CN103298925B - 用于培养人髓样白血病细胞以及由其衍生的细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于培养永生化人血细胞、优选地髓样白血病源的细胞或由其衍生的细胞的悬液的方法，其中所述方法提供高生产率、高细胞生存力及生长速率和批次间高度一致性，并且可以在不改变这些参数的情况下放大。

Description

用于培养人髓样白血病细胞以及由其衍生的细胞的方法

发明领域

本发明涉及一种用于培养人永生化血细胞、优选地培养人髓样白血病源细胞或由其衍生的细胞的方法，涉及一种用于重组产生目的产物的方法，涉及一种用于改变发酵的体积规模以便产生目的产物的方法。

背景技术

为了产生目的产物，尤其如蛋白质，广泛地应用重组技术。在合适的宿主细胞中表达目的产物并且获得表达的产物，例如从细胞和/或细胞培养基中获得。

发酵的基本构思是以不同规模将细胞在最佳条件下维持一段时间以便产生高量的所需产物。发酵常见用于原核生物(例如大肠杆菌)、酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))和哺乳动物细胞(例如啮齿类细胞系如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞(NS0；SP2/0)或人细胞系)。除了优化的培养基之外，充分受控的发酵过程是哺乳动物细胞培养物中生产过程的基础。取决于生产细胞系，将细胞在悬浮培养物中或在用于贴壁依赖性细胞培养物的载体基质上培育。使用相对低水平的仪器仪表，进行小规模的细胞培养。对于悬浮培养，转瓶和旋转瓶(spinnerflask)例如是合适的。小规模细胞培养通常在增湿的二氧化碳培养箱中运行。由于二氧化碳培养箱中的气体转移基于被动扩散，因此可能发生气体转移局限。文献中涵盖了用于发酵产生药物产品的技术，如众多综述是可获得的，例如[Andersen和Reilly2004]、[Shukla和2010]，[Marks2003]和[Morrow2007]。关于细胞培养发酵的运行，存在已经在文献中描述的用于生物反应器的4种不同基本策略：分批、补料分批、无细胞截留下的连续发酵和伴随细胞截留的连续发酵(灌流)。由于灌流的确包括细胞截留，在培养期间移出细胞的唯一方式是利用放出法(bleed，移出细胞悬液)。

发酵参数是生产过程的特征。改变那些参数可能增加或减少产物产率。在生物反应器中，温度、溶解氧和pH值是待控制的基本参数。用于优化的策略基于对这些参数的调节。一些适合优化的参数包括但不限于发酵期间所用的温度、所使用的氧水平、细胞截留和所用培养基的组成。

另外，选择的通气/喷射作用也可以是培养过程的重要特征。在细胞培养物中生长的细胞需要氧以便高效生长。在小培养体积中，通过穿过培养基表面扩散抵达细胞的氧的量通常是足够的。然而，随着培养体积增加，专门添加氧变得必需。这在正常情况下通过喷射来实现，从而导入待向细胞培养物供给的气体或多种气体的气泡。当需要较大容器尺寸时，均匀气体供给变得越来越令人关注。然而，不能任意增加气体供给，因为大多数哺乳动物细胞倾向于对气泡产生的剪切力敏感。所述气泡携带结合的细胞至表面，在这里气泡在高水动力应力的形成下破裂，因而杀死结合的细胞。这些致死效应可以降低细胞生存力并因此降低细胞培养物的生产率。可以在较小培养物中证明有用的无气泡气体供给系统(例如膜)对于放大期间的较大培养物不实用。其原因是例如与膜使用相关的高成本或巨大容器中的技术局限性。

另外，为了实现均一细胞培养，通常通过搅拌混合悬液。这可以例如由叶轮搅拌和气体喷射实现。对于搅拌，通常使用搅拌器。然而搅拌也存在局限性。细胞通常倾向于对由搅拌(例如搅动)引起的剪切力敏感。因此，通过搅拌确保均一性的潜力是有限的。

就混合而言，存在两个特殊问题：(i)添加碱溶液和进料溶液和(ii)二氧化碳积累。底物水平以及氧梯度的浓度变异可能出现。它们在大容器中比小容器中更常见。不均匀分布随容器尺寸而增加并且变得越来越重要。混合的主要问题是不均一性和剪切力之间的权衡。确保足够混合和无损性剪应力是一项奇妙的挑战。混合和剪应力均可以通过不同的手段导致细胞死亡。不充分混合可以例如导致结块或氧限制，而剪应力可能裂解细胞。

基于剪切力的水动力应力是主要的细胞培养事项。通常，由剪切力所致的损伤在很高程度上取决于细胞系。另外，由于补料分批工艺或灌流工艺的峰细胞密度因工艺优化和培养基优化而增加，随着粘度增加，对混合存在额外的需求。搅拌罐生物反应器中的水动力应力是一个非均匀现象。在仅约10%总体积的叶轮区域内内，最高至70%的能量消散。因此，剪切力在靠近叶轮的那些区域内也高得多，这可以对细胞造成致死性或非致死性损害作用。水动力应力不仅可以裂解细胞；它还可以在难以察觉的水平上影响细胞，这目前未被充分理解。

这些因素促成以下事实：可能适用于小规模培养的培养条件不能轻易转移至大规模培养。以大规模培养生产蛋白质的后果经常与小规模培养明显不同。在大规模生产期间，产生的蛋白质的生产率和/或质量(例如，在重组产生糖蛋白的情况下，糖基化结构)极经常地下降。总之，放大仍是哺乳动物细胞培养中的主要问题。虽然许多文献可用于关于放大概念和考虑事项的放大程序，但是放大仍是一项难题并且适用于一种特定细胞系的措施可能极经常无法转移至不同的细胞系。

当产生糖基化目的产物(例如待用于疗法中的抗体)时，需要获得“人”或“人化”糖基化结构。几种技术和宿主细胞可用于这个目的。发现永生化人血细胞和由其衍生的细胞系适合于重组产生具有人糖基化模式的糖基化产物。相应的细胞系例如在WO2008/028686中描述。产物糖基化是可能受许多不同参数影响的复杂翻译后修饰过程。这些参数可以是物理性质、化学性质或热动力学性质的。由于这些参数可能在发酵期间受影响，非常重要的是形成这样的发酵过程，其允许产生具有恒定即均匀糖基化模式的产物。存在在文献中见到的几项报道。例如报道了剪切力、葡萄糖利用率、氧饱和度、pH、温度和其他工艺条件可能影响糖基化[Senger和Karim2003][Godoy-Silva等人,2009][Tachibana等人,1994][Kunkel等人,1998][Müthing等人,2003][Ahn等人,2008][Lipscomb等人,2005]。

本发明的目的是提供一种用于培养细胞、尤其永生化人血细胞的方法，所述方法在使用不同发酵体积(规模)时也允许产生具有可接受产率和良好质量的目的产物。

发明概述

本发明特别基于以下令人惊讶的研究结果：增加对细胞培养物的搅拌，尽管剪切力相关地增加，产生明显改进的培养条件，所述明显改进的培养条件允许在放大期间也以良好产率和质量产生目的产物。这是重要的优点，尤其在产生用于治疗性使用的目的产物如糖蛋白时。对于这类应用，使用不同发酵器体积时产物质量的变化是在GMP工艺中不可接受，这分别增加从管理机关获得批准的必要工作。尤其发现可以用本发明的培养方法改进细胞密度和细胞生存力。改进了细胞培养基中的养分转运并且可以降低通气速率，这减少因气泡形成所致的细胞损伤。另外，发现当培养永生化人血细胞、优选地人髓样白血病源细胞时，如果使得因通气形成的气泡的尺寸和/或量保持最小，则培养过程得到改进。

根据第一方面，提供一种用于培养永生化人血细胞、优选地人髓样白血病源的细胞或由其衍生的细胞的悬液的方法，其中所述方法具有一个或多个以下特征：

a)搅拌所述悬液，从而所得到的比功率输入是至少0.005W/kg，优选地是至少0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075或0.1W/kg，更优选在0.015至0.03、更优选0.018至0.025W/Kg范围内，

b)将所述悬液以适于允许对所述悬液进行互斥流气体供给的强度搅拌，

c)搅拌所述悬液，从而所得到的剪切力是至少0.1N/m²，优选地至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5或2.0N/m²，

d)在搅拌器用于搅拌的情况下，搅拌所述悬液，从而在所述搅拌器顶端的所得到的剪切速率是至少300s^-1，优选地是至少500、700、900，1100或1300s^-1，

e)通过互斥流向所述细胞供给至少一种气体，

f)以每升反应器体积至多0.05l/h、优选地至多0.02、0.01或0.005l/h的流速向所述细胞供给至少一种气体，

g)所述气体供给具有0.05vvm或更小的峰流速，优选0.02、0.01或0.005vvm或更小的峰流速。

根据本发明的第二方面，提供一种用于在人永生化人血细胞中重组产生目的产物的方法，其中所述细胞包含编码所述目的产物的基因并且其中将所述细胞根据本发明第一方面的方法培养。

另外，本发明也提供了允许成功放大发酵同时维持产物产率和质量的方法和工具。

发明详述

根据本发明第一和第二方面的方法允许实现一个或多个以下目标：最小化对细胞的损伤(尤其由气体供给、通气和/或气泡形成引起的损伤)、在表达糖蛋白的情况下糖基化结构的高度稳定性和均匀度、良好的生产速率、易于处置、降低的细胞团块数目、易于放大和对于工艺参数变动的稳健性。

