra humatVEGFi2iintegreres for ekspresjon i E. coli. VEGF12i cDNA blir skåret ut fra pCYTEXP-VEGF12i ved anvendelse av restriksjons-endonukleasene Nde I og Sal I, renset, gjort "blunt-ended" og klonet inn i Sma I kløvningspunktet tilhørende pRT101 (R. Topfer et al., A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions, Nucleic Acids Res., 115, side 5890 (1987)) mellom 35S promotoren og polyadenyleringssekvensen for CaMV. Ved å anvende Hin dill, blir den således tilveiebrakte kasett på nytt skåret ut og klonet inn i Hin dill restriksjonskløvningspunktet for transformasjonsvektoren pRT99. pRT99 inneholder ikke bare et multippelt kloningspunkt, men også neomycin-fosfotransferasegenet under reguleringen av 35S-promotoren og den tilsvarende polyadenyleringssekvens for CaMV (R. Topfer et al., Versatile doning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells, Nucleic Acids Res., 16, side 8725 (1988)). Dette gen bibringer i stabilt transformerte planter resistens overfor antibiotikumet G418. Plasmidene ble formert i Eschehchia co//-stammen DH5a (J. Sambrook et al., Molecular doning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)).

Ved anvendelse av restriksjonsenzymene Barn Hl og Bgl II, skjæres cDNA utfra vektoren pVE-121, som opprinnelig ble konstruert for å uttrykke VEGF121i insektsceller og som i tillegg til VEGFi2i-sekvensen omfatter det DNA som koder for det naturlige transittpeptid som, i dyrecellesystemer, formidler utskilling inn i mediet via det endoplasmiske reticulum (Fiebich et al., Synthesis and assembly of functionally active human vascular endothelial growth factor homodimers in insect cells, Eur. J. Biochem., 211, sidene 19-26 (1993)), og, ved anvendelse av pRT101, klonet inn i pRT99 og verifisert.

Plasmid pNA201 er et derivat av den binære vektor pBI101 (A.R. Jefferson et al., Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, sidene 387-405 (1987)). Det inneholder nptll-genet under nopalinsyntase-promotoren som utvalgsmarkør for planter. Gus-genet, som også foreligger, blir regulert av 1 '-promotoren fra Agrobacterium tumefaciens. pNA201 er egnet for den direkte transformasjon av Physcomitrella patens.

Antistoffer

To ulike antistoffer mot VEGF-proteinet benyttes. Det første antistoff er et kanin-anti-VEGF-antistoff og er rettet mot et syntetisk peptid, som svarer til aminosyrene 1-20 i det naturlige humane VEGF (Fiebich et al., loe. eit. (1993)). Det andre antistoff er et monoklonalt museantistoff som er rettet mot det humane VEGF121-protein (R&D Systems, Wiesbaden, Tyskland).

Plantemateriale

Vildtypestammen av mosen Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G., som stammer fra sammenlikningen til arbeidsgruppen genetikk ved institutt for allmenn botanikk, universitetet i Hamburg, benyttes. Dens opprinnelse er stammen 16/14, som var blitt samlet av H.L.K. Whitehouse i Gransden Wood, Huntingdonshire (England) og hadde blitt subkultivert fra en spore.

Vildtypestammen dyrkes enten i en flytende kultur med Knop medium (R. Reski og W.O. Abel, Induction of budding on chloronemata and caulonemata of the moss, Physcomitrella patens, using isopentenyladenine, Planta, 165, sidene 354-358

(1985)) eller på fast Knop medium med 1% oxoid-agar (Unipath, Basingstoke, England). Flytende kulturer ble utformet som beskrevet av Reski (loe. eit., 1990).

