KR102139844B1 - 암 표적화 치료용 알부민-결합 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

암 표적화 치료용 알부민-결합 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 또는 다른 아르기닌-의존성 질병을 치료하기 위한 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질(AAD)을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. AAD 융합 단백질은 조 단백질의 가용성 및 불용성 분획 둘 다로부터 정제될 수 있으며, 이는 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합하고 암 세포에서 아르기닌의 효율적인 고갈을 위한 보다 긴 반감기와 함께 이의 높은 활성을 갖는다. 본 발명에서 야생형 ADI 및 AAD의 특이 활성은 각각 8.4 및 9.2U/mg(생리학적 pH 7.4에서)이다. 본 발명에 사용된 AAD는 다양한 암(예를 들면, 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 간암, 비인강암, 식도암, 전립샘 암, 위암 및 뇌암)의 치료시 및 아르기닌-의존성 질병을 치유하는데 사용될 수 있다. 조성물은 단독으로 또는 적어도 하나의 화학치료제와 함께 사용되어 암 치료 및/또는 전이를 억제하는데 있어서 상승 효과를 제공할 수 있다.

Description

암 표적화 치료용 알부민-결합 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ALBUMIN-BINDING ARGININE DEIMINASE FOR CANCER TARGETING TREATMENT}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 3월 6일자로 출원된 미국 가특허원 일련 번호 제61/773,214호 및 2014년 3월 5일자로 출원된 미국 비-가특허원 일련 번호 제14/197,236호로부터의 이익을 청구하며, 이의 기재내용은, 이의 전문이 참조로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 유전적으로 변형되어 고 활성 및 장기간의 생체내 반감기를 갖는 물질을 생성하는 알부민-결합 아르기닌 데이미나제(AAD) 융합 단백질을 기술한다. 본 발명은 상이한 AAD 융합 단백질을 생성하기 위해 가공되는 DNA 및 단백질에 대한 설계를 추가로 기술한다. AAD 융합 단백질은 조 단백질의 가용성 분획 및 불용성 분획(봉입체)으로부터 분리되어 정제될 수 있다. 본 발명은 또한 사람 및 다른 동물에서 암 표적화 치료 및 아르기닌-의존성 질병을 치유하기 위한 알부민-결합 아르기닌 데이미나제-함유 약제학적 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
전세계 인구에서 췌장 암, 결장 암, 간 암, 흑색종 및 경부 암의 발생은 증가하고 있다. 이들 질병에 대한 효과적인 치료가 급격하게 요구되고 있다. 백혈병, 흑색종, 췌장, 결장, 신장 세포 암종, 폐, 전립샘, 유방, 뇌, 경부 및 간 암을 포함하는 많은 유형의 암에서, 암 세포는 아르기니노석시네이트 신테타제(ASS)의 발현을 결여하므로 아르기닌에 대한 영양요구성이어서, 이들 암이 아르기닌 고갈 치료요법에 대한 탁월한 표적이 되도록 한다.
아르기닌은 사람 및 다른 포유동물에 대한 반-필수적인 아미노산이다. 이는 우레아 주기 효소 아르기니노석시네이트 신타제(ASS) 및 아르기니노석시네이트 리아제(ASL)에 의해 촉매된 2 단계 공정을 통해 시트룰린으로부터 합성될 수 있다. 아르기닌은 효소 아르기나제에 의해 오르니틴으로 대사될 수 있으며, 오르니틴은 미토콘드리아에서 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(OTC)에 의해 시트룰린으로 전환될 수 있다. 시트룰린은 다시 아르기닌을 합성하는데 이용될 수 있다. 정상 세포는 일반적으로 ASS 및 ASL의 풍부한 촉매 활성으로 인하여 성장을 위한 아르기닌의 외인성 공급을 필요로 하지 않는다. 대조적으로, 많은 유형의 암은 ASS를 발현하지 않으므로 아르기닌에 대해 영양요구성이다. 이들의 성장은 혈액 순환으로부터 유일하게 수득된 아르기닌에 의존적이다. 따라서, 아르기닌-분해 효소를 사용함에 의한 순환하는 아르기닌의 표적화는 ASS-음성 종양 성장을 억제하기 위한 실행가능한 전략이다[참조: Feun et al., Curr. Pharm. Des. 14: 1049-1057 (2008); Kuo et al., Oncotarget. 1 :246-251 (2010)]
아르기닌은 아르기나제, 아르기닌 데카복실라제, 및 아르기닌 데이미나제(ADI)에 의해 분해될 수 있다. 이들 중에서, 아르기닌 데이미나제(ADI)는 아르기닌에 대해 최대 친화성(낮은 Km 값)을 갖는 것으로 여겨진다. ADI는 아르기닌을 우레아 주기의 대사산물인, 시트룰린 및 암모니아로 전환시킨다. 불행하게도, ADI는 원핵세포, 예를 들면, 마이코플라스마 아종(Mycoplasma sp.)에서만 발견될 수 있다. 원핵세포로부터 ADI의 분리 및 정제와 관련된 일부 문제가 존재한다. 슈도모나스 푸디타(Pseudomonas pudita)로부터 분리된 ADI는 중성 pH에서 이의 낮은 효소 활성으로 인하여 생체내에서 효능을 나타내지 못한다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 생산된 ADI는 효소적으로 불활성이며 후속적인 생산 비용을 유발하는 다수의 변성 및 복원 공정을 후속적으로 필요로 한다.
천연의 ADI는 미생물에서 발견되므로, 이는 항원성이고 환자에서 순환으로부터 신속하게 정화된다. ADI의 천연 형태는 사람 순환내로 주사시 면역원성이며 반감기가 짧고(~4 시간) 중화 항체를 유발한다[참조: Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Izzo et al, J. Clin. Oncol. 22: 1815-1822 (2004)]. 이들 단점은 페길화에 의해 제거될 수 있다. 다양한 형태의 페길화된 ADI 중에서, PEG(분자량 20,000)에 석신이미딜 석시네이트를 통해 결합된 ADI(ADI-PEG 20)는 효율적인 제형인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 페길화 후 ADI의 활성은 50%의 정도로 크게 감소한다[참조: Ensor et al, Cancer Res. 62:5443-5450 (2002)]. 페길화된 ADI를 생성하기 위한 앞서의 시도는 동종이 아닌 물질을 생성하며(단백질 표면 Lys 잔기 상의 PEG의 무작위적인 부착으로 인하여) 또한 제조 공정 동안에 특성화하고 품질 조절을 수행하기가 어렵다. 또한, PEG는 매우 비싸고, 생산 비용이 크게 증가한다. 페길화된 ADI를 생체내에서 정맥내 주사한 후, 유리된 PEG의 누출 또는 탈착이 관찰되며 ADI(PEG 부재)는 면역원성 문제를 유발할 수 있다. 따라서, 개선된 암-치료 조성물, 특히, 활성 및 생체내 반감기가 향상된 개선된 암-치료 조성물에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명에서, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제(AAD) 융합 단백질은 이의 활성 및 혈장 반감기를 증가시켜 암 세포내에서 아르기닌을 효율적으로 고갈시킨다. 천연의 ADI는 미생물에서 발견될 수 있으며 항원성이고 환자내 순환으로부터 신속하게 정화된다. 본 발명은 1개 또는 2개의 알부민-결합 단백질과의 상이한 AAD 융합 단백질을 작제하여 고 활성과 함께 보다 긴 생체내 반감기(1회 주사 후 적어도 5일의 아르기닌 고갈)를 유지한다. 본 발명에서, AAD 융합 단백질 생성물내 알부민 결합 단백질은 이의 특이적인 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 여겨지지 않지만 대신 순환하는 반감기를 증가시키는 것으로 여겨진다. 본 발명에서 야생형 ADI 및 AAD 융합 단백질의 특이 활성은 각각 8.4 및 9.2U/mg(생리학적 pH 7.4에서)이다.