除非另外指明，否则术语“根据本发明的多种方法”或“根据本发明的方法”指根据本发明第一方面的方法和根据本发明第二方面的方法两者。

本发明的方法部分地基以下令人惊讶的研究结果：当搅拌强度(激烈)相当高时，根据本发明使用的细胞显示特别良好的生长性能(例如生存力)和特别良好的重组蛋白生产量。这是出人意料的，因为细胞通常倾向于因剧烈搅拌引起的剪切力而受损。一个令人惊讶的研究结果是，根据本发明待使用的细胞对于因搅拌引起的剪切力和对于因空气泡引起的剪切力具有不同的灵敏度。根据本发明使用的细胞对搅拌器引起的剪切力是非常稳健的(例如它们耐受例如0.9N/m²的剪切力和例如1000s^-1的剪切速率)，但是它们对通气相当敏感。互斥流气体供给或在低流速下的气体供给也可以用来实现本发明的优点，因为这些措施减少因气泡引起的剪切力。出人意料的是，根据本发明使用的细胞对于因搅拌引起的剪切力相当不敏感到这样的程度，从而允许剧烈到足以容忍采用互斥流气体供给的搅拌。剧烈搅拌具有以下有利作用：确保全部细胞的均一混合和均一生长条件。

在优选的实施方案中，搅拌细胞悬液，从而所得到的比功率输入是至少0.005W/kg。比功率输入尤其是用于搅拌(例如用于转动搅拌器或用于转动、摇摆、摆动或者搅拌细胞培养物和/或细胞培养物容器)每单位质量(例如kg)或体积(例如m³)细胞培养物的功率。优选地，用于搅拌的比功率输入是至少0.01、至少0.015、至少0.02、至少0.025、至少0.03、至少0.04、至少0.05、至少0.075或至少0.1W/kg，更优选在0.015至0.03W/kg，最优选0.018至0.025W/Kg的范围内。

根据本发明待使用的细胞允许产生具有人糖基化的糖蛋白，这通常导致改进的生物利用率和功能。这是胜过目前可用生产体系的重要优点，所述的目前可用生产体系主要是啮齿类来源的(例如CHO-细胞、NSO-细胞、Sp2/0细胞)。所述细胞系的主要优点是人糖基化作用连同其他的人翻译后修饰作用。

根据本发明待使用的永生化人血细胞优选地是人髓样白血病源细胞或由其衍生的细胞。优选地，所述细胞来自细胞系，尤其来自K562细胞系(例如可作为ATCCCCL243获得的K562细胞系)或由其衍生的细胞系。在通过引用方式并入本文的WO2008/028686中详述相应的细胞、细胞系和宿主细胞。然而，本发明的方也适用于耐受高剪应力的其他悬浮细胞或细胞系，尤其适用于真核悬浮细胞或细胞系，优选地是人悬浮细胞或细胞系。

用于在人永生化人血细胞、优选地人髓样白血病源细胞或由其衍生的细胞中重组产生目的产物、优选地产生糖蛋白的方法允许以良好产率和均一质量产生目的产物，甚至当使用不同培养体积时和甚至当施加因搅拌引起的高剪切力时也是如此。宿主细胞包含编码目的产物的基因并且根据权利要求1所述的方法培养所述细胞。优选地重组导入编码目的产物的所述基因。所述重组技术是熟知并且因此无需在此详述。例如，编码目的产物的基因可以包含于表达载体中，随后将所述表达载体稳定或瞬时导入宿主细胞中。目的产物可以是任何性质的，优选地它是蛋白质或多肽。优选地，所述产物是糖基化的。具体而言，重组产生药物活性产物如抗体或其他有治疗活性的蛋白质是值得关注的。为了大规模生产相应产物，需要这样的发酵方法，所述发酵方法允许以良好产率和良好、均一质量生产目的产物，即便使用不同的培养体积。另外，产物质量和优选地产率也应当优选地是在不同的生产进料之间类似的。这些优点可以用本发明的方法实现。

从细胞培养物获得表达的目的产物，例如通过破坏细胞或通过从细胞培养基收获分泌的目的产物。优选地，从细胞培养基中纯化目的产物。在这个实施方案中，产物优选地由细胞分泌。

优选地，通过伴以细胞截留的连续发酵法(灌流)培养所述细胞，所述方法产生特别良好的结果。在本发明方法中使用的细胞在稳定期期间不以可辨别的量产生重组蛋白。因此，灌流可以起到延长其中产生大部分蛋白质的指数(对数)生长期的作用。因此，培养永生化人血细胞如K562细胞或由其衍生的细胞时，使用灌流用于培养是有利的。

在灌流模式下，优选地连续地供给新鲜培养基。以相同方式，优选地从生物反应器取出无细胞上清液，同时将细胞优选地保留在发酵器中。灌流发酵器的重要的特征是细胞截留系统。可以采用不同技术保留细胞。例如，可以使用过滤法、离心法或沉降法。在本发明的灌流方法中，优选地通过选自离心滤器、中空纤维、连续式离心机和声学细胞截留系统的装置实现细胞截留。

优选地，将连续式离心机如CentritechLab连续式离心机用于灌流。使用CentritechLab连续式离心机的灌流适用于0.5l/d和120l/d之间的灌流体积；对于较大体积的细胞培养物，可以使用Centritech细胞连续式离心机。在这个巨大的体积范围内Centritech使用不同类型的操作。存在几种连续模式：泵模式、阀模式、进料模式和作为泵模式变型的不连续间断模式。在不连续模式下，离心机在运行时间期间运行，所述运行时间被等待时间中断。在等待时间期间，管路系统应当是无细胞的，这通过每次运行后使用无细胞上清液冲洗该系统来确保。

通过设定Centritech的进料泵和控制收获泵控制灌流。根据一个实施方案，将灌流速率设定在0.5V/d(每日细胞培养物体积)和2.5V/d之间。为了相对于细胞要求恰当地调节灌流速率，优选地选择一个关键参数(控制参数)。理想地，该控制参数是生长/生产限制性的并且易于计量。然而，更常见到，该控制参数不是生长限制因子。例如，将葡萄糖设为控制参数。

根据本发明使用的用于细胞的灌流工艺以高密度发酵期间的高细胞生存力特征。在发酵期间，既不存在主要底物(例如氧、葡萄糖、谷氨酰胺)方面的限制，也不存在任何蛋白质性氨基酸的限制。另外，灌流工艺以恒定产物质量和尤其以恒定糖基化模式为特征。优选地将发酵过程控制在pH7.2；DOT(溶解氧张力)40%和在37°C的温度。可以用高功率输入(例如0.022W/m³)进行采用所述永生血细胞的发酵，因为细胞特别耐受搅拌的罐生物反应器中的高剪切力。

在灌流条件下，细胞浓度通常增加直至达到极限。这个极限可以是养分或废物的积累。与分批发酵或补料分批发酵相比，可以达到高得多的细胞密度，原因在于恒定的培养基供给和洗出废物。基于这些更高的细胞密度，实现优异的空间-时间产率。

根据一个实施方案，在培养期间移出细胞，优选地通过放出法（bleeding）移出。当采用放出法时，从发酵器取出某个量的细胞(例如10%的总体积)。放出法具有以下优点：使细胞以增加的生存力在生长相保持更长时间，这产生更稳定的培养物。几种放出策略已经在文献中由Dalm和合作者讨论，所述文献通过引用方式并入本文[Dalm等人,2004]，[Dalm等人,2007]。

本发明培养方法的对于重组产生糖基化目的产物重要的一个特别优点是，当表达例如糖蛋白时，所述方法导致均一和高度可重复的糖结构。在一个优选实施方案中，目的产物的糖基化结构和/或所述细胞的产生速率基本上不受培养物体积影响。例子是其中比较1l反应器中和100l反应器的培养物(优选地灌流培养物)的情况。优选地，产物总体质量是基本上不受培养物体积影响。所述例子显示本发明的方法能够实现这些优点。

根据一个实施方案，细胞培养物中的细胞密度达到至少1x10⁶个/ml。优选地，细胞密度甚至更高，例如是至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10x10⁶个细胞/ml。根据一个实施方案，细胞培养物中的细胞生存力是至少70%，优选地至少80%，更优选至少85%，至少90%或至少95%。根据一个实施方案，本发明方法中的细胞密度在一个时间点在至少90%的细胞生存力情况下达到至少5x10⁶个/ml。细胞生存力尤其指与样品中全部细胞(活细胞和死细胞)的数目相比活细胞数目的百分比。

优选的可实现峰值生产速率是至少25μg/(mld)(每日每ml细胞培养物25μg产物)、优选地至少50μg/(mld)、至少80μg/(mld)、至少90μg/(mld)或至少100μg/(mld)。

在本发明的方法，优选地将搅拌器、尤其叶轮用于搅拌。

细胞培养物通常含于器皿中，所述器皿可以例如是含有细胞培养物的袋子，优选地是一次性使用的袋子，或可选地是除袋子之外的器皿，例如罐、容器等。如果使用袋子，则它可以优选地与用于搅拌的搅拌器组合。优选地，使用发酵器作为适用并优选地常用于灌流方法的容器。

在本发明的优选方法中，将选自环状鼓泡器（sparger）、微量鼓泡器和膜的装置用于通气。本发明的方法允许使用鼓泡器用于气体供给，所述气体供给否则将不是可行的，原因在于根据本发明待使用的细胞对空气泡的高灵敏度。