Bioreaktorkultur

For massedyrking, føres plantematerialet inn i en 7 liters rundbundet glasskolbe-bioreaktor som utstyrt med dobbeltvegg (Applikon Biotek, Knullwald, Tyskland). I dette bioreaktorsystem, føres utslippsluft-kjøler, luftingsrør, pH-elektrode (Conducta, Gerlingen, Tyskland), temperaturføler, røreinnretning, prøvetaktingsrør og innløpene for syre, base og medium inn i kulturvolumet ovenfra gjennom utboringer i lokket. Dyrkninger utføres ved 25°C og styres ved hjelp av et passende justert vannbad som er forbundet med dobbeltveggen. I forsøk som utføres med pH-regulering, holdes pH konstant ved 5,8 ved hjelp av titreringsenheten. Temperaturmålinger og pH-regulering utføres med Biocontroller ADI 1030 (Applikon Biotek, Knullwald, Tyskland). Rørerhastigheten kan varieres ved hjelp av motorstyreren ADI 1012 (Applikon Biotek, Knullwald, Tyskland). Dyrkningsmediet luftes konstant med 1 bar (10<5>Pa) luft via et porøst injeksjonselement. For å sikre sterilitet i dyrkningskaret, er alle innløps- og utslipps-slanger forsynt med filtersteriliseringsenheter (M id isart, 0,2 nm; Sartorius, Gottingen, Tyskland). Bioreaktor-dyrkningen utføres i et miljøstyrt kabinett med sideveis opplysning (hvitt lys; Osram L 40 W/20; max. 100nmols"<1>m"<2>). Kulturene inokuleres med 0,5 - 1 g våtvekt plantemateriale per liter bioreaktorkultur under sterile betingelser. Prøvetakingsrøret er lokalisert ved det samme nivå som røreren, noe som sikrer jevn prøvetaking under omrøring. Små prøvemengder (< 100 ml) tas ved anvendelse av en steril injeksjonssprøyte via en Luer lock- forbindelse mens større prøvevolumer fjernes ved anvendelse av eksempelvis en peristaltisk pumpe type 302/3A med hode 501 RI (Sartorius, Gottingen, Tyskland).

Chloronema-kulturer av vildtypen genereres ved å supplere Knop-mediet med 5 mM ammoniumtartrat.

Utbyttet av biologisk aktivt heterologt protein som utskilles kan økes markert når stabilisatoren PVP foreligger i dyrkningsmediet.

Differensiering av caulonema, som finner sted under protonema-utviklingen, kan induseres og økes ved eksogen tilsats av fysiologiske mengder av auxin, i det egnede konsentrasjoner er eksempelvis 5 nmol/l av indol-3-eddiksyre (IAA).

For å gjennomføre flytende dyrking av transformanter under seleksjonstrykk, tilsettes 50 mg/l av antibiotikumet G418 (Calbiochem, Bad Soden, Tyskland) til Knop-mediet. Til dette formål blir kulturene fjernet ved filtrering over sterile 100 \ im siler (Wilson Sieves, Nottingham, England) hver tiende dag umiddelbart forut for findeling og overført inn i Erlenmeyer kolber som fylt med seleksjonsmedium.

For næringsmiddelelement-forsøk, fortynnes Knop-mediet 1:10 med H20.

Transformasjon

Den valgte transformasjonsmetode er PEG-formidlet direkte DNA-overføring inn i protoplaster som beskrevet av Reutter og Reski (loe. eit., 1996). 50 pg plasmid DNA benyttes for 3x10<5>protoplaster i hver transformasjon. Protoplast-regenerering og utvelgelse for stabile transformanter utføres som beskrevet av Reutter og Reski (loe. eit., 1996), om ikke annet er spesifisert.

Indirekte immunofluorescens

Buffer: MSB: 100 mM PIPES; 5-10 mM EGTA, 5 mM MgS04, pH 6,8

F-MSB: MSB + 5%DMSO

E-MSB: MSB + 5% DMSO + 5% Nonidet

W-MSB: MSB fortynnet 1:2 med H20 (vaske-buffer)

Enzym-løsning: 1% cellulase, 1% pektinase, 2% Driselase i MSB, pH 5,6

(alle fra Sigma, Deisenhofen, Tyskland)

Mose-protonema fikseres i 1,25% glutaraldehyd i F-MSB (volum/volum) ved inkubasjon i ikke mer enn 10 minutter og kortvarig vasking i W-MSB. Deretter blir protonema inkubert med 2% paraformaldehyd i MSB (volum/volum) i 40 minutter og vasket 3x med W-MSB (skylling 1x; vasking 2x i 5 minutter).