이의 광범위한 의미에서, 본 발명은 아르기닌 데이미나제를 포함하는 제2의 부위에 융합됨으로써 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 형성함으로써 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질이 아르기닌 데이미나제의 활성을 보유하고 또한 혈청 알부민에 결합할 수 있는 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩타이드 또는 알부민-결합 단백질(들)로부터 선택된 1개 또는 2개의 성분을 포함하는 제1의 부위를 포함하는 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 사람 및 다른 동물에서 표적화된 암 치료를 위한 알부민-결합 아르기닌 데이미나제(AAD) 융합 단백질-함유 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제1 국면은 암 세포에 대해 고 친화성을 지닌 변형된 AAD 융합 단백질을 작제하는 것이다. 본 발명의 제2 국면은 조 단백질의 가용성 및 불용성 분획 둘 다로부터 고 순도를 지닌 AAD 융합 단백질을 정제하는 것이다. 본 발명의 제3 국면은 순환시 알부민에 보다 잘 결합할 수 있도록 AAD 융합 단백질의 반감기를 연장시키는 것이다. 본 발명의 제4 국면은 상기 조성물을 다양한 종양, 암 또는, 종양 또는 암과 관련된 질병 또는 다른 아르기닌-의존성 질병으로 고생하는 이를 필요로 하는 피검자에게 투여함으로써 암을 치료하기 위한 본 발명의 AAD-함유 약제학적 조성물의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 AAD 융합 단백질은 알부민-결합 단백질 및 ADI로의 분리를 피하기 위해 변형시킴으로써 이것이 보다 안정하게 되고 순환시 보다 긴 반감기를 가지도록 한다. ADI는 AAD 융합 생성물 속에서 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질에 융합하여 혈장 반감기를 연장시키고 융합 생성물의 면역원성을 감소시킨다. 알부민 결합 도메인(ABD)은 혈액 속에서 알부민에 결합하는 펩타이드이다. 상이하거나 증진된 사람 혈청 알부민(HSA) 친화도를 나타내는 ABD의 상이한 변이체가 존재한다. ABD의 상이한 변이체를 작제하여 ADI에 융합시킬 수 있다. 천연적으로 존재하는 ADI와는 달리, 이러한 보다 긴 반감기 특성은 암 세포, 암 줄기 세포 및/또는 암 후대 세포에서 아르기닌의 고갈을 효율적으로 촉진시킨다.
AAD 융합 단백질을 함유하는 약제학적 조성물은 정맥(i.v.) 주사(의약의 신속히 작용하는 용량용) 및 근육내(i.m.) 주사(의약이 상당한 신속-작용 및 장기-지속 용량용)용으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 AAD 융합 단백질의 적용은 췌장 암, 백혈병, 두경부암(head and neck cancer), 결장직장암, 폐암, 유방암, 전립샘암, 경부암, 간암, 비인강암, 식도암 및 뇌암과 같은 다양한 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 AAD 융합 단백질, 암을 치료하는 방법, 암 조직의 전이를 치료하고/하거나 억제하는 방법, 및 아르기닌-의존성 질병을 치유하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 또한 화학치료학적 약물 및/또는 방사선치료요법과 본 발명의 AAD 융합 단백질의 조합물을 사용하여 암 치료시 상승 효과를 제공함을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 3차원 구조에서 1개 또는 2개의 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질(들)과의 상이한 AAD 융합 단백질의 작제를 위한 설계 시도를 나타낸다. 1개 또는 2개의 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질(들)을 ADI에 융합시켜 AAD 융합 단백질을 형성할 수 있다. 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질의 위치는 ADI 활성 부위로부터 멀다.
알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질을 ADI의 N-말단 또는/및 C-말단에 융합시킬 수 있다. 당해 도에서 구조는 마이코플라스마 아르기니니(Mycoplasma arginini) ADI 구조(단백질 데이타 뱅크: 1LXY)를 기본으로 한다. (A) 천연의 ADI; (B) 2개의 ABD 또는 ABDl과의 AAD 융합 단백질; (C) N-말단에서 하나의 ABD 또는 ABDl과의 AAD 융합 단백질; (D) C-말단에서 하나의 ABD 또는 ABDl과의 AAD 융합 단백질.
도 2는 마이코플라스마 아르기니니(서열 번호 23), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) (서열 번호 24), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(서열 번호 25) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)(서열 번호 26)을 포함하는 일부 세균 종에서 ADI에 대한 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 마이코플라스마 아르기니니로부터 기원한 상이한 AAD 융합 단백질(A 내지 E) 및 바실러스 세레우스로부터 기원한 AAD 융합 단백질(F)에 대한 설계 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 다음의 도식 하에서 인테인-융합 단백질 및 발현된 단백질 연결(CBD, 키틴 결합 도메인)의 사용에 의한 2개의 구현예 (A) 및 (B)에서 AAD 융합 단백질의 생성을 나타낸다; (C) C-말단 융합체; (D) N-말단 융합체; (E) 인테인-매개된 단백질 연결.
도 5는 AAD 융합 단백질을 생산하기 위해 작제된 발현 벡터의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 6은 His-ABD-폴리N-ADI의 (A) 유전자 지도, (B) 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 44) 및 (C) 아미노산 서열(서열 번호 40)을 나타낸다. (ADI: 마이코플라스마 아르기니니 ADI)
도 7은 His-ABD-폴리N-bcADI의 (A) 유전자 지도, (B) 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 45) 및 (C) 아미노산 서열(서열 번호 41)을 나타낸다(bcADI, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ADI)
도 8은 AAD 융합 단백질의 발현 및 정제를 나타낸다: (A) AAD는 20℃에 노출되는 경우 ~90% 가용성이고(레인 2 및 3) 37℃에 노출되는 경우 ~90% 불용성(봉입체)이다(레인 4 및 5); (B) 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에서 정제된 AAD 융합 단백질: 레인 1, 정제된 AAD 융합 단백질(52.8 kDa); 레인 2, 분자량 마커.
도 9는 AAD 융합 단백질이 아르기닌을 효율적으로 고갈시키며 사람 흑색종(A375), 사람 결장암(HCT116), 및 사람 췌장암(패널 I)을 포함하는, 시험관내 조직 배양 연구에서 다양한 유형의 사람 암 세포주의 성장을 억제함을 나타낸다.