根据一个实施方案，在培养过程期间给予至少一种气体的脉冲用于通气。

根据一个实施方案，由通气引起的气泡形成受所选择的通气方法限制并且其中产生的气泡优选地具有大于2mm、优选地大于5mm、更优选地10mm或更大的尺寸。如上文讨论，大于2mm并且特别大于10mm的气泡导致较小的剪应力并且因此对于根据本发明使用的细胞具有较小致死作用。

如上文讨论，总体气体供给或通气优选地由互斥气流实现。术语“互斥流”尤其指与其中以连续方式供给气体的恒定流对比，以不连续方式供给气体。术语“通气”尤其指供给包含氧或由氧组成的气体(例如空气，优选地纯氧)。优选地通过互斥流实施通气。根据一个实施方案，气体供给(例如包含氧的气体，优选地全部气体)脉冲可以至多是30秒(或至多10秒、3秒或1秒)持续时间。在至少1小时(或至少2小时或5小时)的培育(培养)时间范围内，期间供给气体的时间部分可以占至多25%(或至多10%、5%、2.5%或1%)。优选地，使用了检测悬液中氧饱和度的手段。当检测到的氧饱和度低于预定义阈值，例如10%、优选地20%、25%、30%或更优选地35%的pO₂或DOT时，优选地供给包含氧的气体。优选地为了通气，供给纯氧。

因此，根据一个实施方案，分别测定细胞培养物中的氧值以及氧饱和度，其中如果氧水平降低低于预定水平(例如如上文定义)，则将氧和/或含氧气体或气体混合物作为脉冲导入细胞培养基中。这有利地使通气并因而使气泡形成最小化。

在优选的实施方案中，以每升反应器体积至多0.05l/h、优选地至多0.02、0.01或0.005l/h的流速向所述细胞供给至少一种气体。具体而言，细胞培养物的整个气体供给是每升反应器体积0.05l/h或更少，优选地每升反应器体积0.02、0.01或0.005l/h或更少。术语“流速”和“气体供给”在这个方面优选地指在整个培养过程范围内的平均流速或平均气体供给。这意指当使用互斥气流时，其中将气体以间断的间距导入细胞培养物中的情况下，供给间距期间的实际流速可能高于以上值。然而，平均而言考虑到供给间距和其中没有向细胞培养物导入气体的间距，总流速或总气体供给优选地是每升反应器体积至多0.05l/h，如上文定义。

在其中通过互斥气流实现气体供给的优选实施方案中，在供给间距期间的任何时间上的流速(峰流速)是0.05vvm(体积/反应器体积/分钟)或更小，优选地0.02、0.01或0.005vvm或更小。

在某些特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中，

(i)用于搅拌悬液的比功率输入是至少0.01W/kg；并且

(ii-1)采用至少一种气体的气体供给或悬液的整个气体供给是每升反应器体积0.05l/h或更少，或者

(ii-2)气体供给由互斥气流实现并且峰流速是0.05vvm或更小。

优选地，用于搅拌悬液的比功率输入是至少0.015W/kg；并且采用至少一种气体的气体供给或悬液的整个气体供给是每升反应器体积0.02l/h或更少，或者如果气体供给由互斥气流实现，则峰流速是0.02vvm或更小。在这些实施方案中，因搅拌悬液产生的剪切力是至少0.1N/m²，优选地是0.3N/m²，和/或在所述搅拌器顶端的剪切速率是至少300s^-1，优选地是500s^-1。

根据一个实施方案，在培养期间添加碱以维持pH处在预定的水平或pH范围。优选的pH范围或值在5至9之间，更优选地在6至8.5之间，在6.5至8之间，或最优选地在7至7.5之间。通常需求添加碱以便抵消例如乳酸盐形成，或用于抵消CO₂形成。在现有技术中已知的方法中，添加碱导致细胞结块，所述细胞结块可能由能够引起细胞裂解的碱所致。结块是死细胞的聚集物。结块尤其在较大规模下是个问题。本发明方法减少结块形成，可能原因在于更剧烈的搅拌。本发明的方法允许减少细胞团块的形成。待添加至细胞悬液的碱可以更迅速和均匀地分布。在本发明的优选方法中，与不包括特征a)至f)中任一个的相应方法对比，细胞团块的形成减少。

优选地，紧邻搅拌器区域添加碱。另外，优选地将碱直接添加至细胞悬液中，即添加部位在悬液表面之下并且不将碱滴入悬液中。

细胞优选地在无血清培养基(例如化学定义的GTM培养基)中培养。

在本发明方法的一个优选实施方案中，细胞培养基包含剪切保护剂，例如血清、聚(乙二醇))(PEG)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙烯醇)(PVA)或Pluronic-F68。剪切保护剂优选地以<0.01至3g/l的浓度使用。优选地，所述细胞培养基是无血清的。

根据一个实施方案，细胞培养在6.5至8、优选地7至7.5之间的pH范围；10%至90%、优选地30%至50%、更优选地35%至45%的pO₂和/或30至40°C、优选地37°C的温度进行。

根据一个优选实施方案，目的产物的糖基化结构和/或所述细胞的产生速率基本上不受培养物体积影响。

优选地，如本文中公开的优选实施方案彼此组合。具体而言，提供以下的优选组合：

特征a)与特征e)组合

特征a)与特征f)组合

特征a)与特征g)组合

特征a)与特征e)和特征g)组合

特征c)与特征e)组合

特征c)与特征f)组合

特征c)与特征g)组合

特征c)与特征e)和特征g)组合

特征d)与特征e)组合

特征d)与特征f)组合

特征d)与特征g)组合

特征d)与特征e)和特征g)组合

特征e)与特征g)组合

特征a)与特征e)和特征g)以及特征c)和/或特征d)组合

在这些组合中，可以使用如上文定义的特别优选的值和范围。在某些实施方案中，以上组合进一步与本文中限定的一个或多个实施方案、尤其与特征b)组合。

根据一个实施方案、将发酵器用于细胞培养，所述细胞培养具有至少1l、优选地至少10l、至少20l、至少50l、至少100l、至少200l、至少500l或至少1000l的体积、尤其在1l至1000l、1l至500l、10l至250l或20l至100l范围内的体积。如上文讨论，尤其令人惊讶地，产物质量以及生产率均不受发酵器的尺寸影响。当改变生产过程的规模时，这是一个特殊优点。根据一个实施方案，使用功率输入作为放大标准并且因此，比功率输入在不同发酵器尺寸(然而，优选地允许大约25%、20%、15%、10%、5%的偏差)之间保持恒定。优选地，比功率输入是至少0.005W/kg，优选地是至少0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075或0.1W/kg，更优选在0.015至0.03、更优选0.018至0.025W/Kg范围内。

根据又一个方面，本发明涉及一种放大在根据本发明方法中所用的培养或生产过程的方法，其中使用所述功率输入作为放大标准。具体而言，在放大期间保持功率输入恒定，即，用于初始、小规模培养方法的比功率输入处在放大的最终大规模方法的比功率输入的75%至125%、优选地80%至120%、85%至115%、90%至110%或95%至105%范围内。具体而言，用于小规模培养方法和/或用于大规模培养方法的比功率输入是至少0.005W/kg，优选地是至少0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.075或0.1W/kg，更优选在0.015至0.03、最优选0.018至0.025W/Kg范围内。大规模培养优选地具有比小规模培养的细胞培养物体积大至少25%的细胞培养物体积。更优选地，大规模培养的细胞培养物体积是比小规模培养的细胞培养物体积大至少50%、大至少100%、大至少1.5倍、大至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或大至少100倍。

具体而言，本发明涉及一种用于改变重组产生目的蛋白之规模的方法，包括以下步骤：

-提供用于培养细胞的第一容器，

-提供永生化人血细胞或由其衍生的细胞，

-提供所述细胞的第一悬液，

-将第一悬液导入第一容器，

-进行本发明的培养或生产方法，尤其根据权利要求1至25中任一项所述的方法，

-任选地记录第一悬液中产生的目的糖蛋白的糖基化结构和/或第一悬液的细胞的产生速率，

-提供用于培养细胞的第二容器，其具有与第一容器不同的内部体积，

-提供所述细胞的第二悬液，

-将第二悬液导入第二容器，

-进行本发明的培养或生产方法，尤其根据权利要求1至25中任一项所述的方法，

-任选地记录第二悬液中产生的目的糖蛋白的糖基化结构和/或第二悬液的细胞的产生速率，

-任选地比较两种悬液中产生的目的糖蛋白的糖基化结构和/或两种悬液的细胞的产生速率，

术语“改变规模”优选地指放大，即增加培养物体积。

本发明的方法(例如高度搅拌和低通气)允许根据本发明待使用的细胞的良好生长。发现可以在搅拌罐生物反应器和在体积和几何形状方面不均一的众多其他容器中培养它们，本文还统称作发酵器(例如T型瓶（T-flask）、旋转瓶和摇袋式生物反应器(wavebioreactor))。对于搅拌罐，可以实现约2*10⁶个细胞/ml的活细胞密度连同>95%的高生存力。在灌流模式下，细胞生长至最高到107个细胞/ml的高细胞密度，连同>90%的高生存力。可以例如通过灌流获得良好的比生产率。

标准条件是pH7.2；溶解氧张力(DOT)是40%并且温度是37°C，不过本发明的方法就工艺参数变异而言是稳健的。使用低气体流量和环状鼓泡器产生了令人惊讶良好的结果。