Frie aldehyder som ikke kan elimineres ved vasking reduseres ved tilsats av MSB og en spatulaspiss med fast borhydrid, med en inkubasjonstid på 10 minutter. Borhydridet fjernes ved tre vaskinger med W-MSB.

I det neste trinn, gjøres celleveggene gjennomtrengelige ved tilsats av enzymløsningen i 10 minutter. Den enzymatiske reaksjon kveles ved å endre pH (MSB, pH 6,8). Igjen vaskes blandingen 3x med W-MSB.

Klorofyller ekstraheres ved inkubasjon med en detergentløsning i løpet av en periode på 120 minutter. Løsningen fjernes deretter ved tre vaskinger med W-MSB.

Etter denne preparering, kan mose-protonemaet inkuberes sammen med det primære antistoff (anti-VEGF; fortynning 1:50). Dette utføres ved 37°C i 45 minutter. Etter tre vaskinger med W-MSB, tilsettes det etiketterte sekundære antistoff (antikanin eller antimus; fortynning 1:30; etikettert med fluorescein-isotiocyanat (FITC) (Molecular Probes, Leiden, Nederland)) i løpet av 45 minutter ved 37<0>C. I tillegg til de tre vasketrinn som i det foregående, vaskes blandingen en gang med W-MSB + 0,1 % Triton. Protonemaet blir deretter tatt opp i W-MSB og lagret ved 4<<>,C i det minste over natten.

Materialet evalueres ved hjelp av et konfokalt laserskannende mikroskop (CLSM) type TCS 4D (Leica Lasertechnik, Heidelberg, Tyskland) og programvaren Scanware 5.0 (Leica Lasertechnik, Heidelberg, Tyskland).

For å analysere prøvene under CLSM, plasseres de på et objektglass i "mounting solution" (Dabco, Sigma, Deisenhofen, Tyskland). Eksiteringen av fluorescentfargestoffet FITC koplet til det sekundære antistoff utføres ved hjelp av en argon-krypton-laser med en bølgelengde på 488 nm. FITC emitterer lyset ved en bølgelengde på 528 nm.

ELISA- test

VEGF-proteinet i dyrkningsmediet, som er dannet i egnet transformerte moseplanter, bestemmes kvalitativt og kvantitativt ved konvensjonelle metoder ved anvendelse av ELISA-test og de i det foregående beskrevne antistoffer. En mengde på 200 ni dyrkningsmedium benyttes direkte i ELISA-testen.

Funksionalitetstest

Den biologiske aktivitet av det rekombinant dannede VEGF som er tilveiebrakt fra dyrkningsmediet sjekkes ved anvendelse av "Mitogenic Assay" (Miyazono et al., Purification and properties of an endothelial cell growth factor from human platelets, J. Biol. Chem., 262, sidene 4098-4103 (1987)) og i en "Day-13 chorioallantoic-membrane angiogenesis assay" (Wilting et al., A morphological study of the rabbit corneal assay, Anat. Embryol., 183, sidene 1167-1174 (1991)). Dyrkningsmediet utsettes på forhånd for ultrafiltrering, blir så frysetørret og deretter resuspendert i buffer. Om ønsket, kan et ytterligere rensingstrinn gjennomføres ved anvendelse av en kation kolon ne.

