BRPI0708260A2 - célula hospedeira eucariótica, conjuntos semelhantes a corpo proteìnicos recombinantes, método para a preparação de um polipeptìdeo biologicamente ativo e vacina ou inóculo - Google Patents

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Abstract

CELULA HOSPEDEIRA EUCARIOTICA, CONJUNTOS SEMELHANTES A CORPOS PROTEINICOS RECOMBINM4TES, METODO PARA A PREPARAçAO DE UM POLIPEPTIDEO BIOLOGICAMENTE ATIVO E VACINA OU INOCULO. Expõe-se uma proteína de fusão que é expressa em um conjunto semelhante a corpo proteinico recombinante (RPBLA) em organismos e células hospedeiras eucaríóticas. Mais particularmente, um polipeptidio biologicamente ativo fundido a uma seqüência de proteínas que promovem a mediação da indução de formação de RPBLA é expressa e acumulada em células hospedeiras depois da transformação com um vetor apropriado. A célula hospedeira eucariótica não produz corpos de proteínas na ausência da proteína de fusão. Expõem-se igualmente métodos para a preparação e utilização de RPBLAs e a proteína de fusão, da mesma maneira que o são as moléculas de ácido nucléico que codificam as proteínas de fusão.

Description

CÉLULA. HOSPEDEIRA EUCARIÓTICA, CONJUNTOS SEMELHANTES ACORPOS PROTEÍNICOS RECOMBINANTES, MÉTODO PARA APREPARAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO BIOLOGICAMENTE ATIVO EVACINA OU INÓCULO
Referência Remissiva a Pedido Relacionado
O presente pedido reivindica o beneficiodo pedido provisório No. de série 60/776.391 que foidepositado em 23 de fevereiro de 2006.
Campo técnico
A presente invenção relaciona-se com aprodução de peptidios e proteínas recombinantes biolo-gicamente ativas, coletivamente chamados de polipeptí-dios, em organismos e células eucarióticas como siste-mas hospedeiros. Mais particularmente, um polipeptídiobiologicamente ativo é fundido a uma seqüência indutorade proteína corpórea (PBIS) que promove a mediação daindução de conjuntos semelhantes a corpo proteínico re-combinante (RPBLA) para formar uma proteína de fusãoque é expressa e acumulada de forma estável no sistemahospedeiro como um RPBLA depois de transformação dascélulas hospedeiras com um vetor apropriado.
Técnica Antecedente
A produção de proteínas recombinantes parausos terapêuticos, nutracêuticos ou industriais usufru-iu de grande êxito na última década anterior. A intro-dução de genes heterólogos dotados de uma seqüência denucleotídeos desejada conduz à expressão de um polipep-tídio ou proteína que tem a correspondente seqüência deaminoácidos ou estrutura principal desejada. Em muitoscasos, entretanto, a proteína ou polipeptídio expressoteve a seqüência de resíduo de aminoácido do materialproduzido naturalmente, mas foi deficiente na atividadebiológica desse material.
A atividade biológica, dada a estruturaprincipal apropriada do produto expressado, pode seruma função do produto que tem o hidrogênio interno edobradura apropriados, Van der Waals, aglutinação iôni-ca e de bissulfureto, e tem também modificação pós-translação apropriada, tal como, por exemplo, glicoli-sação. Por exemplo, a formação de aglutinação de bis-sulfureto ocorre espontaneamente no lúmen do retículoendoplásmico (ER), mas não no citosol de procariotos, oque torna as células bacterianas tais como as célulasE. coli hospedeiras deficientes para a síntese das pro-teínas de mamífero corretamente dobradas que são nor-malmente estabilizadas por aglutinações de bissulfure-to. A formação de aglutinação de bissulfureto pode o-correr no espaço periplásmico de E. coli onde proteínassemelhantes a PDI são funcionais (Fernandez, et al.,2001. Mol. Microbiol. Apr 40(2) :332-346) , entretanto osistema oxi-redox não é muito eficiente.
Um caso particular ilustrativo refere-se àeritropoietina (EPO), uma proteína que estimula a pro-dução das células vermelhas do sangue. EPO recombinan-te encontra-se exposto na patente US No. 4.703.008 con-cedida a Lin. A patente expõe atividades para a prote-ina EPO expressa a partir de E. coli, S. cerevisiae, eovário de hamster mamífero chinês (CHO) e células derim de macaco cercopiteco africano (COS-I). Muito em-bora imuno-reagidos anti-soros anti-EPO com EPO expres-so por cada tipo de célula, somente as proteínas ex-pressas a partir de células de mamíferos exibiram ati-vidade biológica substancial in vivo como EPO, e con-centrações semelhantes por ensaio anticorpo, por meiode ensaios in vitro e in vivo. A proteína expressa pormamíferos é aquela que é utilizada para tratar os sereshumanos.
Acredita-se que essas diferenças na ativi-dade biológica foram uma função da glicosilação em queE. coli, um procariote, não pode glicosilar suas prote-ínas expressas. As células de levedura são eucariotes,mas o seu padrão de glicosilação para proteínas secre-tadas é diferente daquelas de um mamífero. Por outrolado, as células CHO e COS-I usadas para proporcionaremproteína de atividade biológica substancial foram demamífero e a proteína expressa a partir das mesmas foide utilidade. Estudos publicados de EPO glicosilado enão glicosilado indicam que a glicosilação desempenhauma função da maior importância na estabilização de e-ritropoietina para condições de desnaturação. Narhi etal., (1991) J. Biol. Chem. 266(34):23022-23026. Alémdisso, foi reportado que o tempo de vida in vivo e aatividade de EPO podem ser relacionados com a glicosi-lação da molécula.Conseqüentemente, as células eucarióticassão enormemente preferidas para a produção recombinantede proteínas terapêuticas, industriais e outras proteí-nas de utilidade de origem eucariótica. Foi demonstra-do que diferentes organismos e células eucarióticas sãocapazes de produzir terapêutica baseada em proteína a-tive. Infelizmente, os altos custos freqüentemente de-rivados dos baixos níveis de produção de proteína re-combinante e/ou a partir dos procedimentos de isolamen-to e purificação de proteína, podem invalidar a sua a-plicação industrial. Pesquisa ativa é realizada com afinalidade de aperfeiçoar tanto os níveis de produção,quanto os procedimentos de purificação por meio de di-ferentes abordagens.
Uma maneira de se aperfeiçoar a eficiênciado isolamento da proteína recombinante é por meio deconcentração intracelular. Uma destas abordagens com-preende a agregação aleatória de proteínas recombinan-tes em corpos de inclusão não segregados que podem serseparados em relação às células submetidas a lisado pormeio de técnicas de purificação baseadas em densidade.Os corpos de inclusão são depósitos de proteínas amor-fos encontrados nas bactérias. Estudos de caracteriza-ção estrutural mostraram que a natureza insolúvel doscorpos de inclusão pode ser devida às interações inter-moleculares hidrófobas de proteínas dobradas não-nativas (Seshadri et al., 1999, Methods Enzymol.309:559-576). A estratégia geral usada para recuperarproteínas ativas a partir dos corpos de inclusão requera solubilização da proteína para romper os agregadosaleatórios, seguida por uma ou mais etapas de redobra-mento químico. Isto constitui um problema importante aser solucionado, porque a eficiência de re-naturaçãodas proteínas desnaturadas pode ser limitada, a maiorparte das vezes se a proteína contiver ligações de bis-sulfureto, Ed., Apr. 2001 Curr. Opin. Biotechnol.12 (2) : 202-207) .
Com maior particularidade, desnaturantesfortes, tais como alta concentração de agentes caotró-picos (isto é, uréia e cloridrato de guanidínio) sãousados para solubilizar proteínas não dobradas que seacumulam nos agregados. Os agentes de desnaturação sãodepois disso removidos por diálise numa tentativa deredobrar a proteína em uma conformação natural. A ati-vidade biológica destas proteínas redobradas é usual-mente muito menor do que a proteína formada nativa.
Os corpos de proteína (PBs) são estruturasque se apresentam naturalmente em certas sementes deplantas que foram desenvolvidas para proteínas de arma-zenamento concentradas intracelularmente em células eu-carióticas ao mesmo tempo em que retêm dobramento e a-tividade biológica corretos. Os corpos de proteínas(PBs) compartilham de algumas das características doscorpos de inclusão a partir das bactérias. Eles sãodensos, e contêm uma alta quantidade de proteínas agre-gadas que são estreitamente compactadas por interaçõeshidrófobas [Momany et al., 2006 J Agric. Food Chem. Jan25;54 (2):543-547 e Garrat, et al,. 1993 ProteínasJan;15(1):88-99]. Além disso, a presença de uma grandequantidade de aglutinações de bissulfureto em algumasdas PBIS, tal como, por exemplo, RX3, [Ludevid, et al.,1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234 e Kawagoe et al., 2005Plant Cell Apr 17(4):1141-1153], que estão provavelmen-te envolvidas na formação de PB e estabilização, pode-rão representar uma dificuldade adicional para produziruma proteína nativa-dobrada, biologicamente ativa, comparticularidade uma proteína que contém resíduos decisteína.
A observação da atividade biológica sem anecessidade de redobramento e renaturação de uma amplavariedade de proteínas produzidas em PBs sintéticashospedeiras eucarióticas não-levedura foi, portanto,inesperada.
Uma nova tecnologia baseada na fusão de umdomínio de proteína de armazenamento de semente deplanta com a proteína de interesse (WO 2004/003207) foidesenvolvida para aumentar a estabilidade e acúmulo deproteínas recombinantes em plantas mais altas. Estasproteínas de armazenamento são específicas para semen-tes de plantas em que elas se acumulam de uma forma es-tável nos corpos de proteínas (Galili et al., 1993,Trends Cell Biol 3:437-442).
As proteínas de armazenamento são inseri-das no lúmen do retículo endoplásmico (ER) por meio deum peptidio de sinal e são montadas seja nas organelasespecíficas de desenvolvimento de reticulo endoplásmicochamados corpos de proteínas derivados de ER (ER-PBs)ou em vacúolos de armazenamento de proteína (PSV) (Oki-ta et al., 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol.47:327-350; Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613;Sanderfoot et al., 1999 Plant Cell 11:629-642). Asproteínas de armazenamento recombinantes de comprimentopleno também foram descritas para montagem em organelassemelhantes a PB em sistemas hospedeiros de não plantascomo oocitos Xenopus.
A expressão de prolaminas de cereais (asproteínas de armazenamento de cereais mais abundantes)foi descrita em oocitos Xenopus depois de injeção dascorrespondentes mRNAs. Este sistema foi usado como ummodelo para estudar as propriedades de objetivação des-tas proteínas de armazenamento (Simon et al., 1990,Plant Cell 2:941-950; Altschuler et al., 1993, PlantCell 5:443-450; Torrent et al., 1994, Planta 192:512-518) e para testar a possibilidade de modificar a 19kDa α-zeína, uma prolamina de milho, pela introduçãodos aminoácidos de lisina e triptofan essenciais na suaseqüência, sem alterar a sua estabilidade (Wallace etal, 1988, Science 240:662-664).
Zeínas, o grupo complexo de prolaminas demilho, também foram produzidos em levedura com váriosobjetivos. Coraggio et al., 1988, Eur J Cell Biol47:165-172, expressaram α-zeínas nativas e modificadasem levedura para estudar determinantes de objetivaçãodesta proteína. Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672, estudaram as possíveis interações de α-ΙΧΠβ-ΙΧΟγ-□□e δ-zeína que conduzem à formação do corpo de proteí-na. Para tratar desta questão, eles transformaram cé-lulas de levedura transformadas com cDNAs codificandoestas proteínas. Além disso, esses autores construíramproteínas de fusão zeína-GFP para determinar a locali-zação subcelular de proteínas de zeína nas células delevedura, mas não observaram a formação de estruturasconcentradas, densas, características de bona fide PBs.É digno de nota que Kim et al., 2002, Plant Cell 14:655-672, concluíram que a levedura não é um bom modelopara estudar interações de zeína, porque as zeínas, porelas mesmas, foram deficientemente acumuladas na leve-dura transformado. As células de levedura também foramusadas como um modelo para estudar os mecanismos quecontrolam o transporte e deposição de corpo de proteínadas proteínas de armazenamento de trigo chamadas glia-dinas (Rosenberg et al., 1993, Plant Physiol 102:61-69).
A atividade biológica é particularmente rele-vante para vacinas que devem induzir uma imuno-respostacorreta em um ser humano ou outro animal imunizado.Diversas vacinas novas são compostas de imunogens (an-tígenos) sintéticos, recombinantes, ou subunidades al-tamente purificadas, que são consideradas como sendomais seguras do que as vacinas plenamente desativadasou de vida atenuada. Entretanto, a ausência de compo-nentes imunomoduladores de auxilio associados com vaci-nas atenuadas ou neutralizadas freqüentemente resultaem imunogenicidade mais fraca para essas vacinas.
Os adjuvantes imunológicos são agentes queaumentam as respostas imuno especificas às vacinas. Umadjuvante imunológico pode ser definido como qualquersubstância ou formulação que, quando incorporada em umavacina, opera de uma maneira geral para acelerar, pro-longar, ou aumentar a qualidade das imuno-respostas es-pecificas aos antigenos de vacinas. A palavra adjuvan-te é derivada do verbo do latim adjuvare, que significaajudar ou auxiliar. Mecanismos de ação adjuvantes in-cluem os seguintes: (1) aumentar a semi-vida biológicaou imunológica de imunogenes de vacina; (2) aperfeiçoara distribuição de antigenos às células de apresentaçãode antigenos (APCs), bem como processamento de antigenoe apresentação pelos APCs; e (3) induzir a produção decitoquinas imunomoduladoras.
A fagocitose envolve a entrada de grandespartículas, tais como células apoptóticas, ou micróbiosindivisos. A capacidade das células engolirem grandespartículas similarmente pareceu como uma função nutri-cional em organismos unicelulares; entretanto, organis-mos complexos têm tirado vantagem do mecanismo fagocí-tico para preencher funções adicionais. Por exemplo, afagocitose de antigenos assegurada pelos macrófagos, ascélulas B ou as células dendríticas representam um pro-cesso chave na imunidade inata e adaptativa. Natural-mente, a fagacitose e subseqüente neutralização dos mi-cróbios nos fagossomos formam a base de uma defesa ina-ta do organismo contra os agentes patogênicos intrace-lulares. Além disso, a degradação de agentes patogêni-cos no lúmen de fagossomo e a produção de peptidios an-tigênicos, que são apresentados por células fagociticaspara ativar linfócitos específicos, também vinculam afagacitose a imunidade adaptável (Jutras et al., 2005Annual Review in Cell Development Biology. 21:511-27).
As proteínas presentes nas partículas en-golfadas encontram um arranjo de proteases degradantesnos fagossomos. Mais, este ambiente destrutivo gerapeptidios que são capazes de aglutinação às moléculasde classe II MHC. Complexos de classe II antígenos-MHCrecém formados são distribuídos à superfície da célulapara apresentação às células CD4+ T (Boes et al,. 2002.Nature 418:983-988). A ativação destas células induz osubconjunto Th2 de citoquinas, tais como IL-4 e IL-5que ajudam as células B a proliferar e diferenciar-se,e encontra-se associada com a resposta imune do tipohumoral.
Uma grande parte de evidência indica que,adicionalmente ao claro envolvimento do caminho declasse II MHC na resposta imune contra agentes patogê-nicos fagocitosados, antígenos provenientes de agentespatogênicos, incluindo microbactérias, Salmonella, Bru-cella, e Leishmania, podem fazer surgir uma apresenta-ção transversa de antígenos. Isto quer dizer, a apre-sentação de antígeno engolfado por fagocitose pela res-posta dependente de MHC classe I promove a proliferaçãode células T citotóxicas CD8+ (Ackerman et al., 2004Nature Immunology 5(7):678-684 Kaufmann et al., 2005Current Opinions in Immunology 17 (1):79-87).
As células dendríticas desempenham umafunção de apresentação de antígeno central para induziro sistema imune (Blander et al., Nature Immunology 200610:1029-1035). Muito embora raras, as células dendrí-ticas são as APC mais altamente especializadas, com ca-pacidade tanto de instigar quanto regular a reatividadeimune (Lau et al. 2003 Gut 52:307-314). Muito emboraas células dendríticas sejam importantes na apresenta-ção de antígenos, particularmente para iniciar respos-tas imune primárias, os macrófagos são o tipo de APCmais importante nos locais inflamatórios e especializa-dos para desobstruir material necrótico e apoptótico.Os macrófagos podem agir não somente como APCs, mastambém podem desempenhar funções pró- ou antiinflamató-rias, na dependência dos meios pelos quais eles são a-tivados.
Considerando-se que a APC desempenha umafunção central na indução e regulagem da imunidade a-daptativa (humoral e celular), o reconhecimento e fago-citose do antígeno por aquelas células pode ser consi-derada uma etapa indispensável no processo de imuniza-ção. Uma ampla variedade de técnicas baseadas na apre-ensão de partículas fluorescentes foi desenvolvida paraestudar fagocitose pelos macrófagos (Vergne et al, .1998 Analytical Biochemistry 255:127-132).
Um aspecto importante nas vacinas veteri-nárias é a diversidade genética da espécie que estásendo considerada e do requisito para sistemas genéri-cos que operam através de diferentes espécies. Em umamplo grau, esta diversidade limita o uso de técnicasde objetivação molecular para marcadores de superfíciee moduladores de imune em células, tais como citoqui-nas, porque para muitas espécies, incluindo as silves-tres, somente se dispõe de conhecimento mínimo destasmoléculas. Desta forma, deve ser dada preferência aosadjuvantes que se baseiam em sinais de ativação univer-sais da resposta imune inata (isto é, que são idênticasem diferentes espécies). Levando-se estes requisitosem consideração, sistemas de distribuição de vacinasparticulados são plenamente adequados para estratégiasde vacinas veterinárias e de vida silvestre (Scheer-linck et al. , 2004 Methods 40:118-124).
Tal como se encontra discutido em maioresdetalhes mais adiante, a presente invenção expõe que aexpressão de uma proteína de fusão compreendida de (i)a seqüência de proteínas que media a indução de conjun-tos semelhantes a corpo proteínico recombinante (RP-BLAs) associado a (ii) um polipeptídio biologicamenteativo (proteína de interesse ou visada) induz o acúmulodesses RPBLAs em células de organismos eucarióticos,tais como plantas, fungos, algas e animais, produzindoum objetivo biologicamente ativo (proteína).
Sumário Breve da Invenção
A presente invenção proporciona um sistemae método para produzir uma proteína de fusão que contéma seqüência indutora de proteína corpórea (PBIS) e umpeptídio ou proteína biologicamente ativo (freqüente-mente referido coletivamente neste contexto de um poli-peptídio ou objetivo) de interesse em células eucarió-ticas. As proteínas de fusão que contêm o polipeptídiode interesse acumulam de forma estável os conjuntos se-melhantes a corpo proteínico recombinante (RPBLAs) nascélulas eucarióticas, que podem ser células de planta,animal, fungo ou alga.
As células de plantas mais altas são célu-las hospedeiras eucarióticas preferidas em algumas con-cretizações, enquanto que células de plantas mais bai-xas, tais como algas, são preferidas em outras concre-tizações, com as células de animais tais como mamíferose insetos sendo células hospedeiras eucarióticas prefe-ridas em outras concretizações, e com os fungos sendoainda as células hospedeiras eucarióticas preferidas emoutras concretizações. A proteína de fusão pode serexpressa constitutivamente ou preferencialmente em cé-lulas particulares em eucariotes multicelulares. AsPBISs são capazes de mediar a indução de formação deRPBLA e entrada e/ou acúmulo de proteína de fusão nes-tas organelas, com dobramento e/ou modificações pós-translação apropriados, tais como glicosilação e forma-ção de ligação de bissulfureto basal para proporcionaratividade biológica para o peptidio ou proteína de in-teresse (objetivos) expressos.
Desta forma, uma célula hospedeira eucari-ótica que contém uma proteína recombinante de fusão bi-ologicamente ativa dentro de conjuntos semelhantes acorpo proteínico recombinante (RPBLAs) é consideradacomo um aspecto da presente invenção. A proteína defusão contém duas seqüências ligadas entre si em queuma seqüência é uma seqüência indutora de proteína cor-pórea (PBIS) e a outra é a seqüência de pelo menos 20resíduos de aminoácidos de um polipeptídio biologica-mente ativo. O polipeptídio biologicamente ativo, talcomo encontrado na natureza, pode ser heterólogo paraas células hospedeiras eucarióticas mencionadas e édeste modo expresso em um segundo tipo de célula que édiferente da células hospedeira eucariótica primeiromencionada, ou é produzida sinteticamente. Adicional-mente, a célula hospedeira eucariótica não produz PBsna ausência da proteína de fusão. Desta forma, é a ex-pressão da proteína de fusão e a PBIS que faz com que acélula hospedeira forme conjuntos semelhantes a corposde proteína ou RPBLAs.
Em uma concretização particular, a seqüên-cia de ácido nucléico usada para transformação compre-ende (i) uma seqüência de ácido nucléico que codificauma PBIS, e (ii) uma seqüência de ácido nucléico quecompreende a seqüência de nucleotideos que codifica umproduto de interesse. Em uma concretização, a extremi-dade 3' da seqüência de ácido nucléico (i) é ligada àextremidade 5' da referida seqüência de ácido nucléico(ii). Em outra concretização, a extremidade 5' da se-qüência de ácido nucléico (i) é ligada à extremidade 3'da seqüência de ácido nucléico (ii). Desta forma, aseqüência de PBIS pode estar no término-N ou no térmi-no-C da proteína de fusão. Deverá ser compreendido quetodas as ligações de DNA discutidas neste contexto Paraa expressão de uma proteína de fusão são tais que osdois componentes da proteína de fusão são expressos noquadro.
O polipeptídio biologicamente ativo daproteína de fusão exibe pelo menos 25 por cento, prefe-rentemente pelo menos 50 por cento, com maior preferên-cia 75 por cento, e ainda com maior preferência pelomenos 90 por cento da atividade biológica do mesmo po-lipeptídio isolado em relação ao segundo tipo de célulaanterior em um ensaio da atividade desse polipeptídio.
Em uma outra concretização particular, aseqüência de ácido nucléico usada para a transformaçãocompreende, adicionalmente às seqüências de ácido nu-cléico (i) e (ii) mencionadas anteriormente, uma se-qüência de ácido nucléico que compreende a seqüênciade nucleotideos que codifica uma seqüência de aminoáci-dos de ligante ou espaçador. A seqüência de aminoáci-dos espaçadores pode ser uma seqüência de aminoácidoscliváveis, ou não cliváveis, por meios enzimáticos ouautoproteoliticos ou químicos. Em uma concretizaçãoparticular, a seqüência de ácidos nucléicos (iii) é co-locada entre a seqüência de ácidos nucléicos (i) e (i-i) , por exemplo, a extremidade 3' da seqüência de áci-dos nucléicos (iii) é ligada à extremidade 5' da ditaseqüência de ácidos nucléicos (ii). Em uma outra con-cretização, a extremidade 5' da dita seqüência de áci-dos nucléicos (iii) é ligada à extremidade 3' da se-qüência de ácidos nucléicos (ii) .
Da mesma maneira, em uma concretizaçãoparticular, a seqüência de ácidos nucléicos usada parapropósitos de transformação codifica uma seqüência deacordo com o pedido de patente WO 2004/003207, em que aseqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência deaminoácido que é especificamente suscetível de ser cli-vada por meios enzimáticos ou químicos está presente ouausente. De acordo com uma outra concretização, asproteínas de fusão podem ser uma fusão direta entre aPBIS e o peptídio ou proteína de interesse.
Em uma outra concretização, o método dainvenção compreende ainda o isolamento e purificação daproteína de fusão biologicamente ativa.
Segundo outra concretização, o método dainvenção compreende, outrossim, o isolamento e purifi-cação da proteína de fusão, e obtenção de uma proteínade fusão biologicamente ativa. Desta forma, onde aproteína de fusão está hermeticamente montada e encer-rada dentro de uma membrana, pode ser difícil ilustrarque o polipeptídio é biologicamente ativo. Como umaconseqüência, a atividade biológica pode ser ensaiadadepois da remoção da membrana, e se for requerida, asolubilização da proteína de fusão. Considera-se, por-tanto, um método para a preparação de um polipeptídiobiologicamente ativo.
Neste método, são proporcionados conjuntossemelhantes a corpos proteínicos recombinantes (RPBLAs)que compreendem uma proteína de fusão encerrada em mem-brana. Os RPBLAs encontram-se usualmente presentes emuma forma de uma maneira geral esférica que tem um diâ-metro de cerca de 0,5 até cerca de 3 micrômetros (μ),mas em alguns casos são de forma amorfa e podem variaramplamente nas dimensões, mas são ainda derivados deER. A proteína de fusão contém duas seqüências ligadasem conjunto, em que uma seqüência é uma seqüência indu-tora de proteína corpórea (PBIS) e a outra é um poli-peptídio biologicamente ativo. Os RPBLAs são contacta-dos com um amortecedor aquoso que contém uma quantidadedesmontadora de membrana de um detergente (agente ten-soativo). Esse contacto é mantido durante um períodode tempo suficiente para desmontar a membrana e a umatemperatura que não desnatura o polipeptídio biologica-mente ativo para separar a membrana e a proteína de fu-são. Depois disso, a proteína de fusão separada é co-letada de uma maneira usual, ou pode ainda agir sem sercoletada.
Em algumas concretizações, a proteína defusão separada exibe a atividade biológica do polipep-tídio biologicamente ativo. Em outras concretizações,a atividade biológica do polipeptídio is exibida depoisda proteína de fusão ser dissolvida ou dispersada em umamortecedor apropriado. Ainda de acordo com outrasconcretizações, a proteína de fusão tem de ser clivadaem suas partes constituintes antes de ser exibida a a-tividade biológica do polipeptídio. Desta forma, o po-lipeptídio biologicamente ativo pode ser ligado ao PBISpor uma seqüência de aminoácidos espaçadora que é sus-cetível de ser clivada por meios enzimáticos ou quími-cos. Então, quando da clivagem, o polipeptídio biolo-gicamente ativo exibe atividade biológica quando cliva-do a partir do PBIS da proteína de fusão. De acordocom algumas concretizações, a proteína de fusão retém asua atividade mesmo quando ainda se encontra incorpora-da no RPBLA intacto.
De acordo com outra concretização, o poli-peptídio biologicamente ativo contém pelo menos duasseqüências de glicosilação ligadas por N.
Ainda de acordo com outra concretizaçãopreferida, o polipeptídio de interesse é fundido a umaproteína de armazenamento natural ou modificada, talcomo por exemplo, prolaminas ou domínios de prolaminasnaturais ou modificadas.
Em outra concretização, os RPBLAs que con-têm o polipeptidio biologicamente ativo são usados comoum sistema de distribuição para o polipeptidio biologi-camente ativo. Os benefícios desta invenção poderãoser aplicados na distribuição de medicamentos, vacinase nutrição.
Segundo ainda outra concretização, os RP-BLAs que contêm um antigeno de polipeptidio podem serusados como um sistema de distribuição para proporcio-nar adjuvanticidade (aumento na resposta imune). A ad-ministração destes RPBLAs pode representar um aperfei-çoamento nos parâmetros de imunização, tais como a ve-locidade, quantidade, qualidade e duração da imuniza-ção. O efeito benéfico de administrar antigenos em RP-BLAs pode ser conseguido porque (i) o antigeno é encap-sulado e permanece mais tempo no sangue ou no tratogastrointestinal (efeito de liberação lenta) e/ou (ii)o antigeno é mais bem exposto ao sistema imune (RPBLAscomo um veiculo de apresentação de antigeno) e/ou (iii)a presença de moléculas adjuvantes nos preparados RP-BLAs, e/ou (iv) os RPBLAs são carreadores capazes decruzar membranas que por si mesmos proporcionam adju-vanticidade, e/ou outros.
Desta forma, outro aspecto da invenção écompreendido por uma vacina ou inóculo (composição imu-nogênica) que compreende uma quantidade imunogênica e-fetiva de RPBLAs que contém biologicamente ativo é pro-teína recombinante de fusão dissolvida ou dispersada emum diluente farmaceuticamente aceitável. A proteína defusão recombinante contém duas seqüências ligadas emconjunto em que uma seqüência é um PBIS e a outra é umpolipeptidio biologicamente ativo ao qual deverá serinduzida uma resposta imunológica pela dita vacina ouinóculo. A composição diluente farmaceuticamente acei-tável tipicamente também contém água. Em uma outraconcretização, um RPBLA que não incorpora um antigenomas que possui propriedades de adjuvante ativo é co-distribuido com um antigeno isolado para induzir umaresposta imunológica.
Em uma outra concretização, a PBIS podeser usada como um carreador para cruzar membranas. Emuma concretização especifica a PBIS é ZERA (RX3) ou umfragmento do mesmo.
A presente invenção tem diversos benefí-cios e vantagens.
Um benefício é que o uso da invenção pos-sibilita uma expressão relativamente simples e rápidade uma proteína biologicamente ativa recombinante dese-jada em uma célula eucariótica de escolha.
Uma vantagem da invenção é a de que elaproporciona uma fonte de proteína biologicamente ativarecombinante facilmente obtenível e purificável devidoàs propriedades únicas da expressão em.
Um outro benefício da invenção é que osRPBLAs que contém proteína de fusão podem ser usadospara distribuição de vacinas, incluindo vacina de dis-tribuição oral.Outra vantagem da presente invenção é a deque os RPBLAs que contêm proteína de fusão podem serusados da mesma forma que em um imunógeno em uma vacinainjetável.