通过本发明方法获得的产物质量是极高的，因此可以基于生产率和经济考虑作出生产方法的选择。当使用本发明的方法表达抗体时，发现糖基化模式是可类似的，因此与不同几何比例的10l和100l生物反应器相比，使用1l规模时，糖基化模式未改变。基于根据本发明使用的细胞的高度剪应力稳健性(与CHO细胞相比增加至少10倍)，可以按恒定的比功率输入进行放大。对1l、10l和100l生物反应器的定性与定量性能评价及一系列生物化学表征试验显示过程(方法)和产物的可比性在工艺放大期间充分维持。

附图简述

图1显示对于GlycoExpressAhPM(PankoMab，抗MUC1抗体)而言，针对100转/分钟(0.0007W/kg)、200转/分钟(0.006W/kg)和300转/分钟(0.02W/kg)比较不同功率输入的一组实验的结果。显示活细胞浓度(A)、生产率(B)和生存力(C)的数据。

图2显示对于连续模式中GlycoExpressAhPM的细胞截留，使用CentritechLabII时两个类似灌流试验(run)的细胞生长(A)、比生产率(B)、生存力(C)、灌流速率(D)和葡萄糖浓度(E)的比较。

图3显示以1l；10l和100l规模放大发酵的示例性数据。显示了在相似条件下使用GlycoExpressAhPM的3种发酵的细胞生长(A)、比生产率(B)、生存力(C)、灌流速率(D)和葡萄糖浓度(E)。

图4显示相似100l灌流试验轮次的比较。显示3个重复发酵的细胞生长(A)、比生产率(B)、生存力(C)、灌流速率(D)和葡萄糖浓度(E)。

引用的文献

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实施例

实施例1：预培养物

预培养物在细胞培养瓶(TPP/Biochrom，德国)中培育。将培养瓶使用达5ml(T25，25cm²面积)、30ml(T75，75cm²)和75ml(T150，150cm²)悬液体积。通过每隔2-3日分瓶并且在分瓶后设定细胞浓度至0.15*10⁶个细胞/ml，将细胞维持在对数生长期。以克隆依赖性方式基于每周或永久地以不同浓度添加甲氨蝶呤(Sigma-Aldrich，德国)和嘌呤霉素(TakaraBioEurope，德国)。细胞在培养箱(IntegraBiosciencesIBS,Biosafeplus,瑞士或Thermo/HeraeusBBD6220,德国)中在37°C、8%二氧化碳和95%相对湿度培育。

实施例2：旋动培养

从125ml细胞悬液的体积开始，使用旋转瓶(IntegraBiosciencesIBS，Cellspin，瑞士)实施旋动预培养。使用3种不同体积(0.25l、0.5l、1l)的旋转瓶。将旋动速度设定至60转/分钟，同时在培养箱(IntegraBiosciencesIBS,Biosafeplus,瑞士)中在37°C，8%二氧化碳和95%相对湿度操作系统。将旋转瓶用0.15*10⁶-0.3*10⁶个细胞/ml接种。出于预培养目的，通过每隔2-3日增加悬液体积并且在分瓶后设定细胞浓度为0.15*10⁶个细胞/ml，将细胞维持在对数生长期。

在建立发酵过程用于GlycoExpressA和GlycoExpressB细胞(其是由K562衍生的细胞系的细胞)之前，分析旋动培养物中的生长。除了T型瓶之外，还将旋转瓶和摇瓶用于预培养目的。与T型瓶相比，旋转瓶和摇瓶均具有改进的传质性能，导致增加的kla-值。

已经在批次实验中针对GlycoExpressAhPM细胞平行分析生长曲线。细胞在全部3种不同系统中类似地生长。与旋转瓶和摇瓶培养物相比，T型瓶中的细胞浓度略微较低。

虽然达到较低的细胞密度，T型瓶中的细胞培养物显示最高乳酸盐浓度。得出结论，旋转瓶和摇瓶同等地充分适用于培养细胞。与T型瓶相比，二者似乎提供略微更好的生长并且因此充分适用于发酵之前的预培养。这也暗示涉及培养的细胞系的稳健性。

实施例3：发酵BiostatB-DCU2l

使用SartoriusBiostatB-DCU2l系统(Sartorius，德国)实施实验室规模发酵。双层壁Univessel2l(Sartorius，德国)发酵釜具有最小0.8升和最大2升的工作容积。通常，以1升工作容积进行发酵。全部发酵器在SystecV-150高压釜(Systec，德国)中灭菌。气体混合支持4种不同气体：氮气、氧气、二氧化碳和压缩空气。通过质量流量控制器操作氧气、二氧化碳和压缩空气，而使用变截面流量计Q-Flow(Instrruments,德国)控制控制氮气。也可以通过设定全部气体的总流量控制通气。使用SartoriusMidisart20000.2μmPTFE滤器(Sartorius，德国)过滤气体供给和排出气。使用MettlerTorledoInPro6800电极(Mettler-Torledo，瑞士)在线测量溶解氧浓度。使用碱(0.1MNaOH)的添加和二氧化碳的添加来控制pH值。使用Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S电极(Mettler-Torledo，瑞士)在线测量pH-值。通过WatsonMarlow100OEM泵(WatsonMarlow,英格兰)添加碱。将两台额外的WatsonMarlow100OEM泵(WatsonMarlow，英格兰)和一台WatsonMarlow313OEM泵(WatsonMarlow，英格兰)用于细胞收获、接种或其他目的。使用SartoriusLE10001天平(Sartorius，德国)和重力测量流量控制器通过WatsonMarlow101U/R(WatsonMarlow，英格兰)添加进料培养基。使用Economy系列EA60EDE-1天平(Sartorius，德国)测量反应器重量。细胞用一个或两个3叶片叶轮1-2l，可调式，compl.，54/10H7(Sartorius，德国)搅拌。搅拌器轴由KollmorgenSeidel65M27LL-4.500电机(KollmorgenSeidel，德国)提供动力。取决于反应器体积，使用一个或两个搅拌器：例如，对于BiostatB-DCU2l，当采用1l工作容积工作时，使用一个搅拌器，而对于2l发酵，使用两个搅拌器。使用自动环和Frigomix1000冷冻机实施过程冷却(Sartorius，德国)。

分批发酵

该项工作中的大部分发酵使用SartoriusBiostatB-DCU系统以0.8-2升之间(优选的体积是1l)的工作容积进行。除非另外指出，否则以0.15*10⁶–0.3*10⁶个细胞/ml的细胞密度在37°C，pH7.2和40%DOT的空气饱和度开始发酵。将二氧化碳体流/0.5NaOH用来调节pH。通过使用压缩空气或纯氧，使DOT保持在40%。pH和DOT均是PID控制的。在优化功率输入之前，测试不同的通气系统。以50转/分钟的搅拌器速度、37°C、40%DOT，pH7.2在1.5l工作容积下进行这些发酵。在平行试验中测试环状鼓泡器、微量鼓泡器和膜通气(Sartorius，德国)。

连续发酵

使用4种不同细胞截留技术实施连续发酵。全部发酵均使用SartoriusBiostatB-DCU系统以1-1.5升之间的工作容积进行。

1.连续式离心机：CentritechLabII或CentritechLabIII(BerryWehrmiller，CarrCentritech，美国)

2.内部离心滤器：Sartorius离心滤器2l20μm(Sartorius，德国)

3.外部中空纤维：AmershamBiosciencesCFP-4E5A，0.45μm，1200cm²(AmershamBiosciences，美国)

4.声学细胞截留：BiosepAPS990(Applisens/Applikonbiosciences，荷兰)

在工艺开发的稍后阶段，已经使用CentritechLabII或CentritechLabIII(BerryWehrmiller，CarrCentritech，美国)连续式离心机实施全部连续发酵。Centritech为不同尺寸的反应器体积提供不同的运行模式。对于1l工作容积的实验室规模发酵，使用“断续泵模式”进行离心。以10l或100l规模的发酵使用连续运行下的“泵模式”或“进料模式”。通过两台天平控制灌流。使用重力测量流量控制器进料，同时通过改变Centritech控制参数设定收获。CentritechLabII和LabIII离心机不直接与DCU连接。通过控制进料的浓度传感器控制100l规模的灌流，同时Centritech连续地收获。

实施例4：DASGIP生物反应器系统

使用DASGIP生物反应器系统(DASGIP，Jülich，德国)实施额外的实验室规模发酵。由不同模块组成，DASGIP生物反应器系统可以同时操作4个生物反应器，独立控制每个反应器的pH(模块PH4/PO4)、DOT(模块PH4/PO4)、温度(模块TC4/SC4)、搅拌(模块TC4/SC4)和液体进料(模块MP8)。发酵釜(DASGIP，德国)具有0.6-1l的工作容积。使用加热套确保温度控制。DASGIP系统配备以可变速度驱动为特征的蠕动泵。每台泵的流速可以由用户编程，以便由独立功能基于在线数据来控制。可以实现同时反馈性控制针对养分和代谢物的多个分析。使用MX4/4模块控制气体供给。气体混合支持由质量流量控制器控制的4种不同气体：氮气、氧气、二氧化碳和压缩空气。使用SartoriusMidisart20000.2μmPTFE滤器(Sartorius，德国)过滤气体供给和排出气。使用碱(0.5MNaOH)的添加和二氧化碳的添加来控制pH值。使用Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S电极(Mettler-Torledo，瑞士)在线测量pH。全部发酵器在SystecV-150高压釜(Systec，德国)中灭菌。细胞用一个3叶片叶轮(DASGIP，Jülich德国)搅拌。搅拌器轴由磁力搅拌器提供动力。

