ES2624479T3 - Métodos para cultivar células de leucemia mieloide humana y células derivadas de esta - Google Patents

Abstract

Un método para cultivar una suspensión de células sanguíneas humanas inmortalizadas de origen de leucemia mieloide humana o células derivadas de las mismas, en donde dicha suspensión se agita tal que la entrada de energía específica resultante es al 5 menos 0,005 W/kg.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para cultivar celulas de leucemia mieloide humana y celulas derivadas de esta Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para cultivar celulas sangulneas inmortalizadas humanas de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de ellas, a un metodo para la produccion recombinante de un producto de interes.

Antecedentes de la invencion

Las tecnicas recombinantes se aplican ampliamente para producir un producto de interes, tal como particularmente una protelna. El producto de interes se expresa en una celula huesped adecuada y el producto expresado se obtiene por ejemplo a partir de las celulas y/o el medio de cultivo celular.

La idea basica de la fermentacion es mantener las celulas en condiciones optimas durante un perlodo de tiempo en diferentes escalas para producir grandes cantidades del producto deseado. La fermentacion es comun para procariotas (por ejemplo, Escherichia coli), levadura (por ejemplo, Pichia pastoris) y celulas de mamlfero (por ejemplo, llneas celulares de roedor tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas de mieloma de raton (NS0; SP2/0) o llneas de celulas humanas ). Ademas de unos medios de cultivos optimizados, un proceso de fermentacion bien controlado es la base para un proceso de produccion en el cultivo de celulas de mamlferos. Dependiendo de la llnea celular de produccion, las celulas se cultivan en cultivo en suspension o en una matriz portadora para el cultivo celular dependiente de anclaje. El cultivo celular a pequena escala se realiza usando un nivel relativamente bajo de instrumentacion. Por ejemplo, para la suspension las botellas de cultivo rotatorias y frascos de centrifugacion son adecuados. El cultivo de celulas a pequena escala se opera generalmente en una incubadora de dioxido de carbono humidificada. Como la transferencia de gas en una incubadora de dioxido de carbono se basa en la difusion pasiva, pueden ocurrir limitaciones en la transferencia de gas. La tecnica de fermentacion para la produccion de productos farmaceuticos esta ampliamente cubierta en la literatura ya que se disponen de numeroso artlculos de revision, por ejemplo [Andersen y Reilly 2004], [Shukla y Thommes 2010], [Marks 2003] y [Morrow 2007]. Con respecto al funcionamiento de la fermentacion del cultivo celular, existen cuatro estrategias basicas diferentes para biorreactores, que se han descrito en la literatura: fermentacion discontinua, semicontinua, continua sin retencion celular y fermentacion continua con retencion celular (perfusion). Como la perfusion incluye una retencion celular, la unica forma de eliminar las celulas durante el cultivo es el uso de un sangrado (eliminacion de la suspension celular).

Los parametros de fermentacion son caracterlsticos de un proceso de produccion. Cambiar estos parametros puede aumentar o disminuir el rendimiento del producto. Dentro de la temperatura del biorreactor, el oxlgeno disuelto y el valor del pH son parametros basicos que deben controlarse. Las estrategias de optimizacion se basan en el ajuste de esos parametros. Algunos parametros, que son adecuados para la optimizacion incluyen, pero no se limitan a, la temperatura usada durante la fermentacion, el nivel de oxlgeno utilizado, la retencion celular y la composition de los medios usados.

Ademas, la selection de la aireacion/rociado tambien puede ser una caracterlstica importante para el proceso de cultivo. Las celulas que crecen en el cultivo celular requieren de oxlgeno para un crecimiento eficiente. En pequenos volumenes de cultivo la cantidad de oxlgeno que llega a las celulas por difusion a traves de la superficie del medio de cultivo es generalmente suficiente. Sin embargo, a medida que aumenta el volumen de cultivo, se hace necesaria la adicion especlfica de oxlgeno. Esto se logra normalmente mediante burbujeo, de manera que se introducen burbujas del gas o gases que se introducen al cultivo celular. Cuando se requieren tamanos de recipientes mas grandes, el suministro de gas homogeneo se torna cada vez mas preocupante. Sin embargo, el suministro de gas no puede aumentarse arbitrariamente porque la mayorla de las celulas de mamlferos tienden a ser sensibles a las fuerzas de cizallamiento creadas por las burbujas. Dichas burbujas portan celulas unidas a la superficie, donde la ruptura de las burbujas bajo la formation de alta tension hidrodinamica, mata por lo tanto, las celulas unidas. Estos efectos letales pueden reducir la viabilidad celular y por tanto, la productividad de un cultivo celular. Los sistemas de suministro de gas sin burbujas (por ejemplo membranas) que pueden resultar utiles en cultivos mas pequenos no son practicos para su uso en cultivos mas grandes durante el escalado. Las razones para esto son, por ejemplo, los elevados costes asociados al uso de membranas o limitaciones tecnicas en los grandes recipientes.

Ademas, para conseguir un cultivo celular homogeneo, la suspension se mezcla generalmente por agitation. Esto puede lograrse por ejemplo por agitacion del impulsor y burbujeo de gas. Para la agitacion generalmente se usa un agitador. Sin embargo, existen tambien limitaciones para la agitacion. Las celulas generalmente, suelen ser sensibles a las fuerzas de cizallamiento inducidas por la agitacion, por ejemplo mezclando. Por lo tanto, el potencial para asegurar la homogeneidad por agitacion es limitado.

Con respecto a la mezcla, existen dos problemas especlficos: (i) la adicion de solution base y solution de alimentation y (ii) acumulacion de dioxido de carbono. Se pueden producir variaciones en la concentration de los niveles de sustrato, pero tambien de los gradientes de oxlgeno. Son mas comunes en recipientes grandes que en recipientes pequenos. La

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distribucion desigual aumenta con el tamano del recipiente y se torna cada vez mas crltica. El principal problema de mezclar es el intercambio entre las fuerzas de cizallamiento y heterogeneidades. Para garantizar suficiente mezcla y sin danos, la tension por el cizallamiento es un reto intrigante. Tanto la mezcla como la tension de cizallamiento pueden conducir a la muerte celular por diferentes medios. La mezcla insuficiente puede conducir por ejemplo a ala floculacion o limitation de oxlgeno, mientras que la tension de cizallamiento puede lisar las celulas.

La tension hidrodinamica basada en fuerzas de cizallamiento es un topico importante en el cultivo celular. Generalmente, el dano por las fuerzas de cizallamiento depende en gran medida de la llnea celular. Adicionalmente, a medida que aumentan las densidades celulares maximas de los procesos semicontinuos o de perfusion debido a la optimization del proceso y del medio hay una demanda adicional para el mezclado a medida que aumenta la viscosidad. La tension hidrodinamica en un biorreactor de tanque agitado es un fenomeno no homogeneo. En las regiones del impulsor, que representan solo alrededor del 10 % del volumen total, se disipa hasta el 70 % de la energla. Por consiguiente, las fuerzas de cizallamiento son tambien mucho mas altas en aquellas regiones cercanas al impulsor que pueden causar efectos daninos letales o no letales en las celulas. La tension hidrodinamica no solo puede lisar las celulas; tambien puede influir en las celulas a un nivel sublltico, que actualmente no esta bien esclarecido.

Estos factores contribuyen al hecho de que las condiciones de cultivo que pueden ser adecuadas para los cultivos en pequena escala no pueden transferirse facilmente a cultivos a gran escala. El resultado de la production de protelnas en cultivos a gran escala es frecuentemente considerado diferente del de los cultivos a pequena escala. Durante la produccion a gran escala, muy frecuentemente disminuye la productividad y/o la calidad de la protelna producida (por ejemplo, las estructuras de glicosilacion en caso de que la glicoprotelna se produzca de forma recombinante). En conjunto, el escalado sigue siendo un problema importante en el cultivo de celulas de mamlferos. Aunque hay mucha literatura disponible para los procedimientos del escalado con respecto a los conceptos y consideraciones del escalado, el escaldo sigue siendo un reto y las medidas adecuadas para una llnea celular especlfica, frecuentemente no se pueden transferir a una llnea celular diferente.

Cuando se produce un producto glicosilado de interes, tal como por ejemplo un anticuerpo que se usa en la terapia, es deseable obtener una estructura de glicosilacion "humana" o "humanizada". Varias tecnicas y celulas huesped estan disponibles para ese proposito. Las celulas sangulneas humanas inmortalizadas y las llneas celulares derivadas de las mismas se encontraron adecuadas para producir de forma recombinante productos glicosilados que tienen un patron de glicosilacion humana. Las llneas celulares respectivas se describen por ejemplo en el documento de patente num. WO 2008/028686. La glicosilacion del producto es una compleja modification postraduccional que puede afectarse por muchos parametros diferentes. Estos parametros pueden ser de naturaleza flsica, qulmica o termodinamica. Como estos parametros pueden verse afectados durante la fermentation, es muy importante desarrollar un proceso de fermentation que permita producir un producto con un patron de glicosilacion constante, es decir, homogeneo. Existen varios informes que se encuentran en la literatura. Se informa, por ejemplo que la fuerza de cizallamiento, la disponibilidad de glucosa, la saturation de oxlgeno, el pH, la temperatura y otras condiciones del proceso pueden afectar la glicosilacion [Senger y Karim 2003] [Godoy-Silva y otros 2009] [Tachibana y otros 1994] [Kunkel y otros 1998] [Muthing y otros 2003] [Ahn y otros 2008] [Lipscomb y otros 2005].

Stiens y otros (2000) describe los metodos para cultivar la llnea de celulas sangulneas humanas inmortalizadas K562 y producir de forma recombinante el receptor de la estimulante de tiroides (TSH-R) en dicha llnea celular. El cultivo se realiza con agitation estandar bastante baja. Goletz y otros (2009) discuten la glico-optimizacion para los anticuerpos y las protelnas biofarmaceuticas completamente humanas y muy mejoradas. Las llneas celulares humanas de origen leucemico glico-manipuladas por ingenierla genetica se mencionan generalmente como celulas en suspension y resistentes a fuerzas de cizallamiento elevadas.

Un objetivo de la presente invention es proporcionar un metodo para cultivar celulas, particularmente celulas sangulneas humanas inmortalizadas, que permite producir un producto de interes con rendimiento aceptable y buena calidad al usar tambien diferentes volumenes de fermentacion (escalas).

Resumen de la invencion

La presente invencion se basa, entre otros, en el descubrimiento sorprendente de que un aumento en la agitacion del cultivo de celulas resulta pese a un aumento asociado en las fuerzas de cizallamiento en la mejorla considerable de las condiciones de cultivo que permiten la produccion de un producto de interes con buen rendimiento y calidad tambien durante el escalado. Esta es una ventaja importante, particularmente cuando se produce un producto de interes tal como una glicoprotelna para usos terapeuticos. Para tales aplicaciones, los cambios en la calidad del producto al usar diferentes volumenes de fermentador son inaceptables en el proceso de BPM, respectivamente, aumentan los esfuerzos necesarios para obtener la aprobacion de las autoridades reguladoras. Se encontro particularmente que la densidad celular y la viabilidad celular pueden mejorarse con el metodo de cultivo de conformidad con la presente invencion. El transporte de nutrientes en el medio de cultivo celular se mejora y la velocidad de aireacion puede reducirse, lo que reduce el dano de las celulas debido al desarrollo de burbujas. Ademas, se encontro que el proceso de cultivo se mejora si el tamano y/o la cantidad de burbujas que se desarrollan debido a la aireacion se mantiene al mlnimo cuando se cultivan celulas sangulneas humanas inmortalizadas, preferentemente celulas de origen de leucemia mieloide humana.

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De conformidad con un primer aspecto, se proporciona un metodo para cultivar una suspension de celulas sangulneas humanas inmortalizadas de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de las mismas, en donde dicha suspension se agita tal que la entrada de energla especlfica resultante es al menos 0,005 W/kg.

Dicho metodo puede tener una o mas de las siguientes caracterlsticas adicionales:

a) dicha suspension se agita tal que la entrada de energla especlfica resultante es al menos 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,04, 0,05, 0,075 o 0,1 W/kg, preferentemente en un intervalo de 0,015 a 0,03, con mayor preferencia de 0,018 a 0,025 W/kg,

b) dicha suspension se agita con una intensidad que es adecuada para permitir un suministro de flujo exclusivo de gas de dicha suspension,

c) dicha suspension se agita tal que la fuerza de cizallamiento resultante sea de al menos 0,1 N/m2, preferentemente al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,7, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5 o 2,0 N/m2,

d) en el caso de que se use un agitador para la agitacion, dicha suspension se agita de tal manera que la velocidad de cizallamiento resultante en la punta del agitador es al menos 300 s'1, preferentemente al menos 500, 700, 900, 1100 o 1300 s'1,

e) dichas celulas se suministran con al menos un gas por flujo exclusivo,

f) dichas celulas se suministran con al menos un gas a una velocidad de flujo de como maximo 0,05 l/h, preferentemente como maximo 0,02, 0,01 o 0,005 l/h por litro de volumen del reactor,

g) el suministro de gas tiene una velocidad de flujo maxima de 0,05 vvm o menos, preferentemente de 0,02, 0,01 u 0,005 vvm o menos.

De conformidad con un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para la produccion recombinante de un producto de interes en celulas sangulneas inmortalizadas humanas de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de las mismas, en donde dichas celulas comprenden un gen que codifica el producto de interes y en donde dichas celulas se cultivan de conformidad con el metodo de conformidad con el primer aspecto de la presente invencion.

Ademas, se describen metodos y herramientas que permiten el escalado exitoso de la fermentacion mientras que mantiene el rendimiento y la calidad del producto.