Outra vantagem da presente invenção é queos RPBLAs podem ser usados como isoladores, estruturasde ligação de membrana que isolam o polipeptídio ex-presso em relação ao restante dos componentes de célu-la. Estes isoladores protegem a célula em relação àatividade de polipeptídio, e o polipeptídio em relaçãoà célula, aumentando a taxa de acúmulo. Desta forma,polipeptídios difíceis biologicamente ativos que sãotóxicos e/ou instáveis poderão ser expressos eficiente-mente.
Ainda outros benefícios e vantagens serãoevidentes para aquele versado na técnica a partir daexposição que se segue.
Breve Descrição dos Desenhos
Nos desenhos que constituem uma parte des-ta exposição:
A Figura 1, Painel A é a representação es-quemática das construções usadas para os estudos detransfecção de células CHO. A construção pECFP-Nl cor-responde ao controle que expressa a ECFP no citosol.
As PRX3-ECFP e pRX3-Gx5-ECFP são as construções que ex-pressam a proteína de fusão RX3-ECFP, na ausência oupresença de um espaçador formado por cinco aminoácidosde glicina (Gx5), respectivamente. A p22aZ-ECFP é acodificação de construções para a alfa zeina de milho(22KDa) fundida à ECFP. No fundo, os vetores baseadosem pcDNA3.1(-) (Invitrogen) estão representados junta-mente com várias construções discutidas mais adiante.
O Painel B mostra a representação esquemática de veto-res binários para transformação de plantas (superior) eos vetores baculovirus para infecção por insetos (infe-rior) . "RX3" = seqüência de gama-zeina rica em prolinaN-terminal; "(Gly)x5" = espaçador formado por cincoglicinas; "ECFP" = gene de proteína fluorescente cianoaumentado; "Pcmv" = promotor citomegalovírus humano; "P-PH" = promotor de poliedrina; "Psv4o" = promotor SV40 i-nicial; "CaMV35S x2" = Promotor de vírus mosaico cauli-flor duplo; "PCbhi" = promotor de celulase principal;"t35S" = Terminador de vírus mosaico cauliflor; "TEV" =Intensificador de translação do vírus causticador detabaco; "SV40 ter" = terminador de SV40; "HSV ter" =sinal de poliadenilação de quinase timidina de vírussimplex de herpes; "cbhl ter" = sinal de poliadenilaçãode celulase principal; "Kana/Neo" = gene de resistênciacanamicina/neomicina; "Amp R" = gene de resistência deampicilina; "Gentamicina" = Gene de resistência de gen-tamicina; "SPcbhi" = peptídio de sinal de celulase prin-cipal; "Ori fl" = origem de DNA de fiada individualfl; "Ori pUC" = origem de replicação de plasmídio; "BGHter" = Terminador de hormônio de crescimento bovino; "PBLA" = promotor de gene de lactamase beta; "GFP" = Pro-teína fluorescentese verde; "DsRED" = Proteína flúores-centese vermelha Dicosoma; "hGH" = hormônio de cresci-mento humano; "EGF" = fator de crescimento epidérmicohumano; "EK" = enteroquinase bovina; "GUS" = Glucuroni-dase; "RTB" = Subunidade de lecitina de ricino (Ricinuscomunis); "Casp2" = Caspase Humano 2; "Casp3" = CaspaseHumano 3; "Int" = inteina DNAb Ssp proveniente dos NewEngland Biolabs; "mlnt" = versão mudada de inteina DNAbSsp (Aspl54 -> Ala substituição).
A Figura 2 mostra imunomanchas provenien-tes de estudos de fracionamento subcelular de célulasCHO transfectadas com plasmidios pRX3-ECFP, pRX3-G-ECFPe pECFP-Nl como um controle (Painel A); p3.l-RX3-hGH,p3.1-RX3, p3.1-RX3-EK, p3.1-RX3-C3, p3.1-RX3-C2, p3.1-RX3-GUS e p3.l-RX3-I-hGH (Painel B) . No painel B tam-bém estão ilustradas as imunomanchas provenientes deestudos de fracionamento subcelular de plantas de taba-co agroinfiltradas com pB-RX3-RTB. O Painel C corres-ponde aos estudos de fracionamento subcelular de larvasde insetos infectadas com pF-RX3-DsRED e pF-DsRED comoum controle. Homogenados de células transfectadas fo-ram carregadas na etapa de gradientes de sacarina, edepois de centrifugação o acúmulo das proteínas de fu-são correspondentes no sobrenadante, interfase e fra-ções de pílulas foram analisadas por imunomanchas. Ospesos moleculares e o anticorpo usado na imunomanchaestão indicados à direita. H, homogenado carregado nogradiente de densidade; S, sobrenadante; Fx, interfasesuperior do amortecimento de sacarina X% p/p; P, pílulasob amortecimento de sacarina a 56%.
A Figura 3 é uma fotografia de microscopiaconfocal em seis painéis, mostrando a localização dasproteinas de fusão RX3-ECFP (painel A) , RX3-Gx5-ECFP(painel Β) , 22aZ-ECFP (painel D), RX3-GFP (painel E) eRX3-DsRED (painel F) nas RPBLAs dentro de células CHOtransfectadas. Algumas das estruturas RPBLA que contêmas proteinas de fusão ativas (fluorescentes) são indi-cadas por setas. A localização das ECFP no citosol e onúcleo (painel C) nas células CHO transfectadas porpECFP-Nl estão ilustrados como um controle. "N" = nú-cleo.
A Figura 4 é uma fotografia de microscopiaconfocal em quatro painéis, mostrando a localização dasproteinas de fusão RX3 fluorescentes em hospedeiros di-ferentes. No painel A estão ilustradas as seções ópti-cas confocais do tecido de folha epidérmica de plantasde tabaco co-agroinfiltradas com pB-RX3-GFP e uma codi-ficação de vetor binário para HcPRO, um supressor desilenciamento de gene. Pode ser observada uma quanti-dade de RPBLAs fluorescentes que contêm a proteína defusão RX3-GFP ativa. À direita, no Painel B, a fusãoda fluorescência de RX3-GFP e a fase de contraste mos-tra a alta percentagem de células transfectadas transi-toriamente. A transfecção de seções ópticas de célulasde inseto SF9 infectadas com pF-RX3-DsRED está ilustra-da no Painel C. Seções ópticas de um micrômetro de te-cido oleoso proveniente de larvas de inseto infectadascom pF-RX3-DsRED estão ilustradas no Painel D. Algumasdas estruturas de RPBLA que contêm as proteínas de fu-são ativas (fluorescentes) estão indicadas por meio dassetas.
A Figura 5 é uma fotografia em seis painéis(A-F) mostrando a localização de proteínas de fusão RX3dentro de RPBLAs nas células CHO, quatro dias depois dasua transfecção. Utilizou-se microscopia óptica paramostrar células CHO expressando RX3-hGH (Painéis AeB)imunolocalizadas, mediante utilização de soro anti-RX3e anti-hGH, respectivamente. 0 painel C mostra a imu-no-localização de proteína RX3 com anti-soro RX3. UTI-lizou-se soro anti-hGH no Painel D para imuno-localizara proteína de fusão RX3-I-hGH. A incubação de célulasCHO expressoras de proteína de fusão RX3-GUS com anti-soro RX3 está ilustrada no Painel E. Observaram-se RP-BLAs menores nas células CHO expressoras de RX3-EK, in-cubadas com soro anti-RX3 (Painel F). Estão indicadoso retículo endoplásmico (ER) e as RPBLAs.
A Figura 6 mostra manchas a oeste que i-lustram a indução de auto-clivagem intein de Ssp DNAbdepois de solubilização de proteína de fusão RX3-I-hGHa partir de uma preparação de RPBLAs por centrifugaçãode baixa velocidade. Os Painéis AeB ilustram a auto-clivagem da proteína de fusão RX3-I-hGH (Ssp DNAb inte-in do tipo silvestre), depois de solubilização. A pro-teína de fusão RX3-Im-hGH (Ssp DNAb intein modificada)foi incluída como um controle negativo. Volumes equi-valentes das amostras foram carregados por faixa, e amancha de oeste foi executada com soro anti-RX3 (PainelA) ou soro anti-hGH (Painel Β) . O comprimento plenodas proteínas de fusão está indicado com cabeças de se-tas brancas e os produtos da auto-clivagem intein SspDNAb (RX3-I no Painel A, e hGH no Painel B) estão indi-cados com cabeças de setas pretas. O Painel C ilustraa comparação da eficiência de auto-clivagem da proteínade fusão RX3-I-hGH depois de 0,1% SDS (Sl) e solubili-zação bifásica (S2). Volumes equivalentes das amostrasforam carregados por faixa, exceto TO que foi sobrecar-regado 4 vezes. A incubação com soro anti-hGH mostra aextensão plena da proteína de fusão RX3-I-hGH (cabeçade seta branca) e a hGH liberada (cabeça de seta pre-ta). "S" = Fração solúvel; "U" = fração insolúvel;"TO" = Amostra antes da indução de auto-clivagem de in-tein .
A Figura 7 contém micrográficos que mos-tram a apreensão e processamento de RX3-DsRED RPBLAsprovenientes de larvas de insetos por macrófagos. Nopainel A, está ilustrada análise de microscopia confo-cal de macrófagos 1 hora depois da incubação com RX3-DsRED RPBLAs de inseto. À esquerda, podem ser observa-dos 2 macrófagos por microscopia de contraste de fases.À direita, está ilustrada a imagem fundida de fluores-cência de DsRED (cabeças de setas pretas) e a auto-fluorescência dos macrófagos (cabeças de setas brancas)a partir da seção óptica de 1 micrômetro das mesmas cé-lulas. A observação do núcleo (N) nesta seção ópticaindica que as RPBLAs foram apreendidas e são agora in-tracelulares. 0 Painel B mostra o estudo no decorrer dotempo (1 e 10 horas) de fluorescência de DsRED emitidapelos macrófagos, depois de incubação durante 1 horacom RPBLAs que contêm RX3-DsRED. No lado esquerdo, amicroscopia de contraste de fase mostra a presença dosmacrófagos. No lado direito, a fluorescência de seçõesópticas de 1 micrômetro de DsRED mostra a presença deRPBLAs não diferidos em 1 hora (cabeça de seta branca)e um padrão de fluorescência de DsRED mais homogêneanas 10 horas indicador de RPBLAs digeridas e dispersa-das. A imagem de inseto corresponde a uma ampliaçãomais alta das RPBLAs não digeridas observadas durante 1 hora.
A Figura 8 contém micrográficos que mostram aapreensão de RX3-DsRED RPBLAs a partir de larvas de in-setos por células dendriticas. As fotografias corres-pondem às células dendriticas incubadas com RPBLAs(Painel A) e RPBLAs sem membrana (Painel B) no tempo(2, 5 e 10 horas). Na parte superior de cada painel ocontraste de fase mostra a presença de células dendri-ticas. Na parte inferior, a fluorescência de DsRED apartir das mesmas células dendriticas mostra a presençade RPBLAs absorvidas para a membrana de plasma (2 ho-ras) ou fagocitosadas dentro da célula (5 e 10 horas)."N" = núcleo.Descrição Detalhada da Invenção
Um polipeptídio biologicamente ativo re-combinante considerado é uma parte de uma proteína defusão que forma conjuntos semelhantes a corpo proteíni-co recombinante (RPBLAs), freqüentemente encerrado emmembrana, em células hospedeiras nas quais eles são ex-pressos. A formação do RPBLA é induzida por a seqüên-cia indutora de proteína corpórea (PBIS) compreendidade um peptídio de sinal e domínio de proteína de arma-zenamento que forma depósitos de alta densidade dentrodas células. Estes depósitos densos podem acumular-seno citosol, uma organela do sistema de endomenbrana,mitocôndria, plastídio ou podem ser segregados. Com aexceção de determinadas sementes de plantas de cereais,por si mesma a célula hospedeira eucariótica não produzos corpos de proteínas (PBs) na ausência da proteína defusão. Desta maneira, é a expressão da proteína de fu-são e a sua parte de PBIS que faz com que a célula hos-pedeira forme conjuntos semelhantes a corpos de proteí-nas ou RPBLAs.
Uma proteína de fusão considerada compre-ende duas seqüências de polipeptídios ligadas em con-junto diretamente ou indiretamente por uma ligação depeptídio, em que uma seqüência é aquela de uma seqüên-cia indutora de proteínas corpóreas (PBIS) ligadas àsegunda seqüência que é um produto de polipeptídio bio-logicamente ativo (por exemplo, peptídio ou proteína)de interesse (objetivo). 0 polipeptídio biologicamenteativo, tal como encontrado na natureza, é heterolólogoàs e células hospedeiras eucarióticas mencionadas e édeste modo expressa em um segundo tipo de célula que édiferente da célula hospedeira eucariótica primeiromencionada, ou é produzida sinteticamente. Ou seja, opolipeptidio biologicamente ativo é heterolólogo às cé-lulas hospedeiras eucarióticas mencionadas. PBIS sãoseqüências de aminoácidos de proteína ou polipeptidioque promovem a mediação da indução de formação de RPBLAe uma entrada e/ou acúmulo de proteínas em organelastais como o ER. A proteína de fusão quando livre e se-parada do PBIS exibe uma atividade biológica similaràquela do polipeptidio.
O polipeptidio biologicamente ativo daproteína de fusão exibe pelo menos 25 por cento,preferentemente pelo menos 50 por cento, com maior pre-ferência pelo menos 75 por cento, e ainda com maiorpreferência pelo menos 90 por cento da atividade bioló-gica do mesmo polipeptidio isolado em relação ao segun-do tipo de célula mencionado retro, ou sintetizado invitro. Um material é considerado "biologicamente ati-vo" ou "bioativo" se ele tiver uma interação com ou e-feito em qualquer metabolito, proteína, receptor, orga-nela, célula ou tecido em um organismo.
Estas atividades biológicas podem ser fa-cilmente determinadas e quantificadas utilizando-setécnicas padrão para determinação da atividade destepolipeptidio. Por exemplo, resultados de ensaio paraatividade biológica entre o polipeptidio isolado em re-lação ao segundo tipo de célula, ou sintetizado in vi-tro, e o polipeptidio expresso podem ser comparados.Quando se compara a atividade de uma proteína de fusão,a proporção desse material proporcionada pelo PBIS equalquer seqüência de ligante são levadas em considera-ção na comparação de ensaios. A atividade biológicapode ser exibida pelos RPBLAs expressos, a proteína defusão tal como uma proteína isenta de uma membrana cir-cundante ou como um polipeptidio objetivo o qual estáisento de seu PBIS.
Em uma concretização particular, a seqüên-cia de ácido nucléico usada para transformação compre-ende (i) uma seqüência de ácido nucléico que codificauma PBIS, e (ii) uma seqüência de ácido nucléico quecompreende a seqüência de nucleotídeos que codifica umproduto de interesse. Em uma concretização, a extremi-dade 3' da seqüência de ácido nucléico (i) é ligada àextremidade 5' da referida seqüência de ácido nucléico(ii). Em outra concretização, a extremidade 5' da se-qüência de ácido nucléico (i) é ligada à extremidade 3'da seqüência de ácido nucléico (ii). Desta forma, aseqüência de PBIS pode estar no término-N ou no térmi-no-C da proteína de fusão. Deverá ser compreendido quetodas as ligações de DNA discutidas neste contexto Paraa expressão de uma proteína de fusão são tais que osdois componentes da proteína de fusão são expressos noquadro.A maior parte dos corpos de proteína têmestruturas de forma redonda (geralmente estruturas es-féricas, com diâmetros de cerca de 0,5 até cerca de 3,0μ. Quando expressos em células de animais, os RPBLAssão geralmente de forma esférica, têm diâmetros de cer-ca de 0,5 até cerca de 3 micrômetros (μ) e têm umamembrana circundante. Os RPBLAs expressos em plantastambém são usualmente esféricos, têm diâmetro de cercade 0,5 até cerca de 2 μ, e são circundados por umamembrana. Os RPBLAs expressos seja em plantas, animaisou fungos são derivados do ER se forem visados por umsinal de secreção específico de ER e acumulam-se exter-namente ao invólucro do ER da célula hospedeira em se-guida à montagem. Observa-se que os RPBLAs que contêmEGF expresso no ER das células de planta não foram deum modo geral esféricos, e foram de forma amorfa e dedimensão não uniforme.
Os conjuntos semelhantes a corpo proteíni-co recombinante têm uma densidade predeterminada quepode diferir entre as diferentes proteínas de fusão,mas é conhecida para uma proteína de fusão particularque está sendo preparada. Essa densidade predetermina-da do RPBLAs é tipicamente maior do que aquela de subs-tancialmente todas as proteínas de células hospedeirasendógenas presentes no homogenado, e é tipicamente cer-ca de 1,1 até cerca de 1,35 g/ml. A alta densidade donovo RPBLAs é devida à capacidade geral das proteínasrecombinantes de fusão serem montadas como múltimeros eacumularem-se em agregados ordenados associados com asmembranas. Os RPBLAs considerados são expressos em eu-cariotes e podem ser caracterizados por suas densidadesconforme observadas anteriormente, e sua dimensão eforma.
Acredita-se que a parte de polipeptidio daproteína de fusão obtém a sua atividade biológica apartir do dobramento dentro do ER e em alguns casos apartir da glicosilação no ER. Sob um aspecto interes-sante, a maior parte das plantas, animais tais como ma-míferos e eucariotes de célula única, tais como fungos,proporcionam a N-glicosilação de proteínas no mesmo pa-drão baseado na seqüência de glicosilação de tripeptí-dio Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde "X" é qualquer resíduode aminoácido, menos a prolina. Desta maneira, um po-lipeptidio de Glc3Man9(GlcNAc)2 N-Iigado é formado ini-cialmente, e é decotado de volta depois da formação pa-ra o polipeptidio Man7_9(GlcNAc)2 N-Iigado que pode ser
excretado para o Golgi ou retido dentro do ER. Estaglicosilação basal é acentuadamente semelhante atravésdos gêneros eucarióticos. Modificação pós-translaçãoadicional, tal como glicosilação específica de terminalhospedeiro pode ocorrer no Golgi para proteínas nãomantidas nos RPBLAs, como o são as proteínas de fusãoconsideradas neste contexto.
Neste método, são proporcionados conjuntossemelhantes a corpo proteínico recombinante (RPBLAs)que freqüentemente compreendem um conjunto ordenado defusão de proteína encerrada por membrana, estão prefe-rentémente presentes em uma forma geralmente esféricaque tem um diâmetro de cerca de 0,5 até cerca de 3 mi-crômetros. A proteína de fusão contém duas seqüênciasligadas entre si, em que uma seqüência é uma seqüênciaindutora de proteína corpórea (PBIS) e a outra é um po-lipeptídio biologicamente ativo. Os RPBLAs são contac-tados com um amortecedor aquoso que contêm uma quanti-dade de desmontagem de membrana de um detergente (agen-te tensoativo). Este contacto é mantido durante um pe-ríodo de tempo suficiente para desmontar a membrana esob uma temperatura que não desnatura o polipeptídiobiologicamente ativo (por exemplo, acima de congelamen-to até cerca de 40°C) para separar a membrana e a pro-teína de fusão. A proteína de fusão separada é depoisdisso coletada de uma maneira usual, ou poderá ser sub-metida a atuação adicionalmente sem ser coletada. A-gentes tensoativos ilustrativos que são de utilidadeincluem Triton-X 100, CHAPS ande assemelhados, tais co-mo são amplamente conhecidos na bioquímica para solubi-lização de lipídios.
A proteína de fusão separada está tipica-mente numa forma insolúvel devido às interações entreas partes PBIS da proteína de fusão mediada pelo menosem parte pela presença de resíduos de cisteína. Nãoobstante, o polipeptídio de interesse é complexado comacompanhantes e foldases eucarióticos derivados do ERe, portanto, é mantido em uma conformação corretamentedobrada apesar de ser amarrado ao domínio de PBIS mon-tado (e, portanto, insolúvel) . As interações PBIS-PBISpodem ser rompidas e a proteína de fusão solubilizadapor contacto de uma proteína de fusão com um amortece-dor que contém um agente de redução tal como ditiotrei-tol ou 2-mercaptoetanol ou β-mercaptoetanol (β-ΜΕ). Ascondições são escolhidas de forma tal que elas não in-terrompam nem desdobrem a proteína biologicamente ativavinculada de interesse. A proteína de fusão solubili-zada, separada, que contém o polipeptídio biologicamen-te ativo é então coletada ou de outro modo usada. Alémdisso, as duas partes da fusão podem ser clivadas umada outra na solubilização. Deve ser compreendido que aclivagem não precisa ser nos limites exatos entre asduas partes.
Em algumas concretizações, a proteína defusão separada exibe a atividade biológica do polipep-tídio biologicamente ativo. Em outras concretizações,a proteína de fusão é dissolvida ou dispersada em umamortecedor adequado para exibir a atividade biológicado polipeptídio. Por exemplo, tal como discutido emdetalhes mais adiante, hormônio de crescimento humano(hGH) expressado em RPBLAs em células de mamíferos esolubilizada como uma proteína de fusão exibiu ativida-de significativa e também como um polipeptídio clivadoexibiu atividades substancialmente similares àquelas dopolipeptídio nativo.
Ainda em outras concretizações, a proteínade fusão tem de ser clivada nas suas partes constituin-tes antes da atividade biológica do polipeptidio serexibida. Desta forma, o polipeptidio biologicamenteativo pode ser ligado ao PBIS por meio de uma seqüênciade aminoácidos espaçadora a qual é suscetível de serclivada por meios enzimáticos ou químicos. Então, naclivagem a partir do BPIS da proteína de fusão e ensai-o, o polipeptidio visado (biologicamente ativo) exibeatividade biológica. Estudos discutidos mais adianteilustram a atividade biológica do polipeptidio T-20clivado a partir do seu parceiro de fusão e produzidoem plantas.
Seqüencias Indutoras de Proteínas Corpóreas
Uma seqüência indutora de proteína corpó-reas (PBIS) considerada e célula hospedeira são prefe-rentemente de filas biológicas diferentes. Desta for-ma, o PBIS é preferentemente proveniente de uma plantamais alta, um espermatófito, enquanto a célula hospe-deira é um eucariote que não seja um espermatóf ito epode ser uma célula de animal, tal como, por exemplo,células de mamífero ou inseto, um fungo, ou uma célulade alga, os quais são todos eles filas diferentes pro-venientes de espermatóf itos. Um PBIS e célula hospe-deira também podem ser provenientes do mesmo fila deforma que os dois podem ser, por exemplo, provenientesde uma planta mais alta. Exemplos ilustrativos, nãolimitativos, de PBIS incluem proteínas de armazenamentoou proteínas de armazenamento modificadas, tais como,por exemplo, prolaminas ou prolaminas modificadas, do-mínios de prolaminas ou domínios de prolaminas modifi-cados. As prolaminas encontram-se consideradas emShewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53 (370) : 947-958. AsPBIS preferidas são aquelas de compostos de prolamina,tais como gama-zeína, alfa-zeína, delta-zeína, beta-zeína, prolamina de arroz e a gama-gliadina que se en-contram discutidas adiante neste contexto.
Uma PBIS também inclui uma seqüência quedirige uma proteína no sentido do retículo endoplásmico(ER) de uma célula de planta. Freqüentemente essa se-qüência referida como uma seqüência líder ou peptídiode sinal pode ser proveniente da mesma planta que orestante da PBIS ou proveniente de uma planta, ou ani-mal, ou fungo diferentes. Peptídios de sinal ilustra-tivos são a seqüência de peptídios de sinal gama-zeínade 19 resíduos ilustrada em WO 2004003207 (US20040005660), a seqüência de peptídios de sinal alfa-gliadina de 19 resíduos ou a seqüência de peptídios desinal gama-gliadina de 21 resíduos (vide, Altschuler etal., 1993 Plant Cell 5:443-450; Sugiyama et al., 1986Plant Sei. 44:205-209; e Rafalski et al., 1984 EMBO J3(6):1409-11415 e as citações nos mesmos). A proteínapatogênese relacionada da classe PRlO inclui uma se-qüência de peptídios de sinal de 25 resíduos que tambémé de utilidade neste contexto. Peptídios de sinal fun-cionando similarmente provenientes de outras plantas eanimais encontram-se igualmente reportados na literatura.
As características dos peptídios de sinalresponsáveis por encaminharem uma proteína para o ERforam extensamente estudados (von Heijne et al., 2001Biochim. Biophys. Acta Dec 12 1541(1-2):114-119). Ospeptídios de sinal não partilham de homologia em umaestrutura primária, mas têm uma estrutura tríplice co-mum: uma h-região hidrófoba e hidrófila N- central eregiões de flanco terminais-C. Estas similaridades, eo fato de que as proteínas são translocadas através damembrana de ER utilizando caminhos aparentemente co-muns, permite o intercâmbio dos peptídios de sinal en-tre diferentes proteínas ou mesmo a partir de diferen-tes organismos pertencentes a diferentes filas (Vide,Exemplos 1 e 2 mais adiante, e Martoglio et al., 1998Trends Cell Biol. Oct; 8(10) :410-415) . Desta forma, oPBIS pode incluir um peptídio de sinal de uma proteínaproveniente de um filum diferente oriundo de plantasmais altas.
A Gama-Zeína, uma proteína de armazenamen-to de milho cujo DNA e seqüências de resíduos de amino-ácidos estão expostos mais adiante, é uma das quatroprolaminas de milho e representa 10-15 por cento daproteína total no endoesperma do milho. Como outrasprolaminas de cereais, as alpha- e gama-zeínas são bio-sintetizadas nos polissomos ligados por membrana no la-do citoplásmico do ER bruto, montado dentro do lúmen eentão seqüestrado nos corpos de proteínas derivados deER (Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevidet al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent etal., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403).
A Gama-Zeina é composta de quatro domínioscaracterísticos: i) um sinal de peptídio de 19 aminoá-cidos, ii) o domínio de repetição que contêm oito uni-dades do hexapeptídio PPPVHL (SEQ ID N0:1) [(53 resí-duos de aminoácidos (aa) ] , iii) o domínio ProX onde osresódios de prolina se alternam com outros aminoácidos(29 aa) e iv) o domínio C-terminal rico em proteína hi-drófoba (111 aa).
A capacidade da gama-zeína se reunir emRPBLAs derivados de ER não está restringida às semen-tes. Com efeito, quando gene gama-zeína foi expressoconstitutivamente em plantas Arabidopsis transgênicas,a proteína de armazenamento acumulou-se dentro de PBLSderivado de ER nas células mesofílicas de folhas (Geliet al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). Contando com umsinal responsável pela deposição de gama-zeína no deri-vado de ER os corpos de proteínas (prolaminas não têmsinal de KDEL), foi demonstrado que o domínio de termi-nal N rico em prolina incluindo o domínio de repetiçãoem tandem foi necessário para retenção de ER. Nestetrabalho, também foi sugerido que o domínio de terminalG poderia estar envolvido ma formação de corpo de pro-teína, entretanto, dados recentes (W02004003207A1) de-monstram que o domínio de terminal N rico em prolina énecessário e suficiente para reter o ER e induzir aformação de corpo de proteína. Entretanto, os mecanis-mos pelos quais estes domínios promovem a reunião docorpo de proteína ainda são desconhecidos, mas a evi-dência decorrente de estudos in vitro sugere que a par-te terminal N da gama-zeína é capaz de auto reunir-seem estruturas ordenadas.
Prefere-se que o PBIS baseado em gama-zeína inclua pelo menos uma repetição e os nove resí-duos amino-terminais do domínio ProX, e com maior pre-ferência a totalidade do domínio Pro-X. A parte termi-nal-C da gama-zeína não é necessária, mas poderá estarpresente. Tais seqüências estão ilustradas na US20040005660 e designadas como RX3 e P4, respectivamen-te, e estão registradas mais adiante.
Considerando que os corpos de proteínassão apropriadamente chamados somente de sementes, es-truturas similares produzidas em outros órgãos de plan-tas e em plantas não mais altas são chamadas geralmentePBs sintéticos ou conjuntos semelhantes a corpos prote-ínicos recombinantes (RPBLAs).
As zeínas são de quatro tipos distintos:alfa, beta, delta, e gama. Elas acumulam-se de uma ma-neira seqüencial nos corpos de proteínas derivados deER durante o desenvolvimento de endosperma. A beta-zeína e a delta-zeína não se acumulam em grandes quan-tidades no PBs de milho, mas elas mostraram-se estáveisnos tecidos vegetativos e foram depositadas nas estru-turas semelhantes a corpos de proteína derivados de ERquando expressas em plantas de tabaco (Bagga et al.,1997 Plant Cell Sep 9(9):1683-1696) . Este resultadoindica que a beta-zeína, da mesma maneira que a delta-zeína, poderão induzir a retenção de ER e a formação decorpo de proteína.
As proteínas de prolaminade trigo de arma-zenamento, gliadinas, constituem um grupo de proteínasisentas de K/HDEL, cujo transporte por meio de ER pare-ce ser complexo. Estas proteínas isolam-se no ER ondeelas são ou retidas e empacotadas em densos corpos deproteínas, ou são transportadas a partir do ER por meiode Golgi para vacúolos. (Altschuler et al., 1993 PlantCell 5:443-450.)