实施例5：发酵10l实验室规模

使用SartoriusBiostatC-DCU310l系统(Sartorius，德国)实施实验室规模发酵。使用具有最小4升和最大10升工作容积的不锈钢发酵釜。通常，分批发酵以10l工作容积进行，而灌流以5l工作容积实施。将10lCDCU类似地设置为2lB-DCU生物反应器。气体混合支持4种不同气体：氮气、氧气、二氧化碳和压缩空气。通过质量流量控制器操作氧气、二氧化碳和压缩空气，而使用变截面流量计Q-Flow(Instruments，德国)控制氮气。也可以通过设定全部气体的总流量控制通气。使用SartoriusMini或SartoriusJunior0.2μmPTFE滤器(Sartorius，德国)过滤气体供给和排出气。使用MettlerTorledoInPro6100/120/T/N电极(Mettler-Torledo，瑞士)在线测量溶解氧浓度。使用碱(0.5MNaOH)的添加和二氧化碳的添加来控制pH值。使用Mettler-Torledo405-DPAS-SC-K8S电极(Mettler-Torledo，瑞士)在线测量pH值。通过WatsonMarlow100OEM泵(WatsonMarlow,英格兰)添加碱。将两台额外的WatsonMarlow100OEM泵(WatsonMarlow，英格兰)用于细胞收获、接种或其他目的。使用SartoriusEA150CE天平(Sartorius，德国)和重力测量流量控制器通过WatsonMarlowSCI323(WatsonMarlow，英格兰)添加进料培养基。细胞用一个或两个3叶片叶轮5-10l，可调式，compl.，54/10H7(Sartorius，德国)搅拌。搅拌器轴由KollmorgenSeidel65M57SL-3000电机(KollmorgenSeidel，德国)提供动力。取决于反应器容积，使用一个或两个搅拌器：例如对于10lC-DCU，一个搅拌器用于5l，两个搅拌器用于10l。使用自动环以Frigomix1000冷冻机(Sartorius，德国)或自来水冷却实施过程冷却。

实施例6：发酵100l生产规模

在清洁室条件下实施生产规模发酵。生产试验使用Applikon100l(Applikon,比利时)发酵器用于细胞培养。软件BioXpertXP用于过程监测和数据记录。与实验室规模发酵相似，气体混合支持由质量流量控制器控制的4种不同气体：氮气、氧气、二氧化碳和压缩空气。使用测量用Mettler-Torledo电极(Mettler-Torledo，瑞士)控制pH和DOT。

实施例7：发酵-单次使用

用摇袋式生物反应器运行额外的实验室规模发酵。使用WaveCellbase20SPS平台(WaveBiotechAG，瑞士)测量并且控制温度、摇摆速度和摇摆角度。通过Wavepod-R(GEHealthcare，美国)版本控制DOT、pH和通气。设定点是温度：37°C，pH7.2，摇摆速度：12转/分钟和角度9°。将初始细胞浓度设定至1.5*105个细胞/ml。分别使用CentritechLabII和LabIII(BerryWehrmiller，CarrCentritech，美国)操作灌流。使用汲取管，设计摇袋式细胞培养袋。使用Luer-Lock或MPC转接器连接这些管。全部连接在层流下进行(ThermoScientific，美国)。

实施例8：ELISA

通常使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定抗体浓度。在4°C使用PBS中1μg/ml的50μl体积抗人抗Ig-κ抗体(BDBiosciences，美国)作为包被抗体持续至少12小时。非特异性结合位点用PBS中的2%牛血清白蛋白(BSA)(Roth，德国)封闭30分钟。在1%BSA/PBS中稀释样品并且将50μl孵育1小时。通过使用爱必妥(Erbitux)作为标准，实现数据的定量。爱必妥以10μg/ml、8μg/ml、6μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.75μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml使用。使用50μl兔抗人IgG(H+L)POD(JacksonImmunoResearch，英国)作为第二抗体。孵育1小时。最后，将100μl四甲基联苯胺(TMB)单组分HRP微孔底物(Tebu-BioLaboratories，德国)用于检测。将反应用50μl2.5NH₂SO₄(Sigma，德国)终止并且在450/630nm波长测量。

抗原结合ELISA

在抗原ELISA中通过与糖基化和非糖基化MUC1-肽的结合测量人PankoMab的抗原结合。将糖基化MUC1肽在PBS以等摩尔数在4°C包被至少12小时。非特异性结合位点用PBS中的2%牛血清白蛋白(BSA)(Roth，德国)封闭30分钟。将人PankoMab的样品1%BSA/PBS中稀释至浓度0.4μg/ml和0.8μg/ml，并且将50μl孵育1小时。使用细胞培养上清液标准(稀释度：1:100；1:200；1:400)进行校正。使用50μl兔抗人IgG(H+L)POD(JacksonImmunoResearch，英国)作为第二抗体。孵育1小时。最后，将100μl四甲基联苯胺(TMB)单组分HRP微孔底物(Tebu-BioLaboratories，德国)用于检测。将反应用50μl2.5NH₂SO₄(Sigma，德国)终止并且在450/630nm波长测量。使用上清液标准的回归，分析抗原-ELISA。对产物高质量的规定是以高于0.3的光密度(OD)与糖基化肽结合。另外，非糖基化MUC1肽对糖基化MUC1的结合比率必须小于5%，以便符合所述规定。

实施例9：大小排阻层析分析

通过使用大小排阻层析(SEC)测定单体抗体的百分比。使用Superdex20010/300GC(GEHealthcare，美国)柱在prime(GEHealthcare，美国)系统上进行层析。样品用PBS稀释至含有大约50-200μg蛋白质的250μl样本容量。使用200μl上样环，将样品以无气泡方式上样。用于分析的运行缓冲液是PBS，将流速设定至0.5ml/分钟。在洗脱后，就单体含量、二聚体含量和多聚体含量分析层析图峰面积。

实施例10：聚糖分析

单糖分析

对于聚糖单糖分析，将糖基化抗体用三氟乙酸水解，导致单糖部分从聚糖链中释放。额外地，通过三氟乙酸的作用，使N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺脱乙酰成氨基葡萄糖和氨基半乳糖。通过具有脉冲安培检测的高效液相阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分离并定量单糖的混合物。

糖谱分析(Glycoprofiling)

对于糖谱分析，在采用PNG酶的凝胶消化下从蛋白质芯释放完整的N-聚糖。从凝胶洗出N-聚糖并且随后用荧光标记2-氨基苯甲酰胺进行标记。通过正相色谱色谱(NP-HPLC)或亲水相互作用色谱(HILIC)分离标记的N-聚糖的纯化样品，伴以荧光检测。NP-HPLC允许分离大部分N-聚糖。与NP-HPLC相反，HILIC-HPLC允许分离含有对分N-乙酰葡糖胺的N-聚糖结构物。通过将停留时间与数据库比较，将各峰分配至聚糖结构。额外地，通过MALDI-TOF质谱法和使用外切糖苷酶的酶消化阵列验证结构。

Fc/Fab糖基化的独立分析

在Fc糖基化影响抗体的效应子功能情况下，Fab糖基化影响抗体与抗原的相互作用。因此，聚糖分析的首要关注点是确定是否两个部分Fc和Fab均糖基化，并且其次是在两个部位的糖基化模式之间是否观察到差异。用木瓜蛋白酶完全裂解抗体产生一个Fc片段和两个Fab片段。使用亲和层析在蛋白A固相进行各片段的分离。蛋白A特异性结合Fc片段以及未消化的抗体。Fc片段和未消化的抗体与蛋白A结合，而Fab可以存在于通流中。采用pH2.2的0.1M柠檬酸盐、0.15M氯化钠的洗脱步骤引起Fc片段以及未消化的抗体的释放。在Fc部分与Fab部分分离后，将每种片段的N-聚糖进行糖谱分析。基于得到的谱，相应的结构物因以下特征分类：存在或不存在岩藻糖、存在或不存在对分GlcNAc、半乳糖基化状态的分布、唾液酸化水平(N0、A1、A2)和antennarity的分布。

实施例11：旋动培养产物表征

使用蛋白A柱纯化GlycoExpressAhPM(人PankoMab)的旋动培养上清液。在洗脱后，表征纯化的抗体。纯化的抗体显示在ELISA中与生物活性抗原特异性结合(这符合本说明书)、在SDS-PAGE中的清晰条带(这表示高纯度)，并且也是高度单体性的抗体结构(97%)。关于聚糖图谱，产物显示双天线状结构物，连同高的唾液酸化和半乳糖基化值。从固定相抗体分析聚糖图谱。

为了分析不同生长阶段期间的产物质量，进行了代表3种不同生长阶段的3次不同收获。在培养大约48小时后收集首次收获物(指数期)。细胞处于指数生长(μ>0)。在处于稳定期大约140小时培养后收集第二收获物。在此时，细胞没有显著地生长(μ=0)，但是生存力高(大约95%)。在大约210后死亡期间收集第三收获物。生存力显著降低(大约80%)并且活细胞浓度下降(μ<0)。将抗体收获，使用蛋白A纯化并相对于不同生长阶段分析。结果显示重链和轻链的清晰条带。在不同生长阶段期间不存在可见到的产物降解。由此得出结论，旋动培养物提供高度单体性产物(由大小排阻层析(SEC)测定)，所述产物在抗原ELISA中特异性结合并且在SDS-PAGE中显示无杂质。还对稳定生长期分析聚糖图谱。在进一步工艺开发期间，主要目标是维持这种高产物质量。