도 10은 AAD 융합 단백질의 알부민 결합 결과를 나타낸다: (A) 첨가된 AAD 융합 단백질(아미노산 서열은 서열 번호 36에 나타낸다; 도 3a)의 양이 증가하는 경우 HSA+AAD 복합체의 양에 있어서의 증가를 나타내는 비-변성의 천연 폴리아크릴아미드 겔(12%). 사람 혈청 알부민(HSA)의 몰 비: 레인 3 내지 6에서 AAD는 각각 1 :1, 1:2, 1:5, 및 1:15이다. 레인 1 및 2는 6 및 30 pmole 각각에서 HSA 및 AAD를 나타낸다; (B) AAD 융합 단백질(서열 번호 40; 도 3e)을 기본으로 한 다른 실험에서, 1:8의 알부민:AAD 비가 존재하는 모든 알부민을 결합시키는데 충분하다(레인 5).
도 11은 마우스에서 혈장 아르기닌 수준에 있어서 AAD 융합 단백질의 투여량 반응을 나타내는 그래프이다. 100㎍의 AAD의 투여량은 적어도 5일 동안 혈장 아르기닌을 고갈시키는데 충분하다.
정의
용어 "암 줄기 세포"는 생체내에서 종양 성장을 개시하고 지속시킬 수 있는 신생물 클론내 생물학적으로 명백한 세포를 말한다(즉,암-개시 세포).
발명의 상세한 설명
아르기닌은 사람 및 다른 포유동물용의 반-필수 아미노산이다. 이는 우레아 주기 효소 아르기니노석시네이트 신타제(ASS) 및 아르기니노석시네이트 리아제(ASL)에 의해 촉매된 2 단계 공정을 통한 시트룰린으로부터 합성될 수 있다. 아르기닌은 효소 아르기나제에 의해 오르니틴으로 대사될 수 있으며, 오르니틴은 미토콘드리아내에서 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제(OTC)에 의해 시트룰린으로 전환될 수 있다. 시트룰린은 다시 아르기닌을 합성하는데 이용될 수 있다. 정상 세포는 전형적으로 ASS 및 ASL의 풍부한 촉매 활성으로 인하여 성장을 위해 아르기닌의 외인성 공급을 필요로 하지 않는다. 대조적으로, 많은 유형의 암이 ASS를 발현하지 않으므로 아르기닌에 대해 영양요구성이다. 이들의 성장은 순환으로부터 아르기닌에 의존적이다. 따라서, 아르기닌-분해 효소를 사용함으로써 순환하는 아르기닌을 표적화하는 것은 ASS-음성 종양 성장을 억제하는 용이한 전략이다.
아르기닌은 아르기닌 데이미나제(ADI)에 의해 분해될 수 있다. ADI는 아르기닌을 우레아 주기의 대사산물인, 시트룰린 및 암모니아로 전환시킨다. 불행하게도, ADI는 원핵세포, 예를 들면, 마이코플라스마 아종에서만 발견될 수 있다. 원핵세포로부터 아르기닌 데이미나제의 분리 및 정제와 관련된 많은 문제들이 존재한다. 슈도모나스 푸디타로부터 분리된 ADI는 중성 pH에서 이의 낮은 효소 활성으로 인하여 생체내에서 효능을 나타내지 못하였다. 에스케리키아 콜라이로부터 생산된 ADI는 효소적으로 불활성이며 후속적인 생산 비용을 상승시키는 다중 변성 및 복원 공정을 필요로 한다. ADI의 천연 형태의 혈장 반감기는 사람 순환내로 주사시 짧다(~4시간)[참조: Ensor et al, Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Izzo et al, J. Clin. Oncol. 22: 1815-1822 (2004)]. 이들 단점은 페길화에 의해 부분적으로 제거된다. 다양한 형태의 페길화된 ADI 중에서, PEG(분자량 20,000)에 석신이미딜 석시네이트를 통해 결합된 ADI(ADI-PEG 20)는 효율적인 제형임이 밝혀졌다. 그러나, 페길화 후 ADI의 활성은 크게 감소한다(~50% 까지)[참조: Ensor et al, Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Wang et al, Bioconjug. Chem. 17: 1447-1459 (2006)]. 또한, 석신이미딜 석시네이트 PEG 링커는 단백질로부터 용이하게 가수분해되고 탈착되어 체내에서 짧은 사용 기간 후 면역원성 문제를 유발한다. 따라서, 개선된 암-치료 조성물, 특히, 활성이 향상된 개선된 암-치료 조성물에 대한 요구가 존재한다.
피. 푸디타(P. pudita)로부터 분리된 ADI는 중성 pH에서 효소 활성을 거의 지니지 않았고 실험 동물의 순환으로부터 신속하게 정화되었으므로 생체내에서 효능을 나타내는데 실패하였다. 마이코플라스마 아르기니니로부터 기원한 ADI는 예를 들면, 문헌[참조: Takaku et al, Int. J. Cancer, 51 :244-249 (1992), 및 미국 특허 제5,474,928호]에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 이종 단백질의 치료학적 용도와 관련된 문제는 이의 항원성이다. 마이코플라스마 아르기니니로부터의 ADI의 시아누릭 클로라이드 연결 그룹을 통해, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한 화학적 변형은 문헌[참조: Takaku et al, Jpn. J. Cancer Res., 84: 1195-1200 (1993)]에 기술되어 있다. 그러나, 변형된 단백질은 시아누릭 클로라이드 연결 그룹으로부터 시아나이드의 방출로 인하여 대사시 독성이었다. 대조적으로, ADI-PEG20의 경우에서조차, PEG 링커는 단백질로부터 용이하게 가수분해되어 탈착됨으로써 체내에서 짧은 기간의 사용 후 면역원성 문제를 유발할 수 있다. 따라서, 비-필수 아미노산을 분해하고 선행 기술과 관련된 문제를 가지지 않는 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
흑색종, 췌장, 결장, 백혈병, 유방, 전립샘, 신장 세포 암종 및 간암을 포함하는 많은 유형의 암에서, 암 세포는 아르기니노석시네이트 신타제(ASS)의 발현을 결여하므로 아르기닌에 대해 영양요구성이어서, 이들을 아르기닌 고갈 치료요법에 대한 탁월한 표적이 되도록 한다. 본 발명에서, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 (AAD) 융합 단백질은 암 세포에서 아르기닌의 효율적인 고갈에 대한 긴 반감기와 함께 고 활성을 갖는다.