As gliadinas parecem ser quimeras natu-rais, que contêm duas regiões autônomas dobradas sepa-radamente. O término N é composto de cerca de 7 atécerca de 16 repetições em tandem ricas em glutamina eprolina. A seqüência das repetições em tandem variaentre as diferentes gliadinas, mas são baseadas em umaou outra seqüências de consenso PQQPFPQ (SEQ ID NO:47),PQQQPPFS (SEQ ID NO:48) e PQQPQ (SEQ ID NO:49). A re-gião de terminal C da proteína contém de seis a oitocisteínas que formam ligações de bissulfureto intramo-leculares. O trabalho do grupo de Altschuler et al.,indica que a região terminal-N e seqüências de consensosão responsáveis pela formação de PB no ER a partir degama-gliadina. (Altschuler et al., 1993 Plant Cell5:443-450. )
Outras seqüências do tipo prolamina ilus-trativas que são de utilidade estão ilustradas na Tabe-la seguinte, junto com os seus identificadores de Bancode Genes.
<table>table see original document page 42</column></row><table>
Outras seqüências de utilidade são obtidaspela realização de uma pesquisa de BLAST em todas asbases de dados de tranduções+PDB+SwissProt+PIR+PRF CDSBanco de Genes não-redundantes (excluindo as amostrasambientais) conforme descritas em Altschul et al., 1997Ácido nucléicos Res. 25:3389-3402 utilizando-se inqui-rições tais como aquelas expostas adiante:Inquirição de RX3 (SEQ ID NO: 2)Alfa-zeina (SEQ ID NO: 3)
Inquirição de prolamina de arroz (SEQ ID NO: 4)
Uma prolamina modificada ilustrativa in-clui (a) uma seqüência de peptidio de sinal, (b) umaseqüência de uma ou mais cópias do hexapeptidio de do-mínio de repetição PPPVHL (SEQ ID NO: 1) da proteínagama-zeína, o domínio inteiro que contêm oito unidadesde hexapeptidio; e (c) uma seqüência de todo ou partedo domínio ProX da gama-zeína. As prolaminas modifica-das específicas ilustrativas incluem os polipeptídiosidentificados adiante como R3, RX3 e P4 cujo DNA e se-qüências de resíduos de aminoácidos também estão ilus-trados adiante.
Prolaminas particularmente preferidas in-cluem a gama-zeína e suas partes componentes conformeexpostas no pedido publicado W02004003207, a proteínade arroz rP13 e a alfa-zeína de milho 22 kDa e o seufragmento terminal-N. As seqüências de DNA e de resí-duos de aminoácidos das proteínas de gama-zeína, arroze alfa-zeína estão ilustradas em seguida.
Gama-zeína de 27 kD
Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 5)
Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 6) RX 3
Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 7)Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 8)R3
Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 9)Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 10)
P4
Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 11)Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 12)
X10
Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 13)Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 14)
rP13 - prolamina de arroz de 13 kD homólogos ao clone -ABO16504 Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem.60(2) : 335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol.101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell17 (4) : 1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. FoodChem. 52 (8) :2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci.Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858
Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 15)seqüência de DNA (SEQ ID NO: 16)22aZt fragmento de terminal-N da alfa-zeína do milhode 22 kD - V01475 Kim et al., 2002 Plant Cell14(3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta1339 (1) : 14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol.18(4):827-833.Seqüência de Proteína (extensão plena) (SEQ ID NO: 17)Seqüência de DNA (extensão plena) (SEQ ID NO: 18)
Precursor de Gama-Gliadina - AAA34272- Scheets et al.,1988 Plant Sei. 57:141-150.Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 19)
Seqüência de DNA (M36999) (SEQ ID NO:20)
Beta zeína - AF371264 - Woo et al., (2001) Plant Cell13 (10), 2297-2317.DNA (SEQ ID NO: 21)Proteína (SEQ ID NO: 22)
Delta zeína 10 kD- AF371266- Woo et al., (2001) PlantCell 13 (10), 2297-2317. e Kirihara et al., (1988) Ge-ne. Nov 30;71(2):359-70.DNA (SEQ ID NO:23)Proteína (SEQ ID NO:24)
Peptídios de sinaisGama-Zeina (SEQ ID NO:25)
Alfa-Gliadina (SEQ ID NO:26)
Gama-Gliadina (SEQ ID NO:27)
PRlO (SEQ ID NO:28) '
Proteínas de Interesse
Exemplos de polipeptídios ou proteínas deinteresse (objetivos) incluem qualquer proteína dotadade usos terapêuticos, nutracêuticos, agrícolas, biocon-trole, ou industriais. Atividades ilustrativas de taisproteínas incluem (a) captura e emissão de luz, comosão proporcionadas pela proteína fluorescente verde(GFP), proteína fluorescente de ciano aumentada (ECFP),proteína fluorescente vermelha (DsRED) e assemelhadas;(b) atividade enzimática como pode ser associada comcaminhos de sinalização e metabólicos intracelularesprimários e secundários, é exemplificado por enteroqui-nase, beta-glucuronidase (GUS), fitase, anidrase carbô-nica, e enzimas industriais (hidrolases, glicosidases,celulases, óxido-reductases, e assemelhadas); (c) inte-ração proteína-proteína, proteína-receptor, e proteína-ligante, tal como, por exemplo, anticorpos (mAbs taiscomo IgG, IgM, IgA, e assemelhados) e os seus fragmen-tos, hormônios [calcitocina, hormônio de crescimentohumano (hGH) , fator de crescimento epidérmico (EGF) eassemelhados], inibidores de protease, antibióticos,antimicrobianos, inibidores de acesso de HIV [Ryser etal., 2005 Drug Discov Today. Aug. 15;10(16):1085-1094] ,colágeno, lactoferrina humana, e citoquinas; (d) antí-genos de proteínas e peptídios para vacinas (vírus deimunodeficiência humana, HIV; antígenos de hepatite Bpré-superfície, superfície e núcleo, gene Pl de poli-proteína estrutural de Vírus de Enfermidades do Pé e daBoca (FMDV) [Dus Santos et al., 2005 Vacina. Mar7;23(15):1838-1843] peptídios estimuladores de célula Tda Patente US No. 4.882.145, vírus corona de gastroen-terite, vírus de papiloma humano, e assemelhados); (e)interações de proteína não proteína, tais como, fitoe-maglutinina (PHA), a subunidade B Ricin Toxin (RTB) eoutras lecitinas.
Ensaios para a bioatividade desses poli-peptídios expressados são amplamente conhecidos na téc-nica e encontram-se disponíveis em uma ou mais publica-ções. Por exemplo, a atividade de ECFP (proteína fluo-rescente de cian aumentada) pode ser medida por quanti-ficação da fluorescência emitida em um comprimento deonda de 470-530 nm quando uma proteína é emitida comosaída a 458 nm. Vide, Richards et al., 2003 Plant CellRep. 22:117-121. A atividade enzimática de ente.roqui-nase (EK), por exemplo, pode ser medida com duas abor-dagens diferentes. A atividade pode ser determinadapor análise da clivagem de uma proteína de fusão quecontêm o local de clivagem específico de enteroquinasepor mancha a oeste, tal como discutido no InvitrogenLife Technologies catalog (E180-01 e E180-2), e tambémpor quantificação da atividade de EK utilizando-sesubstrato de peptídio fluorogênico para EK (Sigma G-5261, CAS® RN 70023-02-8); a atividade de enzima é me-dida por um aumento de fluorescência (excitação a 337nm, emissão a 420 nm) causada pela liberação de β-naftilamina a partir do peptídio com o tempo. Vide,LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268 (31) : 23311-23317. A atividade da enzima beta-glicoronidase (GUS)pode ser medida pela conversão do substrato MUG (4-metil umbeliferil glicoronida) para o produto MU. Esteproduto pode ser quantificado pela medição da fluores-cência com excitação a 365 nm, emissão a 455 nm em umespectrofluorímetro. Vide, Pai-Hsiang et al., 2001 J.Plant Physiol. 158(2):247-254; e Jefferson et al., 1987EMBO J 6:3901-3907. Ensaios de fitase são realizadospela quantificação de orto fosfatos inorgânicos libera-dos a partir do reagente AAM que consiste de acetona,ácido sulfúrico 5,0 N, e molibdato de amônio 10 mM.Vide, Ullah et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun.264 (1):201-206. Ensaios similares encontram-se dis-poníveis para outras proteínas biológicas. Os ensaiosde atividade de RTB podem ser executados pela mediçãoda aglutinação do RTB ao asialofetuin, lactose e galac-tose, conforme descrito por Reed et al., 2005 PlantCell Rep. Apr;24(1):15-24.
O EGF compreende um fator de crescimentoque está envolvido na proliferação de fibroblastos. Aatividade de EGF pode ser ensaiada pela quantificaçãoda indução de síntese de DNA medida por incorporação doanálogo de pirimidina 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU),em vez de timidina, no DNA de células proliferantes u-tilizando-se o kit ELISA de proliferação de células [0-liver, et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol.286:1118-1129; Catalog no. 1647229, Roche Diagnostics,Mannheim, Germany]
Observa-se que a captura e emissão de luzconstitui um tipo separado e especial de "atividade bi-ológica" em que essa atividade não proporciona uso te-rapêutico, nutracêutico, agrícola, biocontrol, ou in-dustrial como ocorre com outros tipos de atividade ob-servados anteriormente retro. Os polipeptídios destaclasse de objetivos são incluídos neste contexto comobiologicamente ativos porque eles compartilham de al-guns dos aspectos estruturais secundários, terciários equaternários requeridos que são possuídos pelas molécu-las visadas que proporcionam usos terapêuticos, nutra-cêuticos, de biocontrol, ou industriais. Estas proteí-nas são de utilidade, entretanto, como moléculas infor-mantes em muitos tipos de ensaios ou monitores usadosna análise ou descoberta de moléculas biologicamenteimportantes, e sua atividade luminescente requer a pre-sença de estrutura de proteína secundária e terciáriacorreta. É possível, com maior precisão, fazer-se re-ferência ao grupo de objetivos como aqueles polipeptí-dios que são biologicamente ativos e/ou luminescente-mente ativos.
Proporcionam-se adiante seqüências de DNA eresíduos de aminoácidos ilustrativas para proteínas deinteresse ilustrativas.
ECFP
DNA(SEQ ID NO:29)proteína (SEQ ID NO:30)
GUS1381
DNA (SEQ ID NO:31)proteína (SEQ ID NO:32)GUS1391Z
DNA (SEQ ID NO:33)proteína (SEQ ID NO:34)
Salmon calcitonin BAC57417Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 35)Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 36)
hEGF - Construção baseada no AAF85790 sem o peptídio desinal
Seqüência de proteína (SEQ ID NO: 37)Seqüência de DNA (SEQ ID NO: 38)
hGH - Construção baseada no P01241 sem o peptídio desinal.
Seqüência de Proteína (SEQ ID NO: 39)Seqüência de DNA (SEQ ID NO:40)
Em uma outra concretização, a proteína re-combinante de fusão compreende, outrossim, adicional-mente às seqüências do PBIS e produto de interesse, umaseqüência espaçadora de aminoácidos. A seqüência espa-çadora de aminoácido pode ser uma seqüência de aminoá-cido capaz de ser clivada por meios enzimáticos ou quí-micos, ou não clivável. Por "não clivável" entende-seque a clivagem do espaçador não ocorre sem destruiçãode algum ou de todo o polipeptídio biologicamente ativo.
Em uma concretização particular, a seqüên-cia espaçadora de aminoácidos é colocada entre o PBIS eo polipeptídio biologicamente ativo. Uma seqüência deaminoácidos ilustrativa é clivável por uma protease talcomo uma enteroquinase, endoprotease Arg—C, endoprote-ase Glu—C, endoprotease Lys—C, Factor Xa, proteasesSUMO [Tauvidef et al., 2005 Proteína Expr. Purif. 2005Sep 43(1):1 — 9] e assemelhadas. Alternativamente, a se-qüência espaçadora de aminoácido corresponde a uma se-qüência auto-clivável tal como a seqüência 2A de auto-processamento viral FMDV, inteinas tais como a inteinaSsp DNAb e assemelhadas, tais como são encontradas co-mercialmente disponíveis a partir da New England Bio-Iabs e outras. O uso de uma seqüência de encadeamentode inteina é preferida, uma vez que essas seqüênciaspodem ser seletivamente induzidas a ocasionar a divisãoda proteína e eliminar-se desse modo por si mesmas apartir de uma proteína expressada, recuperada. As in-teinas são particularmente interessantes, uma vez queelas não requerem amplas enzimas de proteína Para al-cançar o seu local visado a fim de clivar o PBIS em re-lação à proteína de interesse. Esta propriedade podeser particularmente útil para o isolamento direto deproteínas de interesse em relação a RPBLAs intactos.Alternativamente, é codificada uma seqüência de aminoá-cidos a qual é especificamente suscetível de ser cliva-da por um reagente químico, tal como, por exemplo, bro-meto de cianogênio que promove a clivagem nos resíduosde metionina.
Em uma outra concretização, a seqüência deácido nucléico usada para propósitos de transformação étal como exposta de acordo com o pedido de patente co-cedido WO 2004003207, com ou sem codificação de uma se-qüência de ácido nucléico para a seqüência de aminoáci-dos suscetível de ser clivada.
Métodos de Preparação
Em uma concretização preferida, as proteí-nas de fusão são preparadas de acordo com um método quecompreende transformar um sistema de célula hospedeiraeucariótica, tal como um animal, cultura de célula deanimal, planta ou cultura de célula de planta, culturade célula de fungo, cultura de célula de inseto ou cul-tura de algas, com uma seqüência de ácido nucléico (DNAou RNA) que compreende (i) uma codificação de primeiroácido nucléico para um PBIS que é ligado operacional-mente no quadro a (ii) uma seqüência de segundo ácidonuclé ico que compreende a codificação de seqüência denucleotídio para um produto de polipeptídio de interes-se que é biologicamente ativo; ou seja, a seqüência deácido nucléico que codifica o PBIS é ligada quimicamen-te (peptídio ligado) à seqüência que codifica o poli-peptídio de interesse de forma tal que os dois polipep-tídios são expressos a partir de seus próprios quadrosde leitura e a proteína de interesse é biologicamenteativa. Considera-se igualmente que seqüências regula-doras apropriadas estejam presentes em cada lado de umaseqüência de ácidos nucléicos que codificam o PBIS e aproteína de interesse tal como se encontra discutidomais adiante. Tais seqüências de controle são ampla-mente conhecidas na técnica e encontram-se presentes emvetores disponíveis comercialmente. 0 uso de meios in-diretos de introdução de DNA, tais como transdução ouinfecção viral, é igualmente considerada e será usadapermutavelmente com métodos de distribuição de DNA di-reta, tais como transfecção.
A célula ou entidade hospedeira transfor-mada é mantida durante um período de tempo e sob condi-ções de cultura adequadas para expressão da proteína defusão e ajuntamento da proteína de fusão expressada emconjuntos semelhantes a corpo proteínico recombinante(RPBLAs). Quando da expressão, a proteína de fusão re-sultante acumula-se no sistema hospedeiro transformadocomo conjuntos de alta densidade semelhantes a corpoproteínico recombinante. A proteína de fusão pode en-tão ser recuperada a partir das células hospedeiras oudas células hospedeiras que contêm a proteína de fusãopodem ser usadas conforme desejado, tal como para umalimento de animal que contém um nutriente ou suplemen-to adicionado. A proteína de fusão pode ser isoladacomo parte dos RPBLAs ou livre dos RPBLAs.
As condições de cultura adequadas para aexpressão da proteína de fusão são tipicamente diferen-tes para cada tipo de entidade hospedeira ou célulahospedeira. Entretanto, essas condições são conhecidasdaqueles versados na técnica e são facilmente determi-nadas. De forma assemelhada, a duração da manutençãopode diferir com as células hospedeiras e com a quanti-dade de proteína de fusão que se deseja preparar. No-vamente, essas condições são amplamente conhecidas epodem ser facilmente determinadas em situações especí-ficas. Adicionalmente, condições de cultura específi-cas poderão ser obtidas a partir das citações apresen-tadas neste contexto.
Em uma concretização, a extremidade 3' daprimeira seqüência de ácidos nucléicos (i) está encade-ada (ligada) à extremidade 5' da segunda seqüência deácidos nucléicos (ii) . Em outra concretização, a ex-tremidade 5' da primeira seqüência de ácidos nucléicos(i) é encadeada (ligada) à extremidade 3' da segundaseqüência de ácidos nucléicos (ii). Em outra concreti-zação, o PBIS compreende uma proteína de armazenamentoou uma proteína de armazenamento modificada, um frag-mento ou um fragmento modificado da mesma.
Em outra concretização particular, umaproteína de fusão é preparada de acordo com um métodoque compreende transformar o sistema de célula hospe-deira tal como um animal, cultura de células de animal,planta, cultura de células de planta, fungos ou algascom uma seqüência de ácidos nucléicos que compreende,adicionalmente à seqüência de ácidos nucléicos (i) e(ii) previamente mencionados, uma seqüência de ácidosnucléicos em quadro (iii) que codifica a seqüência es-paçadora de aminoácidos. A seqüência espaçadora de a-minoácidos pode ser uma seqüência de aminoácidos capazde ser clivada por meios enzimáticos ou químicos ou nãoclivável, como observado anteriormente. De acordo comuma concretização particular, a seqüência de ácido nu-cléico (iii) é colocada entre a dita seqüência de áci-dos nucléicos (i) e (ii), por exemplo, a extremidade 3'da terceira seqüência de ácidos nucléicos (iii) é liga-da à extremidade 5' da segunda seqüência de ácidos nu-cléicos (ii). Em uma outra concretização, a extremida-de 5' da terceira seqüência de ácidos nucléicos (iii) éligada à extremidade 3' da segunda seqüência de ácidosnucléicos (ii).
Uma seqüência de ácidos nucléicos (segmen-tos) que codifica uma molécula de proteína de fusãodescrita anteriormente ou um complemento dessa seqüên-cia de codificação, também é considerado neste contex-to. Esse segmento de ácido nucléico encontra-se pre-sente na forma isolada e purificada em algumas concre-tizações preferidas.
Em organismos vivos, a seqüência de resí-duos de aminoácidos de uma proteína ou polipeptídio es-tá diretamente relacionada por meio do código genéticoà seqüência de ácido deoxirribo nucléico (DNA) do geneque codifica a proteína. Desta maneira, através da de-generação amplamente conhecida do código genético DNAsadicionais e correspondentes seqüências de RNA (ácidosnucléicos) podem ser preparados conforme desejado, quecodificam as mesmas seqüências de resíduos de aminoáci-dos de proteínas de fusão, mas são suficientemente di-ferentes em relação a uma seqüência de genes discutidaanteriormente, em que as duas seqüências não hibridizamsob alta premência, mas que hibridizam sob premênciamoderada.
Condições de alta premência podem ser de-finidas como compreendendo hibridização a uma tempera-tura de cerca de 50°-55°C em 6XSSC e uma lavagem finalsob uma temperatura de 68°C em 1-3XSSC. As condiçõesde premência moderadas compreendem hibridização a umatemperatura de cerca de 50°C até cerca de 65°C em 0,2até 0,3 M de NaCl, seguida por lavagem a cerca de 50°Caté cerca de 55°C em 0,2X SSC, 0,1% SDS (sulfato dode-cil de sódio).
Também se considera neste contexto uma se-qüência nucléica (seqüência de DNA ou uma seqüência deRNA) que (1) por si mesma codifica, ou seu complementocodifica, uma proteína de fusão que contêm a seqüênciaindutora de proteína corpórea (PBIS) e um polipeptídiode interesse. Tal como é amplamente conhecido, uma se-qüência de ácido nucléico tal como a seqüência de ácidonucléico considerada é expressa quando ligada operacio-nalmente a um promotor apropriado em um sistema de ex-pressão apropriado tal como discutido em algum pontoneste caso. Esta seqüência de ácido nucléico pode serdistribuída diretamente ou indiretamente (por meio deum organismo de vetor apropriado, tal como um vírus oubactéria) à célula eucariótica hospedeira, e pode serintegrada de forma estável no genoma nuclear ou de or-ganela hospedeiro, ou expressa transitoriamente sem in-tegração de genoma.
Hospedeiros diferentes freqüentemente têmpreferências para um codon particular a ser usado paracodificar um resíduo de aminoácido particular. Essaspreferências de codon são amplamente conhecidas e umaseqüência de DNA que codifica uma seqüência de proteínade fusão desejada pode ser alterada, utilizando-se, porexemplo, mutagênese in vitro, de forma que os códonspreferidos por hospedeiro são utilizados para um hospe-deiro particular em que a proteína de fusão se destinaa ser expressada.
Uma molécula de ácido nucléico recombinan-te, tal como uma molécula de DNA, que compreende umvector que contêm uma ou mais seqüências reguladoras(elementos de controle) tais como um promotor adequadopara induzir a expressão do gene em um organismo de cé-lula hospedeira eucariótica compatível ligada operacio-nalmente a um segmento de ácido nucléico exógeno (porexemplo, um segmento ou seqüência de DNA) que define umgene que codifica uma proteína de fusão considerada,tal como discutida anteriormente, também está conside-rada nesta invenção. Mais particularmente, considera-se igualmente uma molécula de DNA recombinante que com-preende um vetor o qual compreende um promotor parainduzir a expressão da proteína de fusão em células deorganismo hospedeiro ligadas operacionalmente a um seg-mento de DNA que define um gene, codifica uma seqüênciaindutora de proteína corpórea (PBIS) ligada a um poli-peptídio de interesse. Essa molécula de DNA recombi-nante, na transfecção e expressão adequadas em uma Cé-lula eucariótica hospedeira, proporciona uma proteínade fusão considerada como RPBLAs.
Tal como é amplamente conhecido na técni-ca, contanto que o ácido nucléico requerido, ilustrati-vamente seqüência de DNA, esteja presente, (incluindosinais de partida e parada), pares de base adicionaispodem usualmente estar presentes em cada extremidade dosegmento de DNA e esse segmento pode ser ainda utiliza-do para expressar a proteína. Isto, naturalmente, pre-sume a ausência no segmento de uma seqüência de DNA li-gada operacionalmente a uma seqüência que reprime ex-pressão, expressa um outro produto que consome a prote-ína de fusão desejada produzida por essa proteína defusão desejada, ou de outro modo interfere com a ex-pressão do segmento de DNA.
Desta forma, na medida em que o segmentode DNA esteja isento dessas seqüências de DNA interfe-rentes, um segmento de DNA da invenção pode ter cercade 500 até cerca de 15.000 pares de base de extensão.A dimensão máxima de uma molécula de DNA recombinante,particularmente um vetor de expressão, é governada amaior parte das vezes por conveniência e a dimensão devetor que pode ser acomodada por uma célula hospedeira,uma vez que todas as seqüências de DNA mínimas requeri-das para replicação e expressão, quando desejado, estãopresentes. As dimensões de vetor mínimas são amplamen-te conhecidas. Esses segmentos de DNA longos não sãopreferidos, mas podem ser usados.
Um segmento de DNA que codifica uma prote-ína de fusão anteriormente descrita pode ser sintetiza-do por meio de técnicas químicas, por exemplo, o métodofosfotriéster de Matteucci et al., 1981 J. Am. Chem.Soc., 103:3185. Naturalmente, ao sintetizar-se quimi-camente a seqüência de codificação, quaisquer modifica-ções desejadas podem ser feitas simplesmente pela subs-tituição das bases apropriadas por aquelas que codifi-cam a seqüência de resíduos de aminoácidos nativos.
Entretanto, são preferidos os segmentos de DNA que in-cluem as seqüências especificamente discutidas nestecontexto.
Os segmentos de DNA que contêm um gene quecodifica uma proteína de fusão são preferentemente ob-tidos a partir de moléculas de DNA recombinantes (veto-res plasmídicos) que contêm este gene. Um vetor queencaminha a expressão de um gene de proteína de fusãoem uma célula hospedeira é chamado neste contexto de um"vetor de expressão".
Um vetor de espressão contém elementos decontrole de expressão que incluem o promotor. 0 genede codificação de proteína de fusão é ligado operacio-nalmente ao vetor de expressão para permitir que a se-qüência de promotor encaminhe a ligação de polimerasede RNA e a expressão do gene de codificação da proteínade fusão. De utilidade na expressão do gene de codifi-cação de polipeptidio são os promotores que são susce-tíveis de ser induzidos, virais, sintéticos, constitu-tivos, como descritos por Paszkowski et al., 1989 EMBOJ., 3:2719 e Odell et al., 1985 Naturer 313:810, bemcomo regulados temporariamente, regulados espacialmentee regulados espaço-temporariamente, tal como expostopor Chua et al., 1989 Science, 244:174-181.
Neste contexto são considerados os vetoresde expressão compatíveis com células eucarióticas, taiscomo aquelas compatíveis com as células de mamíferos,algas ou instos e assemelhadas. Estes vetores de ex-pressão também podem ser usados para formar as molécu-las de DNA recombinantes da presente invenção. Os ve-tores de expressão de células eucarióticas são ampla-mente conhecidos na técnica e encontram-se disponíveisa partir de diversas fontes comerciais. Normalmente,esses vetores contêm um ou mais locais de restriçãoconvenientes para inserção do segmento de DNA desejadoe seqüências de promotor. Opcionalmente, esses vetorescontêm um detector selecionável específico para o usoem células eucarióticas.
A produção de uma proteína de fusão porexpressão de DNA recombinante em células de mamíferosestá ilustrada mais adiante utilizando-se um vetor deDNA recombinante que expressa o gene de proteína de fu-são em células hospedeiras de ovário de hamster chinês(CHO), células hospedeiras de macaco Cosl e hospedeirashumanas 293T. Isto é conseguido utilizando-se procedi-mentos que são amplamente conhecido na técnica e encon-tram-se descritos de forma mais detalhada em Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor Laboratories (1989).
Um sistema de células de inseto também pô-de ser usado para expressar uma proteína de fusão con-siderada. For exemplo, em um sistema desses utiliza-seo vírus polyhedrosis nuclear Autographa californica(AcNPV) ou bacilovírus como um vetor para expressar ge-nes externos em células Spodoptera frugiperda ou em la-rvas Trichoplusia. As seqüências que codificam umaproteína de fusão podem ser clonadas em uma região nãoessencial do vírus, tal como o gene poliedrin, e colo-cadas sob o controle do promotor de poliedrin. A in-serção bem sucedida de uma seqüência de proteína de fu-são torna o gene de poliedrin inativo e produz vírusrecombinante desprovido de proteína de cobertura. Osvírus recombinantes podem ser então usados para infec- tar, por exemplo, células de S. Frugiperda ou larvas deTrichoplusia em que a proteína de fusão pode ser ex-pressa. E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Sci., USAf 91:3224-3227; e V. Luckow, "Insect Cell Ex-pression Technology", péginas 183-218, em Proteína En-gineering: Principies e Practice, J.L. Cleland et al.eds., Wiley-Liss, Inc, 1996). Genes heterólogos colo-cados sob o controle do promotor de poliedrin do viruspoliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) sãofreqüentemente expressados sob altos níveis durante osúltimos estágios de infecção.
Baculovirus recombinantes que contêm o ge-ne de proteína de fusão são construídos utilizando-se osistema de vetor de lançadeira baculovírus (Luckow etal., 1993 J. Virol., 67:4566-4579], vendido comercial-mente como o sistema de expressão de baculovírus Bac-To-Bac™ (Life Technologies). Cepas de virus recombi-neantes são preparadas e a expressão da proteína recom-binante é monitorada por protocolos padrão (O'Reilly etal. , Baculovírus Vetor de expressãos: A Laboratory Ma-nual, W.H. Freeman e Company, New York, 1992; e King etal., The Baculovírus Expression System: A LaboratoryGuide, Chapman & Hall, London, 1992). Na presente in-venção considera-se igualmente o uso de baculovírus oude outros vetores de distribuição em células de mamífe-ros, tais como o sistema λBacMam', o qual está descritopor T. Kost e colaboradores (vide, por exemplo, Merri-hew et al., 2004 Methods Mol Biol. 246:355-365 ) , ououtros de tais sistemas como são conhecidos daquelesversados na técnica.
A escolha de qual vetor de expressão e porultimo a qual promotor um gene de codificação de prote-ína de fusão é ligado operacionalmente, depende direta-mente das propriedades funcionais desejadas, por exem-plo, a localização e distribuição da expressão de pro-teína, e da célula hospedeira a ser transformada. Es-tas são limitações amplamente conhecidas inerentes natécnica de construção de moléculas de DNA recombinan-tes. Entretanto, um vetor de utilidade na prática dapresente invenção pode orientar a replicação e prefe-rentemente também a expressão (para um vetor de expres-são) do gene da proteína de fusão incluído no segmentode DNA ao qual ele está operacionalmente ligado.
Vetores típicos que são de utilidade paraexpressão de genes em células provenientes de plantasmais altas e mamíferos são amplamente conhecidos natécnica e incluem vetores de plantas derivados do plas-mídio indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefad-ens descrito por bed by Rogers et al. (1987) Meth. inEnzymol., 153:253-277 e vetores de expressão de mamífe-ros pKSV-10, retro, e pCI-neo (Promega Corp., #E1841,Madison, WI). Entretanto, são conhecidos vários outrossistemas de vetores de expressão que funcionam em plan-tas, incluindo o vetor de controle de transferênciapCaMVCN descrito por Fromm et al. (1985) Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 82:58-24. 0 plasmídio pCaMVCN (dispo-nível a partir da Pharmacia, Piscataway, NJ) inclui opromotor de vírus mosaico de couve-flor CaMV 35S.
Os sistemas de expressão de plantas tipi-camente proporciona expressão sistêmica ou constitutivade um transgene inserido. A expressão sistêmica podeser de utilidade onde a maior parte ou totalidade deuma planta é usada como uma fonte de RPBLAs e suas pro-teínas de fusão. Entretanto, pode ser mois eficaz ex-pressar RPBLAs e seu teor de proteína de fusão em umórgão de armazenamento de planta, tal como uma raiz,semente ou fruto a partir do qual as partículas podemser mais facilmente isoladas ou ingeridas.