Description detallada de la invencion

Los procedimientos de conformidad con el primer y segundo aspecto de la invencion permiten alcanzar uno o mas de los siguientes objetivos: dano minimizado a las celulas, especialmente dano inducido por el suministro de gas, aireacion y/o formation de burbujas, una alta estabilidad y uniformidad de las estructuras de glicosilacion en caso de que se exprese una glicoprotelna, una buena velocidad de produccion, facilidad de manejo, un numero reducido de agregados celulares, facilidad de escalado y robustez para procesar la variation de parametros.

A menos que se indique de cualquier otra manera, el termino "metodos de conformidad con la invencion" o "metodo de conformidad con la invencion" se refiere tanto al metodo de conformidad con el primer aspecto como al metodo de conformidad con el segundo aspecto de la presente invencion.

Los metodos de conformidad con la invencion se basan en parte en el sorprendente hallazgo de que las celulas usadas de conformidad con la presente invencion muestran propiedades de crecimiento particularmente buenas (por ejemplo viabilidad) y una produccion particularmente buena de protelnas recombinantes cuando la intensidad (vigor) de agitacion es bastante alta. Esto fue inesperado debido a que generalmente, las celulas suelen danarse por las fuerzas de cizallamiento inducidas por agitacion vigorosa. Un hallazgo sorprendente fue que las celulas que se usan de conformidad con la invencion tienen una sensibilidad diferente a las fuerzas de cizallamiento inducidas por agitacion y a las fuerzas de cizallamiento inducidas por las burbujas de aire. Las celulas que se usan de conformidad con la invencion son muy robustas a las fuerzas de cizallamiento inducidas por el agitador (por ejemplo, toleran fuerzas de cizallamiento de, por ejemplo, 0,9 N/m2 y velocidades de cizallamiento de, por ejemplo,1000 s'1), pero son muy sensibles a la aireacion. El suministro de flujo exclusivo de gas o el suministro de gas a una velocidad de flujo baja puede usarse para conseguir tambien, las ventajas de la presente invencion debido a que estas medidas reducen las fuerzas de cizallamiento inducidas por las burbujas. Fue inesperado que las celulas usadas de conformidad con la invencion eran mas bien insensibles a las fuerzas de cizallamiento inducidas por agitacion hasta un grado que permita una agitacion suficientemente vigorosa para permitir la aplicacion de un suministro de flujo exclusivo de gas. La agitacion vigorosa tiene el efecto ventajoso de que se garantiza una mezcla homogenea y condiciones de crecimiento homogeneas para todas las celulas.

La suspension celular se agita tal que la entrada de energla especlfica resultante es de al menos 0,005 W/kg. La entrada de energla especlfica particularmente es la energla usada para la agitacion (por ejemplo, para girar un agitador o para rotar, balancear, girar o de cualquier otra manera agitar el cultivo de celulas y/o el recipiente de cultivo celular) por masa (por ejemplo, kg) o volumen (por ejemplo m3) del cultivo celular. Preferentemente, la entrada de energla especlfica para la agitacion es al menos 0,01, al menos 0,015, al menos 0,02, al menos 0,025, al menos 0,03, al menos

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Las celulas que se van a usar de conformidad con la invencion permiten la production de glicoprotelnas con glicosilacion humana, que generalmente conducen a una biodisponibilidad y funcionalidad mejoradas. Esta es una ventaja importante sobre los sistemas de produccion actualmente disponibles, que son principalmente de origen de roedor (por ejemplo, celulas CHO, celulas NSO, celulas Sp2/0). La principal ventaja de las llneas celulares es la glicosilacion humana junto con otras modificaciones postraduccionales humanas.

Las celulas sangulneas humanas inmortalizadas que se usan de conformidad con la invencion son celulas de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de las mismas. Preferentemente, las celulas son de una llnea celular, particularmente de la llnea celular K562 (por ejemplo, la llnea celular K562 disponible como ATCC CCL 243) o una llnea celular derivada de la misma. Las celulas respectivas, las llneas celulares y las celulas huesped se describen en detalle en el documento de patente num. WO 2008/028686. Metodos similares son adecuados tambien para otras celulas en suspension o llneas celulares que toleran una alta tension de cizallamiento, particularmente para las celulas o llneas celulares en suspension eucariotas, preferentemente celulas en suspension o llneas celulares humanas.

El metodo para la produccion recombinante de un producto de interes, preferentemente una glicoprotelna, en celulas sangulneas humanas inmortalizadas de origen de leucemia mieloide o celulas derivadas de las mismas, permite producir el producto de interes con buen rendimiento y calidad homogenea aun al usar diferentes volumenes de cultivo y aun al aplicar altas fuerzas de cizallamiento inducidas por la agitation. Las celulas huesped comprenden un gen que codifica el producto de interes y dichas celulas se cultivan de conformidad con el metodo de la revindication 1. Dicho gen que codifica el producto de interes se introduce preferentemente de forma recombinante. Dichas tecnicas recombinantes se conocen bien y por lo tanto, no necesitan de description detallada en la presente. por ejemplo el gen que codifica el producto de interes puede comprenderse en un vector de expresion que despues se introduce de forma estable o transitoria en las celulas huesped. El producto de interes puede ser de cualquier naturaleza, preferentemente es una protelna o polipeptido. Preferentemente, dicho producto esta glicosilado. Particularmente, son de interes la produccion recombinante de los productos farmaceuticamente activos tales como anticuerpos u otras protelnas terapeuticamente activas. Para la produccion a gran escala de los respectivos productos, se necesitan metodos de fermentation que permitan la produccion del producto de interes con buen rendimiento y buena calidad homogenea, aunque se usen diferentes volumenes de cultivo. Ademas, la calidad del producto y preferentemente, tambien el rendimiento deben preferentemente ser comparables entre diferentes cargas de produccion. Estas ventajas pueden lograrse con el metodo de conformidad con la presente invencion.

El producto expresado de interes se obtiene a partir del cultivo celular, por ejemplo mediante la ruptura de las celulas o recolectando el producto de interes secretado del medio de cultivo celular. Preferentemente, el producto de interes se purifica a partir del medio de cultivo celular. En esta modalidad, el producto preferentemente se secreta por las celulas.

Preferentemente, las celulas se cultivan mediante fermentacion continua con retention celular (perfusion), lo que produce resultados particularmente buenos. Las celulas usadas en los metodos de conformidad con la invencion no producen protelna recombinante en cantidades discernibles durante la fase estacionaria. Por consiguiente, la perfusion puede servir para prolongar la fase de crecimiento exponencial (logarltmica) en la que se produce la mayor parte de la protelna. Por lo tanto, el uso de la perfusion para el cultivo es ventajosa cuando se cultivan las celulas sangulneas humanas inmortalizadas tales como las celulas K562 o celulas derivadas de las mismas.

En el modo de perfusion, se suministra preferentemente medios frescos de forma continua. En este mismo sentido, el sobrenadante libre de celulas se toma preferentemente del biorreactor mientras que las celulas se retienen preferentemente en el fermentador. Una caracterlstica importante de un fermentador de perfusion es el sistema de retencion celular. Las celulas se pueden retener aplicando diferentes tecnicas. Por ejemplo, pueden usarse filtration, centrifugation o sedimentation. En un metodo de perfusion de conformidad con la invencion, la retencion celular se consigue preferentemente mediante un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un filtro de rosca, una fibra hueca, una centrlfuga continua y un sistema de retencion de celulas acusticas.

Preferentemente, se usa una centrlfuga continua, tal como una centrlfuga continua Centritech Lab, para la perfusion. La perfusion usando la centrlfuga continua Centritech Lab es adecuada para volumenes de perfusion entre 0,5l/d y 120l/d; para cultivos de celulas mas grandes puede usarse la centrlfuga continua Centritech. Sobre este amplio intervalo de volumen, el Centritech se usa en diferentes tipos de operation. Hay varios modos continuos: modo de bomba, modo de valvula y modo de alimentation y un modo intermitente discontinuo, que es una variante del modo de bomba. En modo discontinuo, la centrlfuga funciona durante el tiempo de corrida, que se interrumpe por un tiempo de espera. Durante el tiempo de espera, el sistema de tuberla debe estar libre de celulas, lo que se garantiza al lavar el sistema despues de cada corrida usando el sobrenadante libre de celulas.

La perfusion se controla ajustando la bomba de alimentacion y controlando la bomba de recoleccion del Centritech. De conformidad con una modalidad, la velocidad de perfusion se establece entre 0,5 V/d (volumenes de cultivo celular por dla) y 2,5 V/d. Para ajustar adecuadamente la velocidad de perfusion a los requerimientos de celulas, se elige

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preferentemente un parametro clave (parametro de control). Idealmente, el parametro de control es limitante del crecimiento/produccion y facil de medir. Sin embargo, mas frecuentemente el parametro de control no es el factor limitante del crecimiento. por ejemplo, la glucosa se ajusta como parametro de control.

Un proceso de perfusion para las celulas usadas de conformidad con la presente invencion presenta alta viabilidad celular durante la fermentacion de alta densidad. Durante la fermentacion, no existen limitaciones con respecto a los sustratos principales, por ejemplo oxlgeno, glucosa, glutamina, ni tampoco ninguna limitante para aminoacidos proteinogenicos. Adicionalmente, el proceso de perfusion presenta una calidad de producto constante y especialmente un patron de glicosilacion constante. El proceso de fermentacion se controla preferentemente a pH 7,2; DOT (tension de oxlgeno disuelto) del 40 % y a una temperatura de 37 °C. La fermentacion con dichas celulas sangulneas inmortalizadas se puede realizar con una entrada de energla alta (por ejemplo, 0,022 W/m3), ya que las celulas toleran altas fuerzas de cizallamiento, particularmente en un biorreactor de tanque agitado.

En condiciones de perfusion, la concentracion celular aumenta generalmente hasta que se cumple una limitacion. Esta limitation puede ser o bien un nutriente o la acumulacion de un producto residual. Comparado con una fermentacion discontinua o una semicontinua, se pueden alcanzar densidades de celulas mucho mas altas debido al suministro constante de medios y al lavado de productos de desecho. Basandose en esas densidades celulares superiores, se logran rendimientos de espacio-tiempo superiores.

De conformidad con una modalidad, las celulas se eliminan durante el cultivo, preferentemente mediante el sangrado. Cuando se aplica el sangrado, se toma una cierta cantidad de celulas (por ejemplo, 10 % del volumen total) del fermentador. El sangrado tiene la ventaja de que las celulas se mantienen en una fase de crecimiento durante un tiempo mas prolongado con una viabilidad aumentada, lo que da como resultado un cultivo mas estable. Varias estrategias de sangrado se han discutido en la literatura por Dalm y colaboradores [Dalm y otros, 2004], [Dalm y otros, 2007].

Una ventaja particular del metodo de cultivo de la presente invencion que es importante para la production recombinante de un producto glicosilado de interes es que dicho metodo resulta en glicoestructuras homogeneas y altamente reproducibles cuando se expresan por ejemplo glicoprotelna. En una modalidad preferida, la estructura de glicosilacion de un producto de interes y/o la velocidad de produccion de las celulas no se afecta sustancialmente por el volumen de cultivo. Un ejemplo es un caso en donde se comparan los cultivos (preferentemente los cultivos de perfusion) de un reactor de 1 l y un reactor de 100 l. Preferentemente, la calidad global del producto no se afecta sustancialmente por el volumen de cultivo. Los ejemplos muestran que los metodos de conformidad con la presente invencion son capaces de alcanzar estas ventajas.

De conformidad con una modalidad, la densidad celular en el cultivo celular alcanza al menos 1x106 /ml. Preferentemente, la densidad celular es incluso mayor, por ejemplo al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 x106 celulas/ml. De conformidad con una modalidad, la viabilidad celular en el cultivo celular es al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 %. De conformidad con una modalidad, la densidad de celulas de conformidad con los metodos la invencion, alcanza en un punto en el tiempo al menos 5x106/ml con una viabilidad celular de al menos 90 %. La viabilidad celular particularmente denota el porcentaje del numero de celulas vivas comparado con el numero de todas las celulas (vivas o muertas) en una muestra.

Una velocidad de produccion maxima alcanzable preferida es de al menos 25 pg/(mld) (25 pg de producto por ml de cultivo celular por dla), preferentemente al menos 50 pg/(mld), al menos 80 pg/(mld), al menos 90 pg/(mld) o al menos 100 pg/(mld).

En los metodos de conformidad con la invencion preferentemente se usa un agitador para la agitation, particularmente un impulsor.

El cultivo de celulas esta generalmente contenido en un recipiente, que puede ser por ejemplo una bolsa que contiene un cultivo de celulas, preferentemente una bolsa desechable, o alternativamente un recipiente distinto de una bolsa, por ejemplo un deposito, contenedor o similar. Si se usa una bolsa, puede combinarse preferentemente con un agitador que se usa para la agitacion. Preferentemente, se usa un fermentador como recipiente que es adecuado y preferentemente se usa comunmente para un metodo de perfusion.

En los metodos preferidos de conformidad con la invencion se usa un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un rociador en anillo, un micro-rociador y una membrana para la aireacion. Los metodos de conformidad con la invencion permiten el uso de un rociador para el suministro de gas, que puede de cualquier otra manera no ser factible debido a la alta sensibilidad a las burbujas de aire de las celulas que se usan de conformidad con la invencion.

De conformidad con una modalidad, se dan pulsos de al menos un gas durante el proceso de cultivo para la aireacion.