Induksjon av 1'- promotoren

Induserbarheten av 1'-promotoren ved auxin testes med 5 |xmol/l av indol-3-edikksyre (IAA). Fem dager etter transformasjon, overføres 100 \ i\ protoplastalikvoter fra en transformasjonsreaksjon med pNA201 inn i fordypningene i en 96-fordypningers mikrotiterskål (Nunc, Wiesbaden, Tyskland). Protoplastsuspensjonene inkuberes i fem timer med IAA (sluttkonsentrasjon 0 5 jiM). Induksjonseksperimentene evalueres direkte etter inkubasjonsperioden ved hjelp av den kvalitative (i-glukuronidasetest.

Kvalitativ fi- glukuronidasetest

p-glukuronidaseaktiviteten bestemmes i en kvalitativ test (A.R. Jefferson, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol. Rep., 5, sidene 387-405(1987)).

Substratbuffer: 50 mM K3Fe (CN)650 mM Na2HP04

50 mM K4Fe (CN)61 % (v/v) Triton X-100

50 mM NaH2P0410 mM EDTA, pH 7,0

4 mg/ml PVP (MW 10.000)

Fargingsløsning: 12,5 mg 5-brom-4-klor-3-indolylglukoronsyre (Biomol,

Hamburg, Tyskland) oppløst i 250 pJ N,N-dimetylformamid/50 ml substratbuffer

Mose-protonemata og mose-protoplaster i Knop eller regenerasjons-medium inkuberes i opptil 72 timer ved 37°C i et like stort volum av fargingsløsing og evalueres umiddelbart deretter ved anvendelse av et mikroskop.

Resultater

Homogenitet av bioreaktorkultur; prøvetaking

Bare homogene kulturer sikrer at prøvetaking fra cellekulturer er standardisert. Etter langvarig dyrkning, fører protonemavekst inn i lange cellefilamenter hyppig til celleagregater og således til uhomogen distribusjon av plantematerialet i de flytende kulturer. For å unngå slik aggrigering, findeles protonemata ved spesifikke intervaller - i bioreaktoren annen hver dag fra dag 10 og i rystekultur hver 12 dag - ved anvendelse av hurtige rørere/homogenisatorer. For å muliggjøre kontinuerlige betingelser i bioreaktoren samtidig med standardisert prøvetaking endog i løpet av en forlenget dyrkningsperiode, anbefales det å modifisere en turbinrører med tre rørerblader ved å slipe rørerbladenes kanter, slik at de omdannes til skjærblader. Konstant "omrøring" ved 300 - 500 omdreininger/minutt gjør det således mulig å drive homogene bioreaktorkulturer.

Biomasseutvikling (i tørrvekt [mg/l]) i løpet av en periode på 35 dager (840 timer) ved 500 omdreininger/minutt i kontrollkulturer med turbinrøreren er den samme som i bioreaktorkulturer som omrørt med skjæreblad-røreren.

Kulturhomogenitet vurderes ved å sammenlikne i hvert tilfelle seks parallelle prøver. Tørrvekten av plantemateriale fra et prøvevolum på 100 ml bestemmes som sammenliknings-parameteren. Ved anvendelse av en umodifisert turbinrører, øker standardavviket med økt biomassekonsentrasjon. Som en konsekvens av omrøring med skjæreblad-røreren, forblir standardavvikene av de uttatte prøver lav. Dette muliggjør den konklusjon at en jevnt homogen kultur kan oppnås med den modifiserte rører i løpet av en periode på 35 dager.

Studier med hensyn til induserbarheten for 1'- promotoren

I plasmidet pNA201, posisjoneres 1'-promotoren oppstrøms for gus-genet og fungerer som kontrollelement. Den kjente p-glukuronidasetest er egnet som påvisningstest for indukjonseksperimenter med mosen. Eksperimenter med transgen tobakk viser at 1'-promotoren fører til ekspresjon av p-glukuronidase i vev med et høyt auxin-innhold, og det antas derfor at denne promotor er auxin-avhengig. Induserbarheten av 1'-promotoren ved auxin i Physcomitrella patens er studert i transient transformerte protoplaster.