ADI에 대한 단량체의 크기는 45 kDa의 정도이며 이는 이량체로서 존재한다(90 kDa의 정도)[참조: Das et al, Structure. 12:657-667 (2004)]. AAD 융합 단백질의 작제를 위한 설계는 도 1에 나타나 있다. 링커(들)의 존재 또는 부재하에 1개 또는 2개의 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질(들), 서열 번호 46 내지 49는 ADI에 융합되어 AAD 융합 단백질을 형성한다. 1개 또는 2개의 특수한 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질(들)의 선택이 표적화될 암 조직의 유형, 바람직한 크기 및 생성되는 융합 단백질의 반감기, 및 도메인 또는 전체 단백질의 선택 여부에 의존하여 이루질 수 있으므로 가치가 있다. 또한, 선택된 알부민-결합 물질은 동일하거나 상이할 수 있다. 즉, 단백질 및 펩타이드는, 생성되는 분자가 ADI의 활성을 보유하고 또한 융합 단백질의 하나의 일부의 기능이 융합 단백질의 다른 일부에 의해 방해되지 않으면서 혈청 알부민에 결합할 수 있는 한, 2개의 단백질, 2개의 도메인, 도메인 및 단백질에 융합될 수 있다. 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질의 위치는 활성 부위로부터 멀다. 알부민-결합 도메인/펩타이드/단백질은 ADI의 N-말단 또는/및 C-말단에 융합될 수 있다. 상이하거나 개선된 사람 혈청 알부민(HSA) 친화성을 나타내는 ABD의 상이한 변이체가 존재한다. ABD의 상이한 변이체를 작제하여 ADI에 융합시킬 수 있다. ADI를 지닌 일부 미생물(예를 들면, 슈도모나스 아종)은 이들의 잠재적인 병원성 및 발열원성으로 인하여, 사용될 수 없다. ADI의 공급원은 상이한 미생물, 예를 들면, 마이코플라스마[예를 들면, 마이코플라스마 아르기니니, 마이코플라스마 아르트리티디스(Mycoplasma arthritidis), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)], 락토코쿠스(Lactococcus)[예를 들면, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)], 슈도모나스[예를 들면, 슈도모나스 플레코글로씨키다(Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)], 스트렙토코쿠스(Steptococcus)[예를 들면, 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)], 에스케리키아, 마이코박테리움(Mycobacterium)[예를 들면, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)] 및 바실러스[예를 들면, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)]로부터 기원할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. ADI는 마이코플라스마 아르기니니, 락토코쿠스 락티스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 또는 이의 어떠한 조합으로부터 클로닝되는 것이 바람직하다. 서열 번호(서열 번호 23 내지 35)를 지닌 이들의 아미노산 서열 및 도 2에서 아미노산 서열 중의 일부에 대한 서열 정렬은 본원 및 또한 문헌[참조: Das et al, Structure. 12:657-667 (2004); Wang et al, Bioconjug. Chem. 17: 1447-1459 (2006); Ni et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 193-201 (2011)]에 개재되어 있다.
(A) 천연의 마이코플라스마 아르기니니 ADI 단백질(서열 번호 23), (B) 마이코플라스마 아르기니니 ADI로부터 기원한 상이한 AAD 융합 단백질(서열 번호 36 내지 40) 및 (C) 바실러스 세레우스 ADI로부터 기원한 AAD 융합 단백질(서열 번호 41)에 대한 설계 및 아미노산 서열은 도 3에 나타나 있다. 상이한 AAD 융합 단백질이 성공적으로 작제되어 있다. 링커는 이들 구현에에서 AAD 융합 단백질내 알부민-결합 단백질과 ADI 사이에 삽입된다.
다른 한편, 신규한 AAD 융합 단백질은 또한 인테인-융합 단백질의 사용 및 발현된 단백질 연결에 의해 생성된다(도 4). 신규한 AAD 융합 단백질은 (1) N-말단 시스테인 잔기를 지닌 ADI를 ABD의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응시키거나, (2) N-말단 시스테인 잔기를 지닌 ABD를 ADI의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응시킴으로써 ADI 및 ABD가 공유결합에 의해 연결되도록 함으로써 형성될 수 있다. 도 4e에서, N-말단 시스테인 잔기를 지닌 ADI는 ABD의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응한다. ABD의 C-말단에서 티오에스테르 태그, 및 ADI의 N-말단에서 α-시스테인은 단백질 연결을 촉진시키는데 요구된다. 이들 단편은 pTWINl 벡터(제조원: New England Biolabs)를 사용하여 제조업자의 매뉴얼에 따라 생산된다. 특히, ABD-인테인-CBD 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 합성하여 이를 이. 콜라이내에서 발현시키기 위한 T7 프로모터의 조절하에 벡터내로 클로닝한다(도 4c). 생산된 ABD-인테인-CBD 융합 단백질은 컬럼내에서 키틴에 결합한다. ABD-인테인-CBD의 아미노산 서열(서열 번호 42)은 도 4a에 나타낸다. 티올-유도성 절단 및 컬럼으로부터의 용출 후, 이의 C-말단에서 반응성 티오에스테르를 지닌 ABD를 수득한다(도 4c). 다른 한편, CBD-인테인-ADI 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 합성하여 이. 콜라이내에서 발현시키기 위한 T7 프로모터의 조절하에 벡터내로 클로닝한다(도 4d). 생산된 CBD-인테인-ADI 융합 단백질은 컬럼에서 키틴에 결합한다. CBD-인테인-ADI의 아미노산 서열(서열 번호 43)은 도 4b에 나타낸다. pH 7 및 25℃에서 분해, 및 컬럼으로부터 용출 후, 이의 N-말단에 α-시스테인을 지닌 ADI를 수득한다(도 4d). 최종적으로, AAD 융합 단백질은 도 4e에 나타낸 바와 같이 단백질 연결 반응에 의해 생산된다.
중요하게도, AAD 융합 단백질은 통상의 방식으로 생산되어 정제될 수 있다. 예를 들면, AAD 융합 단백질은 가용성 분획 및 불용성 분획 둘 다에서 이. 콜라이로부터 성공적으로 발현되어 정제되며, 당해 결과는 도 8에 나타낸다. 또한, 도 8은 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석된 정제된 AAD 융합 단백질을 나타낸다. 정제된 AAD 융합 단백질의 크기는 52.8 kDa로서 측정된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암 치료를 위해 종양 세포내에서 아르기닌을 고갈시키는데 고 활성을 지닌 AAD 융합 단백질을 함유한다. 정제된 AAD 융합 단백질의 특이 활성은 야생형 ADI의 것과 유사한 것으로 밝혀져 있다. IC50은 최대 억제 농도의 1/2이며, 즉, 이는 암 세포주의 50% 억제에 요구되는 AAD 융합 단백질의 농도를 나타낸다. IC50은 약물의 효능의 척도이다. 상이한 암 세포주(사람 흑색종, A375 & SK-mel-28; 사람 결장 암종, HCTl16; 사람 췌장 암, PancI; 사람 간 암, Sk-hepl; 사람 경부암, C-33A)에 대한 AAD 융합 단백질(아미노산 서열은 서열 번호 40에 나타낸다; 도 3e)의 IC50은 표 1에 나타낸다. 상이한 암 세포주에서 AAD 융합 단백질의 시험관내 효능은 도 9에 입증되어 있다. AAD 융합 단백질은 사람 흑색종, 사람 결장 암종 및 췌장 암 세포주를 포함하는 많은 세포유형을 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
암 세포주 AAD의 IC50(㎍/ml)
A375(사람 흑색종) 0.104
SK-mel-28(사람 흑색종) 1.92
PancI(사람 췌장암) 1
Sk-hep1(사람 간암) 10
C-33A(사람 경부암) 0.063
HCT116(사람 결장 암종) 1.30
알부민 결합 연구를 위해, 본 발명자들은, 가공된 AAD 융합 단백질이 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있음을 성공적으로 입증하였다. 도 10은, AAD 융합 단백질(아미노산 서열은 서열 번호 40에 나타낸다; 도 3e)은 HSA에 용이하게 결합한다. 1:5 또는 1:15의 몰 비에서, HSA-AAD 복합체의 형성은 도 1의 작제에 따라서 링커 분자 설계를 사용하여 형성시킨다. 혈액 속에서 AAD 융합 단백질의 순환하는 반감기는 비-공유결합성 HSA-AAD 복합체 형성에 의해 증가되는 것으로 예측된다. 따라서, AAD 융합 단백질의 장기-지속되는 버젼(version)이 성공적으로 생성되었다.