De conformidad con una modalidad, el desarrollo de burbujas causado por la aireacion esta limitado por el metodo de aireacion elegido y en donde las burbujas producidas tienen preferentemente un tamano de mas de 2 mm,

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preferentemente mas de 5 mm, con mayor preferencia mas de 10 mm o mas. Como se discutio anteriormente, las burbujas mayores que 2 mm y particularmente mayores que 10 mm resultan en una tension de cizallamiento menor y, en consecuencia, son menos letales para las celulas usadas de conformidad con la presente invencion.

Como se discutio anteriormente, el suministro de gas en general o la aireacion se logra preferentemente mediante un flujo exclusivo de gas. El termino "flujo exclusivo" se refiere particularmente al suministro de gas de una manera discontinua, en oposicion a un flujo constante en donde el gas se suministra de manera continua. El termino "aireacion" particularmente se refiere al suministro de un gas que comprende o que consiste en oxlgeno (por ejemplo aire, preferentemente oxlgeno puro). Preferentemente, la aireacion se realiza mediante flujo exclusivo. Un pulso de suministro de gas (por ejemplo, un gas que comprende oxlgeno, preferentemente todos los gases) puede, de conformidad con una modalidad, como maximo tener una duracion de 30 s (o como maximo 10 s, 3 s o 1 s). La fraccion de tiempo durante la cual se suministran los gases pueden ser como maximo 25 % (o como maximo 10 %, 5 %, 2,5 % o 1%) del tiempo de cultivo (que se cultiva) durante al menos 1 h (o al menos 2 h o 5 h). Preferentemente, se usa medio para detectar la saturacion de oxlgeno en la suspension. El gas que comprende oxlgeno se suministra preferentemente cuando la saturacion de oxlgeno detectada es inferior a un umbral predefinido, tales como por ejemplo una pO2 o DOT de 10 %, preferentemente 20 %, 25 %, 30 % o con mayor preferencia 35 %. Preferentemente para aireacion, se suministra oxlgeno puro.

Por lo tanto, de conformidad con una modalidad, se determina el valor de oxlgeno, respectivamente la saturacion de oxlgeno en el cultivo de celulas y en donde se introduce oxlgeno y/o un gas o mezcla de gas que contiene oxlgeno como un pulso en el medio de cultivo celular si el nivel de oxlgeno cae por debajo de un nivel predeterminado, por ejemplo como se definio anteriormente. Esto minimiza ventajosamente la aireacion y consecuentemente la formacion de burbujas.

En las modalidades preferidas, las celulas se suministran con al menos un gas a una velocidad de flujo de como maximo 0,05 l/h, preferentemente como maximo 0,02, 0,01 o 0,005 l/h por litro de volumen del reactor. Particularmente, el suministro total de gas del cultivo de celulas es de 0,05 l/h por litro de volumen del reactor o menos, preferentemente 0,02, 0,01 o 0,005 l/h por litro de volumen del reactor o menos. Los terminos "velocidad de flujo" y "suministro de gas" a este respecto se refieren preferentemente a la velocidad de flujo medio o al suministro de gas durante todo el proceso de cultivo. Esto significa que cuando se usa un flujo exclusivo de gas, en donde se introduce gas en el cultivo celular con intervalos interrumpidos, las velocidades de flujo reales durante los intervalos de suministro pueden ser mayores que los valores anteriores. Sin embargo, en promedio, considerando los intervalos de suministro y los intervalos en los que no se introduce gas en el cultivo celular, la velocidad de flujo global o suministro de gas es preferentemente como maximo 0,05 l/h por litro de volumen del reactor, como se definio anteriormente.

En modalidades preferidas en donde el suministro de gas se alcanza por flujo exclusivo de gas, la velocidad de flujo en cualquier momento durante los intervalos de suministro (velocidad de flujo maximo) es 0,05 vvm (volumen por volumen de reactor por minuto) o menos, preferentemente 0,02, 0,01 o 0,005 vvm o menos.

En ciertas modalidades especialmente preferidas, en los metodos de conformidad con la presente invencion

(i) la entrada de energla especlfica para la agitacion de la suspension es de al menos 0,01 W/kg; y

(ii-1) el suministro de gas con al menos el suministro de un gas o gas total de la suspension es de 0,05 l/h por litro de

volumen del reactor o menos, o

(ii-2) el suministro de gas se alcanza mediante un flujo exclusivo de gas y la velocidad de flujo maxima es de 0,05 vvm o menos.

Preferentemente, la entrada de energla especlfica para la agitacion de la suspension es al menos de 0,015 W/kg; y el suministro de gas con al menos el suministro de un gas o gas total de la suspension es de 0,02 l/h por litro de volumen del reactor o menos o, si el suministro de gas se logra por flujo exclusivo de gas, la velocidad de flujo maxima es 0,02 vvm o menos. En estas modalidades, la fuerza de cizallamiento resultante de la agitacion de la suspension es de al menos 0,1 N/m2, preferentemente 0,3 N/m2, y/o la velocidad de cizallamiento en la punta del agitador es de al menos 300 s-1, preferentemente 500 s-1.

De conformidad con una modalidad, se anade una base durante el cultivo para mantener el pH a un nivel o intervalo de pH predeterminado. Los intervalos o valores de pH preferidos estan entre 5 y 9, con mayor preferencia entre 6 y 8,5, entre 6,5 y 8, o lo con la maxima preferencia entre 7 y 7,5. Generalmente se requiere la adicion de una base para neutralizar, por ejemplo la formacion de lactato, o para neutralizar la formacion de CO2. En los metodos conocidos en la tecnica anterior, la adicion de una base resulta en una floculacion celular que probablemente se induce por la base que puede inducir la lisis celular. La floculacion es una agregacion de celulas muertas. La floculacion es particularmente, un problema en escalados mas grandes. El metodo de conformidad con la presente invencion reduce la formacion de floculacion, probablemente debido a la agitacion mas vigorosa. Los metodos de conformidad con la invencion permiten reducir la formacion de floculos de celulas. Las bases que se anaden a la suspension celular pueden distribuirse mas rapida y uniformemente. En un metodo preferido de conformidad con la invencion, la formacion de floculos celulares se reduce en oposicion a un metodo correspondiente que comprende ninguna de las caracterlsticas a) a f).

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Preferentemente, la base se anade muy proxima a la region del agitador. Ademas, la base se anade preferentemente directamente a la suspension de celulas, es decir, el sitio de adicion esta por debajo de la superficie de la suspension y la base no se gotea en la suspension.

Las celulas se cultivan preferentemente en un medio libre de suero, por ejemplo medios GTM qulmicamente definidos.

En una modalidad preferida de los metodos de conformidad con la presente invencion, el medio de cultivo celular comprende un agente protector de cizallamiento, por ejemplo suero, poli(etilenglicol) (PEG), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(vinilalcohol) (PVA) o Pluronic-F68. El agente protector de cizallamiento se usa preferentemente a una concentracion de < 0,01 a 3 g/l. Preferentemente, el medio de cultivo celular es libre de suero.

De conformidad con una modalidad, el cultivo celular se realiza a un intervalo de pH entre 6,5 y 8, preferentemente 7 y 7,5; una pO2 del 10 % al 90 %, preferentemente del 30 % al 50 %, con mayor preferencia del 35 % al 45 % y/o una temperatura de 30 a 40°C, preferentemente 37°C.

De conformidad con una modalidad preferida, la estructura de glicosilacion del producto de interes y/o la velocidad de produccion de las celulas no se afecta sustancialmente por el volumen de cultivo.

Preferentemente, las modalidades preferidas como se describen en la presente invencion se combinan entre si.

Particularmente, se proporcionan las siguientes combinaciones preferidas:

caracterlstica a) con la caracterlstica e)

caracterlstica a) con la caracterlstica f)

caracterlstica a) con la caracterlstica g)

caracterlstica a) con la caracterlstica e) y la caracterlstica g)

caracterlstica c) con la caracterlstica e)

caracterlstica c) con la caracterlstica f)

caracterlstica c) con la caracterlstica g)

caracterlstica c) con la caracterlstica e) y la caracterlstica g)

caracterlstica d) con la caracterlstica e)

caracterlstica d) con la caracterlstica f)

caracterlstica d) con la caracterlstica g)

caracterlstica d) con la caracterlstica e) y la caracterlstica g)

caracterlstica e) con la caracterlstica g)

caracterlstica a) con la caracterlstica e) y la caracterlstica g) y la caracterlstica c) y/o la caracterlstica d)

En estas combinaciones pueden usarse particularmente, los valores preferidos y los intervalos definidos anteriormente. En ciertas modalidades, las combinaciones anteriores se combinan ademas con una o mas de las modalidades definidas en la presente descripcion, particularmente con la caracterlstica b).

De conformidad con una modalidad, se usa un fermentador para cultivo celular que tiene un volumen de al menos 1 l, preferentemente al menos 10 l, al menos 20 l, al menos 50 l, al menos 100 l, al menos 200 l, al menos 500 l o al menos 1000 l, particularmente un volumen en el intervalo de 1 l a 1000 l, 1 l a 500 l, 10 l a 250 l o 20 l a 100 l. Como se discutio anteriormente, sorprendentemente, en particular la calidad del producto, pero tambien la productividad, no se afecta por el tamano del fermentador. Esta es una ventaja particular cuando se altera la escala del proceso de produccion. de conformidad con una modalidad, la entrada de energla se usa como criterio de escalado y, por tanto, la entrada de energla especlfica se mantiene constante entre los diferentes tamanos de fermentador (lo que permite sin embargo, preferentemente una desviacion de aproximadamente 25 %, 20 %, 15 %, 10 % 5 %). Preferentemente, la entrada de energla especlfica es al menos 0,005 W/kg, preferentemente al menos 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,04, 0,05, 0,075 o 0,1 W/kg, con mayor preferencia en un intervalo de 0,015 a 0,03, con la maxima preferencia de 0,018 a 0,025 W/kg.

Un metodo para escalar el proceso de cultivo o produccion usado en los metodos de conformidad con la invencion puede usar la entrada de energla como criterio de escalado. Particularmente, la entrada de energla se mantiene constante durante el escalado, es decir, la entrada de energla especlfica para el metodo de cultivo inicial a pequena escala esta en el intervalo de 75 % a 125 %, preferentemente de 80 % a 120 %, de 85 % a 115 %, 90 % a 110 % o 95 % a 105 % de entrada de energla especlfica para el metodo de cultivo final, escalado, a gran escala. Particularmente, la entrada de energla especlfica para el metodo de cultivo a pequena escala y/o para el metodo de cultivo a gran escala es de al menos 0,005 W/kg, preferentemente de al menos 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,04, 0,05, 0,075 o 0,1 W/kg, con mayor preferencia en un intervalo de 0,015 a 0,03, con la maxima preferencia de 0,018 a 0,025 W/kg. El cultivo a gran escala preferentemente tiene un volumen de cultivo celular que es al menos un 25 % mayor que el volumen de cultivo celular del cultivo a pequena escala. Con mayor preferencia, el volumen de cultivo celular del cultivo a gran escala es al menos 50 % mayor, al menos 100 % mayor, al menos 1,5 veces mayor, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor que el volumen de cultivo celular del cultivo a pequena escala.

Particularmente, un metodo para alterar la escala de la produccion recombinante de una protelna de interes puede

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comprender las siguientes etapas:

proporcionar un primer recipiente para cultivar las celulas,

proporcionar las celulas sangulneas humanas inmortalizadas o celulas derivadas de las mismas, proporcionar una primera suspension de dichas celulas, introducir la primera suspension en el primer recipiente,

realizar el metodo de cultivo o produccion de conformidad con la presente invention, particularmente el metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25,

notificar opcionalmente la estructura de glicosilacion de una glicoprotelna de interes producida en la primera suspension y/o la velocidad de produccion de las celulas de la primera suspension,

proporcionar un segundo recipiente para cultivar las celulas, que tiene un volumen interno diferente del primer recipiente,

proporcionar una segunda suspension de dichas celulas, introducir la segunda suspension al segundo recipiente,

realizar el metodo de cultivo o produccion de conformidad con la presente invencion, particularmente el metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25,

notificar opcionalmente la estructura de glicosilacion de la glicoprotelna de interes producida en la segunda suspension y/o la velocidad de produccion de las celulas de la segunda suspension,

comparar opcionalmente la estructura de glicosilacion de la glicoprotelna de interes producida en ambas suspensiones y/o la velocidad de produccion de las celulas de ambas suspensiones.

El termino "alterar la escala" se refiere preferentemente al aumento de escala, es decir, al aumento del volumen de cultivo.

Los metodos de conformidad con la invencion (por ejemplo, alta agitation y baja aireacion) permiten un buen crecimiento de las celulas que se usan de conformidad con la invencion. Se encontro que pueden cultivarse en biorreactores de tanque agitado y una serie de otros recipientes, denominados colectivamente en la presente description tambien fermentadores (por ejemplo, frascos en T, biorreactor de cultivo con agitacion centrlfuga y ondulatorio) que son no homogeneos en volumen y geometrla. Para el tanque agitado, se puede lograr una densidad celular viable de aproximadamente 2 * 106 celulas/ml junto con una alta viabilidad > 95 %. En el modo de perfusion, las celulas crecen a densidades celulares altas de hasta 107 celulas/ml junto con una alta viabilidad de > 90 %. Una buena productividad especlfica puede ser, por ejemplo por perfusion.

Las condiciones estandar son pH 7,2; tension de oxlgeno disuelto (DOT) 40 % y temperatura 37 °C, aunque el metodo te conformidad con la invencion es robusto con respecto a la variation de parametros de proceso. El uso de un bajo flujo de gas y de un rociador en anillo proporciona resultados sorprendentemente buenos.