Uma maneira de se conseguir a expressão doórgão de armazenamento é usar um promotor que expressao seu gene controlado em um ou mais órgãos de plantanão-fotossintéticos pré-selecionados ou predetermina-dos. A expressão em um ou mais órgãos de armazenamentopré-selecionados com pouca ou nenhuma expressão em ou-tros órgãos, tais como raízes, semente ou fruto contrafolhas ou talos é chamada neste contexto de expressãoaumentada ou preferencial. Um promotor exemplificativoque dirige a expressão em um ou mais órgãos pré-selecionados em comparação com outro órgão sob uma re-lação de pelo menos 5:1 é definido neste caso como umpromotor de órgão aumentado. A expressão em substanci-almente apenas um órgão de armazenamento e substancial-mente nenhuma expressão em outros órgãos de armazena-mento é chamada de expressão específica de órgão; istoé, uma relação de produtos de expressão em um órgão dearmazenamento em relação a outro de cerca de 100:1 oumaior indica especificidade de órgão. Desta forma,promotores específicos de órgãos de armazenamento sãoelementos da classe de promotores aumentados de órgãosde armazenamento.
Órgãos de armazenamento de plantas exem-plificativos incluem as raízes de cenouras, inhame oumandioca, tubérculos de batata, e a polpa de frutostais como goiaba vermelha, maracujá, manga, papaia, to-mate, abacate, cereja, tangerina, bergamota, palma, me-lões tais como cantalupo e melancia e outras frutaspolpudas tais como polpa, pepinos, mangas, damascos,pêssegos, bem como as sementes de milho, soja, arroz,óleo de semente de colza e assemelhados.
O promotor CaMV 35S é normalmente conside-rado como sendo um promotor constitutivo. Entretanto,pesquisas mostraram que uma região 21-bp do promotorCaMV 35S, quando operacionalmente ligada em uma outra,promotor de tecido verde usual heterólogo, o promotorrbcS-3A, pode fazer com que o promotor quimérico resul-tante se torne um promotor de raiz aumentada. Essa sqde 21-bp está exposta na patente U.S. No. 5.023.179. Opromotor quimérico rbcS-3A que contém o inserto 21-bpda patente U.S. Patent No. 5.023.179 é um promotor deraiz aumentada de utilidade neste caso.
Um promotor de raiz aumentada similar, queinclui o segmento 21-bp retro é a região -90 até +8 dopróprio promotor CAMV 35S. A patente U.S. No.5.110.732 descreve que o promotor CaMV 35S truncadoproporciona expressão aumentada em raizes e o radicalde semente, um tecido destinado a tornar-se raiz. Estepromotor também é de utilidade neste caso.
Outro promotor de raiz aumentada de utili-dade é o promotor -1616 a -1 do gene de óleo de sementede colza (Brassica napus L.) exposto no PCT/GB92/00416(WO 91/13922 publicado em 19 de setembro de 1991) . E.coli DH5.alpha. harboring plasmid pRlambdaS4 e bacteri-ophage lambda.beta.1 que contêm este promotor foram de-positados na National Collection of Industrial e MarineBactéria, Aberdeen, GB on Mar. 8, 1990 e têm os númerosde acesso NCIMB40265 e NCIMB40266. Uma parte de utili-dade deste promotor pode ser obtida como um fragmento1,0 kb por clivagem dos plasmidio com HaeIII.
Um promotor de raiz aumentada preferido éo promotor de sintase manopine (mas) presente no plas-midio pKan2 descrito por DiRita e Gelvin (1987) Mol.Gen. Genetr 207:233-241. Este promotor é removível doseu plasmidio pKan2 como um fragmento XbaI-XbalI.
O promotor de raiz aumentada de sintase demanopine preferido é compreendido da região de promotor(mas) de sintase de manopine de núcleo até à posição -138 e do ativador de sintase de manopine de -318 até -213, e é referido coletivamente de AmasPmas. Consta-tou-se que este promotor aumenta a produção de raízesde tabaco em cerca de 10- até cerca de 100-vezes emcomparação com os níveis de expressão de folha.
Outro promotor específico de raiz é a se-qüência de flanqueio de cerca de 500 bp 5' que acompa-nha o gene de glicopoproteína rico em hidroxiprolina ,HRGPnt3, expresso durante a iniciação de raiz lateral ereportado por Keller et al. (1989) Genes Dev., 3:1639-1646. Outro promotor específico de raiz preferido estápresente na região de flanqueio cerca de -636 até -1 5'do gene específico de raiz de tabaco ToRBF reportadopor Yamamoto et al. (1991) Plant Cellr 3:371-381. Oselementos cis-atuantes que regulam a expressão ficammais especificamente localizados por aqueles autores naregião que vai de cerca de -636 até cerca de -299 5' apartir do local de iniciação de transcrição. Yamamotoet al. reportaram produção de mRNA de condição estávela partir do gene ToRBF em raizes, mas não nas folhas,meristemas ou hastes de rebento.
Ainda outros promotores específicos de ór-gãos de armazenamento são as regiões de flanqueio 5' e3' do gene E8 de amadurecimento de fruto do tomate, Ly-copersicon esculentum. Estas regiões e suas seqüênciasde cDNA estão ilustradas e discutidas em Deikman et al.(1988) EMBO J., 7(11):3315-3320 e (1992) Plant Phy-siol., 100:2013-2017.
Três regiões ficam localizadas no 2181 bpda seqüência de flanqueio 51 do gene e uma seqüência522 bp 3' para o local de adição poli (A) apareceu paracontrolar a expressão do gene E8. Uma região de -2181até -1088 é requerida para ativação da transcrição degene E8 em fruto imaturo por etileno e também contribuipara a transcrição durante o amadurecimento. Duas ou-tras regiões, -1088 até -863 e -409 até -263, são inca-pazes de conferir receptividade ao etileno em fruto a-inda verde, mas são suficientes para expressão de geneE8 durante o amadurecimento.
0 promotor da sintase-1 (Sh) de sacarinade milho que no milho expressa a sua enzima controladaem altos níveis de endosperma, sob níveis muito reduzi-dos em raízes e não em tecidos verdes ou pólen foi re-portado como expressando um gene repórter quimérico, β-glicoronidase (GUS), especificamente em células de flo-ema de tabaco que são abundantes nas hastes e raízes.Yang et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.,87:4144-4148. Este promotor é, desta forma, de utili-dade para órgãos de plantas tais como frutas polpudastais como melões, por exemplo, cantaloupe, ou sementesque contêm endosperma e para raízes que são dotadas dealtos níveis de células de floema.
Outro promotor específico de tecido exem-plificativo é o promotor de lecitina, que é específicopara tecido de sementes. A proteína de lecitina nassementes da soja é codificada por um gene distinto(Lel) que é apenas expressado durante a maturação dasemente e contribui com derca de 2 até cerca de 5 porcento do mRNA total da semente. O gene de lecitina e opromotor específico de semente foram plenamente carac-terizados e usados para encaminhar a expressão especí-fica da semente em plantas de tabaco transgênicas.Vide, por exemplo, Vodkin et al. (1983) Cellf 34:1023 eLindstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160.
Um promotor de expressão específico de tu-bérculo particularmente preferido é a região de flan-queio 5' do gene patatin da batata. 0 uso deste promo-tor encontra-se descrito em Twell et al. (1987) PlantMol. Biol., 9:365-375. Este promotor está presente emum fragmento de cerca de 406 bp de bacteriofagos LPOTI.o promotor de LPOTI tem regiões de mais de 90 por centode homologia com quatro outros promotores de patatin ecerca de 95 por cento de homologia sobre todas as 400bases com promotor de patatin PGT5. Cada um destespromotores é de utilidade neste contexto. Vide, também,Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12:41-50.
Além disso, outros promotores de órgãosaumentados e de órgãos específicos de plantas mais al-tas estão expostos por Benfey et al. (1988) Science,244:174-181.
Cada uma das seqüências de promotores uti-lizaos é substancialmente não afetada pela quantidadede RPBLAs na célula. Da maneira que é utilizado nestecontexto, o termo "substancialmente não afetado" signi-fica que o promotor não é sensível ao controle de rea-limentação direta (inibição) pelo RPBLAs acumulado nascélulas transformadas ou planta transgênica.
A transfecção de células de plantas utili-zando-se Agrobacterium tumefaciens é tipicamente maisbem realizada em plantas dicotiledonous. Os monocotossão usualmente mais facilmente transformados pela cha-mada transferência de protoplastos de genes direta. Atransferência de genes direta é usualmente realizadapor eletroportação, por transferência mediada por poli-etileneglicol ou bombardeio de células por microprojé-teis portadores do DNA necessário. Estes métodos detransfecção são amplamente conhecidos na técnica e nçaoprecisam ser mais discutidos neste caso. Os métodos deregeneração de plantas inteiras a partir das célulastransfectadas e protoplastos também são amplamente co-nhecidos, da mesma forma que o são as técnicas para ob-tenção de uma proteína desejada a partir de tecidos deplantas. Vide, igualmente, as patentes U.S. Nos.5.618.988 e 5.679.880 e as citações nas mesmas.
Uma planta transgênica formada utilizando-se transformação por Agrobacterium transformation, ele-troportação ou outros métodos contém tipicamente um Cí-nico gene ou cromossoma. Essas plantas transgênicaspodem ser referidas como sendo heterozigóticas para ogene adicionado. Entretanto, uma vez que o uso da pa-lavra "heterozigótica" usualmente implica na presencede um gene complementar no mesmo local do Segundo cro-mossoma de um par de cromossomas, e não existe tal geneem uma planta que contém um gene adicionado como aqui,acredita-se que um nome mais exato para essa planta éum segregante independente, porque o gene de codifica-ção de molécula híbrida exógena adicionado segrega in-dependentemente durante a mitose e a meiose. Uma plan-ta transgênica que contêm um promotor de órgão aumenta-do o qual induz um único gene estrutural que codificauma molécula quimérica HBc considerada; isto é, um se-gregante independente, constitui uma planta transgênicapreferida.
De maior preferência é uma planta transgê-nica que é homozigótica para o gene estrutural adicio-nado; ou seja, uma planta transgênica que contém doisgenes adicionados, um gene no mesmo local em cada cro-mossoma do par de cromossomas. Uma planta transgênicahomozigótica pode ser obtida casando sexualmente (sei-fing) uma planta transgênica independente que contém umúnico gene adicionado, germinação de algumas das semen-tes produzidas e analisando-se as plantas resultantesproduzidas para acúmulo de partículas de quimera aumen-tado em relação a um controle (nativo, não transgênico)ou uma planta transgênica segregante independente. Umaplanta transgênica homozígua exibe acúmulo de partícu-las de quimera aumentado em comparação com uma plantanão transgênica, nativa, e uma uma planta transgênicasegregante independente.
Deve ser compreendido que duas plantastransgênicas diferentes também podem ser associadas pa-ra produzir progênie que contém dois genes exógenos(heterólogos) adicionados segrendos independentemente.Selfing de progênie apropriada pode produzir plantasque são homozíguas para genes exógenos adicionados quecodificam uma molécula HBc quimérica. Consideram-seigualmente o retrocruzamento para uma planta de origeme o acasalamento com uma planta não transgênica.
Desta forma, uma planta transgênica destainvenção tem um gene estrutural heterólogo que codificauma molécula HBc quimérica considerada. Uma plantatransgênica preferida é um segregante independente parao gene estrutural HBc quimérico heterólogo e podetransmitir esse gene para a sua progênie. Uma plantatransgênica de maior preferência é homozigua para o ge-ne heterólogo, e transmite esse gene a toda a sua dês-cendência na combinação sexual.
Os RPBLAs expressos e as suas proteínas defusão podem ser obtidos a partir da expressão das célu-las hospedeiras por meios usuais utilizados em recupe-ração bioquímica ou biológica. Uma vez que os RPBLAssão densos em relação às outras proteínas presentes nascélulas hospedeiras, os RPBLAs são particularmente a-cessíveis a serem coletados por centrifugação de um ho-mogenado celular.
Desta forma, regiões de diferentes densi-dades são formadas no homogenado para proporcionaremuma região que contém uma concentração relativamenteaumentada dos RPBLAs e uma região que contém uma con-centração relativamente exaurida dos RPBLAs. A regiãoexaurida de RPBLAs é separada da região de concentraçãode RPBLAs relativamente aumentada, purificando destemodo a dita proteína de fusão. A região de concentra-ção de RPBLAs relativamente aumentada pode depois dissoser coletada ou pode ser tratada com um ou mais reagen-tes ou submetida a um ou mais procedimentos antes doisolamento dos RPBLAs ou da proteína de fusão nos mes-mos. Em algumas concretizações, os RPBLAs coletadossão usados como são, sem a necessidade de isolar a pro-teína de fusão, tal como onde os RPBLAs são usados comouma vacina oral. A proteína de fusão que contêm o po-lipeptidio biologicamente ativo pode ser obtida a par-tir dos RPBLAs coletados por dissolvimento da membranecircundante em um amortecedor aquoso que contém um de-tergente e um agente de redução, tal como discutido an-teriormente. Agentes de redução ilustrativos incluem2-mercaptoetanol, ácido tioglicólico e sais de tiogli-colato, ditiotreitol (DTT), ions de sulfito ou bissul-fito, seguidos por métodos de isolamento da proteínausuais. Sulfato dodecil de sódio (SDS) é o detergentepreferido, muito embora possam ser utilizados outrosagentes tensoativos iônicos (deoxicolato, 'N-Lauroilsarcosina, e assemelhados) não iônicos (Tween®20, Nonidet® P-40, octil glicosido e assemelhados) ezuiteriônicos (CHAPS, Zwittergent™ 3-X série e asseme-lhados). Utiliza-se uma quantidade mínima de agentetensoativo o qual dissolve ou dispersa a proteína defusão.
VACINAS e INÓCULOS
Ainda em outra concretização da invenção,utilizam-se RPBLAs como os imunogenes de um inóculo ouvacina em um paciente humano ou hospedeiro animal ade-quando, tal como um chimpazé, camundongo, rato, cavalo,ovelha, bovino, cachorro, gato ou assemelhado. Um inó-culo pode induzir uma resposta (estímulo) de célula oude célula T, tal como a produção de anticorpos que imu-noreagem com a determinante epítope imunogênica ou de-terminante antigênica, ou ativação de célula T para e-sas epitope, enquanto que a vacina proporciona proteçãocontra a entidade a partir da qual o imonogene foi de-rivado por meio de uma ou das duas respostas da célulaB ou da célula T.
Os RPBLAs de uma vacina ou inóculo em con-sideração parecem agir nas células de apresentação deantigeno (APCs) tais como células dendriticas e monóci-tos / macrófagos que engolfam os RPBLAs e processam oseu conteúdo. Ao agir nesses tipos de células, os RP-BLAs aperfeiçoam a distribuição de antigeno para as cé-lulas de apresentação de antigeno. Esses RPBLAs tambémaperfeiçoam o processamento de antigeno e apresentaçãoàs células de apresentação de antigeno.
Desta forma, a invenção também considerauma vacina ou inóculo que compreende uma quantidade e-fetiva imunogênica de conjuntos semelhantes a corpoproteinico recombinante (RPBLAs) que são dissolvidos oudispersados em um diluente farmaceuticamente aceitável.Os RPBLAs contêm uma proteína recombinante de fusão quecontém ela mesma duas seqüências ligadas entre si, emque uma seqüência é uma seqüência indutora de proteínacorpórea (PBIS) e a outra é um polipeptídio biologica-mente ativo ao qual deve ser induzida uma resposta imu-nológica pela dita vacina ou inoculo.
A ativação da célula T pode ser medida poruma variedade de técnicas. Na prática usual, um animalhospedeiro é inóculosdo com uma vacina ou inoculo deRPBLA considerada, e células sangüíneas mononuclearesperiféricas (PMBC) são, depois disso, coletadas. TaisPMBC são então cultivadas in vitro na presence do poli-peptidio biologicamente ativo (imunogene da célula T)durante um período de cerca de três a cinco dias. AsPMBC cultivadas são então ensaiadas quanto a prolifera-ção ou secreção de uma citoquina, tal como IL-2, GM-CSFde IFN-γ. Ensaios para ativação de células T são am-plamente conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, apatente U.S. No. 5.478.726 e a técnica citada na mesma.
Utilizando-se a formação de anticorpos co-mo exemplo, um inóculo ou vacina pretendida compreendeuma quantidade imunigenicamente efetiva de RPBLAs quesão dissolvidos ou dispersos em uma composição diluentefarmaceuticamente aceitável a qual, tipicamente, tambémcontém água. Quando administrado a um animal hospedei-ro em que uma resposta imunológica ao polipeptídio bio-logicamente ativo deve ser induzida pela vacina ou inó-culo, tal como um animal hospedeiro com necessidade deimunização ou em que se deseja que anticorpos sejam in-duzidos, tal como um mamífero (por exemplo, um camun-dongo, cachorro, cabra, ovelha, cavalo, bovino, mico,g., a mouse, dog, goat, sheep, horse, bovine, monkey,macaco, ou ser humano) ou ave (por exemplo, uma gali-nha, peru, pato ou ganso), um inoculo induz anticorposque imunoreagem com um ou mais determinantes antigêni-cos do polipeptídio biologicamente ativo visado.
A quantidade de imunogene RPBLA utilizadoem cada imunização é referida como uma quantidade imu-nogenicamente efetiva e pode variar amplamente, na de-pendência inter alia, do imunogene RPBLA, do pacienteimunizado e da presença de um adjuvante na vacina, talcomo discutido adiante. As quantidades imunogenicamen-te efetivas para uma (i) vacine e um (ii) inóculo pro-porcionam a (i) proteção ou (ii) anticorpo ou atividadede célula T, respectivamente, discustidas anteriormenteneste contexto.
As vacinas ou inóculos contêm tipicamenteuma ccncentração de imunogene RPBLA de cerca de 1 mi-crograma até cerca de 1 miligrama por inóculosção (doseunitária), e preferentemente cerca de 10 microgramasaté cerca de 50 microgramas por dose unitária. O termo"dose unitária" quando ela é pertencente a uma vacinaou inóculo da presente invenção refere-se a unidadesfisicamente distintas, adequadas como dosagens unitá-rias para animais, cada unidade que contém uma quanti-dade predeterminada de material ativo calculada paraproduzir individualmente ou colectivamente o efeito i-munogênico desejado em associação com o diluente reque-rido; ou seja, carreador ou veiculo.
As vacines ou inóculos são tipicamentepreparados a partir de um imunogene RPBLA recuperadopela dispersão do imunogene, na forma particulada, emum veiculo diluente fisiologicamente tolerável (aceitá-vel) tal como água, solução salina, solução salina a-mortecida com fosfato (PBS) , solução salina amortecidacom acetato (ABS), solução de Ringer, ou assemelhadapara formar uma composição aquosa. 0 veículo diluentetambém pode incluir materiais oleaginosos, tais comoóleo de amendoim, squalane, ou squalene, tal como édiscutido mais adiante.
A preparação de inóculos e vacinas quecontêm materiais proteináceos como ingredientes ativostambém é amplamente compreendida na técnica. Tipica-mente, tais inóculos ou vacinas são preparadas como pa-renterais, seja como soluções líquidas ou suspensões;formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensãoem, líquido antes da injeção, também poderão ser prepa-radas. O preparado também pode ser emulsionado, o queé particularmente preferido.
Os RPBLAs imunogenicamente ativos são fre-qüentemente misturados com excipientes os quais sãofarmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingre-diente ativo. Excipientes adequados compreendem, porexemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, eta-nol, ou assemelhados e as suas combinações. Adicional-mente, se desejado, um inóculo ou vacina pode conterquantidades mínimas de substâncias auxiliares, tais co-mo agentes de umedecimento ou emulsionamento, agentesamortecedores de pH que aumentam a eficácia imunogênicada composição.
A palavra "antígeno" foi usada historica-mente para designar uma entidade que é restringida porum anticorpo ou receptor, e também para designar a en-tidade que induz a produção do anticorpo. A utilizaçãomais comum limita o significado de antigeno a essa res-trição de entidade por um anticorpo ou receptor, en-quanto a palavra "imunogene" é usada para a entidadeque induz a produção de anticorpo ou se vincula ao re-ceptor. Onde uma entidade discutida neste contexto étanto imunogênica quanto antigênica, a referência feitaà mesma seja como imunogene ou como antigene é feitatipicamente de acordo com a utilização que se pretendepara a mesma.
"Determinante antigênica" refere-se à par-te estrutural efetiva do antigeno que é imunologicamen-te vinculada por um local de combinação de anticorpo oureceptor de célula Τ. O termo também é usado permuta-velmente com "epitope".
Da maneira que é usado neste contexto, otermo "proteína de fusão" designa um polipeptídio quecontém pelo menos duas seqüências de resíduos de amino-ácidos normalmente não encontradas ligadas em conjuntona realidade que são operacionalmente ligadas uma à ou-tra ponta com ponta (cabeça com caauda) por uma ligaçãode peptídio entre seus respectivos resíduos de aminoá-cido carboxi- e amino-terminal. As proteínas de fusãoda presente invenção são quimeras de uma seqüência in-dutora de proteína corpórea (PBIS) ligada a uma segundaseqüência que é um produto de polipeptídio biologica-mente ativo product (por exemplo, peptídio ou proteína)de interesse (objetivo).Sem maiores pormenores, acredita-se queaquele versado na técnica pode, utilizando a descriçãoprecedente e os exemplos detalhados expostos adiante,utilizar a presente invenção na sua extensão plena. Asconcretizações especificas preferidas seguintes deve-rão, portando, ser consideradas como meramente ilustra-tivas, e não limitativas do restante da exposição emhipótese alguma.
Exemplo 1: Acúmulo de proteínas de fusão derivadas deRX3-ECFP em frações densas de célulastransfectadas de mamíferos
A codificação de seqüências de polinucleo-tídios para a seqüência de codificação de gama-zeína N-terminal RX3 (W02004003207) foi fundida diretamente, ouatravés de um aglutinante que consiste de cinco glici-nas, à extremidade 5' da ECFP de codificação de seqüên-cia, uma variante fluorescente de ciano GFP. Aquelasconstruções (Figura IA) que codificam as proteína defusão RX3-ECFP ou RX3-Gx5-ECFP foram introduzidas emcélulas cultivadas de mamífero CHO pelo método detransfecção baseado em Lipofectamina (Invitrogen). Cé-lulas CHO transfectadas com plasmídio pECFP-Nl (Clonte-ch) que continham a seqüência de genes da ECFP citoso-lica, foram usadas como controles.
Extratos de células de mamífero transfec-tadas foram carregados em gradients de etapas de densi-dade e centrifugadas. O acúmulo de proteínas recombi-nantes nas diferentes frações foi analisado por imuno-mancha (Figura 2A). Os resultados expostos nesta Figu-ra indicam que RX3-ECFP e RX3-Gx5-ECFP apareceram nasfrações F42, F56 e P correspondentes a RPBLAs densos,(Figura 2A, faixas 3-5) . Este resultado demonstra queas proteínas de fusão são capazes de agrupar e induzira formação de RPBLA. Alguma proteína de fusão tambémfoi detectada na fração sobrenadante (Figura 2A, faixa1), representando provavelmente proteínas de fusão pro-venientes das RPBLAs solubilizadas parcialmente duranteo processo de extração, ou proteínas de fusão apenassintetizadas que não foram agrupadas.
Contrariamente, quando extrato de célulasde mamífero transfectado com o plasmídio de controlepECFP-Nl foi carregado nos mesmos gradientes de etapade densidade, a proteína ECFP foi observada exclusiva-mente no sobrenadante. Não se observaram quaisquer re-síduos de ECFP nas frações densas, indicando que a ECFPpor si mesma não é capaz de agregar-se e formar estru-turas semelhantes a PB.
Exemplo 2: Acúmulo de ECFP ativo fundido aos domíniosde PBIS em RPBLAs de células transfectadasde mamíferos
Para se determinar se as proteínas de fu-são RX3-ECFP, RX3-Gx5-ECFP e 22aZ-ECFP são ativas den-tro das RPBLAs, realizaram-se analyses microscópicasconfocais nas células CHO transfectadas com as constru-ções que as codificam (Figura IA). Imagens fluorescen-tes de ciano foram coletadas sob excitação de 458 nmcom o laser de íon de argônio utilizando-se uma janelade emissão ajustada em 470-530 nm. Tal como ilustradona na Figura 3, as correspondentes proteínas de fusão,RX3-ECFP (Figura 3A) e RX3-Gx5-ECFP (Figura 3B) e 22aZ-ECFP (Figura 3D) , foram detectadas no retículo endo-plásmico, indicando que o peptídio de sinal de gama-zeína e alfa-zeína é funcional em células de mamíferosem que elas promovem a mediação da translocação da pro-teína de fusão no ER.
É importante observar que as proteínas defusão surpreendentemente parecem estruturas esféricasgrandes e densas preferencialmente acumuladas que lem-braram fortemente tanto PBs naturais de sementes de ce-reais quanto RPBLAs nos sistemas heterólogos visualiza-dos por imunodetecção. A fluorescência intensa obser-vada nestas estruturas indica que a proteína de fusãopermanence apropriadamente dobrada e, portanto, ativa,apesar de ser altamente compactada dentro das RPBLAs.É igualmente importante observer que os domínios deRX3, bem como outras seqüências indutoras de corpos deproteínas (PBIS) responsáveis pela formação de estrutu-ras semelhantes a PB e PBs contêm múltiplos resíduos decisteínas. Muito embora possa ser prognosticado queestas cisteínas poderão formar ligações de bissulfuretocom as cisteínas de proteínas visadas e, portanto, in-terferir com o dobramento apropriado das proteínas vi-sadas, isto não foi observado como sendo o caso. Ob-servaram-se tanto a proteína visada ativa (fluorescên-cia de ECFP) quanto a PBIS functional (formação de RP-BLAs).
Como um controle, utilizou-se a construçãopECFP-Nl para transfectar células CHO. A expressão deuma ECFP cistólica mostrou um padrão de fluorescênciahomogênea por toda a célula, incluindo o núcleo (Figura 3C).
Exemplo 3: Localização subcelular de outras proteínasfluorescentes fundidas ao RX3 em células CHO.
A localização sub-celular da proteína defusão RX3-DsRED e RX3-GFP em células CHO transfectadastransientemente foi analisada por microscopia confocalcom a finalidade de analisar se outras proteínas fluo-rescentes que não ECFP fundidas à RX3 são apropriada-mente dobradas dentro das RPBLAs e bioativas. É impor-tante observar que DsRED não compartilham de homologiacom ECFP, o que implica em um mecanismo de dobramentocompletamente diferente. Obtiveram-se micrográficos apartir das células transfectadas pelo uso de um micros-cópio de varredura a laser confocal (Leica TCS SP, Hei-delberg, Germany) equipado com espectrofotômetros paraseleção de comprimento de onda de banda de emissão.
Imagens fluorescentes verdes foram coletadas sob exci-tação de 488 nm com o laser de íons de argônio, pelouso de uma janela de emissão ajustada para 495-535 nm.
Imagens fluorescentes vermelhas foram coletadas depoisde excitação a 543 nm com um laser HeNe e janela de e-missão de 550-600. As seções ópticas foram de 0,5 μιηde espessura.
A expressão das proteínas de fusão RX3-GFP(Figura 3E) e RX3-DsRED (Figura 3F) nas células CHOproduziram uma grande quantidade de RPBLAs de forma re-donda altamente fluorescentes. Estes resultados con-firmam que as duas proteínas de fusão são apropriada-mente dobradas e ativas dentro das.
Exemplo 4: Localização subcelular de proteínas de fu-são RX3 fluorescentes em plantas e insetos
Com a finalidade de analisar se outrascélulas hospedeiras que não células CHO podem produzirRPBLAs que contém proteínas fluorescentes ativas fundi-das aos domínios de RX3, transformaram-se transiente-mente plantas de tabaco com RX3-GFP mediante agroinfil-tração por seringa. A análise por meio de microscopiaconfocal das células epidérmicas (Figuras 4A e 4B) mos-traram a presence de uma grande quantidade de RPBLAsfluorescentes. Resultados assemelhados foram obtidosquando se analisaram células mesofílicas de tabaço.
Resultados assemelhados foram obtidosquanmdo se infectaram células de insetos Spodoptera SF9ou larvas de insetos (Trichoplusia ni) com codificaçãode baculovírus para a proteína de fusão RX3-DsRED. Talcomo se encontra ilustrado na Figura 4C a projeção deseções ópticas das células de insetos infectadas acumu-laram uma grande quantidade de RPBLAs fluorescentes comcerca de 0,5 micrômetro de diâmetro contendo a proteínade fusão ativa RX3-DsRED. Análise confocal de larvasinfectadas também mostrou uma quantidade impressionantede RPBLAs fluorescentes em qualquer dos tecidos anali-sados. Na Figura 4D, céulas de gordura provenientes delarvas infectadas mostraram RPBLAs que continham RX3-DsRED ativas. Interessantemente, não se observou fluo-rescência DsRED na hemolinfa de insetos, sugerindo quea proteína expressa permaneceu seqüestrada inteiramentedentro das RPBLAs.
Exemplo 5: Atividade de RX3-hGH montados de RPBLAs emcélulas CHO
Realizaram-se estudos para se determinar aatividade de hormônio de crescimento humano (hGH) pro-duzido em RPBLAs. 0 hGH foi escolhido porque esta mo-lécula contém 2 ligações de bissulfureto que são impor-tantes para o dobramento apropriado da proteína. 0 do-mínio de RX3 também contém resíduos de cisteína envol-vidos nas ligações de bissulfureto que são essenceaispara o agrupamento e estabilização das RPBLAs, que po-deria interferir no dobramento apropriado do hGH.