본 발명에서 제조된 AAD 융합 단백질-함유 약제학적 조성물과 비교하는 경우 어떠한 시판 제품도 고 효능을 나타내지 않는다. 암 치료에서 사용하기 위해, 본 발명의 AAD 융합 단백질-함유 약제학적 조성물은 종양 조직내에서 아르기닌을 고갈시키기 위한 항암제로서 제공된다. AAD 융합 단백질은 다른 분자 표적화 또는 세포독성제와 함께 사용될 우수한 후보물이다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 영역을 어떠한 방식으로도 제한할 의도없이 본 발명의 구체적인 구현예를 기술하는 방식으로 제공된다.
하기 실시예 몇몇은 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 클로닝 및 인테인-매개된 단백질 연결을 포함하는 다양한 기술을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "클로닝"은 광범위하게 사용되며 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 작제하고, 융합 유전자를 벡터내로 삽입하며, 당해 벡터를 숙주 유기체내로 삽입하고 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 포함하는 단백질을 발현시킴을 포함한다. 당해 기술에서 다수의 변형을 본 발명에 의해 고려되는 클로닝내에서 수행할 수 있으며 여전히 이에 속한다.
실시예 1
알부민-결합 도메인/ 펩타이드 /단백질( ABD )을 암호화하는 유전자의 작제
ABD를 암호화하는 유전자를 2 라운드의 PCR로 작제한다. 제1 라운드에서, PCR 반응 혼합물(25μl의 총 용적)은 다음 물질을 함유한다:
1 x iProof PCR 완충제(제조원: Bio-Rad)
50 μΜ dNTP 혼합물
0.5 단위의 iProof DNA 폴리머라제(제조원: Bio-Rad)
10 nM의 각각의 다음의 올리고
ABD -F1 전방 프라이머 (forward primer)(서열 번호 01):
5'-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3'
ABD - R2 역방 프라이머 (reverse primer)(서열 번호 02):
5'-TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC-3'
ABD -F3 전방 프라이머(서열 번호 03):
5'-GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACAA-3'
ABD - R4 역방 프라이머(서열 번호 04):
5'-TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC-3 '
ABD -F5 전방 프라이머(서열 번호 05):
5 '-GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTGC-3 '
ABD - R6 역방 프라이머(서열 번호 06):
5 '-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
다음의 PCR 프로그램이 사용된다:
98℃ 30s; 20주기의 {98℃ 10s, 50℃ 20s, 72℃ 20s}
제2 라운드의 PCR에서, PCR 혼합물(50μl의 총 용적)은 다음의 물질을 함유한다:
1x iProof PCR 완충액(Bio-Rad);
50μΜ dNTP 혼합물;
제1 라운드로부터의 DNA 주형(template)으로서 1μl의 PCR 반응제;
1 단위의 iProof DNA 폴리머라제(제조원: Bio-Rad);
200nM의 각각의 다음의 올리고:
ABD -F7 전방 프라이머(서열 번호 07):
5'-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3'
ABD - R8 역방 프라이머(서열 번호 08):
5'-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
다음의 PCR 프로그램이 사용된다:
98℃ 30s; 35 주기의 {98℃ 10s, 60℃ 20s, 72℃ 20s}; 72℃ 5분
ABD의 DNA 서열을 함유하는 PCR 생성물(169 bp)을 수득하고 클로닝 목적을 위해 Qiagen DNA 겔 추출 키트(Gel Extration Kit)로 정제한다.
실시예 2A
AAD 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자의 작제
제1의 PCR에서, PCR 혼합물(50μl의 총 용적)은 다음의 물질을 함유한다:
1 x iProof PCR 완충액(제조원: Bio-Rad);
50μΜ dNTP 혼합물;
25ng의 마이코플라스마 아르기니니 게놈성 DNA;
1 단위의 iProof DNA 폴리머라제(제조원: Bio-Rad);
200nM의 각각의 다음의 올리고:
ADINde-F 전방 프라이머(서열 번호 09):
5' - ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG -3'
ADIhis-R 역방 프라이머(서열 번호 10):
5'-AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTTAAC-3'
다음의 PCR 프로그램이 사용된다:
98℃ 1분; 35 주기의 {98℃ 10s, 50℃ 20s, 72℃ 40s}; 72℃ 5분
1280bp 길이의 PCR 생성물을 수득하고 Qiagen DNA 겔 추출 키트로 정제한다. 이후에, 제2의 PCR을 수행한다. PCR 혼합물(50μl의 총 용적)은 다음의 물질을 함유한다:
1x iProof PCR 완충액(제조원: Bio-Rad);
50μΜ dNTP 혼합물;
10ng의 1280bp PCR 생성물;
10ng의 169bp PCR 생성물;
1 단위의 iProof DNA 폴리머라제(제조원: Bio-Rad);
200nM의 각각의 다음의 올리고:
ADINde-F 전방 프라이머(서열 번호 11):
5'-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3'
ABD-RIO 역방 프라이머(서열 번호 12):
5'-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
다음의 PCR 프로그램이 사용된다:
98℃ 1분; 35 주기의 {98℃ 10s, 50℃ 20s, 72℃ 45s}; 72℃ 5분
1428 bp의 PCR 생성물을 수득하고 Qiagen DNA 겔 추출 키트로 정제한다. 이후에, 이를 제한 효소 Ndel 및 HindIII로 분해하고, 동일한 효소로 예비분해된 플라스미드 pREST A(제조원: Invitrogen)에 연결한다. 이후에, 연결 생성물을 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포내로 형질전환시킨다. 작제된 융합 유전자의 서열은 DNA 서열분석에 의해 입증된다.
실시예 2B
His- ABD - 폴리 N- ADI 의 클로닝
His-ABD-폴리N-ADI(서열 번호 40, 도 3e)의 작제는 2 단계의 오우버랩핑 PCR로 수행하며, 마지막 단계에서 수득된 PCR 단편을 벡터 pET3a내에 NdeI과 BamHI 부위 사이에 삽입한다. 유전자 지도, 뉴클레오타이드 서열 및 His-ABD-폴리N-ADI의 아미노산 서열은 도 6에 나타낸다.
His-ABD-폴리N-ADI의 작제시 포함된 프라이머:
hisABDNde-F 전방 프라이머(서열 번호 13):
5'-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3'
ABDnn-Rl 역방 프라이머(서열 번호 14):
5'-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3'
ABDn-R2 역방 프라이머(서열 번호 15):
5'-AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3'
ADln-F 전방 프라이머(서열 번호 16):
5'-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3'
ADIBam-R 역방 프라이머(서열 번호 17):
5'-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3'
제1 라운드의 PCR에서, 공지된 농도의 성분을 함유하는 50μl의 반응 용적을 2개의 PCR 튜브에서 제조한다. 각각의 튜브에, dNTP, iProof 완충액(제조원: BIO-RAD), iProof DNA 폴리머라제(제조원: BIO-RAD), 프라이머 및 DNA 주형을 혼합하고 50μl까지 ddH20로 가한다. 반응에 사용된 DNA 주형은 ADI 유전자의 단백질 서열의 변경없이 내부 NdeI 부위 돌연변이의 제거로 마이코플라스마 아르기니니로부터의 ADI의 유전자를 함유하는 pET3a 벡터이다.