La calidad del producto obtenida por el metodo de conformidad con la invencion es muy alta, por lo que la election del metodo de produccion puede hacerse basandose en las consideraciones economicas y de productividad. Al expresar un anticuerpo usando los metodos de conformidad con la presente invencion se encontro que el patron de glicosilacion fue comparable y, por lo tanto, inalterado cuando se usa una escala de 1 l en comparacion con biorreactores de 10 l y 100 l de diferentes proporciones geometricas. Basandose en la robustez de la tension de cizallamiento alta de las celulas que se usan de conformidad con la invencion (al menos un aumento de 10 veces en comparacion con las celulas CHO), el aumento de escala puede realizarse a una entrada de energla especlfica constante. La evaluation cualitativa y cuantitativa del rendimiento de los biorreactores de 1 l, 10 l y 100 l y un panel de pruebas de caracterizacion bioqulmica muestran que la comparacion del proceso (metodo) y el producto se mantuvo bien durante el proceso de escalado.

Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1 muestra los resultados de un conjunto de experimentos para GlycoExpress A hPM (PankoMab, un anticuerpo anti-MUC1) comparando diferentes entradas de energla para 100 rpm (0,0007 W/kg), 200 rpm (0,006 W/kg) y 300 rpm (0,02 W/kg). Se muestran datos para la concentration de celulas viables (A), la productividad (B) y la viabilidad (C).

La Fig. 2 muestra una comparacion del crecimiento celular (A), productividad especlfica (B), viabilidad (C), velocidades de perfusion (D) y concentracion de glucosa (E) para dos corridas de perfusion comparables usando Centritech Lab II para la retention celular de GlycoExpress A hPM en modo continuo.

La Fig. 3 muestra datos ilustrativos para el escalado de las fermentaciones en las escalas de 1 l; 10 l y 100 l. Se muestran el crecimiento celular (A), productividad especlfica (B), viabilidad (C), velocidades de perfusion (D) y concentracion de glucosa (E) para tres fermentaciones bajo condiciones similares usando GlycoExpress A hPM.

La Fig. 4 muestra una comparacion de corridas de perfusion de 100 l similares. Se muestran el crecimiento celular (A), productividad especlfica (B), viabilidad (C), velocidades de perfusion (D) y concentracion de glucosa (E) para tres fermentaciones repetidas.

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Bibliografla consultada

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EJEMPLOS

Ejemplo 1: Precultivo

Los precultivos se cultivan en frascos de cultivo celular (TPP/Biochrom, Alemania). Los frascos se usan hasta 5 ml (T25, 25 cm2 de area), 30 ml (T75,75 cm2) y 75 ml (T150, 150 cm2) de volumen de suspension. Las celulas se mantienen en la fase de crecimiento logarltmico dividiendo cada 2-3 dlas y ajustando la concentracion celular a 0.15*106 celulas/ml despues de la division. La adicion de metotrexato (Sigma-Aldrich, Alemania) y Puromicina (Takara Bio Europe, Francia) se realiza de manera dependiente de un clon semanal o permanentemente a diferentes concentraciones. Las celulas se cultivan en incubadoras (Integra Biosciences IBS, Biosafe plus, Suiza o Thermo/Heraeus BBD 6220, Alemania) a 37°C, 8 % de dioxido de carbono y 95 % de humedad relativa.

Ejemplo 2: Cultivo con agitacion centrlfuga

Comenzando con volumenes de 125 ml de suspension celular, se lleva a cabo un precultivo con agitacion centrlfuga usando frascos de centrifugacion (Integra Biosciences IBS, Cellspin, Suiza). Se usan tres volumenes diferentes (0,25 l, 0,5 l, 1 l) de frascos de centrifugacion. La velocidad del rotor se ajusta a 60 rpm mientras que funciona el sistema dentro de una incubadora (Integra Biosciences IBS, Biosafe plus, Suiza) a 37 °C, 8 % de dioxido de carbono y 95 % de humedad relativa. Los frascos de centrifugacion se inoculan con 0,15*106 - 0,3*106 celulas/ml. Para propositos de precultivo, las celulas se mantienen en la fase de crecimiento logarltmico aumentando el volumen de suspension cada 2-3 dias y ajustando la concentracion de celulas 0.15*106 celulas/ml despues de la division.

Antes de establecer un proceso de fermentacion para las celulas GlycoExpress A y GlycoExpress B (que son celulas de una linea celular derivada de K562), el crecimiento se analiza en cultivos con agitacion centrlfuga. Ademas de los frascos en T, se usan frascos de centrifugacion y de agitacion para propositos de precultivo. Comparado con los frascos en T, tanto los frascos de centrifugacion como los de agitacion tienen propiedades de transferencia de masa mejoradas

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que resultan en valores de kla aumentados.

Los perfiles de crecimiento se analizaron en paralelo para las celulas GlycoExpress A hPM en experimentos discontinuos. Las celulas crecen comparativamente en los tres sistemas diferentes. La concentracion celular en los frascos en T es ligeramente inferior en comparacion con los cultivos con agitacion centrlfuga y agitacion.

A pesar de alcanzar densidades de celulas mas bajas, el cultivo celular en frascos T muestra la concentracion de lactato mas alta. Concluyendo, las botellas de cultivo rotatorias y los frascos de agitacion son igualmente adecuados para el cultivo de celulas. Ambos parecen proporcionar un crecimiento ligeramente mejor en comparacion con los frascos en T y por lo tanto, son bien adecuados para los precultivos antes de la fermentacion. Esto tambien sugiere una robustez de la llnea celular concerniente al cultivo.

Ejemplo 3: Fermentacion Biostat B-DCU 2 l

Las fermentaciones a escala de laboratorio se realizan usando un sistema Sartorius Biostat B-DCU 2 l (Sartorius, Alemania). Los recipientes de fermentacion Univessel 2 l (Sartorius, Alemania) de pared doble tienen un volumen de trabajo mlnimo de 0,8 y maximo de 2 litros. Generalmente, las fermentaciones se realizan a un volumen de trabajo de 1 litro. Todos los fermentadores se esterilizan en una autoclave Systec V-150 (Systec, Alemania). La mezcla de gases proporciona cuatro gases diferentes: nitrogeno, oxlgeno, dioxido de carbono y aire comprimido. El oxlgeno, el dioxido de carbono y el aire comprimido se accionan por reguladores de flujo masico, mientras que el nitrogeno se controla usando un flujometro de area variable Q-Flow (Vogtlin Instruments, Alemania). La aireacion puede controlarse tambien estableciendo un flujo total para todos los gases. El suministro de gas y gas de escape se filtran con filtros de PTFE Sartorius Midisart 2000 0,2 pm (Sartorius, Alemania). La concentracion de oxlgeno disuelto se mide en llnea con los electrodos Mettler Torledo InPro 6800 (Mettler-Toledo, Suiza). Se usan la adicion de la base (NaOH 0,5 M) y adicion de dioxido de carbono para controlar el valor del pH. El valor de pH se mide en llnea usando un electrodo Mettler-Toledo 405-DPAS-SC-K8S (Mettler-Toledo, Suiza). La base se anade a traves de una bomba Watson Marlow 100 OEM (Watson Marlow, Inglaterra). Dos bombas Watson Marlow 100 OEM adicionales (Watson Marlow, Inglaterra) y una bomba Watson Marlow 313 OEM (Watson Marlow, Inglaterra) se usan para la cosecha celular, inoculacion u otros propositos. Se anade medio de alimentacion a traves de una bomba Watson Marlow 101 U/R (Watson Marlow, Inglaterra) usando una balanza Sartorius LE10001 (Sartorius, Alemania) y un controlador de flujo gravimetrico. El peso del reactor se midio usando una balanza EA60EDE-1 Economy Series (Sartorius, Alemania). Las celulas se agitan con uno o dos impulsores de segmentos de 3 palas 1-2 l, ajuste, complemento, 0 54/10 H7 (Sartorius, Alemania). El eje agitador se potencia con un motor Kollmorgen Seidel 65M 27LL-4,500 (Kollmorgen Seidel, Alemania). Dependiendo del volumen del reactor se aplican uno o dos agitadores; por ejemplo para el Biostat B-DCU 2 l se usa un agitador cuando se trabaja con 1 l de volumen de trabajo, mientras que se usan dos agitadores para una fermentacion de 2 l. El enfriamiento del proceso se realiza mediante un bucle autonomo y una maquina de refrigeracion Frigomix 1000. (Sartorius, Alemania)

Fermentacion discontinua

La mayorla de las fermentaciones en este trabajo se realizan usando el sistema Sartorius Biostat B-DCU con un volumen de trabajo entre 0,8-2 litros (volumen preferido es 1 l). Se inicia la fermentacion con una densidad celular de

0. 15.*106 - 0,3 *106 celulas/ml a 37 °C, pH 7,2 y una saturacion de aire de 40 % de DOT a menos que se indique de cualquier otra manera. Se usa flujo de gas de dioxido de carbono /0,5 NaOH para regular el pH. La DOT se mantiene al 40 % usando aire comprimido o oxlgeno puro. Tanto el pH como la DOT se controlan por PID. Antes de optimizar la entrada de energla, se ensayan diferentes sistemas de aireacion. Estas fermentaciones se realizan a una velocidad del agitacion de 50 rpm, 37 °C, 40 % DOT, pH 7,2 en 1,51 volumen de trabajo. El rociador en anillo, el micro-rociador y la aireacion por membrana (Sartorius, Alemania) se someten a ensayos paralelos.

Fermentacion Continua

La fermentacion continua se lleva a cabo usando cuatro tecnicas diferentes para la retencion celular. Todas las fermentaciones se realizan con el sistema Sartorius Biostat B-DCU con un volumen de trabajo entre 1-1,5 litros.

1. Centrlfuga continua: Centritech Lab II o Centritech Lab III (Berry Wehrmiller, Carr Centritech, EE.UU.)

2. Filtro de rosca interna: Filtro de rosca Sartorius 2 l 20 pm (Sartorius, Alemania)

3. Fibra hueca externa: Amersham Biosciences CFP-4E5A, 0,45pm, 1200 cm2 (Amersham Biosciences, EE.UU.)

4. Retencion celular acustica: Biosep APS 990 (Applisens/Applikon biosciences, Palses Bajos)

En las etapas posteriores del desarrollo del proceso, todas las fermentaciones continuas se llevaron a cabo usando la centrlfuga continua Centritech Lab II o Centritech Lab III (Berry Wehrmiller, Carr Centritech, EE.UU.). La Centritech proporciona diferentes modos de operacion para diferentes tamanos del volumen del reactor. La centrifugacion se realiza usando el "modo de bomba intermitente" para fermentaciones a escala de laboratorio a en volumen de trabajo de 1 l. La fermentacion en escala de 10 l o 100 l usa el "modo de bombeo" o el "modo de alimentacion" en funcionamiento continuo. La perfusion se controla mediante dos balanzas. El alimentador usa un controlador de flujo gravimetrico, mientras que la cosecha se establece a traves del cambio de los parametros de control de Centritech. Las centrlfugas

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Centritech Lab II y Lab III no estan conectadas directamente a la DCU. La perfusion en escala 100 l se controla a traves de un sensor de nivel que controla la alimentacion mientras que Centritech recolecta continuamente.

Ejemplo 4: Sistema de Biorreactor DASGIP

Las fermentaciones adicionales a escala de laboratorio se realizan usando un sistema de biorreactor DASGIP (DASGIP, Julich, Alemania). El sistema DASGIP Bioreactor que consiste de diferentes modulos, puede operar cuatro biorreactores controlando simultaneamente el pH (modulo PH4/PO4), DOT (modulo PH4/PO4), temperatura (modulo TC4/SC4), agitacion (modulo TC4/SC4) y alimentacion llquida (modulo MP8) independientemente para cada reactor. Los recipientes de fermentacion (DASGIP, Alemania) tienen un volumen de trabajo de 0,6-1 l. El control de la temperatura se garantiza usando mangas de calefaccion. Los sistemas DASGIP estan equipados con bombas peristalticas que cuentan con controles de velocidad variables. La velocidad de flujo de cada bomba puede programarse por el usuario para que se controle por una funcion independiente basada en los datos en llnea. Puede lograrse el control de retroalimentacion concurrente de multiples analisis tanto para nutrientes como metabolitos. El suministro de gas se controla mediante el modulo MX4/4. La mezcla de gases suministra cuatro gases diferentes: nitrogeno, oxlgeno, dioxido de carbono y aire comprimido, que funcionan con controladores de flujo masivo. El suministro de gas y los gases de escape se filtra con filtros de PTFE Sartorius Midisart 2000 0,2 pm (Sartorius, Alemania). Se usa la adicion de base (NaOH 0,5 M) y adicion de dioxido de carbono para controlar el valor del pH. El pH se mide en llnea usando un electrodo Mettler-Toledo 405- DPAS-SC-K8S (Mettler-Toledo, Suiza). Todos los fermentadores se esterilizan en una autoclave Systec V-150 (Systec, Alemania). Las celulas se agitan con un impulsor de segmento de 3 palas (DASGIP, Julich Alemania). El eje del agitador se acciona por un agitador magnetico.