A construção p3.1-RX3-hGH foi introduzidanas células CHO por transfecção transiente com o proto-colo de lipofectamina (Invitrogen). Quatro dias depoisda transfecção fixaram-se as células, permebealizaram-se e incubaram-se com anti-RX3 ou um anti-soro anti-hGH(Figuras. 5A e 5B, respectivamente) e o anticorpo se-cundário conjugado a Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Apresença de grandes RPBLAs (1-3 micrômetros) contendo aproteína de fusão RX3-hGH foi observada por análise demicroscopia óptica, independentemente do anticorpo quefoi usado.
Com a finalidade de corroborar que as RP-BLAs foram organelas densas tais como descritas anteri-ormente, células CHO expressoras de RX3-hGH foram homo-genizadas, e o homogenizado carregado em um gradientede etapa de densidade centrifugado conforme descrito emoutro lugar. 0 acúmulo de RX3-hGH nas diferentes fra-ções foi analsiado por imunomancha. Tal como pode seropbservado, parte da proteína de fusão estava presenteno sobrenadante, representando RX3-hGH não agrupado,mas a maior parte da proteína de fusão foi detectada nafração F56 correspondente às RPBLAs densas (Figura 2B,faixas 2 e 5, respectivamente) .
Esta fração F56 foi diluída 3 vezes em a-mortecedor PBP4 (100 mM Tris pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mMMgCl2, 5 mM EDTA) e centrifugada a 80000xg em uma ca-çamba oscilatória para recuperar as RPBLAs na pílula.A présença de hGH foi quantificada utilizando-se um en-saio ELISA (Ativas® Human Growth Hormone ELISA - DSL-10-1900; Diagnostic Systems Laboratories, Inc), o qualfoi capaz de detectar o hGH mesmo na presença da mem-brana de intacta RPBLA.
Esta mesma amostra foi aplicada a um en-saio de bioatividade (Ativas® Bioativas Human GrowthHormone ELISA - DSL-10-11100; Diagnostic Systems Labo-ratories, Inc). Este ensaio de bioatividade é baseadona capacidade de hGH dobrado apropriadamente interagircom uma proteína de dobramento de hGH proporcionada pe-lo kit, sendo esta interação dependente de uma confor-mação funcional do hGH. A amostra deu um resultado po-sitivo em 24 ng/ml de proteína bioativa. As proteínasde hGH evidentemente foram corretamente dobradas e a-presentadas na superfície externa das RPBLAs densas.
Remoção da membrana circundando as RPBLAs por lavagem opreparado com 50 mM Tris pH 8 e 1% Triton X-IOO e porsonicação a 50% de amplitude e ciclo 50% durante 1 mi-nuto, repetidos 5 vezes (Ikasonic U200S - IKA Laborte-chnik) resultou em maior atividade específica (45ng/ml) devido à exposição de moléculas de hGH adicio-nais na superfície dos agregados.
Na determinação da atividade de hGH fundi-do à RX3, a proteína de fusão foi solubilizada a partirde RPBLAs isoladas por gradiente de densidade (F56, di-luído 3 vezes em amortecedor PBP4 e centrifugada a80000xg em uma caçamba oscilatória durante 2 horas). Aproteína de fusão foi solubilizada em amortecedor S(Tris 50 mM, pH 8, e 2% de β-ΜΕ) e sonicada (Clycle 5,Amplitude 50%, 1 minuto, repetido cinco vezes; IkasonicU200S - IKA Labortechnik). Depois de incubação a 37°Cdurante 2 horas, a amostra foi centrifugada a 5000xgdurante 10 minutos, e o sobrenadante que continha aproteína de fusão RX3-hGH solúvel foi ensaiada paraquantificar e avaliar o componente bioativo da fração.A quantidade de proteína de fusão no sobrenadante foideterminada como sendo 250 ng/ml por ELISA (Ativas® Hu-man Growth Hormone ELISA - DSL-10-1900; Diagnostic Sys-tems Laboratories, Inc). A proteína ensaiada no ensaiode bioatividade ELISA (Ativas® Bioativas Human GrowthHormone ELISA - DSL-10-11100; Diagnostic Systems Labo-ratories, Inc) proporcionou um resultado de 70 ng/ml,indicando que cerca de 30% da proteína de fusão RX3-hGHé ativa. A perda de atividade de hGH poderia ser umaconseqüência da alta concentração de agente de reduçãousado na solubilização, ou devida a algum efeito preju-dicial do domínio de RX3 sobre o hGH ou da proteína deligação de hGH.
Finalmente, a proteína de fusão RX3-hGHfoi clivada por uma protease específica de local paraliberar o hGH a partir da proteína de fusão. A proteí-na de fusão RX3-hGH solubilizada foi diluída 2 vezes ea digestão foi realizada com EKmax da maneira descritapelo fabricante (Invitrogen). Depois disso, o hGH Ii-vre foi isolado a partir da proteína de fusão não cli-vada (insolúvel) por centrifugação a 16000xg a 4°C du-rante 1 hora. 0 hGH solúvel foi recuperado a partir dosobrenadante e aplicado aos ensaios de quantificação ebioatividade provenientes da Diagnostic Systems Labora-tories. Surpreendentemente, os resultados provenientesdestes dois kits proporcionaram o mesmo valor de 90ng/ml para os ensaios de quantificação e bioatividadeELISA (Ativas® Human Growth Hormone ELISA - DSL-IO-1900; Diagnostic Systems Laboratories, Inc) e Ativas®Bioativas Human Growth Hormone ELISA - DSL-10-11100;Diagnostic Systems Laboratories, Inc), indicando destaforma que toda a proteína presente conforme detectadapelo kit de quantificação, também é determinada comosendo bioativa.
Expõe-se em seguida a tabela sumário usadapara mostrar a quantificação e bioatividade da proteínahGH em todas as formulações:
<table>table see original document page 88</column></row><table>
É importante observar que foram utilizadascélulas CHO transfectadas de forma estável com o vetorp3.1-RX3 como um controle negativo. Conforme ilustradona Figura 2B, a expressão de RX3 em células CHO tambémse acumula em estruturas densas que podem ser isaoladaspor gradiente de etapa de densidade em F56 (Figura 2B,faixa 5) . Além do mais, a análise óptica de célulasCHO transfectadas com p3.1-RX3, mostrou que a proteínaRX3 acumula-se nas RPBLAs (Figura 5C). Estes prepara-dos de controle RX3 RPBLA e proteína RX3 isolada nãomostraram atividade de hGH no ensaio de bioatividadeELISA.
Exemplo 6: Atividade de DNAb intein depois de solubi-lização de RX3-Int-hGH a partir de RPBLAsprovenientes de células CHO
A codificação de seqüências de polinucleo-tídios para a intein Ssp DNAb (New England Biolabs) foifundida no quadro à extremidade 3' da seqüência RX3(W02004003207), e à extremidade 5' do hGH cDNA. Aconstrução resultante foi clonada no vetor pcDNA3.1(-)[Figura IA] para formar o vetor p3.l-RX3-I-hGH. Comoum controle negativo, uma versão inativa da mesma inte-in foi produzida pela PCR onde o resíduo de aminoácidoAspl54 foi mudado para Ala [Figura IA] para formar ovetor p3.l-RX3-Im-hGH. 0 resíduo de aminoácido Aspl54foi reportado como sendo essencial para a atividade deauto-clivagem de Ssp DNAb (Mathys et al, GENE (1999)231:1-13).
Análise imunoquímica das células CHOtransfectadas com p3.l-RX3-I-hGH utilizando-se anti-soro anti-hGH revealaram que a proteína de fusão RX3-Int-hGH acumulada em RPBLA de forma redonda grande, si-milar àquelas observadas nas células CHO expressrorasde RX3-hGH (comparem-se as Figuras 5B e 5D). Este re-sultado indica que a proteína de fusão que contém aintein DNAb auto-agrupa-se e acumula-se nas estruturasde alta densidade.Células CHO transfectadas com p3.1-RX3-I-hGH foram homogeneizadas, os homogenados foram carrega-dos em gradients de etapa de densidade, e as fraçõescorrespondentes às diferentes densidades foram analisa-das por meio de imunomancha. A maior parte do RX3-I-hGH foi detectado na fração F56 correspondente às RP-BLAs densas (Figura 2B). Da mesma forma que para a ou-tra proteína de fusão RX3, a presença de proteína defusão RX3-I-hGH no sobrenadante provavelmente represen-ta a proteína de fusão não agrupada contida na ER e so-lubilizada durante o processo de homogeneização.
Uma vez que se demonstrou que o RX3-I-hGHfoi acumulado nas RPBLAs, estas organelas derivadas deER foram isoladas por centrifugação de baixa velocidadetal como descrito em alguma lugar neste contexto. Acentrifugação de homogenados de células CHO transfecta-das com p3.l-RX3-I-hGH a 1500xg durante 10 minutos per-mitiu a separação da proteína de fusão não agrupadaRX3-Int-hGH no sobrenadante a partir daquela agrupadanas RPBLAs na pílula. Estudos equivalentes foram rea-lizados com células CHO expressoras da proteína de fu-são inativa RX3-mInt-hGH.
As pílulas que contêm as proteínas de fu-são RX3-Int-hGH e RX3-mInt-hGH reunidas foram solubili-zadas em amortecedor Sl (20 mM Tris pH 7, 200 mM NaCl,1 mM EDTA, 0,1% SDS e 0,1 mM TCEP) a 37°C durante 2 ho-ras, e a atividade enzimática de intein foi induzidapor incubação a 25°C durante 48 horas depois de diálisecontra o amortecedor de indução de clivagem: 20 mM TrispH 7, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA. Depois de indução de au-to-clivagem de intein, a composição foi centrifugada a16000xg durante 10 minutos e o sobrenadante e a pílulaanalisada por meio de imunomancha utilizando-se anti-RX3 e anti-soro anti-hGH.
As duas proteínas de fusão foram solubili-zadas, mas somente a proteína de fusão que continha aintein ativa (RX3-Int-hGH) foi capaz de ser auto-clivada (Figuras 6A e 6B, cabeças de setas pretas). Aausência de auto-clivagem da proteína de fusão RX3-mlnt-hGH mutada demonstra que a auto-clivagem observadacom o RX3-Int-hGH é devida à atividade específica daintein, e não devida a alguma atividade de protease en-dógena co-purifiçada durante o processo de isolamentode RPBLAs.
Para otimizar-se a eficiência da auto-clivagem de intein, ensaiaram-se protocolos de solubi-lização alternaticos. A auto-clivagem de intein doRX3-Int-hGH pode ser comparada, depois da solubilizaçãocom o amortecedor Sl e o protocolo de extração bifásico(S2) descrito em algum lugar (Figura 6C). A partir darelação entre o restante da proteína de fusão de exten-são plena e o aparecimento da banda correspondente aohGH liberado, mesmo que o protocolo de extração bifási-ca fosse o mais eficiente permitindo mais de 50% declivagem, pode concluir-se que, nos dois casos, umagrande proporção de intein DNAb foi ativa e capaz deauto-clivagem.
Exemplo 7: Atividade de RX3-EGF reunidas em RPBLAsem plantas de tabaco
RPBLAs provenientes de plantas de tabacotransgênicas expressoras da proteína de fusão RX3-EGFforam isoladas por centorifugação de baixa velocidadeessencialmente conforme descrito em U.S. 11/289.264. Aproteína de fusão foi solubilizada por sonicação (Ciclo5, Amplitude 50%, 1 minuto, repetida cinco vezes; Ika-sonic U200S - IKA Labortechnik) em 50 mM Tris pH 8 e 2%de β-ΜΕ e incubação a 37°C durante 2 horas. Depoisdisso, o material solubilizado foi centrifugado a16000xg a 4°C durante 30 minutos para descartar a pro-teína de fusão não solubilizada na pílula. O sobrena-dante foi submetido a diálise contra 50 mM Tris pH 8para remover ρ β-ΜΕ, centrifugado uma vez mais a16000xg a 4°C durante 30 minutos, e o sobrenadantequantificado pelo kit de hEGF proveniente da BiosourceInternational Inc. (KHG0062).
A bioatividade de EGF foi analisada pordeterminação da taxa de proliferação (incorporação detimidina radioativa ao DNA) de células MDA-MB231 (célu-las de câncer da mama que sobre-expressam receptor deEGF) incubadas com 1,2 ng/ml de RX3-EGF proteína de fu-são. Como um controle positivo, incubaram-se célulasMDA-MB231 com 10 ng/ml de EGF comercial (Promega) ousoro de bezerro fetal (FCS). Os resultados, sumariadosna tabela seguinte são representados como por centoagem(%) de proliferação com relação à taxa de proliferaçãobasal rate de células MB231 (100%), determinada como ataxa de proliferação destas células cultivadas na au-sência de EGF (despojado).
Proliferação de células MDA-MB231
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Tal como era esperado, a suplementação decultura de células MB231 com EGF comercial (Promega) oucom a FCS produziu um aumento significativo na taxa deproliferação (158% e 145%, respectivamente). Inespera-damente, a adição de 1,2 ng/ml de RX3-EGF também produ-ziu um aumento de 14 6% da taxa de proliferação. É im-portante observar que quase que a mesma taxa de proli-feração foi observada com uma concentração de 10 vezesmais do EGF comercial do que com RX3-EGF. Este resul-tado surpreendente poderá ser explicado pelos resulta-dos anteriorres que mostraram que a saturação da taxade proliferação de célula MB231 foi observada em 5ng/ml do EGF comercial. Uma outra explicação possívelpoderá ser uma conformação mais ativa do EGF quandofundido ao RX3. Em qualquer caso, este resultado mos-tra que RX3-EGF é pelo menos tão ativo quanto o EGF co-mercial (Promega).
Exemplo 8: Atividade de RX3-GUS reunidas em RPBLAs emcélulas CHO.
A enzima β-glucuronidase (GUS) é uma pro-teína informante amplamente usada (Gilisen et al.,Transgenic Res. (1998) 7 (3) : 157-163) . A expressão deuma proteína de fusão RX3-GUS ativa em RPBLAs constitu-iu-se em um desafio, principalmente pela presença de 9resíduos de aminoácidos de cisteína, e também porqueela é uma proteína ampla (cerca de 70 kDa).
A codificação de seqüências de polinucleo-tídios para RX3 (W02004003207) foi fundida no quadro àextremidade 5' da seqüência que codifica GUS (FiguraIA. RX3-GUS), e a construção resultante foi então uti-lizada para transfectar células CHO, tais como descri-tas no Exemplo 7.
A análise imunoquímica de células CHOtransfectadas com p3.1-RX3-GUS incubadas com anti-RX3anti-soro revelou a presença de RPBLAs amplas (Figura5E). Para se verificar a densidade de tais RPBLAs, cé-lulas CHO transfectadas com o mesmo plasmídio foram ho-mogenizadas e depois disso carregadas em gradientes dedensidade escalonada. A análise das diferentes fraçõespor meio de imuno-manchas mostrou as proteínas de fusãolocalizadas nas frações densas mais altas (Figura 2B.F56) , indicando que as proteínas de fusão RX3-GUS sãocapazes reunir-se e acumular-se nos RPBLAs densos. Éimportante notar que nenhuma proteína de fusão foi de-tectada no sobrenadante, significando que quase toda aRX3-GUS é reunida em estruturas densas (RPBLAs).
Uma vez que foi demonstrado que a RX3-GUSacumularam-se em RPBLAs, a proteína de fusão foi recu-perada a partir da fração F56 (tal como descrita no E-xemplo 5 para RX3-hGH) e solubilizadas em 50 mM Tris,pH 8, β-ΜΕ 2% e SDS 0,1% a 37°C durante 2 horas. De-pois disso, o material solubilizado foi centrifugado a16000xg sob temperatura ambiente durante 10 minutos, eo sobrenadante que continha a proteína de fusão RX3-GUSdesassociada solúvel foi submetido a diálise a 4°C con-tra uma solução 50 mM Tris pH 8 durante a noite (cercade 18 horas).
O teste de atividade de GUS é baseado nacatálise de ácido metilumbeliferil-p-glicuronida (MUG)para o produto fluorescente de 4-metilumbeliferona (4-MU), pela enzima GUS (Jefferson et al. 1987 EMBO J.6(13):3901-3907). Cinqüenta μΐ da proteína de fusãoRX3-GUS solubilizada (em torno de 0,25 ng de RX3-GUS/μΙ) foram incubados na presença de MUG sob tempera-tura ambiente, e o aparecimento de 4-MU foi realizadoem um fluorímetro (comprimento de onda de excitação de355 nm; comprimento de onda de emissão 420 nm) . Pararejeitar a possibilidade de medir a atividade semelhan-te a GUS endógena presente na preparação de RPBLAs apartir de células CHO, isolaram-se RPBLAs a partir decélulas CHO transfectadas com p3.1-RX3, e uma vez que aproteína RX3 foi solubilizada, esta amostra foi incluí-da no teste de atividade como um controle. A tabelaexposta em seguida sumaria os resultados obtidos:
Absorvência a 420 nm
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A partir dos resultados ilustrados nestatabela, é evidente que a proteína de fusão RX3-GUS per-manece ativa uma vez solubilizada a partir dos RPBLAs.A atividade específica da RX3-GUS calculada a partirdestas experiências foi de 0,2 pmol de 4-MU/ min-1 *12,5 ng-1 de RX3-GUS. Não se observou qualquer ativi-dade semelhante a GUS endógena significativa quando seanalisou a preparação de RX3.
Exemplo 9: Atividade de RX3-EK reunidas em RPBLAs emcélulas CHO
A enteroquinase Bos taurus (enteropeptida-se) é uma protease de serina ligada por membrana da mu-cosa duodenal, envolvida no processamento do tripsino-gênio para pripsina (DDDKi) com um domínio de proteasede serina semelhante a quimiotripsina. A enteropepti-dase é um peptídio de duas cadeias ligadas por bissul-fureto formadas pela cadeia pesada (EKHc ~ 120 kD) epela cadeia leve catalítica (EKlc - 47 kD) . A subuni-dade catalítica (aqui chamada de EK) é quase tão ativae específica por si mesma quanto a hinteira (LaVallieet al. 1993 J. Biol. Chem. 268(31):23311-23317). É im-portante salientar que a EK bovina tem 4 ligações debissulfureto. Além do mais, a extremidade terminal-Nda proteína é dobrada dentro da proteína, e é essencialpara o dobramento apropriado de um EK funcional. Estesdois requisiros da EK fazem da proteína EK uma proteínaprovocante a ser expressa como uma proteína ativa nasRPBLAs.
A codificação de seqüências de polinucleo-tídios para RX3 (W02004003207) foi fundida através deum aglutinante que compreende o local de clivagem deFXa (IEGR) à extremidade 5' da seqüência EK, e clonadaem pcDNA3.1(-) (Figura IA, p3.1-RX3-EK).
Esta construção foi usada na transfecçãode células CHO pelo método de lipofectamina (Invitro-gen). A análise de imuno-química dessas células trans-fectadas com anti-soro anti-RX3 revelou a presença deuma grande quantidade de pequenas RPBLAs. Estas orga-nelas foram observadas ao longo de todo o citoplasmadas células transfectadas, mas a dimensão usualmentenão excedeu 0,5 micrômetros (Figura 5F).
Para verificar a densidade dessas pequenasRPBLAs, as células CHO transfectadas com o mesmo plas-midio foram homogenizadas e carregadas nos gradientesde densidade escalonada. A proteína de fusão RX3-EKfoi localizada na fração F56 (Figura 2B). A alta den-sidade dos conjugados de proteína de fusão RX3-EK suge-re que esta proteína de fusão acumula-se em RPBLAs den-sas. É importante observar-se que nenhuma proteína defusão foi detectada no sobrenadante, significando quequase toda a RX3-EK é reunida em estruturas densas (RP-BLAs). De acordo com um aspecto interessante, o pesomolecular da proteína de fusão RX3-EK foi estimado em58 KDa, cerca de 15 KDa mais alto do que o peso mole-cular teórico. Este resultado sugere que o EK na RP-BLAs é altamente glicosilado, tal como foi descrito pa-ra a proteína natural (LaVallie et al., 1993 J. Biol.Cheia. 268 (31) : 23311-23317 ) .
A proteína de fusão foi recuperada a par-tir da fração F56 (tal como descrita no Exemplo 5 paraRX3-hGH) e solubilizada em 50 mM Tris, pH 8, β-ΜΕ 2% eSDS 0,1% at 37°C durante 2 horas. Para aumentar-se asolubilização, a amostra foi sonicada a 50% de amplitu-de e 50% ciclos durante 1 minuto, repetido 5 vezes (I-kasonic U200S - IKA Labortechnik), antes de adicionar-se SDS. Depois disso, a amostra foi centrifugada a5000xg sob temperatura ambiente durante 10 minutos, e osobrenadante que continha a proteína de fusão RX3-EKdesmanchada solúvel foi submetido a diálise a 40C con-tra uma solução de 50 mM Tris pH 8, durante a noite(cerca de 18 horas). Então, a proteína de fusão foidigerida por FXa tal como descrito pelo fabricante(Quiagen) , e a atividade de EK foi medida por ensaiofluorimétrico (Grant, et al., 1979 Biochim. Biophys.Acta 567:207-215). O EK liberado a partir da RX3-EKtinha atividade de enteropeptidase.
Exemplo 10: Atividade de RX3-Casp2 e RX3-Casp3 reuni-das em RPBLAs em células CHORealizaram-se estudos para se determinar aatividade de caspases produzidas em RPBLAs. As caspa-ses são uma família de proteases de cisteína que reali-zam clivagem com alta especificidade depois um ácidoaspártico de uma seqüência de consenso. Elas são osexecutants principais do processo de apoptose altamenteregulado.
As caspases existem como pró-caspases ina-tivas com um predomínio de extensão variável seguidapor uma subunidade ampla (p20) e uma subunidade pequena(plO) . Elas são ativadas através de proteólise e cas-pase ativa madura consiste do heterotetrâmero p202-pl02(Lavrik et al., 2005 J. Clin. Invest. 115:2665-2671).As caspases são divididas em caspases iniciadoras ecaspases executantes que diferem no seu mecanismo deação. A caspase2 (caspase iniciadora) e caspase3 (cas-pase executante) foram escolhidas como um exemplo deproteínas que são nas RPBLAs (Baliga et al., 2004 CellDeath e Differentiation 11:1234-1241; Feeney et al.,2006 Proteína Expression e Purification 47(1):311-318).
Essas proteínas são especialmente desafiantes porqueelas são sintetizadas como zimogenes que, para se tor-narem ativos, precisam ser auto-clivados e formarem oheterotetrâmero.
As construções p3.1-RX3-C2 e p3.1-RX3-C3(Figura 1) foram introduzidas nas células CHO portransfecção transiente com o protocolo de lipofectamina(Invitrogen). Quatro dias depois da transfecção, parase determinar se as caspases estão acumuladas em orga-nelas RPBLAs densas, homogenizaram-se células CHO ex-pressoras de RX3-Casp2 ou RX3-Casp2, carregaram-se emum gradiente de etapa de densidade e centrifugaram-seconforme descrito em outro lugar.
0 acúmulo das duas proteínas de fusão decaspases-RX3 nas diferentes frações foi analisado pormeio de imunomancha (Figura 2B). Tal como poderá serobservado, a maior parte das proteínas de fusão RX3-Casp2 ou RX3-Casp2 sedimentaram para a fração F56 e F42correspondente às RPBLAs densas. Esta resultado indicaque estas duas proteínas de fusão são capazes de reu-nir-se estreitamente em estruturas densas.
Na imunomancha apresentada na Figura 2B,somente foi ilustrada a extensão plena da proteína defusão, mas bandas de peso molecular diferente estãopresentes nesta fraação. Estas bandas sendo reativas aqualquer anticorpo anti-RX3 ou anticorpo anti-CASP (SA-320 e SA-325, Biomol International) correspondem às di-ferentes subunidades de Caspase, indicando que ocorreuativação autocatalitica dentro das RPBLAs. Estas ob-servações indicam que Caspase2 e Caspase3 são ativas invivo.
As frações F56 e F42 foram diluídas 4-vezes em amortecedor PBP4 e centrifugadas a 80000xg emuma caçamba oscilante para recuperar as RPBLAs na pílu-la. A membrana ER que circunda esta organela foi remo-vida por lavagem do preparado de RPBLAs com 50 mM TrispH 8 e 1% Triton X-IOO. Na remoção da membrana ER, aatividade de caspase é ensaiada utilizando-se o BIOMOLQuantiZymeTM Assay System, CASPASE-3 Celular ActividadAssay Kit PLUS-AK703 (caspase 3) e BI0M0L QuantiZymeTMAssay System, CASPASE-2 Celular Atividade Assay KitPLUS-AK702 (caspase 2). Este kit mede a ativideade dacaspase colorimetricamente com um substrato específico.A RX3-Casp2 e a RX3-Casp3 RPBLAs exibem atividade deCaspase.
Na determinação da atividade de Caspasesfundidas a RX3, a proteína de fusão é solubilizada apartir de RPBLAs isolada por gradiente de densidade(F56 e F42, diluído 4 vezes em amortecedor PBP4 e cen-trifugado a 80000xg em uma caçamba oscilante). A pro-teína de fusão é solubilizada em amortecedor CA (50 mMHepes, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM DTT, 1%CHAPS, 10% glicerol) depois de sonicação (amplitude de50% e ciclo de 50% durante 30 segundos, 5 vezes) . Asolubilização é realizada por uma incubação de 2 horasa 37°C e o material insolúvel é descartado por centri-fugação a 16000xg durante 10 minutos. 0 sobrenadanteque continha a proteína de fusão RX3-casp solúvel ésubmetida a diálise contra amortecedor de ensaio de kitde caspase (50 mM Hepes, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM ED-TA, 10 mM DTT, 0,1% CHAPS, 10% glicerol) . A atividadeda amostra submetida a diálise que continha RX3-Casp2 eRX3-Casp3 é avaliada com o BIOMOL QuantiZymeTM AssaySystem, CASPASE-3 Celular Atividade Assay Kit PLUS-AK7 03 (caspase 3) e BIOMOL QuantiZymeTM Assay System,CASPASE-2 Celular Atividade Assay Kit PLUS-AK702 (cas-pase 2). A Caspase 2 e a Caspase 3 são ativas.
Exemplo 11: Atividade de RX3-RTB reunida em RPBLAs em
plantas de tabaco agroinfiltradasA codificação de seqüências de polinucleo-tídios para RTB (Reed et al., 2005 Plant Cell Report24:15-24) foi fundida no quadro à extremidade 3' de do-mínio RX3 e clonada em um vetor binário (pB-RX3-RTB).
Esta construção foi usada em plantas detabaco transformadas por agroinfiltração de seringa,tal como descrita em algum lugar neste contexto. Asfolhas de tabaco agroinfiltradas foram homogeneizadas de carregadas em gradientes de densidade escalonada. Aproteína de fusão RX3-RTB foi localiada em frações F42e F56 (Figura 2B) , sugerindo que a proteína de fusãoauto-reune-se e acumula-se em RPBLAs densas. Tal comodescrito para RX3-EK, a proteína de fusão RX3-RTB iso-lada a partir das RPBLAs tem uma mobilidade eletroforé-tica mais baixa em comparação com o peso molecular teó-rico. Este resultado sustenta que RTB pode ser glico-silada em RPBLAs.
A proteína de fusão foi recuperada a par-tir daquelas frações densas (tais como descritas no E-xemplo 5 para RX3-hGH) e solubilizadas em 50 mM Tris,pH 8, β-ΜΕ 0,8% a 37°C durante 2 horas. Para aumentara solubilização, a amostra foi sonicada sob amplitudede 50% e ciclo de 50% durante 1 minuto, repetida 5 ve-zes (Ikasonic U200S - IKA Labortechnik). Depois disso,a amostra foi centrifugada a 5000xg sob temperatura am-biente durante 10 minutos, e o sobrenadante que conti-nha a RX3-RTB desassociada solúvel foi analisada porELISA para ligação de fetuin de glicoproteína tratadocom sialidase para expor glicans terminados em galacto-se. A RX3-RTB liga-se ao mesmo.
Exemplo 12: Construção de plasmídio para transformaçãode planta
As seqüências de codificação do fator decrescimento epidérmico humano (hEGF) foram obtidas sin-teticamente e foram modificadas a fim de otimizar suautilização codon para expressão em plantas.
Proteína hEGF (SEQ ID NO:41)
DNA hEGF (SEQ ID NO:42)O gene sintético que codifica o hEGF ativode 53 aminoácidos foi obtido por meio do método PCR deextensão de sobreposição de preparador, utilizando-se 4oligonucleotidios de cerca de 60 bases, com 20 bases desobreposição. O cDNA de hEGF sintético incluiu umaseqüência de aglutinante 5' correspondente ao local declivagem especifico de Fator Xa. Os oligonucleotidiosforam purificados por gel de desnaturação de poliacri-lamida.
O cDNA de hEGF sintético foi purificado apartir de gel de agarose (Amersham) e clonado no vetorpGEM (Promega). 0 fragmento RX3 cDNA (codificação paraum domínio N-terminal de gama-zeína) que continha ex-tremidades coesas de BspHI e NcoI, foi inserido no ve-tor pCKGFPS65C (Reichel et al., 1996 Proc. Natl. Acad.Sei. USA 93:5888-5893) previamente digerido com NcoI(tal como descrito no pedido de patente W02004003207).A codificação de seqüências para EGF foi fundida noquadro à seqüência RX3. A construção RX3-EGF foi pre-parada por substituição da seqüência de codificação GFPpara o gene sintético EGF.