2개의 반응 튜브는 (A) 10pmol의 hisABDNde-F(서열 번호 13), 0.5pmol의 ABDnn-Rl(서열 번호 14) 및 10pmol ABDn-R2(서열 번호 15); 및 (B) 10pmol의 ADIn-F(서열 번호 16) 및 10pmol의 ADIBam-R(서열 번호 17) 각각의 프라이머 혼합물을 함유한다.
PCR 프로그램은 50℃(20s) 및 72℃(40s) 각각에서 어닐링(annealing) 및 연장 온도(시간)를 사용한 매뉴얼에서 추천된 단계에 따라 설정한다. 2개의 생성물은 PCR에 의해 237bp 및 1278bp의 크기로 생성되었다. 생성물을 추출하여 다음 라운드의 PCR에 대한 주형으로 적용한다.
제2 라운드의 오우버랩핑 단계에서, 반응 혼합물을, 사용된 주형이 제1 라운드의 PCR 프라이머로부터의 1pmol의 237bp PCR 생성물 및 1pmol의 1278bp PCR 생성물인 것을 제외하고는 제1 라운드와 유사한 방식으로 제조한다. 사용된 프라이머는 10 pmol의 hisABDNde-F(서열 번호 13) 및 10pmol의 ADIBam-R(서열 번호 17)로 변한다.
어닐링 및 연장 온도(시간)은 각각 50℃(20s) 및 72℃(60 s)이다. 크기가 1484 bp인 PCR 생성물이 반응으로부터 생성된다. PCR 생성물을 정제하고 Ndel 및 BamHI로 분해한 후 예비-분해된 pET3a 플라스미드내로 연결한다. 이후에, 연결된 생성물을 재조합체 단백질의 생성을 위한 이. 콜라이 BL21(DE3)내로 형질전환시킨다.
실시예 2C
His- ABD - PolyN - bcADI 의 클로닝
His-ABD-PolyN-bcADI(서열 번호 41, 도 3f에서)의 작제는 2 단계의 오우버랩핑 PCR로 수행하며, 마지막 단계로부터 수득한 PCR 단편은 벡터 pET3a내에 NdeI과 BamHI 부위 사이에 삽입한다. His-ABD-PolyN-bcADI의 유전자 지도, 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 도 7에 나타낸다.
His-ABD-PolyN-bcADI의 작제시 포함된 프라이머:
hisABDNde-F2 전방 프라이머(서열 번호 18):
5'-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3'
bcABDnn-Rl 역방 프라이머(서열 번호 19):
5'-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3'
bcABDn-R2 역방 프라이머(서열 번호 20):
5'-TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3'
bcADln-F 전방 프라이머(서열 번호 21):
5'-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAGA-3'
bcADIBam-R 역방 프라이머(서열 번호 22):
5'-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3'
제1 라운드의 PCR에서, 공지된 농도의 성분을 함유하는 50μl의 반응 용적을 2개의 PCR 튜브에서 제조한다. 각각의 튜브에, dNTP, iProof 완충액(제조원: BIO-RAD), iProof DNA 폴리머라제(제조원: BIO-RAD), 프라이머 및 DNA 주형을 혼합하고 50μl까지 ddH20로 가한다. 반응에 사용된 DNA 주형은 ADI 유전자의 단백질 서열의 변경없이 내부 NdeI 부위 돌연변이의 제거로 바실러스 세레우스로부터의 ADI의 유전자를 함유하는 pET3a 벡터이다.
2개의 반응 튜브는 (A) 10pmol의 hisABDNde-F(서열 번호 18), 0.5pmol의 bcABDnn-Rl(서열 번호 19) 및 10pmol bcABDn-R2(서열 번호 20); 및 (B) 10pmol의 bcADIn-F(서열 번호 21) 및 10pmol의 bcADIBam-R(서열 번호 22) 각각의 프라이머 혼합물을 함유한다. PCR 프로그램은 50℃(20s) 및 72℃(40s) 각각에서 어닐링 및 연장 온도(시간)를 사용한 매뉴얼에서 추천된 단계에 따라 설정한다. 2개의 생성물은 PCR에 의해 237bp 및 1278bp의 크기로 생성되었다. 생성물을 추출하여 다음 라운드의 PCR에 대한 주형으로 적용한다.
제2 라운드의 오우버랩핑 단계에서, 반응 혼합물을, 사용된 주형이 제1 라운드의 PCR 프라이머로부터의 1pmol의 237bp PCR 생성물 및 1pmol의 1250bp PCR 생성물의 혼합물인 것을 제외하고는 제1 라운드와 유사한 방식으로 제조한다. 사용된 프라이머는 10 pmol의 hisABDNde-F2(서열 번호 18) 및 10pmol의 bcADIBam-R(서열 번호 22)로 변한다.
어닐링 및 연장 온도(시간)는 각각 50℃(20s) 및 72℃(60 s)이다. 크기가 1512 bp인 PCR 생성물이 반응으로부터 생성된다. PCR 생성물을 정제하고 Ndel 및 BamHI로 분해한 후 예비-분해된 pET3a 플라스미드내로 연결한다. 이후에, 연결된 생성물을 재조합체 단백질의 생성을 위한 이. 콜라이 BL21(DE3)내로 형질전환시킨다.
실시예 3
AAD 융합 단백질의 발현 및 정제
종균 배양물을 제조하기 위해, AAD 융합 단백질(도 5)을 암호화하는 균주 이. 콜라이 BL21(DE3)을 5ml의 2xTY 배지 속에서, 30℃로, 250rpm에서 밤새 배양한다. 밤샌 종균 배양물(2.5 ml)을 250ml의 2xTY에, 37℃, 250 rpm에서, 2.5시간(OD600
Figure 112015095646729-pct00001
0.6-0.7가 될 때까지) 동안 가한다. OD600이 도달하면, IPTG를 배양물(0.2mM의 최종 농도)에 가한다. 성장을 22시간 이상 동안 20℃에서 지속한 후 세포를 원심분리로 수집하였다. 세포 펠렛을 25ml의 10mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 속에 재현탁한다. 세포를 초음파로 분해한다. 가용성 부위를 원심분리 후 수집한다. 이후에, 융합 단백질(His tag 함유)을 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 표 2는, 배양 온도가 발현 숙주로부터 수득된 AAD 융합 단백질(아미노산 서열은 서열 번호 40에 나타냄; 도 3e)의 용해도에 영향을 미치는 중요한 인자임을 나타낸다.
AAD 융합 단백질의 가용성 분획을 분리하기 위하여, 세포 펠렛을 25ml의 10mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 속에 재현탁시킨다. 세포를 초음파처리로 용해한다. 가용성 부위를 원심분리 후 수집한다. AAD 융합 단백질(His tag 함유)을 이후에 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제한다.