Ejemplo 5: Fermentacion a escala de laboratorio de 10 l

Las fermentaciones a escala de laboratorio se llevan a cabo usando un sistema Sartorius Biostat B-DCU 10 l (Sartorius, Alemania). Un recipiente de fermentacion de acero inoxidable se usa con un volumen de trabajo mlnimo de 4 y maximo de 10 litros. Generalmente, las fermentaciones discontinuas se realizan a volumen de trabajo de 10 l, mientras que la perfusion se lleva a cabo en volumen de trabajo de 5 l. La CDCU de 10 l esta configurada de manera similar que los biorreactores 2 I B-DCU. La mezcla de gases proporciona cuatro gases diferentes: nitrogeno, oxlgeno, dioxido de carbono y aire comprimido. El oxlgeno, el dioxido de carbono y el aire comprimido se accionan por reguladores de flujo masico, mientras que el nitrogeno se controla usando un flujometro de area variable Q-Flow (Vogtlin Instruments, Alemania). La aireacion puede controlarse tambien estableciendo un flujo total para todos los gases. El suministro de gas y los gases de escape se filtran con filtros de PTFE Sartorius Mini o Sartorius Junior de 0,2 pm (Sartorius, Alemania). La concentracion de oxlgeno disuelto se mide en llnea usando los electrodos Mettler Torledo InPro 6100/120/T/N (Mettler-Toledo, Suiza). Se usan la adicion de la base (NaOH 0,5 M) y adicion de dioxido de carbono para controlar el valor del pH. El valor de pH se mide en llnea usando un electrodo Mettler-Toledo 405-DPAS-SC-K8S (Mettler-Toledo, Suiza). La base se anade a traves de una bomba Watson Marlow 100 OEM (Watson Marlow, Inglaterra). Dos bombas adicionales de Watson Marlow 100 OEM (Watson Marlow, Inglaterra) se usan para la cosecha de celulas, la inoculacion u otros fines. El medio de alimentacion se anade a traves de un Watson Marlow SCI323 (Watson Marlow, Inglaterra) usando una balanza Sartorius EA150CE (Sartorius, Alemania) y un controlador de flujo gravimetrico. Las celulas se agitan con uno o dos impulsores de segmentos de 3 palas 5-10 I, ajuste, complemento, 0 54/10 H7 (Sartorius, Alemania). El eje agitador se potencia con un motor Kollmorgen Seidel 65M 57SL-3000 (Kollmorgen Seidel, Alemania). Dependiendo del volumen del reactor, se aplican uno o dos agitadores; por ejemplo para C-DCU 10 l: un agitador para 5 l, dos agitadores para 10 l. El enfriamiento del proceso se realiza usando un bucle autonomo ya sea con una maquina de refrigeracion Frigomix 1000 (Sartorius, Alemania) o una anilla de enfriamiento de agua.

Ejemplo 6: Fermentacion a escala de produccion de 100 l

La fermentacion a escala de produccion se lleva a cabo bajo condiciones de sala limpia. La produccion emplea un fermentador Applikon 100 l (Applikon, Belgica) para cultivo celular. El programa BioXpertXP se usa para la supervision de los procesos y el registro de datos. Similar a la fermentacion a escala de laboratorio, la mezcla de gases proporciona cuatro gases diferentes: nitrogeno, oxlgeno, dioxido de carbono y aire comprimido que funcionan por controladores de flujo masivo. El pH y la DOT se controlan mediante electrodos Mettler-Toledo (Mettler-Toledo, Suiza) para la medicion.

Ejemplo 7: Fermentacion - Uso Unico

Fermentaciones adicionales a escala de laboratorio funcionan con un biorreactor ondulatorio. La temperatura, la velocidad de balanceo y el angulo de oscilacion se miden y controlan usando una plataforma Wave Cellbase 20 SPS (Wave Biotech AG, Suiza). La DOT, el pH y la aireacion se controlan por una version Wavepod-R (GE Healthcare, EE.UU.). Los puntos de ajuste son temperatura 37°C, pH 7,2 velocidad de balanceo: 12 rpm y angulo 9°. La concentracion inicial de las celulas se establece en 1,5 * 105 celulas/ml. La perfusion se realizo usando Centritech Lab II y Lab III respectivamente (BerryWehrmiller, Carr Centritech, EE.UU.). La bolsa de cultivo de celulas ondulatoria se diseno usando un tubo de inmersion. Los tubos se conectan usando ya sea adaptadores Luer-Lock o MPC. Todas las conexiones se realizan bajo un flujo laminar (Thermo Scientific, EE.UU.).

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Ejemplo 8: ELISA

La concentracion de anticuerpos se determina generalmente usando el ensayo inmunoenzimatico ligado a fase solida (ELISA). Se usa un volumen de 50 pl de anticuerpo anti-cadena kappa de Ig humana (BD Biosciences, EE.UU.) como anticuerpo de recubrimiento a 1 pg/ml en PBS durante al menos 12 horas a 4 °C. Los sitios de union no especlficos se bloquean durante 30 min con albumina de suero bovino (BSA) al 2 % (Roth, Alemania) en PBS. Las muestras se diluyen en BSA al 1 %/PBS y 50 pl se incuban durante 1 hora. La cuantificacion de los datos se alcanza usando Erbitux como estandar. Erbitux se usa en 10 pg/ml, 8 pg/ml, 6 pg/ml, 4 pg/ml, 2 pg/ml, 1 pg/ml, 0,75pg/ml, 0,5 pg/ml y 0,25 pg/ml. 50 pl de anti-IgG humano (H+L) en conejo conjugada con POD (Jackson ImmunoResearch, Reino Unido) se usan como un anticuerpo secundario. La incubacion es durante 1 hora. Por ultimo, se aplican 100 pl de sustrato de micropocillo de un componente HRP de la tetrametilbencimidina (TMB) (Tebu-Bio Laboratories, Alemania) para su deteccion. Se detiene la reaccion con 50 pl de H2SO4 2,5N (Sigma, Alemania) y se mide a 450/630 nm de longitud de onda.

ELISA de union al antlgeno

La union al antlgeno de PankoMab humano se mide mediante la union a peptidos MUC1 glicosilados y no glucosilados en un ELISA de antlgeno. Los peptidos MUC1 glicosilados se recubren a molaridades iguales en PBS durante al menos 12 h a 4 °C. Los sitios de union no especlficos se bloquean durante 30 min con albumina de suero bovino (BSA) al 2 % (Roth, Alemania) en PBS. Las muestras de PankoMab humano se diluyen en BSA al 1%/PBS a concentraciones de 0,4 pg/ml y 0,8 pg/ml y 50 pl se incuban durante 1 hora. La calibracion se realiza usando un estandar de sobrenadante de cultivo celular (dilucion 1:100, 1:200, 1:400). 50 pl de anti-IgG humano (H+L) en conejo conjugada con POD (Jackson ImmunoResearch, Reino Unido) se usan como anticuerpo secundario. La incubacion es durante 1 hora. Por ultimo, se aplican 100 pl de sustrato de micropocillo de un componente HRP de la tetrametilbencimidina (TMB) (Tebu-Bio Laboratories, Alemania) para su deteccion. Se detiene la reaccion con 50 pl de H2SO4 2,5N (Sigma, Alemania) y se mide a 450/630 nm de longitud de onda. El ELISA de antlgeno se analiza usando una regresion para el estandar de sobrenadante. La especificacion para la alta calidad del producto se une al peptido glicosilado con una densidad optica (DO) mayor que 0,3. Adicionalmente, la relacion de union del peptido MUC1 no glicosilado con el MUC1 glicosilado tiene que ser < 5 % para cumplir con la especificacion.

Ejemplo 9: Cromatografla de exclusion por tamano

El porcentaje de anticuerpo monomerico se determina usando la cromatografla de exclusion por tamano (SEC). La cromatografla se lleva a cabo usando una columna Superdex 200 10/300 GC (GE Healthcare, Ee.UU.) en un sistema Akta prime (GE Healthcare, EE.UU.). Las muestras se diluyen con PBS hasta un tamano de muestra de 250 pl que contiene aproximadamente 50 - 200 pg de protelna. Las muestras se inyectan de forma libre de burbujas usando un bucle de muestra de 200 pl. El tampon de funcionamiento para el analisis es PBS, el velocidad de flujo se ajusta a 0,5 ml/min. Despues de la elucion se analiza el area maxima del cromatograma con respecto al contenido de monomero, dlmero y multlmero.

Ejemplo 10: Analisis del glicano

Analisis de monosacaridos

Para el analisis del monosacarido de glicano, el anticuerpo glicosilado se hidroliza con acido trifluoracetico lo que resulta en una liberacion de porciones de monosacaridos de la cadena de glicanos. Adicionalmente, la N-acetilglucosamina y la N-acetilgalactosamina se desacetilan a glucosamina y galactosamina mediante la accion del acido trifluoracetico. La mezcla de monosacaridos se separa y cuantifica mediante cromatografla llquida de intercambio anionico de alto rendimiento con deteccion amperometrica pulsada (HPAEC-PAD).

Perfil del glicano

Para el perfil del glicano, los N-glicanos intactos se liberan del nucleo proteico en la digestion del gel con PNGasa. Los N-glicanos se eliminan del gel y posteriormente se marcan con el marcador de fluorescencia 2-aminobenzamida. La muestra purificada de N-glicanos marcados se separa mediante cromatografla de fase normal (NP-HPLC) o cromatografla de interaccion hidrofllica (HILIC) con deteccion fluorometrica. NP-HPLC permite la separation de la mayorla de los N-glicanos. HILIC-HPLC permite la separacion de estructuras de N-glicanos que contienen N- acetilglucosamina biseccional a diferencia de NP-HPLC. Los picos se asignan a estructuras de glicanos mediante la comparacion de los tiempos de retention con una base de datos. Adicionalmente, las estructuras se confirman por espectrometrla de masas MALDI-TOF y matrices de digestion enzimatica empleando exoglicosidasas.

Analisis separado de la glicosilacion de Fc/Fab

Mientras que la glicosilacion de Fc tiene un impacto sobre la funcion efectora de anticuerpos, la glicosilacion de Fab influye en las interacciones del anticuerpo con un antlgeno. Por lo tanto, un interes basico del analisis de glicanos es

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determinar si ambas partes, Fc y Fab estan glicosiladas, y en segundo lugar que diferencias se observan entre los patrones de glicosilacion de ambos sitios. La completa escision de un anticuerpo con papalna resulta en la generacion de un fragmento Fc y dos fragmentos Fab. La separacion de los fragmentos se realiza empleando cromatografla de afinidad sobre la fase solida de la protelna A. La protelna A une especlficamente al fragmento Fc as! como al anticuerpo no digerido. Fc y el anticuerpo no digerido se unen a la Protelna A, mientras que Fab se puede encontrar en el flujo pasante. Una etapa de elucion con citrato 0,1 M, cloruro sodico 0,15 M a pH 2,2 permite la liberacion del fragmento Fc del anticuerpo no digerido. Despues de separar Fc de la parte Fab, se aplican los N-glicanos de cada fragmento para el perfil de glicanos. Basado en el hallazgo de los espectros se clasifican las estructuras correspondientes para las siguientes caracterlsticas: presencia o ausencia de fucosa, presencia o ausencia de GlcNAc biseccional, distribution de los estados de galactosilacion, distribucion del nivel de sialilacion (N0, A1, A2) y antenariedad.

Ejemplo 11: Caracterizacion del producto del cultivo con agitation centrlfuga

El sobrenadante de cultivo con agitacion centrlfuga de GlycoExpress A hPM (PankoMab humano) se purifica usando una columna de Protelna A. Despues de la elucion, se caracteriza el anticuerpo purificado. El anticuerpo purificado muestra una union especlfica al antlgeno bioactivo del ELISA que cumple con la especificacion, las bandas claras en SDS-PAGE indican alta pureza y tambien se corresponden con estructuras monomericas del anticuerpo (97%). En cuanto al perfil de glicano, el producto muestra estructuras diantenarias junto con altos valores de sialilacion y galactosilacion. El perfil de glicano se analiza a partir del anticuerpo en fase estacionaria.

Para analizar la calidad del producto durante las diferentes fases de crecimiento, se realizan tres diferentes recolecciones que representan las tres fases de crecimiento. Se recoge la primera cosecha (fase exponencial) despues de aproximadamente 48 h de cultivo. Las celulas estan en crecimiento exponencial (p > 0). Se recoge la segunda cosecha despues de aproximadamente 140 h de cultivo en fase estacionaria. En este punto, las celulas no crecen significativamente (p = 0), pero la viabilidad es alta (aproximadamente 95 %). Se recoge la tercera cosecha durante la muerte despues de aproximadamente 210 horas. La viabilidad cae significativamente (aproximadamente 80 %) y la concentration de celulas vivas disminuye (p < 0). El anticuerpo se almacena, se purifica usando la Protelna A y se analiza para diferentes etapas de crecimiento. Los resultados indican bandas claras para la cadena de pesada y ligera del anticuerpo. No hay degradation visible del producto durante las diferentes etapas de crecimiento. Concluyendo, los cultivos con agitacion centrlfuga proporcionan un producto altamente monomerico (determinado por cromatografla de exclusion por tamano (SEC)) que se une especlficamente al antlgeno del ELISA y no muestra impurezas en SDS- PAGE. El perfil de glicano tambien se analiza para la fase de crecimiento estacionaria. Durante el proceso de desarrollo, un objetivo principal es mantener la alta calidad del producto.