实施例12：分批发酵

发现GlycoExpress细胞系的生长就工艺条件而言是十分稳健的，并且高度不受因搅拌引起的剪切力影响。相反，就气泡大小和气体流速而言，细胞对通气十分敏感：

12.1通气

通气对生物技术过程至关重要，因为氧供给是动物细胞必需的。然而，气泡可能产生强烈的剪切力。在T型瓶或旋转瓶中培养期间，不施加通气。在通常具有大得多的体积的发酵器中，必须供给氧或空气以防止氧限制。额外地，总体上通过添加二氧化碳进行pH控制，所述二氧化碳需要供给。因此，在生物反应器中测试了3不同种类的气体供给。实施使用GlycoExpressAhPM的平行分批发酵，以便基于例如不同的预培养物使变异最小化。使用环状鼓泡器、微量鼓泡器和膜通气进行发酵。环状鼓泡器向生物反应器供给相当大的气泡。与此相反，通过使用多孔气体可透过结构，微量鼓泡器产生小得多的气泡。环状鼓泡器和微量鼓泡器使用对流供给细胞，所述对流受进入生物反应器的功率输入影响。在较高的功率输入时，存在好得多的传质，这可以减少为维持溶解氧张力(DOT)设定值所需的气体流速。最后，膜通气根本不产生气泡，仅基于扩散供给细胞。因此，膜通气是向细胞供给气体的最慎重方法。当采用膜通气时，不存在基于剪应力的气泡。

对GlycoExpressAhPM的克隆测试全部3种不同类型的通气。就活细胞浓度、生产率和生存力方面分析平行发酵。结果显示相似的生长，对于微量鼓泡器和膜通气达到2*10⁶个细胞/ml的最大细胞密度和大约20-25μg/ml抗体浓度。膜通气导致非常高的等于95%的生存力，同时微量鼓泡器通气导致大约90%生存力。因此，使用环状鼓泡器，细胞生长至最大细胞密度0.7*10⁶细胞个/ml和产物浓度10μg/ml。尽管环状鼓泡器和微量鼓泡器生存力在发酵的中期和后期降低，但膜通气在过程期间确保极高的生存力。这表明当采用环状鼓泡器和微量鼓泡器工作时，气泡引起细胞损伤。最高损伤由环状鼓泡器气泡引起，因为生存力从92%降至74%。微量鼓泡器生存力减少至84%，而膜通气法在整个过程期间保持95%的极高生存力。

选择环状鼓泡器进一步开发。这基于在大容器发酵方面的技术性限制和GMP相关性限制。首先，膜通气是高度成本密集的，原因在于生产规模下膜面积大，例如因为GMP规定，膜管不得不在每次发酵后替换。其次，所要求的膜面积在生产规模下增加得甚至更多，这可能导致因流道阻塞所致的混合问题。关于微量鼓泡器，假设它们在生产规模下导致严重起泡问题，这可能导致需要在下游加工中难以降解的消泡试剂。因此，采用环状鼓泡器工作，增加功率输入将导致气体流速随着传质增加降低(例如舍伍德数随雷诺数增加)。

12.2恒流与互斥流

在发酵器中存在两种不同的通气模式。第一是基于细胞要求，采用恒定流速并且混合4种气体(空气、氧气、氮气和二氧化碳)。第二是不混合恒定气流，但是互斥地给予所需气体的脉冲。互斥流体系产生好得多的生长和生存力。在恒定流速，细胞随渐增流量受损更多。以流速0.01l/h、0.05l/h和0.1l/h进行的一组分批发酵显示生存力在高于每升反应器体积0.01l/h的流速时丧失。因此，选择互斥流体系，以便控制生物反应器中GlycoExpress细胞的发酵。额外地，摇袋式生物反应器体系中的发酵显示有前景的结果。使用这种类型的通气，GlycoExpress细胞生长得非常好。

总之，通气是一个十分重要的参数。已经在各种场合观察到因通气所致的细胞损伤。不得不将通气速率设定得尽可能地低，以便减少损伤。在下文中，全部发酵以互斥流气体混合替代恒流气体混合而进行。在全部开发步骤期间，限制基于气泡通气是关键。因此，优选地使用纯氧供给代替压缩空气进行发酵。

12.3功率输入

在设置通气类型后，优化中的下一个步骤是测试不同的功率输入。因发酵器中的可能剪切损伤，发酵首先以非常低的搅拌器速度50转/分钟(这等于端速0.14m/s)和功率输入9*10^-5W/kg进行，见下表2。实施通气相关的实验，使用搅拌器速度100转/分钟导致低功率输入。为了特别在高细胞密度并且还在更高的发酵器规模时保持均一性，优选较高的功率输入。还假定较高的功率输入减少通气所需气体流速，这也应当产生较少基于气泡的损伤。

使用不同的搅拌器速度，以分批模式测试功率输入。在实验的主要设定中，测试100转/分钟、200转/分钟和300转/分钟。表1显示50-400转/分钟之间不同搅拌器速度的搅拌特征(功率输入、端速、叶端剪切速率和雷诺数)。

表1：2lSartoriusB-DCU生物反应器中不同搅拌速度的搅拌特征。数据基于1l培养物体积和利用一个搅拌用3叶片叶轮。

图1中描述结果。尽管200转/分钟和300转/分钟显示最高到2.5*10⁶个细胞/ml的相似细胞密度，但是当搅拌器速度设定至100转/分钟时，细胞生长不超过1*10⁶个细胞/ml。滴度浓度在全部3个发酵中达到约25μg/ml的相似水平。尽管渐增剪切力，生存力在200转/分钟和300转/分钟最高。当使用100转/分钟时，生存力降至低于80%。稍后，对100l规模以放大方式工作时，混合再次变成紧迫的考虑。使用搅拌器速度200转/分钟和400转/分钟的发酵显示类似的结果。以400转/分钟工作时，细胞似乎生长略微较快，但是未达到高的活细胞浓度和生产率程度。然而，400转/分钟似乎适用于发酵，因为400转/分钟导致对数生长期间非常高的生存力(>90%)，表示没有剪切引起的损伤。总之，在200转/分钟和400转/分钟之间的搅拌器速度显示类似的生长。气泡以比搅拌器引起的剪切力明显更不利的方式影响生存力。将搅拌器速度300转/分钟(功率输入：0.02W/kg)设为2l实验室规模下发酵的标准搅拌速率。

12.4工艺参数的稳健性

采用环状鼓泡器和按Kg计的0.022功率输入，进行分批发酵。分析总计16个使用GlycoExpressAhPM的试验。工艺值已经按以下方式设定：pH(7.0；7.2；7.4)、DOT(20%；40%；60%)和温度(36°C，37°C，38°C)。就生长和生产率而言，在分批发酵期间在所测试的范围内改变工艺参数pH、DOT和温度没有影响。这意指不存在相对应响应而改变工艺参数的相关性。在初始细胞数目(约1.2-1.8*105细胞/ml)和最终批生产率或最大细胞密度之间不存在相关性。作为结果，也可以将接种过程视为稳健的。

除非说明，否则全部发酵均在pH7.2、DOT40%空气饱和度和温度37°C的标准条件下实施。这些条件适用于灌流工艺。

12.5生长依赖性生产

发现随着细胞在分批发酵中生长，生产率和生长彼此紧密关联，因为细胞在稳定生长期期间不生产。就其生长和生产率分析GlycoExpressAhPM的分批培养物。抗体生产强烈地依赖于细胞生长。在发酵中的稳定期期间，抗体浓度不增加。

使用细胞浓度作为影响变量并使用生产率作为响应变量，实施统计检验。使用细胞浓度和生产率之间的线性回归，找到强相关性(R²=0.994)。因此，生产量与生长关联并且细胞在稳定期期间不产生任何抗体。这导致与其中大部分产物在稳定生长期期间产生的其他生产体系(如CHO-细胞)的主要差异。这个结果对于工艺开发是十分重要。这导致优选使用灌流工艺，而非补料分批过程，因为大部分输入补料随着延长的稳定期起效用于产物积累。因此，细胞生长应当是灌流工艺开发和补料分批工艺开发的主要目的。

为进一步分析生长依赖性生产率，使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，分析对数生长期和稳定生长期中的定量性m-RNA水平。结果显示在对数生长期及和稳定生长期中恒定水平的持家基因表达(肌动蛋白和GAPDH)，连同恒定水平的重组表达的蛋白质(V_H和V_L)。这些结果提供二者均在对数生长期和稳定生长期中同等表达的证据。可以得出结论，稳定期内生产下降的原因可能是转录后的。

12.6证实分批发酵的产物质量

分批发酵在标准条件(pH7.2，DOT40%、37°C)下进行，以便分析产物质量和将该结果与旋动法产物的质量比较。通常，GlycoExpressAhPM的产物质量与旋动法产生的产物(表1中显示旋动法产物)略微不同。存在几乎不受影响的数量的多聚体，其中分批培养物中具有减少量的约2%的抗体多聚体(相比之下，旋动培养产物中是3%)。另外，生物活性ELISA在旋动发酵和分批发酵中显示高的特异性结合，并且SDS-PAGE也不受影响。糖基化图谱是与旋动培养物的聚糖图谱类似的。