AAD 융합 단백질의 불용성 분획을 분리하기 위하여, 세포 펠렛을 25ml의 20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 1% 트리톤 X-100 속에 재현탁한다. 세포를 초음파처리로 용해한다. 불용성 부위(봉입체)를 원심분리로 수집한다. 단백질은 10ml의 20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 6M 구아니딘 HCl 속에 재현탁시켜 펼치고(unfolding), 가용성이 될 때까지 와동시킨다. 단백질을, 펼쳐진 단백질 용액 점적(drop)을 100ml의 20mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4의 신속한 교반 용액내로 적가식으로 가하여 펼친다. 불용성 물질을 원심분리로 제거한다. 단백질의 염석(salting out)을, 고체 황산암모늄 분말을 상층액에 가하여 수행함으로써 70% 포화도를 달성한다. 불용성 부위를 원심분리로 수집하고 이를 10ml의 20mM 인산나트륨 완충액 속에 재현탁시킨다. 이후에, AAD 융합 단백질(His tag 함유)을 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제한다.
AAD 1 2 3
배양 온도(℃) 30 20 37
수율(mg)/250ml의 배양물 ~0.66 ~12.0 ~7.0
용해도 50% 가용성 90% 가용성 90% 봉입체
A375 세포에서 IC50(㎍/ml) 0.10 0.68 0.23
실시예 4
AAD 융합 단백질에 대한 효소 활성 검정 및 효소 역학야생형 ADI 및 본 발명의 AAD 융합 단백질에 대한 효소 활성을 측정하기 위하여, 시트룰린 검출을 위한 디아세틸 모노옥심(DAM)-티오세미카바지드(TSC) 검정을 사용한다. 반응은 하기 나타낸다.
Figure 112015095646729-pct00002
당해 검정을, 시료를 산성 염화철 용액과 DAM-TSC 용액을 혼합하여 제조한, 색상 시약에 가하여 수행한다. 요약하면, 효소를 20mM 아르기닌, 10mM 인산나트륨 pH 7.4로 5분 동안 37℃에서 항온처리한다. 반응 혼합물을 100℃에서 5분 동안 가열하여 색상이 발색되도록 하고 540nm(광 경로 = 1cm)에서 판독한다. 표준 곡선을 다양한 농도의 시트룰린을 사용하여 작제한다. ADI 천연 효소 1 단위는 검정 조건하에 37℃에서 분당 1μmol의 아르기닌을 1μmol의 시트룰린으로 전환시키는 양의 효소 활성이다. 본 발명에서 야생형 ADI 및 AAD 융합 단백질의 특이 활성은 각각 8.4 및 9.2U/mg(pH 7.4에서, 생리학적 pH)이다. 상이한 pH 범위(pH 5.5 내지 9.5)에서 야생형 ADI 및 AAD 융합 단백질에 대한 특이 활성을 또한 측정하며, 최적 pH는 6.5이다. 따라서, 결과는, AAD 융합 단백질이 알부민-결합 단백질과의 융합물이 ADI의 효소 활성에 영향을 미치지 않으므로, 아르기닌을 효율적으로 고갈시킴을 나타낸다.
미카엘리스 상수(Michaelis constant) Km은, 반응 속도가 최대의 1/2인 기질 농도이며, 효소에 대한 기질의 친화성의 역수이다. 작은 Km은 기질에 대한 고 친화성을 나타내며, 이는, 당해 속도가 최대 반응 속도에 보다 신속하게 도달할 것임을 의미한다. 효소 역학 또는 Km 값의 측정을 위해, 야생형 ADI 및 AAD 융합 단백질의 활성을 상이한 농도의 기질 아르기닌(2000μΜ, 1000μΜ, 500μΜ, 250μΜ, 125μΜ, 62.5μΜ) 하에서 pH 7.4에서 측정한다. 도 3e(서열 번호 40, ADI 단백질은 마이코플라스마 아르기니니로부터 기원한다)에 나타낸 AAD 융합 단백질 및 도 3f(서열 번호 41, ADI 단백질은 바실러스 세레우스로부터 기원한다)에 나타낸 AAD 융합 단백질의 측정된 Km 값은 각각 0.0041mM 및 0.132mM이다. 당해 결과는, ABD에 대한 융합이 아르기닌에 대한 상이한 AAD 융합 단백질의 결합 친화성에 영향을 미치지 않았음을 제안한다.
실시예 5
암 세포주에서 AAD 융합 단백질의 세포 증식 검정 및 시험관내 효능
배양 배지 DMEM을 사용하여 사람 흑색종 A375 & SK-mel-28, 사람 췌장암 PancI 및 사람 경부암 C-33A 세포주를 성장시킨다. EMEM 배지를 사용하여 SK-hep 1 간세포 및 C-33A 경부암 세포주를 배양한다. 100μl의 배양 배지 중 암 세포(2-5 X 103)를 96-웰 플레이트에 종균배양하고 24시간 동안 항온처리한다. 배양 배지를 상이한 농도의 AAD 융합 단백질을 함유하는 배지로 교체한다. 플레이트를 추가로 3일 동안 37℃에서 95% 공기/5% C02의 대기 속에서 항온처리한다. MTT 검정을 수행하여 제조업자의 지시사항에 따라 배양물 속에서 생존 세포의 수를 평가한다. 세포 성장의 50% 억제를 달성하는데 요구되는 효소의 양을 IC50로 정의한다.
표 1 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 당해 결과는, AAD 융합 단백질이 아르기닌을 효율적으로 고갈시키며 시험관내 조직 배양 연구에서 다양한 유형의 사람 암 세포주의 성장을 억제함을 나타낸다. 예를 들면, 사람 흑색종, 사람 결장 암종, 사람 췌장암, 사람 간암 및 사람 경부암은 AAD 융합 단백질에 의해 모두 용이하게 억제되므로, 이들 모두는 낮은 값의 IC50을 갖는다(참조: 표 1). 예측된 바와 같이, AAD 융합 단백질은 아르기닌-의존성(예를 들면, ASS-음성 암)인 모든 암 유형을 억제할 수 있다.
실시예 6
AAD 융합 단백질의 생체내 반감기 측정
Balb/c 마우스(5 내지 7주령)을 당해 연구에 사용하여 이들이 실험 전 1주일 동안 익숙해지도록 한다. 마우스(n=3)를 4개 그룹으로 나누고 100μl의 PBS 중 0, 100, 500 또는 1000μl의 AAD 융합 단백질(서열 번호 40, 도 3e)을 각각 복강내 주사한다. 각각의 마우스의 혈액을 0h 및 1 내지 7일째에 수집한다. 혈청을 원심분리 후 수득한다. 이후에, 혈청을 탈단백질화시키고 아르기닌에 대해 아미노산 분석기로 분석한다.
도 11에 나타낸 바와 같이, AAD 융합 단백질(서열 번호 40, 도 3e)은, 심지어 최저 용량인 100μg에서도, 혈장 아르기닌을 1, 3 및 5일째에 효율적으로 고갈시키며, 이는, AAD가 적어도 5일 동안 생체내에서 아르기닌을 효율적으로 고갈시킬 수 있음을 제안한다. 아르기닌 수준은 모든 처리 그룹에서 6 및 7일째에 점진적으로 정상으로 돌아온다.