Ejemplo 12: Fermentation discontinua

Se encontro que el crecimiento de las llneas celulares GlycoExpress es muy robusto en cuanto a las condiciones del proceso y no es muy afectado por las fuerzas de cizallamiento que se inducen por la agitacion. Por el contrario, las celulas son muy sensibles a la aireacion con respecto al tamano de la burbuja y la velocidad de flujo de gas:

12.1 Aireacion

La aireacion es crltica para un proceso biotecnologico, ya que el suministro de oxlgeno es esencial para las celulas animales. Sin embargo, las burbujas pueden crear fuerzas de cizallamiento intensivas. Durante el cultivo en frascos en T o botellas de cultivo rotatorias, no se aplica aireacion. En los fermentadores, que generalmente tienen volumenes mucho mayores, tiene que suministrarse oxlgeno o aire para evitar la limitation de oxlgeno. Adicionalmente, el control del pH funciona generalmente con la adicion de dioxido de carbono, que debe suministrarse. Por lo tanto, tres tipos diferentes de suministro de gas se prueban en el biorreactor. Se realizan fermentaciones discontinuas paralelas usando GlycoExpress A hPM para minimizar las variaciones basadas, por ejemplo en diferentes precultivos. Las fermentaciones se realizan usando un rociador en anillo, un micro-rociador y una aireacion de membrana. Un rociador en anillo suministra al biorreactor burbujas bastante grandes. A diferencia de esto, un micro-rociador crea burbujas mucho mas pequenas usando una estructura permeable a gases porosos. Los rociadores en anillo y los micro-rociadores suministran las celulas usando convection, que esta influenciada por la entrada de energla en el biorreactor. A una entrada de energla mas alta le corresponde una transferencia de masa mucho mejor, que puede reducir la velocidad de flujo de gas requerido para mantener un punto de ajuste de la tension de oxlgeno disuelto (DOT). Finalmente, la aireacion de la membrana no crea burbujas en absoluto, suministrando celulas basadas solamente en la difusion. Por lo tanto, la aireacion de la membrana es el metodo mas cauteloso de suministrar las celulas con gas. Cuando se aplica la aireacion de la membrana no hay tension de cizallamiento basada en burbujas.

Los tres tipos diferentes de aireacion se prueban para un clon de GlycoExpress A hPM. Las fermentaciones paralelas se analizan con respecto a la concentracion celular viable, la productividad y la viabilidad. Los resultados muestran un crecimiento similar a una densidad celular maxima de 2*106 celulas/ml y una concentracion de anticuerpo de aproximadamente 20-25 pg/ml tanto para el micro-rociador como para la aireacion de la membrana. La aireacion de la membrana resulta en una vitalidad muy alta de = 95 %, mientras que la aireacion por el micro rociador conduce a aprox. 90 % de la vitalidad. Por lo tanto, usando el rociador en anillo las celulas crecen hasta una densidad celular maxima de

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0,7*106 celulas/ml y una concentracion de producto de 10 pg/ml. Mientras que la viabilidad del rociador en anillo y del micro-rociador caen en las etapas medias y tardlas de la fermentacion, la aireacion de la membrana asegura una viabilidad muy alta durante el proceso. Esto indica que la burbuja induce danos en las celulas cuando se trabaja con un anillo o microrociador. El dano mas alto es causado por las burbujas del rociador en anillo cuya viabilidad cae de 92 % a 74 %. La viabilidad del micro rociador se reduce al 84% mientras que la aireacion de la membrana mantiene una muy alta viabilidad del 95 % durante todo el proceso.

Se elige el rociador de anillo para su desarrollo ulterior. Esto se basa en las limitaciones tecnicas y relacionadas con las BPM en fermentaciones de grandes recipientes. En primer lugar, la aireacion de la membrana es altamente costosa debido al gran area de la membrana en la escala de production, por ejemplo los tubos de membrana tienen que ser reemplazados despues de cada fermentacion debido a los principios de BPM. En segundo lugar, el area de membrana requerida aumenta aun mas en la escala de produccion, lo que puede conducir a problemas de mezcla debido a la obstruction del flujo. En lo que respecta a los micro-rociadores, se supone que conducen a problemas de formation de espuma densa en la escala de produccion, lo que puede dar lugar a la necesidad de reactivos antiespumantes que sean diflciles de degradar en el procesamiento corriente abajo. En consecuencia, el trabajo con un rociador en anillo, una entrada de energla aumentada, dara lugar a un velocidad de flujo de gas reducido a medida que aumenta la transferencia de masa (por ejemplo, el numero de Sherwood aumenta con el aumento del numero de Reynolds).

12.2 Flujo constante vs. flujo exclusivo

Hay dos modos diferentes de aireacion en un fermentador. El primero es aplicar un velocidad de flujo constante y mezclar cuatro gases (aire, oxlgeno, nitrogeno y dioxido de carbono) basados en los requerimientos de las celulas. El segundo es no mezclar un flujo de gas constante, sino dar exclusivamente un pulso de gas requerido. El sistema de flujo exclusivo da mucho mejor crecimiento y viabilidad. A velocidades de flujo constantes, las celulas se danan mas con el aumento del flujo. Un conjunto de fermentaciones discontinuas, realizadas a velocidades de flujo de 0,01 l/h, 0,05 l/h y 0,1 l/h, mostro perdida de viabilidad a velocidades de flujo superiores a 0,01 l/h por litro de volumen del reactor. En consecuencia, se elige el sistema de flujo exclusivo para controlar la fermentacion de celulas GlycoExpress en un biorreactor Adicionalmente, la fermentacion en el sistema biorreactor de cultivo ondulatorio mostro resultados prometedores. Usando este tipo de aireacion, las celulas GlycoExpress crecen muy bien.

Resumiendo, la aireacion es un parametro muy crltico. El dano celular debido a la aireacion se ha observado en varias ocasiones. Para reducir el dano la velocidad de aireacion debe ser tan baja como sea posible. En el siguiente, todas las fermentaciones se ejecutan con un flujo exclusivo de mezcla de gases en lugar de un flujo constante de mezcla de gas. La aireacion basada en la limitation de burbujas es crucial durante todas las etapas del desarrollo. Por lo tanto, las fermentaciones se realizan preferentemente usando suministro de oxlgeno puro en lugar de aire comprimido.

12.3 Entrada de energla

Despues de configurar el tipo de aireacion, la siguiente etapa en la optimization fue probar diferentes entradas de energla. Debido al posible dano por cizallamiento en el fermentador, las primeras fermentaciones se realizan a una velocidad de agitador muy baja de 50 rpm (esto equivale a una velocidad de punta de 0,14 m/s y una entrada de energla de 9 * 10-5 W/kg, ver la tabla 2 mas abajo. Los experimentos relacionados con la aireacion se llevan a cabo usando una velocidad del agitador de 100 rpm que conduce a una entrada de baja energla. Para mantener la homogeneidad, especialmente a altas densidades celulares, pero tambien a escalas de fermentador mas altas, se prefiere una entrada de energla mas alta. Se supone ademas, que la entrada de energla mas alta reduce el velocidad de flujo de gas necesario para la aireacion, lo que debe resultar en menos dano basado en burbujas.

La entrada de energla se comprueba en el modo discontinuo usando diferentes velocidades del agitador. En un conjunto primario de experimentos se prueban 100 rpm, 200 rpm y 300 rpm. La Tabla 1 muestra las caracterlsticas de agitation (entrada de energla, velocidad de punta, relation punta cizallamiento y numero de Reynolds) para diferentes velocidades de agitador entre 50-400 rpm.

Agitacion

Entrada de energla Velocidad de punta Relacion de cizallamiento en la punta Reynolds

[rpm]

[W/kg] [m/s] [l/s]

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0,0001 0,14 200 3700

100

0,0007 0,28 284 7400

200

0,006 0,58 400 14800

300

0,020 0,85 492 22100

400

0,048 1,13 568 29500

Tabla 1: Caracterlsticas de agitacion en el biorreactor de 2l B-DCU Sartorius para diferentes velocidades de agitacion. Los datos se basan en el volumen de cultivo de 1l y en la utilization de un impulsor de segmento de 3 palas para

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agitacion.

Los resultados se representan en la Fig. 1. Mientras que 200 rpm y 300 rpm muestran una densidad celular similar a 2,5*106 celulas/ml, las celulas no crecen mas de 1 *106 celulas/ml cuando la velocidad del agitador se ajusta a 100 rpm. La concentracion del tltulo alcanza niveles similares en las tres fermentaciones de aproximadamente 25 pg/ml. A pesar de las crecientes fuerzas de cizallamiento, la vitalidad es maxima a 200 rpm y 300 rpm. Al usar 100 rpm, la vitalidad cae por debajo del 80 %. Mas tarde, al trabajar en el escalado para la escala 100l, la mezcla se volvio de nuevo una preocupacion urgente. Las fermentaciones con 200 rpm y 400 rpm de velocidad del agitador muestran resultados comparables. En el trabajo con 400 rpm, las celulas parecen crecer ligeramente mas rapido, pero no alcanzan las concentraciones y productividad de celulas vitales. No obstante, 400 rpm parece ser adecuado para la fermentacion, ya que 400 rpm da como resultado una viabilidad muy alta (> 90 %) durante el crecimiento logarltmico, lo que indica que no hay dano inducido por el cizallamiento. Resumiendo, las velocidades del agitador entre 200 rpm y 400 rpm muestran un crecimiento comparable. Las burbujas influyen en la viabilidad de una manera mucho mas negativa que las fuerzas de cizallamiento inducidas por el agitador. Se ajusta una velocidad de agitacion de 300 rpm (entrada de energla: 0,02 W/kg) como agitacion estandar para la fermentacion en una escala de laboratorio de 2 l.

12.4 Robustez de los parametros del proceso

Las fermentaciones discontinuas se realizan aplicando un rociador en anillo y una entrada de energla de 0,022 W/kg. Se analiza un total de 16 corridas usando GlycoExpress A hPM. Los valores del proceso se establecieron de la siguiente manera: pH (7,0; 7,2; 7,4), DOT (20 %; 40 %; 60 %) y temperatura (36 °C, 37 °C, 38°C). No hubo influencia con respecto al crecimiento y la productividad al cambiar los parametros del proceso pH, DOT y temperatura en el intervalo probado durante una fermentacion discontinua. Esto significa que no hay correlacion con respecto a las respuestas durante el cambio de los parametros del proceso. No hubo correlacion entre el numero de celulas inicial (que varla entre aproximadamente 1,2-1,8 * 105 celulas/ml) y la productividad final del lote o la densidad celular maxima. Como consecuencia, el proceso de inoculacion puede considerarse tambien como robusto.

A menos que se indique de cualquier otra manera, todas las fermentaciones se llevan a cabo en condiciones estandar de pH 7,2, DOT 40 % de saturacion de aire y una temperatura de 37 °C. Estas condiciones se aplican tambien a los procesos de perfusion.

12.5 Produccion dependiente del crecimiento

Se encontro que a medida que las celulas crecen en la fermentacion discontinua, la productividad y el crecimiento estan estrechamente unidos entre si ya que las celulas no se producen durante la fase de crecimiento estacionaria. Los cultivos discontinuos de GlycoExpress A hPM se analizaron con respecto a su crecimiento y productividad. La produccion de anticuerpos dependio fuertemente del crecimiento celular. Durante la fase estacionaria en la fermentacion, la concentracion de anticuerpos no aumento.

La prueba estadlstica se aplico usando la concentracion celular como variable de influencia y la productividad como variable de respuesta. Usando una regresion lineal entre la concentracion celular y la productividad, se encuentra una fuerte correlacion (R2 = 0,994). En consecuencia, la produccion esta ligada al crecimiento y las celulas no producen ningun anticuerpo durante la fase estacionaria. Esto da una gran diferencia a otros sistemas de produccion, como las celulas CHO, donde la mayor parte del producto se produce durante la fase de crecimiento estacionaria. Este resultado es muy importante para el desarrollo de procesos. Da lugar a un uso preferido de un proceso de perfusion en lugar de un proceso semidiscontinuo como la mayorla de los trabajos semidiscontinuos con una fase estacionaria extendida para la acumulacion del producto. Como otra consecuencia, el crecimiento celular debe ser un objetivo principal tanto para la perfusion como para el desarrollo de procesos semidiscontinuos.

Para analisis adicional de la productividad dependiente del crecimiento, se analizaron los niveles cuantitativos de ARN- m mediante la reaccion en cadena de polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR) en la fase de crecimiento logarltmica y estacionaria. Los resultados mostraron un nivel constante de expresion del gen de mantenimiento (actina y GAPDH) tanto en fase logarltmica como estacionaria junto con niveles constantes de ARNm para la protelna expresada de forma recombinante (VH y VL). Estos resultados dan evidencia que se expresan igualmente tanto en fase de crecimiento logarltmica como estacionaria. Se puede concluir que la razon para disminuir la productividad en fase estacionaria es probable que sea post-transcripcional.

12.6 Confirmation de la calidad del producto durante la fermentacion discontinua

Las fermentaciones discontinuas se realizaron en condiciones estandar (pH 7,2, DOT 40 %, 37°C) para analizar la calidad del producto y comparar los resultados con la calidad del producto de agitacion centrlfuga. Generalmente, la calidad del producto de GlycoExpress A hPM es poco diferente del producto producido por agitacion centrlfuga (el producto de agitacion centrlfuga se muestra en la Tabla 1). Existe un numero de multlmeros casi no afectados con una cantidad disminuida de aproximadamente 2 % de multlmeros de anticuerpo en el cultivo discontinuo (en comparacion con el 3 % en el producto de cultivo de agitacion centrlfuga). Adicionalmente, el ELISA de bioactividad muestra elevada

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union especlfica tanto en la fermentacion por agitacion centrlfuga como discontinua y el SDS-PAGE tampoco se afecta. El perfil de glicosilacion es comparable al perfil de glicano de un cultivo con agitacion centrlfuga.