A construção resultante chamada pCRX3EGFcontinha uma seqüência de ácido nucléico que encaminhaa transcrição de uma proteína como o promotor 35S au-mentado, um intensificador de transformação como o ví-rus de causticação de tabaco (TEV), a seqüência de co-dificação EGF e as seqüências de poliadenilação 3' apartir do vírus mosaico da couve-flor (CaMV). O vetorde transformação de planta efetivo pl9RX3EGF foi porultimo obtido por inserção dos cassetes de expressãoHindIII/HindIII dentro do vetor binário pBinl9 (Bevan,1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721).
O cDNA que codifica a alfa-zeína de 22 kD(22aZ) e a prolamina de arroz de 13 kD (rP13) foram am-plificados por RT-PCR proveniente de uma biblioteca decDNA proveniente de W64A de milho e cultivo de arrozSenia, respectivamente. Os oligonucleotídios usados nareação de PCR foram:
22aZ-5' (SEQ ID NO:43)
22aZ-31 (SEQ ID NO:44)
Arrozl3Prol-5' (SEQ ID NO:45)
Arrozl3Prol-31 (SEQ ID NO:46)
Os fragmentos de PCR correspondentes foramclonados no vetor pCRII (Invitrogen), secuenciados eclonados em vetores pUC18 que continham o promotor deCaMV 35S intensificado, a seqüência TEV e o terminador3' ocs. 0 pCRII-rP13 foi digerido por SalI e NcoI, eclonado nos plasmídios pUC18RX3Ct, pUC18RX3hGH epUC18RX3EGF digeridos pelas mesmas enzimas para seobter o plasmídio pUC18rP13EGF. 0 pCRII-22aZ foidigerido por Sall/Ncol e clonado no plasmídiopUC18RX3EGF digerido pelas mesmas enzimas para se obtero plasmídio pUC1822aZtEGF. Finalmente, o vetor deriva-do de pUC18 foi clonado em pCambia 5300 por HindII-I/EcoRI.
O construtor pBIN m-gfp4-ER, continha umGFP otimizado para expressão em plantas (Haseloff etal., 1997 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:2122-2127).Esta construção foi usada como gabarito para amplifica-ção de PCR do GFP. Os oligonucleotidios foram projeta-dos para eliminar o peptidio de sinal e tema HDEL pre-sente na seqüência original, bem como para introduziros locais de restrição para clonagem mais adiante.Preparadores:
GFP 5' (SEQ ID N0:50)
GFP 3' (SEQ ID N0:51)
O produto PCR foi clonado em um vetor declonagem de PCR (PCR®II Vector, Invitrogen)) e a se-qüência verificada. 0 fragmento GFP que continhaRcal/BamHI extremas coesas foi clonado em pUC18RX3hGH(US2006123509 (Al)), proporcionando o cassete RX3-GFPem um vetor pUC18. Este cassete foi liberado por di-gestão de HindIII/BamHI e subseqüentemente inserido emum vetor pCAMBIA 2300 (pB-RX3-GFP)
O The clone RTB (n° de acesso no GenBank,X03179) foi amplificado por PCR (RTB5 e RTB3) e digeri-do por Rcal/Smal. 0 fragmento PCR digerido foi clonadoem pUC18RX3hGH (US2006123509 (Al)) digerido porNcol/Smal para obter pUC18RX3RTB. Então, este vetorfoi digerido por HindIII/EcoRI e o fragmento liberadoclonado em um vetor pCAMBIA 2300 digerido pelas mesmasenzimas de restrição (pB-RX3-RTB).
Preparadores:
RTB5 (SEQ ID NO:52)
RTB3 (SEQ ID NO:53)
Material de Planta
Cultivaram-se plantas de tabaco (Nicotianatabacum var. Wisconsin) em uma câmara de produção invitro a 24-26°C com um fotoperiodo de 16 horas. Culti-varam-se plantas adultas em estufa entre 18-28°C, a u-midade foi maintida entre 55 e 65% com fotoperiodo mé-dio de 16 horas.
Desenvolveram-se Pequenas plantas para ométodo de agroinfiltração (Vaquero et al., 1999 Proc.Natl. Acad. Sci., USA 96(20) :11128-11133; Kapila etal., 1997 Plant Sei. 122:101-108) a partir de sementesdurante 4-6 semanas nas condições in vitro descritasanteriormente.
Transformação estável de tabaco
Os vetores binários foram transferidos pa-ra a variedade LBA4404 de A. tumefaciens. Discos defolha de tabaco (Nicotiana tobaccum, W38) foram trans-formados conforme descrito por Draper e Hamil 1988,In: Plant Genetic Transformation e Gene Expression. ALaboratory Manual (Eds. Draper, J., Scott, R., Armit-age, P. e Walden, R.), Blackwell Scientific Publica-tions. Selecionaram-se plantas regeneradas em meioque continha 200 mg/l canamicina e transferiram-se pa-ra uma estufa. Plantas de tabaco transgênicas dotadasde níveis de produto transgene mais alto foram culti-vadas a fim de obterem-se gerações de Tl e T2.
Níveis de proteína recombinante foram de-tectados por imunomancha. Os extratos de proteína to-tal provenienets das folhas de tabaco foram quantifi-cados por ensaio de Bradford, separados em SDS-PAGE15% e transferidos para membranas de nitrocelulose u-tilizando-se um Mini Trans-Blot Electrophoretic Trans-fer Cell (Bio Rad). As membranas foram incubadas comanti-soro de gama-zeína (diluição 1/7000) (Ludevid etal. 1985, Plant Science 41:41-48) e foram então incu-badas com anticorpos peroxidase-conjugados de raiz-forte (diluição de 1/10000, Amersham Pharmacia). ban-daa imuno-reativas foram detectadas por quimiolumines-cência aumentada (ECL western blotting system, Amer-sham Pharmacia).
Agroinfiltração de Tabaco
Agroinfiltração a vácuo
Desenvolveram-se pequenas plantas para ométodo de agroinfiltração a partir de sementes durante4-6 semanas em uma câmara de crescimento in vitro a 24-26°C com um fotoperíodo de 16 horas.
Desenvolveu-se uma variedade A. tumefaci-ens LB4404 que continha uma construção desejada em meiode LB (Triptone 10 g/l, extrato de fermento 5 g/l, NaCl10 g/l) suplementado com canamicina (50 mg/l) e rifam-picina (100 mg/l) a 28°C com agitação (250 rpm) durantea noite (cerca de 18 horas). Inocularam-se então a-grobactérias em 30 ml de LB também suplementado com ca-namicina (50 mg/l) e rifampicina (100 mg/l). Depois decultura durante a noite a 28°C (cerca de 18 horas),coletaram-se as células agrobacterianas por centrifuga-ção durante 10 minutos a 3000xg e re-suspenderam-se em10 ml de meio de MS liquido com MES (Sigma Chemical)4,9 g/l e sacarina 30 g/l a pH 5,8. A cultura bacteri-ana foi ajustada para um OD6oo final de 0,1 para agroin-filtração. Então, a cultura de células foi suplementa-da com acetosiringona para uma concentração final de0,2 mM e incubaram-se durante 90 minutos a 28°C.
Para a agroinfiltração, as pequenas plan-tas foram totalmente cobertas com a suspensão e apli-cou-se vácuo (100 kPa) durante 5-6 segundos. A suspen-são foi removida e as pequenas plantas mantidas em umacâmara de crescimento a 24-26°C sob um fotoperiodo de16 horas durante quatro dias. O material de planta foirecuperado e a extração de proteína total analisada porimunomancha utilizando-se anticorpo de anti-gama-zeina.
Agroinfiltração por seringa
Desenvolveu-se EHA 105 da variedadeAgrobacterium tumefaciens a 28°C em caldo-Lsuplementado com 50 pg ml-1 de canamicina e 50yg ml"1rifampicina para a fase estacionária. Sedimentaram-sebactérias por centrifugação a 5000 g durante 15 minutossob temperatura ambiente e resuspendeu-se em 10mM deamortecedor MES, pH 5,6, 10 mM MgCl2 e 200 μΜacetosiringona para um ODeoo final de 0,2. Deixaram-seas células neste meio durante 3 horas sob temperaturaambiente. Culturas individuais de Agrobacteriumportadoras de construções de RX3 e as construçõessupressoras de silenciamento HC-Pro (Goytia etal.,2006) foram misturadas entre si e infiltradas naface abaxial de folhas de plantas Nicotiana benthamianacom 2-4-semanas de idade (Voinnet et al, 2003).
Exemplo 13: Isolamento (Purificação) de RPBLAs por gra-diente de densidade a partir de tecidosvegetativos de plantas transgênicas
A codificação de gene para proteínas defusão derivadas de gama-zeína RX3-EGF foi introduzidaem plantas de tabaco por meio de Agrobacterium tumefa-ciens. As plantas transformadas foram analisadas porimunomancha para se determinarem aquelas plantas comexpressão recombinante de proteína mais alta. As ban-das predominantes mais baixas das imunomanchas corres-pondem à forma de monômero da proteína de fusão e asbandas mais altas aos dímeros. A proteína de fusão u-sualmente acumula-se como multímeros e a quantidade demonômeros e oligômeros detectados nas imunomanchas de-pendem do nível de redução de ligação de bissulfureto.
Extratos de folha de tabaco foram carrega-dos em gradientes de densidade escalonada e o acúmulode proteínas recombinantes nas diferentes frações foianalisado por imunomancha. Os resultados indicam que aRX3-EGF apareceu em frações correspondentes a RPBLAsdensas. A maior parte destas organelas exibiram densi-dades mais altas do que 1,2632 g/cm3 e uma parte signi-ficativa delas mostrou uma densidade mais alta do que1,3163 g/cm3.
Estas novas RPBLAs formadas nas folhas detabaco exibiram densidades na faixa dos corpos de pro-teína de milho natural (Ludevid et al., 1984 Plant Mol.Biol. 3:227-234; Lending et al., 1989 Plant Cell1:1011-1023), ou são ainda mais densas.
Foi avaliado que mais de 90 por cento daproteína recombinante foi recuperada nas frações de RP-BLAs densas e pílula. Desta forma, isolamento de RP-BLAs por densidade parece ser um sistema de utilidadepara purificar (concentrar) a proteína de fusão.
Para se avaliar a purificação da proteínarecombinante RX3-EGF por isolamento de RPBLAs, analisa-ram-se as diferentes frações de densidade por coloraçãocom prata. Mais de 90 por cento de proteínas endógenasde tabaco ficaram localizadas no solúvel e as fraçõesinterfase do gradiente, as frações em que a proteínaRX3-EGF estava ausente ou raramente detectada. Destamaneira, as proteínas solúveis e o grosso das proteínaspresentes nas organelas menos densas puderam ser des-cartadas por meio da seleção de uma ou duas frações dogradiente.
Com relação ao grau de purificação de pro-teina de fusão nas frações de RPBLAs, foi avaliado quea proteína RX3-EGF representa aproximadamente 80 porcento das proteínas detectadas nas frações que conti-nham PBLS. Este resultado indica que, utilizando-se umprocedimento de isolamento de RPBLAs, é possível conse-guir-se um enriquecimento importante da proteína de fu-são em apenas uma etapa de purificação.
Exemplo 14: Recuperação de proteínas recombinantes emRPBLAs isoladas a partir de tecidos deplantas secas
Um ponto importante em cultivo molecular éa presença de um meio fácil para armazenar biomassa deplantas. Neste contexto, a secagem pode proporcionarum método conveniente para reduzir o volume de armaze-namento e preservar o produto. Não obstante, freqüen-temente a secagem promove a degradação das proteínas deinteresse. O uso de plantas dessecadas para isolar asRPBLAs que contêm proteínas recombinantes seria degrande interesse para propósitos industriais.
Folhas de tabaco transformadas que acumu-lavam proteína de fusão RX3-EGF como descrita anterior-mente foram secadas, também como discutido anteriormen-te. Depois de 5 meses de armazenagem seca a estabili-dade das proteínas recombinantes foi analisada. Extra-tos de proteína provenientes de quantidades equivalen-tes de tecido de folha úmida (fresca) e seca foram ana-lisados por imunomancha. A proteína RX3-EGF apresen-tou-se estável nas plantas transformadas dessecadas,sendo semelhante a quantidade recuperada em plantas ú-midas e secas.
A distribuição em gradientes de densidadeescalonada de proteína de fusão RX3EGF a partir dos ho-mogenados de folhas secas foi analisada por meio de i-munomancha. A proteína de fusão foi recuperada princi-palmente em estruturas densas que exibiam densidadesmais altas do que 1,1868 g/cm3 e 1,2632 g/cm3.
Desta forma, proteínas recombinantes podemser purificadas a partir de tecidos submetidos a seca-gem por meio de isolamento de RPBLAs, ilustrando destemodo que coleta de planta transgênica e extração e pu-rificação de proteína recombinante podem ser indepen-dentes no tempo. Em harmonia com estes resultados,proteínas de fusão de gama-zeína foram também acumula-das em RPBLAs em sementes de arroz.
Exemplo 15: Recuperação de proteína recombinante porisolamento de RPBLAs a partir de pequenasplantas de tabaco transformadas transito-riamente
Os sistemas de expressão transiente podemser uma ferramenta conveniente para testar o comporta-mento de acúmulo de proteínas recombinantes em um curtoperíodo de tempo. Desta forma, a proteína recombinanteRX3-EGF foi também expressa e acumulada em pequenasplantas tabaco transformadas transitoriamente por meiode agroinfiltração. Os extratos de proteína provenien-tes das pequenas plantas transformadas analisadas porimunomancha mostram o padrão eletroforético complexocaracterístico observado a partir de plantas transfor-madas de forma estável, indicando que as proteínas defusão agrupam-se corretamente utilizando-se este métodode transformação.
Exemplo 16: Recuperação de proteínas recombinantes pormeio de centrifugaçâo de baixa e média ve-locidade
Para simplificar o procedimento usado parapurificar proteínas recombinantes por meio de conjuntosdensos semelhantes a corpo proteínico recombinante, re-alizaram-se dois métodos alternativos adicionais: i) oshomogenados clarificados foram centrifugados através desomente um amortecedor de sacarina denso e ii) os homo-genados clarificados foram simplesmente centrifugadossob centrifugaçâo de baixa velocidade (ou seja, 1000-2500xg durante 10 minutos).
Em concordância com os resultados descri-tos anteriormente, a proteína RX3-EGF foi recuperada emrendimentos elevados (mais de 90%) nas pílulas obtidasdepois de centrifugaçâo através de amortecedores de sa-carina de 1,1868 g/cm3. Adicionalmente, a purificaçãode proteína RX3-EGF foi muito alta uma vez que proteí-nas endógenas de tabaco contaminantes foram raramentedetectadas na correspondente pílula.The principal advantage de this método ascompared to gradientes de densidade escalonada lies inits easy scalability for industrial production de pro-teínas recombinantes. It should be noted that the cu-shion density as cavidade other properties such as itsviscosity e osmolarity can be adjusted in each case inorder to optimize recovery e purification de a proteí-nas recombinantes.
Adicionalmente, centrifugação de baixa ve-locidade (LSC) foi também ensaiada para concentrar epurificar estruturas semelhantes a corpo de proteínaque contém proteína de fusão. Os resultados indicaramque, depois de IOOOxg durante 10 minutos, practicamentetoda a proteína de fusão RX3-EGF foi recuperada na pí-lula. Mas a xcoloração das proteínas contidas nestapílula revelaram que a proteína de fusão não foi alta-mente purificada em comparação com aquela obtida depoisde centrifugação através de amortecedor de sacarina de1,1868 g/cm3.
Depois disso, a primeira pílula obtida porcentrifugação de baixa velocidade foi lavada pelo usode um amortecedor que continha 5% Triton® X-100. De-pois de lavagem, a amostra foi centrifugada a 12.OOOxgdurante 5 minutos e, interessantemente, o grosso dasproteínas contaminantes presentes na pílula Pl forameliminadas depois de lavagem e centrifugação e a novapílula continha uma proteína RX3-EGF altamente enrique-cida. Observa-se que a quantidade bem como o padrão deproteínas observados neste estudo é semelhante àquelesobtidos depois da lavagem da pílula obtida depois decentrifugação através do amortecedor de sacarina noTriton Χ-100-que continha amortecedor. A centrifugaçãode baixa velocidade alternative é baseada na alta den-sidade das estruturas que continham proteína de fusão eas condições de centrifugação podem ser otimizadas paracada alvo antes de aumentar.
Plantas de tabaco transgênicas expressorase proteínas de fusão que incluem EGF vinculado a pro-lamina ou alfa-zeína de arroz em vez de RX3, rP13-EGF ea 22aZ-EGF, foram produzidas por transformação de Agro-bacterium tumefasciens. Os melhores expressores foramdeterminados por imunomanchas utilizando-se um anticor-po contra o EGF, e essas linhas de células foram usadasem uma análise comparativa com pequenas plantas de ta-baco agroinfiltradas com as mesmas construções. Em to-dos os casos, as RPBLAs foram recuperadas em interfaceúnica, sugerindo que as RPBLAs são muito densas e homo-gêneas.
Tomando todos estes resultados em conjun-to, é evidente que as prolaminas são capazes de induzirRPBLAs de alta densidade, mesmo quando elas são fundi-das a outras proteínas. Isto constitui um resultadoinesperado, principalmente quando quase nenhuma homolo-gia é observada entre elas. Além do mais, existem al-guns dados que sugerem que as prolaminas interagem paraestabilizar os corpos de proteínas, e que algumas delasnão são estáveis quando são ex'pressas em tecido vege-tativo somente somente, tal como, por exemplo, a alfa-zeina (Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)
Exemplo 17: Extração de proteínas recombinantes a par-tir de RPBLAs isoladas
Foi demonstrado que o isolamento de con-juntos semelhantes a PB recombinantes densos é um méto-do vantajoso para recuperar proteínas recombinantes comalto rendimento e alto nível de purificação a partir deorganismos transgênicos. Aqui está ilustrado que estasproteínas recombinantes podem ser extraídas a partirdas organelas de armazenamento.
Depois de passar uma noite (cerca de 18horas) incubação de frações de RPBLAs a 370C em um a-mortecedor que continha um detergente e agentes de re-dução (amortecedor SB que continha borato de sódio 12,5mM pH 8, 0,1% SDS e 2% β-mercaptoetanol; tratamento), aproteína RX3-EGF foi solubilizada. A proteína de fusãoextraída foi recuperada na sua forma solúvel. Depoisdisso, como uma função da sua aplicação, as proteínasextraídas podem ser submetidas a purificação adicionalou usada como extratos parcialmente purificados.
Exemplo 18: Construção de plasmídio construction paratransformação de células de animais
A seqüência RX 3 foi amplificada por PCRpara se obterem os fragmentos de cDNA correspondentes aRX3 e RX3-(Gly)x5. Estes fragmentos foram digeridospor SalI/BamHI clonado em plasmídio pECFP-N1 (Clontech)aberto pelas mesmas enzimas para se obterem os plasmí-dios pRX3-ECFP e pRX3-G-ECFP, respectivamente.
Preparadores:
SPfor (SEQ ID NO:54)
RX3ECFP3' (SEQ ID NO:55)
RX3G5ECFP3' (SEQ ID NO:56)
O vetor p22aZ-ECFP corresponde ao fragmen-to de DNA HindIII/Xbal seguinte em plasmidio pEGFP-Nl(Clontech) (SEQ ID NO:57).
O GFP foi obtido por amplificação PCR doplasmídio pEGFP-Nl (Clontech) com oligonucleotídios es-pecíficos que continham locais de restrição de enzimaspara clonagem ulterior:
ECFP NcoI 5' (SEQ ID NO:58)
ECFPNl BamNotSac 3'(SEQ ID NO:59)
O produto de PCR (GFP) foi clonado em umvetor de clonagem de PCR (PCR®II Vector, Invitrogen) ea seqüência verificada. O fragmento de GFP foiexcisado por digestão de NcoI/BamHI e clonado empUC18RX3hGH (US2006123509 (Al)), proporcionando ocassete RX3-GFP em um vetor pUC18. Este vetor foiliberado por digestão de SalI/BamHI e subsecuentementeclonado em um pCDNA3.1(-) (Invitrogen) previamentedigerido por Xhol/BamHI (p3.1-RX3-GFP)
Uma construção que continha a seqüência decodificação de uma proteína DS Red monomérica aperfei-çoada (mCherry; Shaner et al., 2004 Nat. Biotechnol.22:1567-1572) foi um gabarito em uma reação de PCR (m-Cherry RcaI 5'/ECFPNl BamNotSac 3').
mCherry RcaI 5' (SEQ ID NO:60)
0 produto de PCR (DsRed) foi clonado em umvetor de clonagem de PCR (PCR®II Vector, Invitrogen)) ea seqüência verificada. 0 fragmento DsRed foi excisedopor por digestão RcaI/BamHI e clonado em pUC18RX3hGH(US2006123509 (Al)), proporcionando o cassete RX3-DsRedem um vector pUC18. Este cassete foi liberado por di-gestão de SalI/BamHI e subseqüentemente clonado em umapCDNA3.1(-) (Invitrogen) previamente digeria porXhoI/BamHI (p3.l-RX3-DsRED)
Para obter-se um RX 3 cDNA com um codonSTOP na extremidade 3', o fragmento RX3 foi amplificadopor PCR (SPF0R/RX3ST0P) e digerido por SalI/BamHI. 0fragmento foi clonado em pcDNA3.1(-) digerido peplasmesmas enzimas de restrição para obter-se p3.1-RX3.RX3ST0P3'(SEQ ID NO:61)
A codificação por cDNA do hGH foi fundidaà seqüência de codificação de gama-zeina N-terminal RX3(patent W02004003207) e foi introduzida em um vetorpcDNA3.1(-) (Invitrogen) tal como descrito em algumaoutro lugar. Na construção resultante nomeada
p3.1RX3hGH, as seqüências de proteína de fusão sequen-ces foram sob o promotor CMV e o terminador pA BGH.
A inteína Ssp DNAb proveniente do plasmí-dio pTWINl (New England Biolabs) e o hGH cDNA foram am-plificados por PCR. Os dois fragmentos PCR foram fun-didos no quadro, também por PCR, digeridos porNcoI/BamHI e clonados em pUC18RX3hGH (US2006121573(Al)) vetor também digerido por NcoI/BamHI. O insertoRX3-Int-hGH foi obtido por digestão de SalI/BamHI destevetor intermediário e clonado em pcDNA3.1(-) (Invitro-gen) digerido por XhoI/BamHI. A construção resultantefoi chamada p3.l-RX3-I-hGH. O produto de PCR foi dige-rido por BsRGI/BamHI e clonado no plasmidio p3.1-RX3-I-hGH digerido com as mesmas enzimas de restrição.
Preparadores:
5'DNAb (SEQ ID NO:62)3'DNAb (SEQ ID NO:63)DNAb-hGH: (SEQ ID NO:64)3'hGH (SEQ ID NO:65)
Como controle negative de indução de cli-vagem, arquitetou-se uma Ssp DnaB não clivável. A in-teina Ssp DnaB (Aspl54 ->· Alal54) mutada, fundida noquadro à hGH, foi obtida por meio de PCR a partir deρ3.l-RX3-I-hGH.
Preparadores:
IM-for (SEQ ID NO:66)IM-rev (SEQ ID NO:67)
c DNAs de extensão plena de caspase-2humana (IRAUp969A0210D6) e caspase-3 (IRATp970B0521D6)foram adquiridos a partir de RZPD GmbH (Berlin), a par-tir de uma referência original baseada na NacionalLawrence Livermore Library.Por meio de PCR, os locais de clivagemespecifica da caspase-2 e da caspase-3 (DEVD e DEHD,respectivamente) foram adicionados nos terminais 5' dasq de caspase correspondente. É importante observarque o fragmento amplificado correspondente à caspase-2não continha o pró-dominio.
Casp3 adiante (SEQ ID NO:68)
Casp3 inversa (SEQ ID NO:69)Casp2 para (SEQ ID NO:70)Casp2 inversa (SEQ ID NO:71)
As seqüências amplificadas foram clonadasem pUC18RX3hGH (US2006123509 (Al)) por digestão comNcoI e KpnI. A construção resultante foi então digeri-da por Sall/Kpnl e clonada a um vetor pCDNA3.1 (Invi-trogen) digerido por Xhol/Kpnl. Os vetores correspon-dentes foram chamados (p3.1-RX3-C2 e p3.1-RX3-C3).
0 vetor pUC18RX3hGH (US2006123509 (Al))foi digerido por HindIII/EcoRI, e o inserto liberadoclonado em pCambia2300 também digerido por estas enzi-mas. 0 vetor correspondente foi digerido por HindII-I/Ncol e o inserto clonado em pCambial381 aberto porHindIII/Ncol (p4-17) . 0 DNA que compreendida o frag-mento RX3-(gly)x5-GUS foi obtido por digesão de p4-17por BstEII, então preenchendo no ressalto com klenow efinalmente digestão por SalI. Este fragmento foi clo-nado em pcDNA3.1(-) digerido por Xhol/EcoRV para obtero clone ρ3.1-RX3-GUS.
0 ρ3.1-RX3-EK corresponde ao fragmento deDNA NheI/HindIII seguinte em pcDNA3.1(-) (Invitrogen)(SEQ ID NO:72)
Exemplo 19: Construção de plasmidio para infecção porinsetos
O fragmento RX3-DsRED proveniente de p3.1-RX3-DsRED foi digerido por Xbal/HindIII e clonado empFastBacl (Invitrogen) digerido também por estas duasenzimas a fim de obter-se o vetor pF-RX3-DsRED.
0 DsRED c DNA foi amplificado por PCR apartir de pF-RX3-DsRED pelo uso dos seguintes preparadores:
bGH rev (SEQ ID NO:73)
bGH rev2 (SEQ ID NO:74)
Para obter-se o vetor pF-DsRED, o fragmento de DNA am-plificado por PCR foi digerido por Xbal/HindIII e clo-nado em pFastBacl (Invitrogen) , também digerido porXbal/HindIII.
Exemplo 20: Infecção por células e larvas de insetos
Baculovirus e Larvas
0 sistema de vetor de expressão de baculo-virus (pFastBac, Invitrogen), foi usado como o vetor debase para este trabalho. 0 virus recombinante foi pro-duzido e amplificado tal como descrito pelo fabricante.Ovos de mede-palmos de couve, Trichoplusia ni, foramobtidos a partir da Entopath, Inc. (Easton, PA) . Osovos foram incubados de acordo com as orientações for-necidas pelo fabricante; e utilizaram-se as larvas ins-tar adiante para infecção.
Infecção por Larvas
Várias quantidades de solução de estoquede baculovirus, consistindo de virus recombinantes o-cluidos foram espalhadas no alimento larval, que foipré-preparado por encomenda em copos de Styrofoam apartir da Entopath, Inc. (Easton, PA) . Os copos foramcobertos e deixados ficar durante uma hora de forma queo viruso foi completamente absorvido pelo meio. Aslarvas instar adiante foram então colocadas nos copos(aproximadamente 10 a 15 larvas por copo) , e os coposforam invertidos. As larvas alimentaram-se a partir dotopo (fundo do copo) de forma que a matéria fecal caiupara a tampa onde ela foi descartada diariamente. Aquantidade de alimento foi suficiente para pelo menos 5dias de crescimento. Três a cinco larvas foram coleta-das diariamente para análise de RX3-DsRED e DsRED.
Infecção de SF9
Spodoptera
Obtiveram-se células Sf9 a partir da Invi-trogen (San Diego, CA, U.S.A.) e cultivaram-se tal comodescrito anteriormente (O1Reilly et al., 1992) utili-zando-se meio de inseto de Grace suplementado com hi-drolisado de lactalbumina, ieastolato, L-glutamina, so-ro bovino fetal desativado a quente 10% e solução depenicilina/estreptomicina a 1% (Gibco). As células fo-ram desenvolvidas seja em balões de vidro giratórios(Bélico Glass, Vineland, NJ, U.S.A.) ou bandejas decultura de tecido plásticas 100 mm (Falcon). Produzi-ram-se virus recombinantes utilizando-se o Kit Baculo-Gold Transfection Kit (PharMingen, San Diego, CA,U.S.A.). Isolaram-se placas individuais e amplifica-ram-se duas a quarto vezes para obter-se cepa viral dealta titulação que foi armazenada a 4°C até ser usada.Para rotina de infecção, células Sf9 em meio de Graceforam deixadas fixar-se ao fundo de uma bandeja de cul-tura de plástico de 100 mm (107 células/bandeja). De-pois de incubação durante 15 minutos até 1 h, uma parteda cepa viral foi adicionada e as culturas foram main-tidas a 27°C em uma atmosfera de ar umidifiçado. Comu-mente células foram usadas 30-36 horas depois da infecção.
Exemplo 21: Preparação de RPBLAs a partir de célulasde mamíferos e larvas de insetos
Células de mamíferos
Células transfectadas foram recuperadas apartir de placas de cultura por raspagem e foram colo-cadas em suspensão em meio B de homogeneização (10 mMTris-HCl pH 8,0, 0,9% NaCl, 5 mM EDTA com inibidores deprotease). A suspensão de células foi recolhida em uma.seringa de 5 ml equipada com uma agulha bitola 23 e foicoletada e expelida aproximadamente 30 vezes. A ruptu-ra das células foi monitorada por um microscópio decontraste de fases.
Larvas de insetos
Lavas Trichoplusia ni congeladas expresso-ras de proteínas RX3-DsRED e DsRED foram homogeneizadasem amortecedor PBP5 (20 mM Hepes pH 7,5, 5 mM EDTA) porpolitron durante 2 minutos a 13500 rpm e por Potter du-rante 5 minutos em gelo a 2000 rpm. Este homogenadofoi centrifugado a 200g 10 minutos para remover cuticu-Ias resíduos de tecidos e o sobrenadante foi carregadoem um gradiente de etapa de densidade.