12.7结论分批发酵

人髓样白血病源细胞可以在分批发酵下培养。与旋动培养法相比，分批发酵法产生略微改进的细胞密度，连同略微较高的生产率(约10%增加，数据未显示)。发酵过程可以在高度搅拌时进行，因为细胞对搅拌器引起的剪切力不敏感。另外，该方法显示针对发酵过程条件的高度稳健性，相对于宽范围的pH、DOT和温度设定点，产生良好的生长和生产率。然而，细胞对通气敏感，因此应当通过使用互斥流通气避免气泡。因此随着传质增加，施加高功率输入是有用的。为了增加生产率，如下文描述进行灌流发酵。对于灌流工艺，从分批培养取得工艺条件。

实施例13：灌流

发现伴以细胞截留的连续发酵(灌流)能够以高细胞密度发酵人髓样白血病源细胞，同时具有良好的比生产率和高度稳定的糖基化。

13.1结果

使用Centritech实验室离心机，细胞以非常高的生存力声场，并且实现高于10*10⁶个细胞/ml的细胞密度。结果(见图2)证明是高度可重复的，并且没有发现关于产物糖基化(GlycoExpressAhPM)的不均一性。各过程运行至少300小时培养时间。比生产率在每日两个生物反应器体积的灌流速率时达到最大值约100μg/(ml*d)。对于实验室规模发酵规模，平均比生产率在约70μg/(ml*d)。

表2中显示优选的灌流工艺。

参数	设定点和备注
		pH	7.2；CO2/NaOH；死区+/-0.1单位
DOT	40%空气饱和度，4种气体(N2、CO2、空气，O2)；气体混合物
		温度	37°C
灌流速率	0.5-2.5V/d
		细胞截留	Centritech,连续式离心机，泵模式
搅拌	3桨斜叶轮
		比功率输入	0.022W/m3无挡板

表2：优选的灌流工艺

13.2证实连续发酵的产物质量

如已经在分批发酵中见到，产物质量是相当稳健的。将产物进行生物化学分析。就多聚体而言，存在一部分的3%的非单体性抗体，这与分批发酵是类似的。抗原ELISA符合本说明书,因为它显示高的特异性结合。另外，在两个独立进行的灌流试验中的GlycoExpressAhPM的糖基化模式是相似的，还与旋动法/分批法产生的产物比较。

在SDS-PAGE(还原条件)中，存在抗体轻链和重链的清晰条带。重链(=50kDa)和轻链(=25kDa)显示如所预期的尺寸。

13.3灌流期间的糖基化

由于产物糖基化可能受例如培养基、机械应力或溶解氧张力的变化影响，所以在发酵期间，分析糖基化模式的形成变得十分重要。就过程稳健性而言，产物糖基化是待分析最重要参数之一。

对于在37°C、40%DOT、pH7.2，以使用GTM培养基的GlycoExpressB进行的灌流试验，分析GlycoExpress细胞系的产物糖基化。对灌流工艺第3日和第20日之间取得的样品，分析产物。尽管存在某些变异，但可以将糖基化模式视为稳定的。

得出结论，在该过程期间不存在糖基化的变异。就过程稳健性和细胞系稳健性而言，这种发酵提供了稳定的产物糖基化。GlycoExpressAhPM的灌流发酵产生高纯、有生物化学活性的产物。

13.4结论

用于GlycoExpress细胞系的灌流工艺以高密度发酵期间的高细胞生存力特征。灌流工艺以恒定产物质量和尤其以恒定糖基化模式为特征。将发酵过程控制在pH7.2；DOT40%和在37°C的温度。发酵可以用高功率输入(例如0.022W/m³)进行采用GlycoExpress细胞的发酵，因为细胞耐受高剪切力。

实施例14：不同生产方法的比较

就生物化学产物质量，全部方法(旋动法、分批法、补料分批法(数据未显示)和灌流法)均提供相似的高度单体性有生物活性的抗体。使用大小排阻层析(SEC)的分析产生一部分的2-3%的多聚体性抗体。尽管分批发酵产物和补料分批发酵产物显示约2%多聚体，但是灌流法显示约3%的多聚体，这仍可比于旋动法产物。可以在下游加工(DSP)期间容易地移出2-3%的多聚体部分，对于GlycoExpressAhPMa，使用多模态阴离子交换柱。在DSP的这个步骤期间，宿主细胞蛋白(hcp)和人血清白蛋白(HSA)也耗尽。SDS-PAGE中的额外分析显示全部过程的类似蛋白质纯度。在非还原性条件(完整抗体结构)下和在还原条件(重链和轻链分离)下分析产物。使用蛋白质印迹法证实抗体链的身份。关于生物活性，以抗原结合型ELISA分析全部样品。样品显示与糖基化MUC1-肽高度结合并且与非糖基化MUC1肽很少结合，这与全部过程的描述一致。

作为最重要的特征之一，对旋动培养物、分配培养物、补料分批培养物和灌流培养物分析抗体糖基化。糖基化模式是十分均一的。归因于糖谱分析的复杂性(还参见第4.5.4部分)，测量到+/-4%的标准偏差。因此，仅大于5%的糖基化变化视为显著。

总之，糖基化模式是十分稳健的。与低搅拌和不通气的旋动培养物相比，它不变化。另外，它似乎并不对细胞浓度或细胞生存力敏感，因为分批过程、补料分批过程和灌流过程在这些特性上差异(灌流法显示较高的细胞浓度，补料分批法显示在收获时较低的生存力)。由于分批法、补料分批法和灌流法的产物质量均高，因此当注意力放在适合GMP的工艺时，可以基于生产率和经济考虑作出生产工艺的选择。

实施例15：放大

发现从旋动培养至GMP生产工艺的上游加工放大(>1000倍)提供最高到90g的纯化抗体，而不改变产物质量和尤其不改变糖基化谱。

发酵以不同的规模进行。对于最小规模(工作容积0.6l)，使用DASGIP平行生物反应器体系。在Sartorius玻璃生物反应器(B-DCU2l，B-DCU5l)和Sartorius不锈钢反应器(C-DCU10l)中以1l和10l工作容积规模进行培养。另外，使用10lApplikon玻璃生物反应器。在100lApplikon不锈钢发酵器中实施最大规模(100l)。因此，发酵不仅以4种不同规模进行，还在3个不同公司的发酵器中进行。使用以下步骤：1:1.5:16:166，实现总放大倍数166。由于不同公司的发酵器用于发酵，所述发酵器显示关于几何特性、通气和搅拌的不同特征，因此放大变得更加重要。

15.1放大条件

当进行放大时，就剪切力而言是，细胞必须是特别稳健的。由于在2lSartorius容器中使用400转/分钟时细胞不因剪切力遭受损害，因此当细胞似乎高度耐受剪切力时，选择功率输入为放大标准。因此，在全部不同的发酵器尺寸选择比功率输入(每体积功率输入)恒定不变。一旦选择功率输入作为放大标准，选择约Pspec=0.02W/kg的比功率输入。这等于Sartorius2l发酵器中300转/分钟的搅拌器速度。这个搅拌器速度显示优异的混合和均化性能。

虽然几何相似性在正常情况下是放大的一项重要前提条件，但是成功的放大可以在进行高度多样的容器中。表6显示使用功率输入作为标准成功放大的结果。除了Applikon10l发酵器之外，全部发酵器均可以支持相似的比功率输入。应当指出两种Applikon发酵器使用最大可能的搅拌速度(转/分钟)。因此，不可能按照与其他发酵器相同的比功率输入率操作Applikon10l。

表3：所用发酵容器的几何特性。搅拌器搅拌[转/分钟]基于最常见工作容积的恒定功率输入。图注：D_i：搅拌器直径；D_t：发酵器直径；H：发酵器高度；H_t：上搅拌器距液体表面的距离；Hi：搅拌器之间的距离；H_b：距下搅拌器的距离。

由于功率输入在放大期间保持恒定(例外是Applikon10l，原因在于设计限制)，剪切力在放大期间增加。表4中显示计算的剪切力[N/m²]。计算搅拌器叶端的最大剪切力，原因是将该区域视为最高能量消散的区域。由于随反应器规模增加，细胞生长似乎不受影响并且生存力不降低，故GlycoExpressAhPM细胞抵抗至少0.9N/m²的永久搅拌器引起的剪应力。与剪切速率0.1N/m²时受损的CHO细胞[Motobu等人,1998]相比，这等于抗剪切性增加至少10倍。

表4：显示剪切和混合性能的不同发酵器的放大结果。对如表6中所示的生物反应器设置进行计算。

15.2不同规模的比较

已经使用1升、10升和100升规模发酵进行灌流发酵的放大。图3显示在37°C、pH7.2和DOT40%时控制的3个相似GlycoExpressAhPM发酵的示例性结果。采用如图3(D)中所示的相似进料策略，以灌流法进行发酵。取决于葡萄糖消耗量设定灌流速率。

在实验室规模过程和100l生产规模之间存在生长和生产率方面的几个差异。与其中实现最大细胞浓度>10*10⁶个细胞/ml的较小规模发酵(1l工作容积)相比，细胞在10l和100l灌流法中没有生长到比6*10⁶个细胞/ml更高的浓度。此后，随着规模增加存在较少的葡萄糖消耗，并且对于100l规模，保持葡萄糖浓度高于1.5g/l。在细胞通常生长到更高浓度的小规模发酵中，将葡萄糖消耗至低于1g/l的浓度。