12.7 Conclusion de la Fermentacion discontinua

Las celulas humanas de origen de leucemia mieloide pueden cultivarse en fermentacion discontinua. En comparacion con el cultivo con agitacion centrlfuga, la fermentacion discontinua da lugar a densidades de celulas ligeramente mejoradas junto con una productividad ligeramente superior (aproximadamente un 10 % de aumento, datos no mostrados). El proceso de fermentacion puede realizarse con alta agitacion ya que las celulas no son sensibles a las fuerzas de cizallamiento inducidas por el agitador. Adicionalmente, el proceso muestra una alta robustez hacia las condiciones del proceso de fermentacion dando buen crecimiento y productividad para un amplio intervalo de valores de ajuste de pH, DOT y temperatura. Sin embargo, las celulas son sensibles a la aireacion, por lo tanto las burbujas deben evitarse mediante el uso de aireacion de flujo exclusivo. Por lo tanto, la aplicacion de una entrada de alta energla es util a medida que aumenta la transferencia de masa. Para aumentar la productividad, las fermentaciones de perfusion se realizan como se describe mas abajo. Para los procesos de perfusion, las condiciones del proceso se toman del cultivo discontinuo.

Ejemplo 13: Perfusion

Se encontro que la fermentacion continua con retencion celular (perfusion) permite la fermentacion de las celulas humanas de origen de leucemia mieloide a alta densidad celular junto con buena productividad especlfica y glicosilacion altamente estable.

13.1 Resultados

Con el uso de la centrlfuga Centritech Lab, las celulas crecieron a muy alta viabilidad, y se alcanzaron densidades celulares superiores a 10*106 celulas/ml. Los resultados (ver Fig. 2) demostraron ser altamente reproducibles y no se encontraron heterogeneidades con respecto a la glicosilacion del producto (GlycoExpress A hPM). Los procesos se llevaron a cabo durante al menos 300 h de tiempo de cultivo. La productividad especlfica alcanza un maximo de aproximadamente 100 pg/(ml * d) a una velocidad de perfusion de dos volumenes de biorreactor por dla. La productividad especlfica promedio fue de aproximadamente 70 pg/(ml * d) para la escala de fermentacion a escala de laboratorio.

Un proceso de perfusion preferido se muestra en la Tabla 2.

Parametro

pH

DOT

Temperatura tasa de perfusion Retencion celular Agitacion

especlfica Entrada

Puntos de ajuste y observaciones

7,2 ; CO2/NaOH; banda muerta unidades +/- 0,1

40 % saturation de aire, cuatro gases (N2, CO2, aire

comprimido, O2); mezcla de gases

37°C

0,5-2,5 V/d

centrlfuga continua, modo bomba Impulsor de 3 palas 0,022 W/m3 sin deflectores

Tabla 2: Proceso de perfusion preferido

13.2 Confirmation de la Calidad del Producto en la Fermentacion Continua

Como ya se ha visto en las fermentaciones discontinuas, la calidad del producto es notablemente robusta. El producto se analizo bioqulmicamente. Con respecto a los multlmeros, hay una portion de anticuerpo no monomerico al 3 %, que es comparable a la fermentacion discontinua. El antlgeno ELISA cumple con la especificacion ya que muestra alta union especlfica. Adicionalmente, el patron de glicosilacion de GlycoExpress A hPM es similar en las dos corridas de perfusion realizadas independientemente, pero tambien en comparacion con el producto producido por la fermentacion con agitacion centrlfuga/discontinua.

En el SDS-PAGE (condiciones reductoras), hubo bandas claras para la cadena ligera y pesada del anticuerpo separadas. Cadena pesada (= 50kDa) y cadena ligera (= 25kDa) muestran los tamanos como esperado.

13.3 Glicosilacion durante la perfusion

Como la glicosilacion del producto puede afectarse, por ejemplo cambios en los medios, estres mecanico o tension de oxlgeno disuelto, durante la fermentacion resulta muy importante analizar el desarrollo del patron de glicosilacion. Con

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respecto a la robustez del proceso, la glicosilacion del producto es uno de los parametros mas importantes a analizar.

Se analizo la glicosilacion del producto de las lineas celulares GlycoExpress durante una corrida de perfusion que se realizo a 37 °C, 40 % DOT, pH 7,2 con medio GTM usando GlycoExpress B. El producto se analizo para las muestras tomadas entre el dia 3 y dia 20 del proceso de perfusion. A pesar de algunas variaciones, el patron de glicosilacion puede considerarse estable.

Concluyendo, no existe variacion en la glicosilacion durante el proceso. En cuanto a la robustez del proceso y la robustez de la linea celular, la fermentacion proporciona una glicosilacion estable del producto. La fermentacion por perfusion de GlycoExpress A hPM resulta en un producto bioquimico activo altamente puro.

13.4. Conclusion

Un proceso de perfusion para lineas celulares GlycoExpress presenta alta viabilidad celular durante la fermentacion de alta densidad. El proceso de perfusion presenta una calidad constante del producto y especialmente un patron de glicosilacion constante. El proceso de fermentacion se controla a pH 7,2; DOT 40 % y a una temperatura de 37 °C. La fermentacion con celulas GlycoExpress se puede realizar con una entrada de alta energia (0,022W/m3), ya que las celulas toleran altas fuerzas de cizallamiento.

Ejemplo 14: Comparacion de diferentes metodos de produccion

En cuanto a la calidad del producto bioquimico, todos los procesos (con agitacion centrifuga, discontinuo, semidiscontinuo (datos no mostrados) y perfusion) proporcionaron un anticuerpo bioactivo similar altamente monomerico. El analisis usando cromatografia de exclusion por tamano (SEC) resulto en una porcion de 2-3 % de anticuerpo multimerico. Mientras que el producto de la fermentacion discontinua y semidiscontinua mostro aproximadamente un 2 % de multimeros, la perfusion mostro aproximadamente un 3 % de multimero, que es todavia comparable al producto de la agitacion centrifuga. Una porcion multimera de 2-3 % puede eliminarse facilmente durante el procesamiento corriente abajo (DSP), para GlycoExpress A hPM se aplica una columna multimodal de intercambio anionico. Durante esta etapa de DSP se agotan tambien la proteina de la celula huesped (hcp) y la albumina de suero humano (HSA). Los analisis adicionales en SDS-PAGE mostraron una pureza de proteina comparable para todos los procesos. Se analizo el producto en condiciones no reductoras (estructura completa del anticuerpo) y en condiciones reductoras (separacion de la cadena pesada y ligera). La identidad de las cadenas de anticuerpos se confirmo mediante transferencia de membrana de tipo Western. En cuanto a la bioactividad, todas las muestras se analizan en un ELISA de union al antigeno. Las muestras muestran alta union al peptido MUC1 glicosilado y muy poca al peptido MUC1 no glicosilado, lo cual estuvo de conformidad con la especificacion para todos los procesos.

Como una de las caracteristicas mas importantes, la glicosilacion de anticuerpos se analizo para el cultivo de agitacion centrifuga, discontinuo, semidiscontinuo y de perfusion. El patron de glicosilacion fue muy homogeneo. Debido a la complejidad del perfil de glicanos (ver tambien la seccion 4.5.4) se mide una desviacion estandar de +/- 4 %. Por lo tanto, solo los cambios en la glicosilacion > 5 % se consideran significativos.

Resumiendo, el patron de glicosilacion es muy robusto. No cambia en comparacion con los cultivos con centrifugacion poco agitados y no aireados. Adicionalmente, no parece ser significativamente sensible a las concentraciones celulares o a la viabilidad celular, ya que los procesos con agitacion centrifuga, discontinuo, semidiscontinuo y perfusion difieren en esas propiedades (la perfusion muestra mayores concentraciones celulares, el semidiscontinuo muestra viabilidades mas bajas en la cosecha). Dado que la calidad del producto es alta para todos discontinuo, semidiscontinuo y perfusion, la eleccion del proceso de produccion puede basarse en la productividad y la consideracion economica, puesto que se centra en el desarrollo de un proceso adecuado para BPM.

Ejemplo 15: Escalado

Se encontro que el escalado de procesamiento corriente arriba (> 1000 veces) del cultivo con agitacion centrifuga hasta un proceso de produccion de BPM proporciona hasta 90 g de anticuerpo purificado sin alterar la calidad del producto y especialmente el perfil de glicosilacion.

La fermentacion se realizo en diferentes escalas. Para la escala mas pequena (volumen de trabajo 0,6 l) se utilizo un sistema de biorreactor paralelo DASGIP. Los cultivos en escala de volumen de trabajo de 1 l y 10 l se realizan en biorreactores de vidrio Sartorius (B-DCU 2 l, B-DCU 5 l) y un reactor de acero inoxidable Sartorius (C-DCU 10 l). Ademas, se utilizo un biorreactor de cristal Applikon de 10 l. La escala mas grande (100 l) se llevo a cabo en un fermentador de acero inoxidable Applikon de 100 l. En consecuencia, las fermentaciones no solo se realizaron en cuatro escalas diferentes, sino tambien en fermentadores de tres companias diferentes. Se realizo un escalado total de factor 166, usando las siguientes etapas: 1 : 1.5 : 16 : 166. Como fermentadores de diferentes companias se usan para la fermentacion, que muestran caracteristicas diferentes en cuanto a propiedades geometricas, aireacion y agitacion, el escalado se vuelve aun mas critico.

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15.1 Condiciones de escalado

Al realizar el escalado, las celulas tienen que ser especialmente robustas con respecto a las fuerzas de cizallamiento. Dado que las celulas no sufren danos por las fuerzas de cizallamiento cuando se usan 400 rpm en un recipiente Sartorius de 2 l, se eligio la entrada de energla para que fuera un criterio del escalado porque las celulas parecen ser altamente resistentes a la fuerza de cizallamiento. En consecuencia, se selecciona que la entrada de energla especlfica (entrada de energla por volumen) sea constante en todos los diferentes tamanos de fermentadores. Una vez seleccionada la entrada de energla como criterio de escalado, se selecciona una entrada de energla especlfica de aproximadamente Pesp = 0,02 W/kg. Esto equivale a una velocidad del agitador de 300 rpm en un fermentador Sartorius 2 l. Esta velocidad del agitador muestra excelentes propiedades de mezclado y homogeneizacion.

Aunque la similitud geometrica es normalmente una precondicion importante para el escalado, el escalado exitoso puede realizarse en recipientes muy diversos. En la Tabla 6 se muestran los resultados del escalado exitoso usando la entrada de energla como criterio. Ademas del fermentador Applikon 10 l, todos los fermentadores pueden soportar una entrada de energla especlfica similar. Debe tenerse en cuenta que ambos fermentadores Applikon usan la maxima velocidad de agitacion posible (rpm). Por lo tanto, no es posible funcionar el Applikon 10 l con las mismas velocidades de entrada de energla especlficas que los otros fermentadores.

DASGIP 0,6 l B-DCU 1 l B-DCU 5 l C-DCU 10 l Applikon 10 l Applikon 100 l

Dt [m]

0,125 0,130 0,160 0,215 0,222 0,491

Dt [m]

0,055 0,054 0,070 0,110 0,074 0,234

Angulo

+30° +30° +30° +30° -45° -45°

rpm [1/min]

250 300 300 200 200 125

Volumen [l]

2 3 5 15 15 130

volumen maximo [l]

1,5 2 5 10 10 100

volumen mlnimo [l]

0,4 0,6 1 4 4 30

volumen de trabajo

0,6 1 5 10 10 100

[l]

numero de

1 2 2 1 1

agitadores

H [m]

0,210 0,170 0,255 0,315 0,245 0,593

Ht [m]

0,175 0,13 0,08 0,155 0,21 0,393

Hi [m]

0,13 0,11

Hb [m]

0,035 0,04 0,045 0,05 0,035 0,2

Di/Dt

0,44 0,42 0,44 0,51 0,33 0,48

H/Dt

3,82 3,15 3,64 2,86 3,31 2,53

H/Dt

1,68 1,31 1,59 1,47 1,10 1,21

Tabla 3: Propiedades geometricas de los recipientes de fermentacion empleados. Agitacion del agitador [rpm] basado en la entrada de energla constante para la mayorla del volumen de trabajo comun. Leyenda: Di: diametro del agitador; Dt: diametro del fermentador; H: altura del fermentador; Ht: distancia del agitador superior a la superficie del llquido; Hi: distancia entre agitadores; Hb: distancia por debajo del agitador inferior.

Como la entrada de energla se mantiene constante durante el escalado (excepto Applikon 10 l debido a las limitaciones de diseno), las fuerzas de cizallamiento aumentan durante el escalado. Las fuerzas de cizallamiento calculadas [N/m2] se muestran en la Tabla 4. Se calculan las fuerzas de cizallamiento maximas para la punta del agitador, ya que esta area se considera como la region de mayor disipacion de energla. Como el crecimiento celular no parece afectarse y la viabilidad no disminuye con escalas crecientes del reactor, las celulas GlycoExpress A hPM son resistentes al cizallamiento al menos 0,9 N/m2 de agitacion permanente indujo tension de cizallamiento. Esto equivale a un aumento de al menos 10 veces de la resistencia al cizallamiento en comparacion con las celulas CHO, que reciben dano a velocidades de cizallamiento de 0,1 N/m2 [Motobu y otros 1998].

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DASGIP 1l B-DCU 1l B-DCU 5l GDCU 10l Applikon 10l Applikon 100l

Entrada de energla especlfica [W/kg]

0,021 0,020 0,023 0,021 0,003 0,022

Velocidad de punta [m/s]

0,72 0,85 1,10 1,15 0,77 1,53

Velocidad de cizallamiento de la punta [l/s]

457 492 637 818 550 1375

Tiempo de mezcla [s]

2,87 2,77 2,43 2,43 7,32 4,67

Tiempo de circulation [s]

1,05 0,99 0,89 0,97 2,30 1,80

Fuerza de cizallamiento [N/m2]

0,30 0,32 0,45 0,53 0,36 0,90

Reynolds

19184 22192 37291 61390 27783 173630

Tabla 4: Resultado del escalado para diferentes fermentadores que muestran propiedades de cizallamiento y mezcla. Los calculos se realizan para la configuracion del biorreactor como se muestra en la Tabla 6.