Isolamento de RPBLAs por densidade
RPBLAs a partir de células de mamíferos elarcas de insetos congelados foram isolados essencial-mente como descrito para plantas (gradiente de etapa dedensidade ou baixa velocidade centrifugação).
Exemplo 22: Solubilização por Triton X-114 baseado emseparação bifásica
Diluíram-se homogenados de células com PBSe centrifugado a 16.OOOxg durante 15 minutos. 0 sobre-nadante foi removido e a pílula submetida a secagem.
Adicionaram-se 2 ml de Amortecedor de Solubilisação emágua gelada (50 mM Tris pH 7, 5% Triton X-114, 20 mMTCEP, 20 mM NDSB195 e 100 mM MgCl2) à pílula, e depoisdisso 1 ml de PBS que continha IM Urea, 10% Glicerol e100 mM MgCl2.
Esta composição foi incubada em gelo du-rante 15 minutos com aplicação de vórtice ocasional. Asuspensão foi então sonicada durante 20 segundos X 4 a50% de potencial, mantendo-a no gelo entre rajadas du-rante 1 minute para manter a temperatura fria. A sus-pensão foi então incubada a 37°C durante 15 minutos pa-ra formar as 2 fases. Adicionaram-se três mililitrosde PEG a 10% à camada hidrófoba inferior (Triton X-114rich) e a composição foi incubada em gelo durante 20minutos. Então, a solução foi incubada a 37°C durante15 minutos para formar as 2 fases novamente. A fasesuperior (4 ml) foi recuperada e armazenada para análi-se.
Exemplo 23: Imunolocalização
Imunocitoquimica utilizando-se um micros-cópio fluorescente (Vertical Eclipse Microscope NikonE600A). Entre 2 a 4 dias depois da transfecção, célu-las foram fixadas durante 30 minutos em uma solução deparaformaldeido a 1% e depois de lavagem com amortece-dor de fosfato salino, incubadas durante 45 minutos como anticorpo contra: (i) hGH (diluição 1/150), (ii) EK(diluição 1/500), (iii) RX3 (diluição 1/700). A fim dedetectar a reação antigeno-anticorpo, uma incubação du-rante 4 5 minutos com conjugado anti-tularemia a AlexaFluor 488(Invitrogen)
Realizaram-se análises confocais em um mi-croscópio de varredura a laser Confocal laser (LeicaTCS SP, Heidelberg, Germany) equipado com espectrofotô-metros para seleção de comprimento de onda de banda deemissão. Coletaram-se imagens fluorescentes verdes sobexcitação a 488 nm com laser de ions de argônio pelouso de uma janela de emissão ajustada em 495-535 nm.Imagens fluorescentes vermelhas foram coletadas depoisde excitação a 543 nm com um laser HeNe e janela de e-missão de 550-600. Seções ópticas foram de 0,5 até 1μm de espessura.
Exemplo 24: Ensaios de atividade
Ensaio de atividade de EGFCélulas MDA-MB231 (células de câncer de mamaque sobrexpressaram receptor EGF) são semeadas em pla-cas de 96-cavidades a 5.500 células/cavidade. As célu-las foram deixadas aderir durante 8 horas em meio decrescimento com 10% FCS (soro de bezerro fetal) e entãosubmetidas a inanição durante a noite em meio suplemen-tado com 0,1% de FCS. Depois disso, o meio é removidoe o EGF (controle positivo) proveniente da Promega ou acorrespondente amostra (RX3-EGF solubiizado) é adicio-nado sob concentrações diferentes. Então, a timidinaradioativa é adicionada para uma concentração final de0,5 μCi. A proliferação é estudada 48 horas depois deestimulo a 37°C. Então, as células são lavadas duasvezes com PBS frio, e as células são mantidas em gelopara sustar o metabolismo das células. Uma solução deácido trifluoroacético (TCA) a 10% é adicionada, e ascélulas são incubadas durante 20 minutos a 4°C. Umavez que a solução de TCA é removida, as placas são la-vadas duas vezes com etanol a 70%, e as células são in-cubadas durante 20 minutos a 37°C em 0,5 ml da soluçãode lise (2% C03Na2, 0,1N NaOH e 10% SDS). As placassão misturadas por agitação em vórtice e a amostra nãoé medida antes de 12 horas para evitar fenômeno quími-co-luminescente indesejado.
Ensaio de atividade de EK
A atividade enzimática foi medida por en-saio fluorométrico (Grantet al. (1979) Biochim. Bio-phys. Acta 567:207-215). A reação foi iniciada pelaadição da enzima a 0,3 até 1,0 mM do substrato fluoro-gênico Gly-(Asp)4-Lys-Pnaftilamida (Sigma) em 25 mMTris-HCl (pH 8,4), 10 mM CaC12, 10% DMSO (Dimetil sul-fóxido) a 37°C. A concentração de β-naftilamina livrefoi determinada a partir do aumento de fluorescência(Xex = 337 nm e Xem = 420 nm) monitorada continuamentedurante 1 minuto. A atividade foi calculada como mu-dança na fluorescência com o tempo.
Ensaio de atividade de GUS
O ensaio de atividade de GUS é baseado nacatálise de ácido metilumbeliferil-p-glucuronida (MUG)para o produto fluorescente de 4-metilumbeliferona (4-MU), pela enzima GUS (Jefferson RA,et al. (1987) EMBOJ. 6(13): 3901-3907). 50 μΐ de RX3-GUS solubilizado(ou RX3 solubilizado como um control) foi adicionado a200 μΐ de amortecedor de reação (50 mM de amortecedorde fosfato pH 7, 10 mM EDTA, 0,1% SDS e 0,1% TritonX100) mais 66 μΐ de Metanol. O substrato (MUG) foi a-dicionado para uma concentração final de 10 mM. O pa-drão foi preparado pela adição de 0, 50, 100, 200, 300ou 500 pmols de 4-MU (o produto da reação) a 200 μΐ a-mortecedor de reação da reação (4-MU).
As amostras e o padrão foram misturados e fo-ram medidos em um fluorimetro (Victor, Perkin-Elmer) akex = 355 nm e λθίτι = 460 nm. As amostras foram medidasa cada 30 minutos durante 3 horas. A atividade especi-fica foi calculada pela fórmula: atividade GUS (pmols4-MU/min-l*mg-l) = (λβπι (Tl) - (λβπι(ΤΟ) ) / (k * (T1-T0))."Κ" = relação (Unidades de fluorescência)/(pmol 4-MU).
Ensaio de atividade RTB
(Aglutinação-asialofetuin ELISA)
A funcionalidade de RX3-RTB nos extratos deproteína a partir de RPBLAs foi determinada por meio deaglutinação a asialofetuin, o fetuin de glicoproteínatratado com sialidase para expor glicans terminados emgalactose. Duzentos microlitros de asialofetuin (Sig-ma) sob uma concentração de 300 mg/ml em amortecedor dePBS (mPBS) modificado (100 mM Na-fosfato, 150 mM NaCl,pH 7,0) foi aglutinado às cavidades de uma placa de mi-crotitulação Immulon 4HBX (Fisher, Pittsburg, Pa.) du-rante 1 hora sob temperatura ambiente. A solução derevestimento foi descartada e as cavidades bloqueadascom 200 ml 3% BSA, 0,1% Tween 20 em mPBS durante 1 horasob temperatura ambiente. Depois que a solução de blo-queio foi descartada, aplicaram-se 100 ml de padrõesRTB e extratos de proteínas (vide adiante) e incubaram-se durante 1 h sob temperatura ambiente. As cavidadesforam então lavadas três vezes com 200 ml mPBS, 0,1%Tween 20. Rabbit anti-R. communis lectin (RCA60) poli-clonal Ab (Sigma) a 1:4000 em amortecedor de bloquieo(como anteriormente) foi aplicado e incubado durante 1hora sob temperatura ambiente. The cavidades werethen washed as before. AP conjugated goat-anti-rabbitIgG (Bio-Rad) was applied at a dilution de 1:3000 inblocking amortecedor e incubated for 1 h sob tempera-tura ambiente. As cavidades foram lavadas três vezestal como descrito anteriormente e aplicaram-se 100 mlpNPP (sal dissódio de fosfato de pnitrofenil) substrato(Pierce, Rockford, Ill.). A reação foi sustada depoisde 15 minutos pela adição de 50 μΐ de 2 N NaOH. A ab-sorvência (A405) foi lida em uma Bio-Tek EL808 UltraMicroplate Reader. Extratos de proteína extracts forampreparados sob uma relação de 1 g FW folha para 3 ml deamortecedor Tris-acorbate (retro), e as amostras compa-radas contra uma curva padrão que consistia de RTB de-rivado de mamona diluída em série (Vector Labs, Burlin-game, Calif.) em amortecedor Tris-acorbate, com as con-centrações variando de 5 ng até 500 ng por cavidade.
Exemplo 25: Apreensão aumentada de RX3-DsRED reunidasem RPBLAs a partir de larvas de insetospor macrófagos
As codificações de cDNA para RX3-DsRED eDsRED foram clonadad no vetor baculovírus FastBac (In-vitrogen) para se obterem ρFB-RX3-DsRED e pFB-DsRED.
Estas construções foram usadas para infectar Trichoplu-sia ni larvae. Larvas congeladas expressoras de prote-ínas RX3-DsRED e DsRED foram homogeneizadas e carrega-das em um gradiente de etapa de densidade. Depois decentrifugação a 80000xg em uma caçamba oscilante duran-te 2 horas, a análise da proteína de fusão RX3-DsRED eo controle correspondente à DsRED expressada no citasolfoi realizada por imunomancha (Figura 2C). Tal comoesperado, quando expressa no citosol de células de lar-vas, a proteína DsRED não se agrupou nas estruturas al-tamente densas e ficou localizada no sobrenadante e nafração F35 (Figura 2C, faixa 2 e 3). Por outro lado,proteína de fusão a RX3-DsRED foi capaz de agrupar-se eacumular-se em estruturas densas que podem ser isoladasa partir de F56 (Figura 2C, faixa 5). Tal como ilus-trado por microscopia análise confocal no Exemplo 4(Figura4), a RX3-DsRED acumulou-se em RPBLAs de formaredonda.
As RPBLAS de RX3-DsRED provenientes de F56foram diluídas 3 vezes em PBP5 (10 mM HEPES pH 7,4, 2mM EDTA) e foram coletadas na pílula por meio de cen-trifugação a 80000xg a 4°C em uma caçamba oscilante du-rante 2 horas. A pílula voltou a ser suspense em amor-tecedor PBS e o número de RPBLAs foi quantificado porFACS. A partir de 1 larva infectada com o vetor pFB-RX3-DsRED, obtiveram-se aproximadamente IxlO9 partícu-las de RPBLAs sob uma concentração de 500.000 RPBLAspor microlitro (μΐ).
Constatou-se que a apresentação de antíge-no pelas células de apresentação de antígeno (APC) taiscomo as células macrófagas e dendríticas é um processochave necessário para induzir a resposta imune (Green-berg et al, Current Op. Immunology (2002), 14:136-145).
Neste processo, a APC provoca a fagacitose do antigeno,o qual é subseqüentemente clivada em pequenos peptídiosno fagolisossome. Estes peptídios interagem com o MH-CII e são selecionados para a membrana de plasma serapresentadaàs respostas de imunidade mediadas por célu-Ias e anticorpos (Villandagos et al., Immunological Re-views (2005) 207:101-205).
Para se determinar a antigenicidade daproteína de fusão RX3 presente dentro de RPBLAs, a cul-tura de células macrófagas foi incubada com estas orga-nelas sob diferentes relações de RPBLA/células (100:1 e1000:1). As culturas de células macrófagas foram de-senvolvidas em condições de míngua ou na presença de(M-CSF). Estas culturas de células foram incubadas comRPBLAs durante 1 hora, e 1, 2, 5 e 10 horas depois deremoção de RPBLA, os macrófagos foram lavados extensa-mente com PBS e fixados com paraformaldeido a 2%. De-pois disto, estes macrófagos fixos foram analisados porFACS para quantificar a quantidade de RPBLAs flúores-centes recolhidos pelos macrófagos bem como a percenta-gem de macrófagos que tinham fagocitosado os RX3-DsREDRPBLAs fluorescentes.Percentagem de Macrófagos Fluorescentes
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A partir destes resultados é evidente queos macrófagos fagocitosaram as RX3-DsRED RPBLAs com umaavidez inesperada. Mesmo na relação RPBLAs/célulasmais baixa (1:100) e na presença de M-CSF, 1 hora de-pois da adição de RPBLAs, 65% dos macrófagos são fluo-rescentes. Ainda, a presença de uma citoquina mitogê-nica, tal como M-CSF, que tem um efeito negativo na fa-gocitose de macrófagos não pode impedir de form a sig-nificativa a apreensão das RPBLAs. Nas 5 horas, quasetodos os macrófagos (mais de 80%) eram f luorescents,significando que a maior parte das células tinha apre-endido algumas RPBLAs a partir do meio.
Quando a quantidade de fluorescência asso-ciada com os macrófagos foi analisada sobre o tempo deincubação, o resultado foi ainda mais surpreendente.Em qualquer uma das condições analisadas (relação RP-BLAs/células ou presença ou ausência de M-CSF) não seobservou efeito de saturação na capacidade dos macrofa-gos consumir as RPBLAs. Se os resultados das Tabelasacima e abaixo forem comparados em 5 e 10 horas de in-cubação, observa-se que quase todos os macrófagos sãofluorescentes, mas existe um aumento continuo na fluo-rescência total associada com os macrófagos. Este re-sultado indica que, os macrófagos estão fagocitosandouma grande quantidade de partículas de RPBLAs fluores-centes .
Fluorescência de Macrófagos Dependente de Tempo
<table>table see original document page 135</column></row><table>
Para demonstrar que as RPBLAs que conti-nham a proteína de fusão RX3-DsRED estavam dentro dosmacrófagos e não simplesmente adsorvidos pela membranade plasma, realizaram-se análises de microscopia. AFigura 7A (painel esquerdo) mostra alguns dessas célu-las macrófagas incubadas com partículas RX3-DsRED (a100:1) durante 1 hora. No painel esquerdo da mesma Fi-gura, uma seção de 1 micrômetro das mesmas células mos-tra a auto-fluorescência verde típica dos macrófagosobservados com um filtro verde (Figura 7A, cabeça deseta branca). A presença do núcleo e das partículasRPBLAs fluorescents vermelhas (Figura 7A, cabeça de se-ta preta) na mesma seção óptica indicou que as RPBLAstinham sido apreendidas dentro das células por fagoci-tose.
Um outro fator importante a ser analisadoé a degradação do imunogene uma vez que ele foi fagoci-tosado pelo macrófago. É necessária a degradação deantígeno para produzir os peptídios antigênicos que sãoapresentados no receptor de MHCII. A análise do padrãofluorescente de DsRED dos macrófagos com o tempo mos-trou que as partículas de RPBLAs foram digeridas ativa-mente.
Outro conjunto de micrográficos mostra quedepois de 1 horas de incubação, as partículas de RPBLAnão foram plenamente degradadas e ainda puderam ser ob-servadas dentro das células células (Figura 7B, áinéissuperiores). Depois de 10 horas, o padrão de fluores-ceência vermelha foi mais homogêneo por todas as célu-las, indicando que os macrófagos tinham começado a de-gradar as partículas de RPBLA (Figura 7B, painéis defundo).
Exemplo 26: Apreensão de RX3-DsRED aumentada nas RPBLAsa partir de larvas de insetos por célulasdendriticas
As células dendriticas desempenham umafunção de apresentação de antigeno central para induziro sistema imune (Blander et al., Nature Immunology(2006) 10:1029-1035). Muito embora raras, as célulasdendriticas são as APC mais altamente especializadas,com capacidade para instigar e regular a reatividadeimune (Lau AH et al Gut 2003 52:307-314). Para se ava-liar a capacidade dessas células fagocitarem as proteí-nas de fusão RX3-DsRED reunidas em RPBLAs a partir delarvas de insetos, incubou-se uma cultura de célulascom estas organelas numa relação de 100 RPBLAs/célula.
Prepararam-se duas espécies de RPBLAs: (i) RPBLAs iso-ladas como descritas anteriormente e (ii) as mesmas RP-BLAs completamente lavadas em 50 mM Tris pH 8, 1% Tri-ton X-100, com a finalidade de remover a membrane deER. As culturas de células dendriticas foram desenvol-vidas em condições de inanição na presença de RPBLAs, eamostras foram analisadas em 0, 1, 2, 5 e 10 horas.Percentagem de células Dendrlticas Fluorescentes
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Fluorescência de células Dendríticas Dependente de TemPO
<table>table see original document page 138</column></row><table>
Como pode ser concluído a partir das Tabelas retro, as células dendríticas mostram uma avidesurpreendente pelas RPBLAs. Como é de se esperar, elastêm uma taxa de fagocitose mais baixa em comparação comos macrófagos (comparem-se as tabelas anteriores), talcomo descrito em outro local. A percentagem de célulasdendriticas fluorescentes aumenta todo o tempo da aná-lise, e nenhum efeito de saturação foi observado mesmoem 10 10 horas depois da incubação das RPBLAs. Conclu-sões semelhantes podem ser deduzidas quando foi anali-sada a quantidade de fluorescência associada com os ma-crófagos com o tempo.
A capacidade das células dendriticas apre-enderem as RPBLAs não exibiu um efeito de saturação.Esta ausência de efeito pode ser explicada pelo fato deque cada vez mais células dendriticas são induzidas Pa-ra a fagocitose (e tornam-se fluorescentes) com o tem-po. Não obstante, é igualmente possível que a capaci-dade de fagocitose dessas células não esteja saturada,como foi observado com os macrófagos.
Inesperadamente, a análise de FACS de cé-lulas dendriticas incubadas com RPBLAs sem membranamostrou uma percentagem significativamente mais alta decélulas dendriticas fluorescentes do que as mesmas cé-lulas incubadas com RPBLAs que continham membrana. A-lém do mais, a fluorescência destas células dendriticasfoi também mais elevada. Resultados assemelhados foramobtidos utilizando-se macrófagos com RPBLAs sem membra-na. Isto foi um tanto surpreendente uma vez que se es-perava que a presença de proteínas de membrana deriva-das de insetos nas RPBLAs que continham membrana seriareconhecida como proteínas exteriores pelas célulasdendríticas de murídeo, e portanto aumentasse a fagoci-tose. Deste modo é evidente que as RPBLAs derivadas deinsetos na presence ou ausência da membrana circundantesão veículos de apresentação de antígenos muito efici-entes.
Para demonstrar que RPBLAs e RPBLAs semmembrana contendo a proteína de fusão RX3-DsRED foramapreendidas pelas células dendríticas, realizou-se aná-lise de microscopia óptica. A Figura 8A (superior)mostra células dendríticas incubadas durante 2, 5 e 10horas com RX3-DsRED RPBLAs (relação 100:1). No fundoda Figura 8B, a fluorescência vermelha da proteína Ds-RED ilustra a apreensão das RPBLAs por parte dessas cé-lulas. Nas 2 horas de incubação, podem ser observedosalguns fagócitos, mas a maior parte das RPBLAs está a-penas adsorvida pela membrana plasmática. Nas 5 horas,e ainda mais nas 10 horas, observaram-se muitas RPBLAsfluorescentes vermelhas fagocitosadas. Resultados as-semelhados foram obtidos quando células dendríticas fo-ram incubadas com RPBLAs sem membrana (Figura 8B).
É importante observar que mesmo sob 10 ho-ras de incubação com RPBLAs ou RPBLAs sem membrana, amaior parte das partículas fagocitosadas permanecem vi-síveis como partículas, significando que ocorreu poucatroteólise. Esta observação está de acordo com obser-vação anterior mostrando a cinética de aquisição d e-protease, e portantto, de proteólise é mais lenta emcélulas dendriticas do que em macrófagos (Lennon-Dum'enil et al. (2002) J. Exp. Med. 196:529-540). Es-tas condições podem limitar a proteólise de proteínasem células dendriticas e favorecer a geração de antíge-nos de peptídios de extensão apropriada para carrega-mento nas moléculas MHC de classe II.
Exemplo 27: Fagocitose de macrófagos e células dendri-ticas
Macrófagos
Obtiveram-se macrófagos a partir de medulaóssea de camundongos Balb/C. Os camundongos foram sa-crificados por um deslocamento cervical e o fémur e tí-bia foram extraídos. Os ossos foram cortados e a medu-la óssea extraída com meio DMEM utilizando-se uma se-ringa. A medula óssea foi cultivada em uma placa Petride 150 mm com meio DMEM completo (suplementado com20%FCS e 30% L-célula). Uma cultura de macrófagos de99% de pureza foi obtida depois de 7 dias de incubaçãoa 37°C.
Os macrófagos diferenciados foram cultiva-dos em meio complete para proporcionarem 350.000 célu-las por cavidade. Depois que as células aderiram, omeio foi removido e as células foram incubadas com novomeio que continha RX3-DsRED RPBLAs proveniente de lar-vas. A experiência foi realizada com 100 ou 1000 par-tículas: 1 célula. O número de partículas (RPBLAs) foicontado por Coulter Epics XL FACS utilizando-se o laserde argônio a 488nm para excitação e FL2 a 575nm +/-30para emissão. Utilizou-se contagem de fluxo provenien-te da Beckman Coulter ref. 7547053 (lot 754896F) paraverificar o fluxo.
Depois de diferentes tempos (0, 1, 2, 5 e10 horas) o meio foi removido e realizaram-se duas La-vagens com PBS. Permitiu-se que as células fossem re-cuperadas e então fixaram-se por PBS com 2% de parafor-maldeido. Os macrófagos tratados foram armazenados a4°C e a fluorescência foi analisada por FACS (com omesmo programa usado para a contagem).
Para verificar que as partículas RX3-DsREDtinham sido fagocitadas dentro das células realizou-seuma experiência de imunocitoquímica. Os macrófagos di-ferenciados (50.000 células/ cavidade) foram incubadoscom 100:1 partículas de RX3-DsRED durante 1 hora. De-pois da incubação, as células foram lavadas duas vezescom PBS e fixadas com PBS com formaldehyde a 2% durante15 minutos. As células tratadas foram analisadas pormicroscopia confocal.
Células dendríticas
A medulla óssea proveniente de camundongosBalb/C foi cultivada com meio completo (DMEM, 10% FCS,5ng/ml GM-CSF) durante um dia. A fim de remover granu-lócitos, placas foram submetidas a agitação e o meiofoi trocado duas vezes. O meio foi então trocado duasvezes sem agitação e incubado durante 2 dias para seobterem células dendriticas imaturas. As células den-driticas foram incubadas com partículas 100:1 de RX3-DsRED durante 1, 5 e 10 horas. Depois dos tratamentos,as células foram fixadas com paraformaldeído a 2%, ar-mazenadas a 4°C e a fluorescência foi analisada porFACS.
Cada um dos pedidos de patente, patentes eartigos citados neste contexto ficam incorporados porreferência. O uso do artigo "um" ou "uma" destina-se aincluir um ou mais.
A descrição precedente e os exemplos des-tinam-se a ser ilustrativos e não pretendem ser consi-derados como limitativos. Ainda outras variações den-tro do espírito e escopo desta invenção são possíveis eserão facilmente evidenciadas por si mesmas para aque-les versados na técnica.SEQÜÊNCIA DE LISTAGEM
<110> ERA BIOTECH, S.L.