Transformasjonsreaksjonene underlegges (J-glukuronidasetesten med (5 timer) og uten inkubering med 5 uJvl indol-3-edikksyre (IAA). I kontrollene uten tilsats av IAA, viser evaluering under mikroskopet ingen blå protoplaster i noen av reaksjonene. Derimot bekrefter evalueringen av de protoplaster som er inkubert med auxin ekspresjonen av gus-genet. På basis av de blå protoplaster, oppnås en transformasjonsrate på 3x10"4. Dette er en klar antydning om at 1'-promotoren er induserbar ved plantehormonet auxin i transient transformerte -moseprotoplaster.

Generering av vektorene for VEGF- transformasjonene

For å transformere cDNA for VEGF121uten førersekvens, i det følgende betegnet VEGFC, og cDNA for VEGF121med førersekvens, betegnet VEGFP i det følgende, inn i Physcomitrella, er det nødvendig å klone sekvensene mellom en promotor/terminator-enhet som er egnet for plantene. 35S CaMV-promotoren og tilsvarende polyadenylerings-signal utvelges til dette formål. De passende preparerte VEGF cDNA-sekvenser klones inn i Sma l-restriksjonskløvningspunktet i det multiple kloningspunkt for vektor pRT101.

De resulterende vektorer (pRT101 VEGFC 3 og VEGFP 21) sekvenseres med en primer som er avledet fra den terminale region i 35S promotoren, og den korrekte integrasjon mellom promotoren og polyadenylerings-punktet verifiseres.

De resulterende kassetter kuttes opp med restriksjonsenzymet Hin dill og klones inn i den faktiske transformasjonsvektor pRT99 inn i Hin dill kløvningspunkt (pRT99VEGFC 3 og VEGFP 21). Orienteringen av kassettene i forhold til NPTII-kassetten kan bestemmes ved restriksjon med Sma I og Hine II. I tilfellet med promotor-til-polyadenyleringssignal-orienteringen, tilveiebringes et 5250 (VEGFC) og 5380 bp (VEGFP) fragment, mens den reverserte orientering gir et 1100 (VEGFC) /1230 (VEGFP) og 4150 bp (VEGFC og P) fragment. Restriksjonsanalysene viser bare et 5250/5380 bp fragment, og VEGFC/P kassettene har således blitt inkorporert i promotor-til-polyadenyleringssignal-orienteringen relativt til nptll-genet tilhørende pRT99.

VEGFC- transformasioner inn i Physcomitrella

Den absolutte transformeringsrate for transformasjonen av VEGFC-konstruktet i vildtypeprotoplaster etter gjentatt veksling fra Knop medium til seleksjonsmedium er 0,5x10"<5>, med konstant stabilitet av transformantene.

Demonstrasjon av det transformerte plasmids integrering

Vellykket integrering inn i plantegenomet demonstreres ved Southern hybridisering.

Benyttede prober er for det første et Nco l-fragment av npt ll-genet fra pRT99 og for det andre et Nde I/Sal I VEGFC-fragmentfra pCYTEXP-VEGF12i.

De signaler som påvises i det ukløvede totale DNA for transformantene bekrefter vellykket integrering av plasmid DNA inn i plantegenomet. Hvorvidt alle de aktuelle 35S VEGFC polyA-kassetter tilveiebringes endog etter integrering testes ved restriksjon med Hin dill. Dersom kassetten har fått blitt intakt ved integrering, skjærer dette enzymet av et 1100 bp fragment fra det totale DNA.

Hybridiseringsmønsteret med VEGFC-proben viser et 1100 bp fragment for alle transformanter. Integreringen av den fullstendige VEGFC-ekspresjonsenhet, som er en forutsetning for den korrekte transkripsjon og ekspresjon av VEGF121i mosen, har således blitt demonstrert.