与不同生存力和活细胞浓度相反，在全部规模存在几乎相同生产率水平。全部发酵具有>100μg/(mld)的峰生产率并且也显示十分类似的生产率曲线。

总之，这种放大提供一种能够产生大量产物的方法。产物浓度在全部规模下是相似的。最大生产率是大于100μg/(mld)。然而，存在规模增加时识别到的生存力和最大细胞浓度的显著下降。关于最大细胞浓度，离心机的细胞截留作用具有明显影响。尽管在实验室规模下大于99%，它在生产规模降低至大约90%。这导致恒定放出，所述恒定放出导致最大细胞浓度降低。

15.3大规模灌流

在Applikon100l发酵器中实施大规模灌流试验。使用灌流法，以100l工作容积运行时，使用最高至250l培养基/天。图4显示3个类似的100l灌流试验的结果，所述试验在GMP条件下进行。这些发酵是高度可重复的。已经使用建立的灌流工艺条件(见上文)进行全部发酵。全部3种发酵显示关于生产率和细胞生长的相似行为。最大细胞浓度在6*10⁶细胞/ml达到峰值并且此后显著降低。在灌流的晚期阶段，获得约3-4*10⁶个细胞/ml的细胞密度。因此，由于细胞生长与生产率密切关联，在比生产率方面也存在最大值。比生产率在约100μg/(ml*d)达到峰值。在晚期阶段期间，比生产率降至小于40μg/(ml*d)。关于生存力，发酵在生存力大于90%时开始，但是一旦开始灌流则降低至约80%。

对于全部3种发酵，糖基化模式恒定，处于测量波动范围内。

15.4结论放大

已经使用Centritech连续式离心机将放大应用于灌流过程。发酵设备提供某些限制，例如使用不同通气设置的不同生物反应器类型、不同几何特性、在搅拌(速度，搅拌器数目)方面的限制。由于证明细胞是高度抵抗剪切力的，因此使用功率输入作为放大标准。这导致随着增加发酵器尺寸，增加搅拌器引起的剪切力，但是在实验室规模中提供足够的混合作用。然而，放大产生具有恒定产物糖基化的高度有活力的高密度培养物。产物质量(通过SEC、生物测定法、糖图谱测量)总体上未因放大改变。为了产生最高到90g抗体(下游加工之前的量)，成功地实现发酵。已经通过对1l、10l和100l生物反应器的定性与定量性能评价以及通过一系列生物化学表征试验，显示过程和产物的可比性在工艺放大期间充分维持。

实施例16：培养基

使用不同的培养基将细胞悬浮培养。主要使用的培养基是：x-Vivo20(Lonza，比利时)、GTM-1(Biochrom，德国)、GTM-2(Biochrom，德国)、GTM-3(Biochrom，德国)、GTM-4(Biochrom，德国)、GTM-5(Biochrom，德国)、GTM-6(Biochrom，德国)、GTM-7(Biochrom，德国)、GTM-8(Biochrom，德国)和GTM进料培养基(Biochrom，德国)。培养基以基础培养基为基础，其已经补充有额外的养分。表6中给出GTM培养基的通用命名。

名称	备注
		GTM-1	基础粉状培养基，含有其他添加物
GTM-2	如GTM-1，渗透性因较低葡萄糖(4.5g/l)而降低
		GTM-3	研究培养基，如GTM-2，无Glc/Gln/HAS
GTM-4	低HSA培养基(0.002%)，保留如GTM-2那样的组成
		GTM-5	如GTM-2那样，基于单组分。
GTM-6	低HSA培养基(0.002%)，保留如GTM-5那样的组成
		GTM-7	基于GTM-5的无脂质培养基
GTM-8	低HSA培养基(0.002%)，保留如GTM-7那样的组成

表6：GTM培养基的概述

如上文讨论，优选地使用功率输入作为放大标准。后续等式显示用于功率输入(P)计算的基本公式，所述公式取决于搅拌器速度(N)、搅拌器直径(di)、培养基密度(p)和搅拌器常数(Ne)。

$P=N_e\mathrm{\&rho;}{N}^3{d}_i^5$

理论上，如果叶轮直径对容器直径比率(di=dt)保持恒定，则搅拌器速度在放大期间可以保持恒定。然而，在大多数情况，这因生物反应器容器尺度而是不可能的。为了使功率输入与发酵体积关联，可以计算比功率输入(Pspec)。比功率输入是常使用的放大标准。为了将它应用于某工艺，细胞必须对于随生物反应器体积(V)而增加的剪切力相当不敏感。后续等式显示比功率输入的计算。

$P_{\mathrm{spec}}=\frac{P}{V}$

端速随搅拌器直径和搅拌速度线性增加。因此，恒定端速(v_Tip)导致大容器中每分钟转速(转/分钟)下降。这直接取决于大容器中的较大搅拌器直径。可能地，不存在可能导致不良混合或甚至细胞沉降的足够功率输入。因此，在搅拌器叶端剪切速率恒定的情况下放大可能仅适用于剪切极端敏感的细胞。后续等式显示搅拌器端速的计算，其取决于搅拌器直径和搅拌器速度。

v_Tip=πd_iN

3在一个生物反应器中，最大剪切力在搅拌器的外侧产生。因此，剪切速率

应当使用以上公式在搅拌器顶端计算。剪切速率依赖于搅拌速度(N)、搅拌器直径(di)和动力粘度(v)。在这项研究中，假定动力粘度恒定，即使高细胞浓度可能使其增加。

$\mathrm{\&gamma;}=\mathrm{3,3}{\left(\frac{N{d}_i^2}{v}\right)}^{0.5}{N}^1$

使用搅拌器顶端剪切速率作为放大标准将导致随着发酵器尺寸增加而降低搅拌速度(转/分钟)。如之前提到，不良混合或甚至细胞沉降可能出现。因此，就剪切极端敏感的细胞而言，优选在搅拌器叶端剪切速率恒定的情况下放大。根据本发明使用的细胞是抗剪切的。

Claims (35)

1.一种用于培养K562细胞或由其衍生的细胞的悬液的方法，其中所述方法具有以下特征：

(a)搅拌所述悬液，从而所得到的比功率输入是至少0.005W/kg。

2.根据权利要求1的方法，其中所述方法具有一个或多个以下进一步的特征：

(b)将所述悬液以适于允许对所述悬液进行互斥流气体供给的强度搅拌，

(c)搅拌所述悬液，从而所得到的剪切力是至少0.1N/m²，

(d)在搅拌器用于搅拌的情况下，搅拌所述悬液，从而在所述搅拌器顶端所得到的剪切速率是至少300s^-1，

(e)通过互斥流向所述细胞供给至少一种气体，

(f)以每升反应器体积至多0.05l/h的流速向所述细胞供给至少一种气体，

(g)所述气体供给具有0.05vvm或更小的峰流速。

3.根据权利要求2所述的方法，其中

用于搅拌所述悬液的比功率输入是至少0.01W/kg，并且

所述气体供给由互斥气流实现。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述气体供给具有0.05vvm或更小的峰流速。

5.一种用于在K562细胞或由其衍生的细胞中重组产生目的产物的方法，其中所述细胞包含编码所述目的产物的基因，并且

其中将所述细胞根据权利要求1至4中任一项所述的方法培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其中从所述细胞培养物获得表达的目的产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中从所述细胞培养物通过从细胞培养基纯化目的产物而获得表达的目的产物。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述目的产物是糖蛋白。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中通过伴以细胞截留(灌流)的连续发酵法培养所述细胞。

10.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中将连续式离心机用于灌流。

11.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中在培养期间移出细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在培养期间通过放出法移出细胞。

13.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞密度达到至少1×10⁶个/ml。

14.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物中的细胞生存力是至少70％。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵具有至少80μg/(mld)的峰生产率。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵具有至少90μg/(mld)的峰生产率。

17.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中将搅拌器用于搅拌。

18.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中选自环状鼓泡器、微量鼓泡器和膜的装置用于通气。

19.根据权利要求18所述的方法，其中为了通气，在培养过程期间给予至少一种气体的脉冲。

20.根据权利要求18所述的方法，

其中由通气引起的气泡形成受所选择的通气方法限制，并且

其中产生的气泡具有>5mm的尺寸。

21.根据权利要求20所述的方法，其中产生的气泡具有10mm的尺寸。

22.根据权利要求18所述的方法，其中为了通气，供给纯氧。

23.根据权利要求22所述的方法，

其中测定细胞培养物中的氧值，并且

其中如果氧水平降低低于预定水平，则将氧气和/或含氧气体或气体混合物作为脉冲导入细胞培养基中。

24.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中在培养期间添加碱以维持pH处在预定的水平或pH范围。

25.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中与不包括特征(a)至(f)中任一个的相应方法对比，细胞团块的形成减少。

26.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基包含剪切保护剂。

27.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述细胞在无血清培养基中培养。

28.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述细胞培养在

6.5至8之间的pH范围；

30％至50％的pO₂；和/或

30至40℃的温度

进行。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞培养在7至7.5之间的pH范围进行。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞培养在35％至45％的pO₂进行。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞培养在37℃的温度进行。

32.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中目的糖蛋白的糖基化结构和/或所述细胞的产生速率不受培养物体积影响。

33.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中将发酵器用于具有至少1l至1000l体积的细胞培养。

34.根据权利要求33所述的方法，其中其中将发酵器用于具有10l至250l体积的细胞培养。

35.一种放大在根据前述权利要求中任一项所述的方法中所用的培养过程的方法，其中使用所述功率输入作为放大标准。