<120> PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS<130> P2747PC00<160> 74
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220><223>
hexapeptideo de domínio repetido de proteína gama-zeina<400> 1
Pro Pro Pro Val His Leu1 5
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> RX3<4 00> 2
Pro Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro15 10 15
Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro20 25 30
Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Val Pro Pro Pro Val His35 40 45
Leu Pro Pro Pro Pro50
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Alfa-zeina<400> 3
Gln Gln Gln Gln Gln Phe Leu Pro Ala Leu Ser Gln Leu Asp Val Val1 5 10 15
Asn Pro Val Ala Tyr Leu Gln Gln Gln Leu Leu Ala Ser Asn Pro Leu20 25 30
Ala Leu Ala Asn Val Ala Ala Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln35 40 45
Phe Leu Pro Ala Leu Ser Gln Leu Ala Met Val Asn Pro Ala Ala Tyr50 55 60
Leu65
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Arroz prolamina<4 00> 4
Gln Gln Val Leu Ser Pro Tyr Asn Glu Phe Val Arg Gln Gln Tyr Gly15 10 15
Ile Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gln Ser Ala Thr Phe Gln Leu Arg Asn20 25 30
Asn Gln Val Trp Gln Gln Leu Ala Leu Val Ala Gln Gln Ser His Cys35 40 45
Gln Asp Ile Asn Ile Val Gln Ala Ile Ala Gln Gln Leu Gln Leu Gln50 55 60
Gln Phe Gly Asp Leu Tyr65 70
<210> 5
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Gama-zeina<400> 5 atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60catacaagcg gcggctgcgg ctgccagcca ccgccgccgg ttcatctacc gccgccggtg 120catctgccac ctccggttca cctgccacct ccggtgcatc tcccaccgcc ggtccacctg 180ccgccgccgg tccacctgcc accgccggtc catgtgccgc cgccggttca tctgccgccg 240ccaccatgcc actaccctac tcaaccgccc cggcctcagc ctcatcccca gccacaccca 300tgcccgtgcc aacagccgca tccaagcccg tgccagctgc agggaacctg cggcgttggc 360agcaccccga tcctgggcca gtgcgtcgag tttctgaggc atcagtgcag cccgacggcg 420acgccctact gctcgcctca gtgccagtcg ttgcggcagc agtgttgcca gcagctcagg 480caggtggagc cgcagcaccg gtaccaggcg atcttcggct tggtcctcca gtccatcctg 540cagcagcagc cgcaaagcgg ccaggtcgcg gggctgttgg cggcgcagat agcgcagcaa 600ctgacggcga tgtgcggcct gcagcagccg actccatgcc cctacgctgc tgccggcggt 660gtcccccacg CC 672
<210> 6 <211> 224
<212> PRT<213> Artificial
<220>
<223> Gama-zeina<400> 6
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15
Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Pro Pro Pro20 25 30
Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu35 40 45
Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val50 55 60
His Leu Pro Pro Pro Val His Val Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro65 70 75 80
Pro Pro Cys His Tyr Pro Thr Gln Pro Pro Arg Pro Gln Pro His Pro85 90 95Gln Pro His Pro Cys Pro Cys Gln Gln Pro His Pro Ser Pro Cys Gln100 105 110
Leu Gln Gly Thr Cys Gly Val Gly Ser Thr Pro Ile Leu Gly Gln Cys115 120 125
Val Glu Phe Leu Arg His Gln Cys Ser Pro Thr Ala Thr Pro Tyr Cys130 135 140
Ser Pro Gln Cys Gln Ser Leu Arg Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Arg145 150 155 160
Gln Val Glu Pro Gln His Arg Tyr Gln Ala Ile Phe Gly Leu Val Leu165 170 175
Gln Ser Ile Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Gly Leu180 185 190
Leu Ala Ala Gln Ile Ala Gln Gln Leu Thr Ala Met Cys Gly Leu Gln195 200 205
Gln Pro Thr Pro Cys Pro Tyr Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro His Ala210 215 220
<210> 7
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RX3<4 00> 7
atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60
catacaagcg gcggctgcgg ctgccagcca ccgccgccgg ttcatctacc gccgccggtg 120
catctgccac ctccggttca cctgccacct ccggtgcatc tcccaccgcc ggtccacctg 180
ccgccgccgg tccacctgcc accgccggtc catgtgccgc cgccggttca tctgccgccg 24 0
ccaccatgcc actaccctac tcaaccgccc cggcctcagc ctcatcccca gccacaccca 300
tgcccgtgcc aacagccgca tccaagcccg tgccagacc 339
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> RX3<400> 8
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser15 10 15
Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Pro Pro Pro20 25 30
Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu35 40 45
Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val50 55 60
His Leu Pro Pro Pro Val His Val Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro65 70 75 80
Pro Pro Cys His Tyr Pro Thr Gln Pro Pro Arg Pro Gln Pro His Pro85 90 95
Gln Pro His Pro Cys Pro Cys Gln Gln Pro His Pro Ser Pro Cys Gln100 105 110
Tyr
<210> 9
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial
<220><223> R3
<400> 9 atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60catacaagcg gcggctgcgg ctgccagcca ccgccgccgg ttcatctacc gccgccggtg 120catctgccac ctccggttca cctgccacct ccggtgcatc tcccaccgcc ggtccacctg 180ccgccgccgg tccacctgcc accgccggtc catgtgccgc cgccggttca tctgccgccg 240
<210> 10
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> R3<400> 10
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15
Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Pro Pro Pro20 25 30
Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu35 40 45
Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val50 55 60
His Leu Pro Pro Pro Val His Val Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro65 70 75 80
Pro Pro Cys His Tyr Pro Thr Gln Pro Pro Arg Tyr85 90
<210> 11
<211> 213
<212> DNA
<213> Artificial
<220><223> P4
<4 00> 11
atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctc ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60
catacaagcg gcggctgcgg ctgccagcca ccgccgccgg ttcatctgcc gccgccacca 120
tgccactacc ctacacaacc gccccggcct cagcctcatc cccagccaca cccatgcccg 180
tgccaacagc cgcatccaag cccgtgccag acc 213
<210> 12
<211> 71
<212> PRT
<213> Artificial
<220»
<223> P4
<4 00> 12
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15
Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Pro Pro Pro20 25 30Pro Val His Leu Pro Pro Pro Pro Cys His Tyr Pro Thr Gln Pro Pro35 40 45
Arg Pro Gln Pro His Pro Gln Pro His Pro Cys Pro Cys Gln Gln Pro50 55 60
His Pro Ser Pro Cys Gln Tyr65 70
<210> 13
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> X10
<400> 13
atgagggtgt tgctcgttgc cctcgctctccatacaagcg gcggctgcgg ctgccaatgccctcatcccc agccacaccc atgcccgtgc
ctggctctcg ctgcgagcgc cacctccacg 60
cactacccta ctcaaccgcc ccggcctcag 120caacagccgc atccaagccc gtgccagacc 180
<210> 14
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> XlO<400> 14
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15
Ala Thr Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Cys Gly Cys Gln Cys His Tyr20 25 30
Pro Thr Gln Pro Pro Arg Pro Gln Pro His Pro Gln Pro His Pro Cys35 40 45
Pro Cys Gln Gln Pro His Pro Ser Pro Cys Gln Tyr50 55 60
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<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> rP13 - arroz prolamina de 13 kD<4 00> 15
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Ala Ser Ala Gln Phe Asp Val Leu Gly Gln Ser Tyr Arg Gln Tyr Gln20 25 30
Leu Gln Ser Pro Val Leu Leu Gln Gln Gln Val Leu Ser Pro Tyr Asn35 40 45
Glu Phe Val Arg Gln Gln Tyr Gly Ile Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gln50 55 60
Ser Ala Thr Phe Gln Leu Arg Asn Asn Gln Val Trp Gln Gln Leu Ala65 70 75 80
Leu Val Ala Gln Gln Ser His Cys Gln Asp Ile Asn Ile Val Gln Ala85 90 95
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Arg Asn Leu Ala Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Phe Asn Val Pro Ser115 120 125
Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Arg Tyr Tyr Gly Ala Pro Ser Thr Ile Thr130 135 140
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Val Leu Gln Gln Pro Ile Asn Gln Leu Gln Gln Gln Ser Leu Ala His65 70 75 80
Leu Thr Ile Gln Thr Ile Ala Thr Gln Gln Gln Gln Gln Phe Leu Pro85 90 95
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Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Phe Leu Pro Ala Leu Ser Gln Leu130 135 140
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<220>
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gcgttcatta ttccacaatg ctcacttgct cctagtgcca ttataccaca gttcctccca 120
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cttgcggcaa gcgtcttaca acaaccaatt aaccaattgc aacaacaatc cttggcacat 240
ctaaccatac aaaccatcgc aacgcaacag caacaacagt tcctaccagc actgagccaa 300
ctagatgtgg tgaaccctgt cgcctacttg caacagcagc tgcttgcatc caacccactt 360
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ctcagtcaac ta 432
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Precursor gama-gliadina<400> 19
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Gln Thr Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Gln Thr Phe65 70 75 80
Pro Gln Gln Pro Gln Leu Pro Phe Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe85 90 95
Pro Gln Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Ser Gln Gln Pro100 105 110Gln Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Pro Gln Gln115 120 125
Pro Gln Gln Ser Phe Pro Gln Gln Gln Gln Pro Ala Ile Gln Ser Phe130 135 140
Leu Gln Gln Gln Met Asn Pro Cys Lys Asn Phe Leu Leu Gln Gln Cys145 150 155 160
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Ile Ile Met Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gly Val Pro Ile Leu Arg Pro210 215 220
Leu Phe Gln Leu Ala Gln Gly Leu Gly Ile Ile Gln Pro Gln Gln Pro225 230 235 240
Ala Gln Leu Glu Gly Ile Arg Ser Leu Val Leu Lys Thr Leu Pro Thr245 250 255
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<213> Artificial
<220>
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agcttgttca tcttaccatc atactatact gcaagctagt ttaaaaaaga atyaaagtcc 300
agaatgaaca gtagaatagc ctgatctatc tttaacaaca tgcacaagaa tacaaattta 360
gtcccttgca agctatgaag atttggttta tgcctaacaa catgataaac ttagatccaa 420
aaggaatgca atctagataa ttgtttgact tgtaaagtcg ataagatgag tcagtgccaa 480
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20402086
<210> 21
<211> 537
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Beta zeina
<4 00> 21
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<210> 22
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Beta zeina<4 00> 22
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Ser Ala Ser Ala Met Gln Met Pro Cys Pro Cys Ala Gly Leu Gln Gly20 25 30
Leu Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Leu Thr Thr Met Met Gly Ala Gly Gly35 40 45
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Pro Ser Tyr Arg Thr Asn Pro Cys Gly Val Ser Ala Ala Ile Pro Pro165 170 175
Tyr Tyr
<210> 23
<211> 453
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Delta zeina 10 kD
<4 00> 23 atggcagcca agatgcttgc attgttcgct ctcctagctc tttgtgcaag cgccactagt 60gcgacgcata ttccagggca cttgccacca gtcatgccat tgggtaccat gaacccatgc 120atgcagtact gcatgatgca acaggggctt gccagcttga tggcgtgtcc gtccctgatg 180ctgcagcaac tgttggcctt accgcttcag acgatgccag tgatgatgcc acagatgatg 240acgcctaaca tgatgtcacc attgatgatg ccgagcatga tgtcaccaat ggtcttgccg 300agcatgatgt cgcaaatgat gatgccacaa tgtcactgcg acgccgtctc gcagattatg 360ctgcaacagc agttaccatt catgttcaac ccaatggcca tgacgattcc acccatgttc 420ttacagcaac cctttgttgg tgctgcattc tag 453
<210> 24<211> 150<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Delta zeina 10 kD
<4 00> 24
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Phe Val Gly Ala Ala Phe
145
150
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser
5 10 15Ala Thr Ser
<210> 26
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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5 10 15
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<220>
<223> Sinal peptideo Gama-gliadina<400> 27
Met Lys Thr Leu Leu Ile Leu Thr Ile Leu Ala Met Ala Ile Thr Ile
5 10 15
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<220>
<223> PRlO sinal peptideo<400> 28
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5 10 15
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<220>
<223> ECFP
<400> 29
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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac
60120ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 30
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ECFP<4 00> 30
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Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile35 40 45
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Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys65 70 75 80
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Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235
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<210> 32
<211> 617
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> GUS1381<400> 32
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Ile Lys Lys Leu Asp Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg Glu Asn20 25 30Cys Gly Ile Asp Gln Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu Ser Arg35 40 45
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Ala Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Val Cys Val Asn Asn Glu Leu Asn130 135 140
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Asp Gln Gln Val Val Ala Thr Gly Gln Gly Thr Ser Gly Thr Leu Gln225 230 235 240
Val Val Asn Pro His Leu Trp Gln Pro Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Glu245 250 255
Leu Cys Val Thr Ala Lys Ser Gln Thr Glu Cys Asp Ile Tyr Pro Leu260 265 270Arg Val Gly Ile Arg Ser Val Ala Val Lys Gly Gln Gln Phe Leu Ile275 280 285
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Thr Ser Gln Gly Ile Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Lys Gly Ile Phe565 570 575
Thr Arg Asp Arg Lys Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Gln Lys Arg580 585 590
Trp Thr Gly Met Asn Phe Gly Glu Lys Pro Gln Gln Gly Gly Lys Gln595 600 605
Ala Ser His His His His His His Val610 615
<210> 33
<211> 2041
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GUS1391Z
<4 00> 33
atggtagatc tgagggtaaa tttctagttt ttctccttca ttttcttggt taggaccctt 60ttctcttttt atttttttga gctttgatct ttctttaaac tgatctattt tttaattgat 120tggttatggt gtaaatatta catagcttta actgataatc tgattacttt atttcgtgtg 180tctatgatga tgatgatagt tacagaaccg acgactcgtc cgtcctgtag aacgtgaaat 240caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca 300^ gcgttggtgg gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa 360cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga 420agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac 480tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac 540gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt 600ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga 660aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg gaatccatcg 720
cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca 780
tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt 840
cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg 900
gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact 960
gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg 1020
gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg 1080
ctttggtcgt catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt 1140
gcacgaccac gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc 1200
ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac 1260
tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa 1320
agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat 1380
taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa 1440
cgaaccggat acccgtccgc aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg aagcaacgcg 1500
taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac 1560
cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt 1620
ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa aaagaacttc tggcctggca 1680
ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc gtggatacgt tagccgggct 1740
gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag tgtgcatggc tggatatgta 1800
tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa caggtatgga atttcgccga 1860
ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac aagaaaggga tcttcactcg 1920
cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa cgctggactg gcatgaactt 1980
cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca agctagccac caccaccacc accacgtgtg 2040
a 2041
<210> 34<211> 617<212> PRT<213> Artificial
<220>
<223> GUS1391Z<4 00> 34
Met Val Asp Leu Arg Val Asn Arg Arg Leu Val Arg Pro Val Glu Arg10 15
Glu Ile Lys Lys Leu Asp Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg Glu20 25 30
Asn Cys Gly Ile Asp Gln Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu Ser35 40 45
Arg Ala Ile Ala Val Pro Gly Ser Phe Asn Asp Gln Phe Ala Asp Ala50 55 60
Asp Ile Arg Asn Tyr Ala Gly Asn Val Trp Tyr Gln Arg Glu Val Phe65 70 75 80
Ile Pro Lys Gly Trp Ala Gly Gln Arg Ile Val Leu Arg Phe Asp Ala85 90 95
Val Thr His Tyr Gly Lys Val Trp Val Asn Asn Gln Glu Val Met Glu100 105 110
His Gln Gly Gly Tyr Thr Pro Phe Glu Ala Asp Val Thr Pro Tyr Val115 120 125
Ile Ala Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Val Cys Val Asn Asn Glu Leu130 135 140
Asn Trp Gln Thr Ile Pro Pro Gly Met Val Ile Thr Asp Glu Asn Gly145 150 155 160
Lys Lys Lys Gln Ser Tyr Phe His Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly Ile165 170 175
His Arg Ser Val Met Leu Tyr Thr Thr Pro Asn Thr Trp Val Asp Asp180 185 190
Ile Thr Val Val Thr His Val Ala Gln Asp Cys Asn His Ala Ser Val195 200 205
Asp Trp Gln Val Val Ala Asn Gly Asp Val Ser Val Glu Leu Arg Asp210 215 220
Ala Asp Gln Gln Val Val Ala Thr Gly Gln Gly Thr Ser Gly Thr Leu225 230 235 240
Gln Val Val Asn Pro His Leu Trp Gln Pro Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr245 250 255
Glu Leu Cys Val Thr Ala Lys Ser Gln Thr Glu Cys Asp Ile Tyr Pro260 265 270
Leu Arg Val Gly Ile Arg Ser Val Ala Val Lys Gly Glu Gln Phe Leu275 280 285
Ile Asn His Lys Pro Phe Tyr Phe Thr Gly Phe Gly Arg His Glu Asp290 295 300
Ala Asp Leu Arg Gly Lys Gly Phe Asp Asn Val Leu Met Val His Asp305 310 315 320
His Ala Leu Met Asp Trp Ile Gly Ala Asn Ser Tyr Arg Thr Ser His325 330 335
Tyr Pro Tyr Ala Glu Glu Met Leu Asp Trp Ala Asp Glu His Gly Ile340 345 350
Val Val Ile Asp Glu Thr Ala Ala Val Gly Phe Asn Leu Ser Leu Gly355 360 365
Ile Gly Phe Glu Ala Gly Asn Lys Pro Lys Glu Leu Tyr Ser Glu Glu370 375 380
Ala Val Asn Gly Glu Thr Gln Gln Ala His Leu Gln Ala Ile Lys Glu385 390 395 400
Leu Ile Ala Arg Asp Lys Asn His Pro Ser Val Val Met Trp Ser Ile405 410 415
Ala Asn Glu Pro Asp Thr Arg Pro Gln Val His Gly Asn Ile Ser Pro420 425 430
Leu Ala Glu Ala Thr Arg Lys Leu Asp Pro Thr Arg Pro Ile Thr Cys435 440 445
Val Asn Val Met Phe Cys Asp Ala His Thr Asp Thr Ile Ser Asp Leu450 455 460
Phe Asp Val Leu Cys Leu Asn Arg Tyr Tyr Gly Trp Tyr Val Gln Ser465 470 475 480
Gly Asp Leu Glu Thr Ala Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Leu Leu Ala485 490 495
Trp Gln Glu Lys Leu His Gln Pro Ile Ile Ile Thr Glu Tyr Gly Val500 505 510
Asp Thr Leu Ala Gly Leu His Ser Met Tyr Thr Asp Met Trp Ser Glu515 520 525
Glu Tyr Gln Cys Ala Trp Leu Asp Met Tyr His Arg Val Phe Asp Arg530 535 540
Val Ser Ala Val Val Gly Glu Gln Val Trp Asn Phe Ala Asp Phe Ala545 550 555 560
Thr Ser Gln Gly Ile Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Lys Gly Ile Phe565 570 575
Thr Arg Asp Arg Lys Pro Lys Ser Ala Ala Phe Leu Leu Gln Lys Arg580 585 590
Trp Thr Gly Met Asn Phe Gly Glu Lys Pro Gln Gln Gly Gly Lys Gln595 600 605
Ala Ser His His His His His His Val610 615
<210> 35
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Calcitocina salmão<400> 35
Lys Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu1 5 10 15
Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr20 25 30
Pro Gly
<210> 36<211> 102<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> Calcitonina salmão
<400> 36
aagtgctcca acctctctac ctgcgttctt ggtaagctct ctcaggagct tcacaagctc 60
cagacttacc ctagaaccaa cactggttcc ggtacccctg gt 102
<210> 37
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hEGF<400> 37
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His15 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg50
<210> 38
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> hEGF<400> 38
aactctgatt cagaatgccc actcagtcac gacggatatt gtcttcacga tggggtatgc 60
atgtacatcg aggccttgga caagtácgca tgtaattgtg tagtgggata cattggtgaa 120cgctgtcagt atcgagactt gaaatggtgg gagcttaggt ga 162
<210> 39
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hGH<400> 39
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg15 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
<210> 40
<211> 576
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> hGH<400> 40ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta tgctccgcgc ccatcgtctg 60caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag cctatatccc aaaggaacag 120aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagagtc tattccgaca 180ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctgctccg catctccctg 240ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca ggagtgtctt cgccaacagc 300ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc taaaggacct agaggaaggc 360atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc ggactgggca gatcttcaag 420cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctga 576
<210> 41
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hEGF<400> 41
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg50
<210> 42
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> hEGF
<400> 42
aactctgatt cagaatgccc actcagtcac gacggatatt gtcttcacga tggggtatgc
atgtacatcg aggccttgga caagtacgca tgtaattgtg tagtgggata cattggtgaa
60120cgctgtcagt atcgagactt gaaatggtgg gagcttaggt ga
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotideo 22aZ-5'
<400> 43
gaggatccgc atggctacca agatattagc cct 33
<210> 44
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide 22aZ-3'
<400> 44
cattcatgat tccgccacct ccaccaaaga tggcacctcc aacgatgg 48
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotideo Arroz 13Prol-5'<400> 45
gagtcgacgg atccatgaag atcattttcg tctttgctct cc 42
<210> 46
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotideo Arroz 13Prol-3'<400> 46
catccatggt tccgccacct ccacccaaga caccgccaag ggtggtaatg g 51
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso da seqüência 1 das repetições tandem nas gliadinas
<400> 47Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso da seqüência 1 das repetições tandem nas gliadinas
<400> 48
Pro Gln Gln Gln Pro Pro Phe Ser1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Consenso da seqüência 3 das repetições tandem nas gliadinas
<400> 49
Pro Gln Gln Pro Gln1 5
<210><211><212><213>
5034DNA
Artificial
<220><223>
iniciador GFP 5'
<400> 50
aattcatgag cagtaaagga gaagaacttt tcac
34
<210><211><212><213>
5135DNA
Artificial
<220><223>
iniciador GFP 3'
<400> 51
attggatcct cattatttgt atagttcatc catgc
35
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> iniciador RTB5
<400> 52
aattcatgag cagtaaagga gaagaacttt tcac
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador RTB3
<400> 53
ttaccattat tttgataccc gggaag 26
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador SPfor
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RX3ECFP3'
<400> 55
ggtggatccc tagaatccat ggtctggcac 30
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador RX3G5ECFP3'
<400> 54
cagtcgacac catgagggtg ttgctcgttg ccctcgctc
39
<400> 56
ggtggatccc tagagccacc gccacctcca tccatggtct ggca
44
<210> 57
<211> 1580
<212> DNA
<213> Artificial<220>
<223> HindIII/Xbal fragmento de DNA em pEGFP-Nl plasmideo<400> 57
aagcttcgaa ttctgcagtc gacaacatgg ctaccaagat attagccctc cttgcgcttc 60
ttgccctttt tgtgagcgca acaaatgcgt tcattattcc acaatgctca cttgctccta 120
gtgccattat accacagttc ctcccaccag ttacttcaat gggcttcgaa cacctagctg 180
tgcaagccta caggctacaa caagcgcttg cggcaagcgt cttacaacaa ccaattaacc 240
aattgcaaca acaatccttg gcacatctaa ccatacaaac catcgcaacg caacagcaac 300
aacagttcct accagcactg agccaactag atgtggtgaa ccctgtcgcc tacttgcaac 360
agcagctgct tgcatccaac ccacttgctc tggcaaacgt agctgcatac caacaacaac 420
aacaattgca gcagtttctg ccagcgctca gtcaactagc catggtgaac cctgccgcct 480
acctacaaca gcaacaactg ctttcatcta gccctctcgc tgtgggtaat gcacctacat 540
acctgcaaca acaattgctg caacagattg taccagctct gactcagcta gctgtggcaa 600
accctgctgc ctacttgcaa cagctgcttc cattcaacca actgactgtg tcgaactctg 660
ctgcgtacct acaacagcga caacagttac ttaatccact agaagtgcca aacccattgg 720
tcgctgcctt cctacagcag caacaattgc taccatacag ccagttctct ttgatgaacc 780
ctgccttgtc gtggcagcaa cccatcgttg gaggtgccat ctttggtgga ggtggcggaa 840
tcatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 900
acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 960
acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 1020
ccctcgtgac caccctgacc tggggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 1080
agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 1140
tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 1200
tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 12 60
acaagctgga gtacaactac atcagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga 1320
acggcatcaa ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 1380
ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 1440
actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 1500
tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt 1560
aaagcggccg cgactctaga 1580<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador ECFP NcoI 5'
<400> 58
gtaccatggt gagcaagggc gaggagctg
<210> 59
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador ECFPNl BamNotSac 3'
<400> 59
gcagagctcg cggccgcgga tccttacttg tacagctcgt ccatgccg
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador mCherry RcaI 5'
<400> 60
atcatgatgg tgagcaaggg cgag
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador RX3STOP3'
<4 00> 61
tcggatcctt ctagaatcat caggtct
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador 51DNAb
<4 00> 62
agccatggcg cgagtccgga gctatctctg<210><211><212><213>
6323DNA
Artificial
<220>
<223> iniciador 3'DNAb
<400> 63
gttgtgtaca atgatgtcat tcg
23
<210><211><212><213>
6443DNA
Artificial
<220>
<223> iniciador DNAb-hGH
<4 00> 64
gaatgacatc attgtacaca acttcccaac cattccctta tcc
43
<210><211><212>
6540DNA
<213> Artificial<220>
<223> iniciador 3' hGH
<400> 65
atggtaccac gcgtcttatc agaagccaca gctgccctcc
40
<210><211><212><213>
6636DNA
Artificial
<220>
<223> iniciador IM-for
<4 00> 66
atcattgtac acgccttccc aaccattccc ttatcc
36
<210><211><212>
6735DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador IM-rev
<4 00> 67
tcaggatcct tatcagaagc cacagctgcc ctcca
35<210> 68
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Casp3 avante<400> 68
gactcatgat cgatgaggtg gacatggaga acactgaaaa ctcag 45
<210> 69
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Casp3 inverso<400> 69
ctgggtacca tgtctagatc attagtgata aaaatagagt tcttttgtg 4 9
<210> 70
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Casp2 para
<400> 70
gactcatgat cgatgagcac gacggtcctc tctgccttca ggt 43
<210> 71
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Casp2 inverso
<400> 71
ctgggtacca tgtctagata atcatgtggg agggtgtcct ggg 43
<210> 72
<211> 1148
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NheI/HindlII fragmento de DNA em pcDNA3.1(-)<400> 72
gctagcgttt aaacgggccc tctagactcg acaccatgag ggtgttgctc gttgccctcg 60
ctctcctggc tctcgctgcg agcgccacct ccacgcatac aagcggcggc tgcggctgcc 1201802403003604204805406006607207808409009601020108011401148
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador bGH rev
<400> 73
cctcgactgt gccttcta 18
<210> 74
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador bGH rev2
<400> 74
cctctagact cgacccatgg tgagcaaggg cgaggag 37
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Claims (35)

1. - Célula hospedeira eucariótica que con-tém uma proteína de fusão recombinante dentro de con-juntos semelhantes a corpo proteinico recombinante (RP-BLAs), caracterizada por- a dita proteína de fusão conter duas se-qüências ligadas entre si, em que uma seqüência é umaseqüência indutora de proteína corpórea (PBIS) e a ou-tra é um polipeptídio biologicamente ativo,sendo o dito polipeptídio biologicamenteativo encontrado naturalmente no segundo tipo de célulaque é diferente da dita célula hospedeira eucariótica,sendo que a dita célula hospedeira eucari-ótica não produz corpos de proteína na ausência da ditaproteína de fusão.
2. - Célula hospedeira, de acordo com areivindicação 1, caracterizada por a dita proteína defusão incluir ainda uma seqüência ligante entre a se-qüência indutora de proteína corpórea e a seqüência dopolipeptídio biologicamente ativo.
3. - Célula hospedeira, de acordo com qual-quer uma das reivindicações anteriores, caracterizadapor a seqüência indutora de proteína corpórea compreen-der uma seqüência de prolamina.
4. - Célula hospedeira, de acordo com areivindicação 3, caracterizada por a seqüência de pro-lamina ser gama-zeína, alfa-zeína, gama-gliadina ouprolamina de arroz.
5. - Célula hospedeira, de acordo com areivindicação 4, caracterizada por a seqüência de pro-lamina ser a seqüência RX3 de gama-zeina.
6. - Célula hospedeira, de acordo com qual-quer uma das reivindicações anteriores, caracterizadapor a seqüência indutora de proteína corpórea incluirainda uma seqüência que encaminha uma proteína no sen-tido do retículo endoplásmico (ER) de uma célula deplanta.
7. - Célula hospedeira, de acordo com areivindicação 6, caracterizada por a seqüência indutorade proteína corpórea que encaminha uma proteína no sen-tido do ER de uma célula hospedeira de planta ser umpeptídio de sinal proveniente da mesma planta que orestante das PBIS ou proveniente de uma planta diferen-te.
8. - Célula hospedeira, de acordo com areivindicação 7, caracterizada por o dito peptídio desinal ser selecionado a partir do grupo que consiste daseqüência de peptídios de sinal de gama-zeina de 19 re-síduos, da seqüência de peptídios de sinal de alfa-gliadina de 19 resíduos, da seqüência de peptídios desinal de gama-gliadina de 21 resíduos e da proteína re-lacionada com patogênese da seqüência de peptídios desinal de 25 resíduos da classe PRlO.
9. - Célula hospedeira, de acordo com qual-quer uma das reivindicações anteriores, caracterizadapor o polipeptídio biologicamente ativo da dita proteí-na de fusão exibir pelo menos 25% da atividade biológi-ca do mesmo polipeptídio isolado a partir do dito se-gundo tipo de célula.
10. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri-zada por o polipeptídio biologicamente ativo da ditaproteína de fusão conter pelo menos duas seqüências deglicosilação ligadas por N.
11. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações precedentes, caracteri-zada por a seqüência indutora de proteína corpórea e opolipeptídio biologicamente ativo da dita proteína defusão serem ligadas entre si por uma seqüência de ami-noácidos espaçadores que é suscetível de ser clivadapor meios enzimáticos ou químicos ou não é suscetívelde ser clivada.
12. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri-zada por as ditas células hospedeiras serem células de algas.
13. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri-zada por as ditas células hospedeiras serem células deanimais.
14. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri-zada por as ditas células hospedeiras serem de célulasde plantas mais altas.
15. - Célula hospedeira, de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, caracteri-zada por as ditas células hospedeiras serem célulasfúngicas.
16. - Conjuntos semelhantes a corpo proteí-nico recombinante (RPBLAs), caracterizados por compre-enderem uma proteína de fusão encerrado por membrana, adita proteína de fusão contendo duas seqüências ligadasentre si em que uma seqüência é uma seqüência indutorade proteína corpórea (PBIS) e a outra é um polipeptídiobiologicamente ativo.
17. - RPBLAs, de acordo com a reivindicação-16, caracterizados por terem uma densidade de cerca de-1,1 até cerca de 1,35 g/ml.
18. - RPBLAs, de acordo com as reivindica-ções 16 ou 17, caracterizados por a dita PBIS incluiruma seqüência de prolamina.
19. - RPBLAs, de acordo com a reivindicação-18, caracterizados por a dita seqüência de prolaminaser selecionada a partir do grupo que consiste de gama-zeína, alfha-zeína, prolamina de arroz e gama-gliadina.
20. - RPBLAs, de acordo com a reivindicação-19, caracterizados por a dita seqüência de prolaminaser a seqüência RX3 de gama-zeína.
21. - RPBLAs, de acordo com as reivindica-ções 16 a 20, caracterizados por a dita PBIS também in-cluir uma seqüência que encaminha uma proteína no sen-tido do reticulo endoplásmico (ER) de uma célula deplanta.
22. - RPBLAs, de acordo com a reivindicação-21, caracterizados por a dita seqüência que encaminhauma proteína no sentido do ER de uma célula de plantaser um peptídio de sinal proveniente da mesma plantaque o restante das PBIS ou proveniente de uma plantadiferente.
23. - RPBLAs, de acordo com a reivindicação-22, caracterizados por o dito peptídio de sinal ser se-lecionado a partir do grupo que consiste da seqüênciade peptídios de sinal de gama-zeína de 19 resíduos, daseqüência de peptídios de sinal de alfa-gliadina de 19resíduos, da seqüência de peptídios de sinal de gama-gliadina de 21 resíduos e da proteína relacionada compatogênese da seqüência de peptídios de sinal de 25 re-síduos da classe PRlO.
24. - Método para a preparação de um poli-peptídio biologicamente ativo, caracterizado pelo fatode compreender as etapas de:a) proporcionar conjuntos semelhantes acorpo proteínico recombinante (RPBLAs) que compreendemuma proteína de fusão encerrada em membrana, sendo quea dita proteína de fusão contém duas seqüências ligadasentre si, em que uma seqüência é uma seqüência indutorade proteína corpórea (PBIS) e a outra é um polipeptídiobiologicamente ativo;b) contactar os RPBLAs com um amortecedoraquoso que contém uma quantidade de um agente tensoati-vo capaz de desmontar membrana;c) manter o dito contacto durante um perí-odo de tempo suficiente para desmontar a membrana e auma temperatura que não desnatura o polipeptídio biolo-gicamente ativo para separar a membrana em relação àproteína de fusão;d) coletar a proteína de fusão separadaque contém o polipeptídio biologicamente ativo.
25.- Método, de acordo com a reivindicação-24, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusãoseparada exibe a atividade biológica do dito polipeptí-dio biologicamente ativo.
26. - Método, de acordo com a reivindicação-24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o dito poli-peptídio biologicamente ativo é ligado à dita PBIS poruma seqüência de aminoácidos espaçadora que é suscetí-vel de ser clivada por meios enzimáticos ou químicos.
27. - Método, de acordo com a reivindicação-26, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídiobiologicamente ativo exibe atividade biológica quandoclivado a partir da BPIS da proteína de fusão.
28. - Método, de acordo com as reivindica-ções 24 a 27, caracterizado pelo fato que os ditos RP-BLAs estão presentes em uma forma geralmente esféricaque tem um diâmetro de cerca de 0,5 até cerca de 3 mi-crômetros.
29. - Vacina ou inóculo, caracterizada porcompreender uma quantidade efetiva imunogênica de con-juntos semelhantes a corpo proteinico recombinante (RP-BLAs) que contém uma proteína de fusão recombinantedissolvida ou dispersada em um diluente farmaceutica-mente aceitável, a dita proteína de fusão recombinantecontendo duas seqüências ligadas uma à outra em que umaseqüência é uma seqüência indutora de proteína corpórea(PBIS) e a outra é um polipeptídio imunogênico biologi-damente ativo ao qual vai ser induzida uma resposta i-munológica pela dita vacina ou inoculo.
30. - Vacina ou inóculo, de acordo com areivindicação 29, caracterizada por a dita proteína defusão incluir ainda uma seqüência de ligante entre aseqüência indutora de proteína corpórea e a seqüênciado polipeptídio imunogênico biologicamente ativo.
31. - Vacina ou inóculo, de acordo com asreivindicações 29 ou 30, caracterizada por a PBIS com-preender uma seqüência de prolamina.
32. - Vacina ou inóculo, de acordo com areivindicação 31, caracterizada por a seqüência de pro-lamina ser gama-zeína, alfa-zeína, gama-gliadina ouprolamina de arroz.
33. - Vacina ou inóculo, de acordo com areivindicação 31, caracterizada por a seqüência de pro-lamina ser a seqüência RX3 de gama-zeína.
34. - Vacina ou inóculo, de acordo com asreivindicações 29 a 33, caracterizada por os ditos RP-BLAs aperfeiçoarem a distribuição de antígeno para ascélulas de apresentação de antígeno.
35. - Vacina ou inóculo, de acordo com asreivindicações 29 a 34, caracterizada por os ditos RP-BLAs aperfeiçoarem o processamento de antigenos e apre-sentação às células de apresentação de antigeno.
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