Demonstrasjon av transkripsjonen av de heterologe gener

Transkriptene av de heterologe gener VEGFC og NPTII av transformantene påvises med det ikke radioaktive DIG påvisningssystem ved anvendelse av VEGF og NPT II-probene. Med 760 nukleotiderfor VEGFC-transkriptet og 1100 nukleotiderfor NPT ll-transkriptet, er størrelsene av de påviste transkripter i fluorogrammet innen den størrelsesorden som forventes for hvert tilfelle. Som forventet blir ingen av de heterologe transkripter påvist i WT-kontrollen.

Analyse av transformantene med humant transittpeptid

Den PEG-formidlede DNA-overføring av 50 (xg pRT99P 21 plasmid DNA per transformasjonsreaksjon genererer transformanter som er permanent stabile på seleksjonsmedium. En stabil transformasjonsrate på 3,3x10"<6>fremkommer.

Demonstrasjon av integreringen av det transformerte plasmid

Integreringen av de i det foregående beskrevne transformanter med transittpeptid demonstreres som deskrevet i det foregående ved Southern hybridisering ved anvendelse av de beskrevne prober, og hybridiseringen av Hin dlll-kløvet totalt DNA med VEGF-proben viser et 1230 bp fragment: demonstrasjon av fullstendigheten av den integrerte 35S VEGFP polyA-kassett.

Demonstrasjon av transkripsjonen av de heterologe gener

Både NPTII og VEGFP-transkripter kan påvises ved de metoder som er skissert i det foregående.

Påvisning av humant VEGF121i transgene moseceller ved anvendelse av konfokalt laserskannende mikroskop

I denne metode, etiketteres testproteinet direkte i monterte celler. Evalueringen uføres under konfokalt laserskannende mikroskop, som har en forbedret oppløsningsevne sammenliknet med et normalt lysmikroskop.

Det rekombinante VEGFi2i-protein - om det kan påvises i mosecellene - burde akkumulere i cytoplasma hos VEGF-transformanter. I VEGFP-transformantene, burde det være påviselig i ER-systemet dersom transittpeptidet er funksjonelt som signal i mosen.

Ekspresjonen av humant VEGF121i transgene moseceller har vært vellykket demonstrert med den indirekte immunofluorescensmetode og en datamaskin assistert evaluering med det konfokale laserskannende mikroskop. Dessuten er det demonstrert at, i transgen mose, blir VEGF121vellykket transportert inn i det endoplasmiske retikulum i nærvær av det tilsvarende humane transittpeptid.

Test med hensyn til tilstedeværelsen av VEGF i dyrkningsmediet

En 200 ni alikvot av dyrkningsmediet i nærvær av PVP testes med ELISA og viser at moseplanter som transformert med ekspresjonskassetten inklusive transittpeptid-kodende sekvens er i stand til å frigjøre VEGF inn i mediet. De positive resultater muliggjør at den konklusjon kan trekkes at et funksjonelt VEGF-protein foreligger.

Test av biologisk aktivitet

Begge tester som ble benyttet for å verifisere VEGF-proteinets biologiske aktivitet som frigjort inn i dyrkningsmediet gir positive resultater og bekrefter at VEGF som produsert i samsvar med oppfinnelsen kan tilveiebringes fra dyrkningsmediet med den ønskede biologiske aktivitet.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for produksjon av heterologe proteinholdige substanser i plantemateriale,karakterisert vedat protonemamose-vev benyttes som plantemateriale og at de produserte proteinholdige substanser tilveiebringes fra dyrkningsmediet uten opprivning av det produserende vev eller av cellene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den proteinholdige substans som frigjøres inn i dyrkningsmediet er biologisk aktiv.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat det benyttes et dyrkningsmedium som er fri fra sukker, vitaminer og phytohormoner eller funksjonelle fragmenter derav.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 3,karakterisert vedat mosevevet utvelges fra den gruppe av moser som inkluderer levermoser og ekte moser.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat mosevevet utvelges fra moser av den gruppe som består av Physcomitrella, Funaria, Sphagnum og Ceratodon.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat mosevevet utvelges fra levermoser av den gruppe som består av Marchantia og Sphaerocarpos.