15.2 Comparacion de diferentes escalas

La fermentacion por perfusion se llevo a cabo usando la fermentacion en una escala de 1 litro, 10 litros y 100 litros. La Figura 3 muestra resultados ilustrativos para tres fermentaciones similares de GlycoExpress A hPM controladas a 37 °C, pH 7,2 y un DOT de 40 %. La fermentacion se realiza en perfusion aplicando una estrategia de alimentacion similar a la mostrada en la figura 3 (D). Las tasas de perfusion se establecen dependiendo del consumo de glucosa.

Existen varias diferencias entre el proceso a escala de laboratorio y la escala de production de 100 l con respecto al crecimiento y la productividad. En comparacion con una fermentacion a escala menor (volumen de trabajo 1 l) en el que se alcanzan concentraciones maximas de celulas > 10 *106 celulas/ml, las celulas no crecen a concentraciones mayores que 6 * 106 celulas/ml en 10 l y 100 l de perfusion. A continuation, hay menos consumo de glucosa con escala creciente y la concentration de glucosa se mantiene por encima de 1,5 g/l para la escala de 100 l. En las fermentaciones a pequena escala, donde las celulas suelen crecer a concentraciones mas altas, la glucosa se consume a concentraciones inferiores a 1 g/l.

A diferencia de viabilidades y concentraciones de celulas viables diferentes, hay casi el mismo nivel de productividad en todas las escalas. Todas las fermentaciones tienen una productividad maxima > 100pg/(mld) y tambien muestran una curva de productividad muy comparable.

En resumen, el escalado proporciona un proceso que es capaz de producir grandes cantidades de producto. Las concentraciones de productos son similares en todas las escalas. La productividad maxima es > 100 pg/(mld). Sin embargo, hay una disminucion significativa en la viabilidad y la concentracion maxima de celulas que se reconocen en el escalado creciente. Con respecto a la concentracion celular maxima, la retention celular de la centrlfuga tiene un efecto significativo. Mientras que esta > 99 % a escala del laboratorio, cae a aprox. 90 % en escalas de produccion. Esto resulta en un sangrado constante que conduce a una reduction de la concentracion celular maxima.

15.3 Perfusion a gran escala

Las operaciones de perfusion a gran escala se llevan a cabo en un fermentador Applikon de 100 l. Con el uso de la perfusion, se usan hasta 250 l de medios/dla cuando se trabaja con 100 l de volumen de trabajo. La Figura 4 muestra los resultados de tres corridas de perfusion de 100 l comparables, que se realizan bajo condiciones de BPM. Esas fermentaciones son altamente reproducibles. Todas las fermentaciones se realizaron usando las condiciones del proceso de perfusion establecidas (ver anteriormente). Las tres fermentaciones muestran un comportamiento similar con respecto a la productividad y al crecimiento celular. La concentracion maxima de celulas alcanza un maximo de 6 * 106 celulas/ml y disminuye significativamente despues. En la ultima etapa de la perfusion se obtienen densidades de celulas de aproximadamente 3-4 * 106 celulas/ml. Por consiguiente, como el crecimiento celular esta estrechamente ligado a la productividad, tambien hay un maximo en la productividad especlfica. Los picos de productividad especlficos estan a aproximadamente 100 pg/(ml * d). Durante la etapa tardla, la productividad especlfica cae a < 40pg/(ml * d). En cuanto a la viabilidad, las fermentaciones se inician a > 90 %, pero disminuyen hasta aproximadamente 80 % al inicio de la perfusion.

El patron de glicosilacion fue constante para las tres fermentaciones dentro de las fluctuaciones de medicion.

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15.4 Conclusiones del escalado

El escalado se aplico al proceso de perfusion usando la centrlfuga continua Centritech. El equipo de fermentacion proporciona ciertas limitaciones, por ejemplo diferentes tipos de biorreactores usando diferentes configuraciones de aireacion, diferentes propiedades geometricas, limitaciones en agitacion (velocidad, numero de agitadores). Como las celulas resultan altamente resistentes a la fuerza de cizallamiento, la entrada de energla se utiliza como criterio de escalado. Esto resulta en un aumento de las fuerzas de cizallamiento inducidas por el agitador con un aumento del tamano del fermentador, pero proporciona suficiente mezcla a escala de laboratorio. No obstante, el escalado produjo cultivos de alta densidad altamente viables con una glicosilacion constante del producto. La calidad del producto (medido por SEC, bioensayo, perfil de glicanos) generalmente no se altera con el escalado. Las fermentaciones se realizan con exito para la produccion de hasta 90 g de anticuerpo (cantidad antes del procesamiento corriente abajo). Se demostro a traves de la evaluacion cualitativa y cuantitativa del desempeno de los biorreactores de 1 l, 10 l y 100 l, as! como a traves de un panel de pruebas de caracterizacion bioqulmica, que se mantuvo bien la comparabilidad del proceso y del producto durante el proceso de escalado.

Ejemplo 16: Medios de cultivo

Las celulas se cultivaron en suspension usando diferentes medios. Los medios utilizados principalmente son: x-Vivo20 (Lonza, Belgica), GTM-1 (Biochrom, Alemania), GTM-2 (Biochrom, Alemania), GTM-3 (Biochrom, Alemania), GTM-4 (Biochrom, Alemania), GTM-5 (Biochrom, Alemania), GTM-6 (Biochrom, Alemania), GTM-7 (Biochrom, Alemania), GTM- 8 (Biochrom, Alemania) y medio alimentado con GTM (Biochrom, Alemania). Los medios se basan en un medio basal, y se suplementaron con nutrientes adicionales. La nomenclatura general de los medios GTM se da en la Tabla 6.

Nombre Observacion

GTM-1 Medios basales en polvo con otros aditivos

GTM-2 Como GTM1 con osmolaridad reducida debido a un menor contenido de glucosa 4,5 g/l

GTM-3 Medios de investigacion como GTM-2 sin Glc/Gln/HSA

GTM-4 Medios con bajo contenido de HSA (0,002%), composicion remanente como GTM-2

GTM-5 Como GTM2, basado en el componente unico.

GTM-6 Medios con bajo contenido de HSA (0,002%), composicion remanente como GTM-5

GTM-7 Medios libres de llpidos basado en GTM-5

GTM-8 Medios con bajo contenido de HSA (0,002%), composicion

Como se explico anteriormente, la entrada de energla se usa preferentemente como criterio de escalado. La siguiente ecuacion muestra la formula basica para el calculo de la entrada de energla (P) dependiendo de la velocidad del agitador (N), del diametro del agitador (di), de la densidad del medio (p) y de una constante del agitador (Ne).

p = ncPn3J;

Teoricamente, la velocidad del agitador durante el escalado puede mantenerse constante, si la relacion del diametro del impulsor a diametro del recipiente (di = dt) se mantiene constante. Sin embargo, en la mayorla de los casos esto no es posible debido a las dimensiones del recipiente del biorreactor. Para correlacionar la entrada de energla con el volumen de fermentacion, se puede calcular la entrada de energla especlfica (Pespec). La entrada de energla especlfica es un criterio de escalado ampliamente usado. Para aplicarlo a un proceso, las celulas deben ser bastante insensibles a las fuerzas de cizallamiento, que aumentan con el volumen del biorreactor (V). La siguiente ecuacion muestra el calculo de la entrada de energla especlfica.

e*p«c

La velocidad de la punta aumenta linealmente con el diametro del agitador y la velocidad de agitacion. Por lo tanto, una velocidad de punta constante (vTip) resulta en una disminucion de rondas por minuto (rpm) en un recipiente grande. Esto depende directamente de los diametros mayores del agitador en grandes recipientes. Posiblemente, no hay suficiente entrada de energla que puede resultar en una mezcla pobre o incluso sedimentacion celular. En consecuencia, el escalado con la velocidad de cizallamiento de la punta del agitador constante solo puede aplicarse a las celulas extremadamente sensibles al cizallamiento. La siguiente ecuacion muestra el calculo de la velocidad de la

imagen1

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punta del agitador dependiendo del diametro del agitador y de la velocidad del agitador.

ifpip = itdi A

En un biorreactor, surgen fuerzas de cizallamiento maximas en el lado exterior del agitador. Por lo tanto, la velocidad de cizallamiento

7 (|7]=l/s)

debe calcularse en la punta del agitador usando la formula anterior. La velocidad de cizallamiento depende de la velocidad de agitacion (N), del diametro del agitador (di) y de la viscosidad cinematica (v). En este trabajo se asume que la viscosidad cinematica es constante a pesar de que las altas concentraciones celulares pueden aumentarla.

imagen2

Con el uso de la velocidad de cizallamiento de la punta del agitador a medida que los criterios del escalado aumentan la velocidad de agitacion decrece (rpm) con el aumento del tamano del fermentador. Como se menciono anteriormente, puede producirse una mezcla pobre o incluso la sedimentacion celular. En consecuencia, el escalado con la velocidad de cizallamiento de la punta del agitador constante se prefiere con las celulas extremadamente sensibles al cizallamiento. Las celulas que se usan de conformidad con la presente invencion son resistentes al cizallamiento.

Claims (33)

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para cultivar una suspension de celulas sangulneas humanas inmortalizadas de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de las mismas, en donde dicha suspension se agita tal que la entrada de energla especlfica resultante es al menos 0,005 W/kg.
2. 2. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1, en donde dicha suspension se agita con una intensidad que es adecuada para permitir un suministro exclusivo de flujo de gas de dicha suspension.
3. 3. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde dicha suspension se agita tal que la fuerza de cizallamiento resultante es de al menos 0,1 N/m2.
4. 4. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se usa un agitador para la agitacion, y dicha suspension se agita tal que la velocidad de cizallamiento resultante en la punta del agitador es de al menos 300 s-1.
5. 5. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas celulas se suministran con al menos un gas por flujo exclusivo.
6. 6. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas celulas se suministran con al menos un gas a una velocidad de flujo de como maximo 0,05 l/h por litro de volumen del reactor.
7. 7. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el suministro de gas tiene una velocidad de flujo maxima de 0,05 vvm o menos.
8. 8. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la entrada de energla especlfica para la agitacion de la suspension es de al menos 0,01 W/kg y el suministro de gas se logra por flujo exclusivo de gas.
9. 9. El metodo de conformidad con la reivindicacion 8, en donde el flujo de gas maximo es de 0,05 vvm o menos.
10. 10. Un metodo para la production recombinante de un producto de interes en las celulas de sangre humana inmortalizada de origen de leucemia mieloide humana o celulas derivadas de las mismas, en donde dichas celulas comprenden un gen que codifica el producto de interes y en donde dichas celulas se cultivan de conformidad con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. El metodo de conformidad con la reivindicacion 10, en donde el producto de interes expresado se obtiene a partir del cultivo celular.
12. 12. El metodo de conformidad con la reivindicacion 11, en donde el producto de interes se purifica a partir del medio de cultivo celular.
13. 13. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las celulas de leucemia mieloide humana son celulas K562 o celulas derivadas de las mismas.
14. 14. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las celulas se cultivan mediante fermentation continua con retention celular (perfusion).
15. 15. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se usa una centrlfuga continua para perfusion.
16. 16. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las celulas se eliminan durante el cultivo.
17. 17. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la densidad celular en el cultivo celular alcanza al menos 1x106 /ml.
18. 18. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la viabilidad celular en el cultivo celular es al menos 70 %.
19. 19. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la fermentacion tiene una productividad maxima de al menos 80 pg/(mld).
20. 20. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se utiliza un

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    45

    agitador para la agitacion.
21. 21. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se utiliza un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un rociador en anillo, un micro-rociador y una membrana para la aireacion.
22. 22. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde para la aireacion, se dan pulsos de al menos un gas durante el proceso de cultivo.
23. 23. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el desarrollo de burbujas causado por la aireacion esta limitado por el metodo de aireacion elegido.
24. 24. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde para la aireacion se suministra oxlgeno puro.
25. 25. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se determina el valor de oxlgeno en el cultivo de celulas y se introduce oxlgeno y/o un gas o mezcla de gas que contiene oxlgeno como un pulso en el medio de cultivo celular si el nivel de oxlgeno cae por debajo de un nivel predeterminado.
26. 26. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se anade una base durante el cultivo para mantener el pH a un nivel o rango de pH predeterminado.
27. 27. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formacion de agregados celulares se reduce en oposicion a un metodo correspondiente que comprende ninguna de las caracterlsticas definidas en las reivindicaciones 1 a 6.
28. 28. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio de cultivo celular comprende un agente protector de cizallamiento.
29. 29. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las celulas se cultivan en un medio libre de suero.
30. 30. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cultivo celular se realiza a un intervalo de pH entre 6,5 y 8; una pO2 de 30 % a 50 % y/o una temperatura de 30 a 40 °C.
31. 31. El metodo de conformidad con la reivindicacion 30, en donde el cultivo celular se realiza a un intervalo de pH entre 7 y 7,5; una pO2 de 35 % a 45 % y/o una temperatura de 37 °C.
32. 32. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la estructura de glicosilacion de una glicoprotelna de interes y/o la velocidad de produccion de las celulas no se afecta sustancialmente por el volumen de cultivo.
33. 33. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se usa un fermentador para cultivo celular que tiene un volumen de al menos 1 l a 1000 l.