실시예 7
암 세포 이종이식체에서 AAD 융합 단백질의 생체내 효능
누드(Nude) balb/c 마우스(5 내지 7주령)을 당해 연구에 사용하며 이들을 실험 전 1주 동안 적응하도록 한다. 마우스에게 100μl의 신선한 배양 배지 중 2xl06개의 암 세포를 피하 접종한다. 10이 후, 마우스를 대조군 및 처리 그룹으로 무작위로 분리한다. 대조군 그룹에게 100μl의 PBS를 제공하고 처리 그룹에게 100μl의 AAD 융합 단백질을 매주 복강내 제공한다. 종양 크기는 캘리퍼(caliper)로 측정하고 종양 용적을 식: (길이 x 너비2)/2를 사용하여 계산한다. 혈액 채취(blood draw)를 아르기닌의 혈장 측정을 위한 각각의 처리 후 5일째에 수득한다.
<110> Vision Global Holdings Ltd. WONG, Bing Lou <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ALBUMIN-BINDING ARGININE DEIMINASE FOR CANCER TARGETING TREATMENT <130> P6890US01 <140> PCT/US14/020943 <141> 2014-03-06 <150> US 61/773,214 <151> 2013-03-06 <150> US 14/197,236 <151> 2014-03-05 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD-F1 forward primer <400> 1 catgatgcga attccttagc tgaagctaaa gtcttagcta acagagaact 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD-R2 reverse primer <400> 2 tagtcactta ctccatattt gtcaagttct ctgttagcta agactttagc 50 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD-F3 forward primer <400> 3 gaacttgaca aatatggagt aagtgactat tacaagaacc taatcaacaa 50 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD-R4 reverse primer <400> 4 tacaccttca acagttttgg cattgttgat taggttcttg taatagtcac 50 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD-F5 forward primer <400> 5 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Lys Gln Phe Val Ala Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu 85 90 95 Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val 100 105 110 Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Glu Leu Val 115 120 125 Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala 130 135 140 Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg 145 150 155 160 Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg 165 170 175 Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser 180 185 190 Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu 195 200 205 Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr 210 215 220 Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu 225 230 235 240 Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile 245 250 255 Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met 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His Asn His Ala Met Met His Leu 260 265 270 Asp Thr Val Phe Thr Met Ile Asn His Asp Gln Phe Thr Val Phe Pro 275 280 285 Gly Ile Met Asp Gly Ala Gly Asn Ile Asn Val Phe Ile Leu Arg Pro 290 295 300 Gly Gln Asp Gly Glu Val Glu Ile Glu His Leu Thr Asp Leu Lys Ala 305 310 315 320 Ala Leu Lys Lys Val Leu Asn Leu Ser Glu Leu Asp Leu Ile Glu Cys 325 330 335 Gly Ala Gly Asp Pro Ile Ala Ala Pro Arg Glu Gln Trp Asn Asp Gly 340 345 350 Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Ile Val Thr Tyr Asp Arg 355 360 365 Asn Tyr Val Thr Val Glu Leu Leu Lys Glu His Gly Ile Lys Val His 370 375 380 Glu Ile Leu Ser Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ala Arg Cys 385 390 395 400 Met Ser Gln Pro Leu Trp Arg Glu Asp Leu 405 410 <210> 25 <211> 410 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 25 Met Lys His Pro Ile His Val Thr Ser Glu Ile Gly Glu Leu Gln Thr 1 5 10 15 Val Leu Leu Lys Arg Pro Gly Lys Glu Val Glu Asn Leu Thr Pro Asp 20 25 30 Tyr Leu Gln Gln Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Pro Ile Ile 35 40 45 Gln Lys Glu 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Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn 435 440 445 Asp Thr Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val 450 455 460 Thr Leu Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys 465 470 475 480 Arg Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu 485 490 495 Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro 500 505 510 Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly 515 520 525 Gly Ala Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu 530 535 540 Leu Gln Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly 545 550 555 560 Glu Gly Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly 565 570 575 Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg 580 585 590 Asn Glu Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu 595 600 605 Pro Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys 610 615 620 Met Ser Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 625 630 635 <210> 44 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-ABD-PolyN-ADI (DNA) <400> 44 atgcatcatc accatcacca tgatgaagcc gtggatgcga attccttagc tgaagctaaa 60 gtcttagcta acagagaact tgacaaatat ggagtaagtg actattacaa gaacctaatc 120 aacaatgcca aaactgttga aggtgtaaaa gcactgatag atgaaatttt agctgcatta 180 ccttcgggta gtaacaacaa taataacaat ggtagcggcg gttctgtatt tgacagtaaa 240 tttaaaggaa ttcacgttta ttcagaaatt ggtgaattag aatcagttct agttcacgaa 300 ccaggacgcg aaattgacta tattacacca gctagactag atgaattatt attctcagct 360 atcttagaaa gccacgatgc tagaaaagaa cacaaacaat tcgtagcaga attaaaagca 420 aacgacatca atgttgttga attaattgat ttagttgctg aaacatatga tttagcatca 480 caagaagcta aagacaaatt aatcgaagaa tttttagaag actcagaacc agttctatca 540 gaagaacaca aagtagttgt aagaaacttc ttaaaagcta aaaaaacatc aagagaatta 600 gtagaaatca tgatggcagg gatcacaaaa tacgatttag gtatcgaagc agatcacgaa 660 ttaatcgttg acccaatgcc aaacctatac ttcacacgtg acccatttgc atcagtaggt 720 aatggtgtaa caatccacta catgcgttac aaagttagac aacgtgaaac attattctca 780 agatttgtat tctcaaatca ccctaaacta attaacactc catggtacta cgacccttca 840 ctaaaattat caatcgaagg tggggacgta tttatctaca acaatgacac attagtagtt 900 ggtgtttctg aaagaactga cttacaaaca gttactttat tagctaaaaa cattgttgct 960 aataaagaat gtgaattcaa acgtattgtt gcaattaacg ttccaaaatg gacaaactta 1020 atgcacttag acacatggct aacaatgtta gacaaggaca aattcctata ctcaccaatc 1080 gctaatgacg tatttaaatt ctgggattat gacttagtaa acggtggagc agaaccacaa 1140 ccagttgaaa acggattacc tctagaagga ttattacaat caatcattaa caaaaaacca 1200 gttttaattc ctatcgcagg tgaaggtgct tcacaaatgg aaatcgaaag agaaacacac 1260 ttcgatggta caaactactt agcaattaga ccaggtgttg taattggtta ctcacgtaac 1320 gaaaaaacaa acgctgctct agaagctgca ggcattaaag ttcttccatt ccacggtaac 1380 caattatcat taggtatggg taacgctcgt tgtatgtcaa tgcctttatc acgtaaagat 1440 gttaagtggt aa 1452 <210> 45 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-ABD-PolyN-bcADI (DNA) <400> 45 atgggtcatc atcaccatca ccatgatgaa gccgtggatg cgaacagctt agctgaagct 60 aaagtcttag ctaacagaga acttgacaaa tatggagtaa gtgactatta caagaaccta 120 atcaacaatg ccaaaactgt tgaaggtgta aaagcactga tagatgaaat tttagctgca 180 ttaccttcgg gtagtaacaa caataataac aatggtagcg gcggtaaaca tccgatacat 240 gttacttcag aaattgggga attacaaacg gttttattaa aacgaccggg taaagaagtg 300 gaaaacttga cgccagatta tttgcagcaa ttattatttg acgatattcc atacctacca 360 attattcaaa aagagcatga ttattttgca caaacgttac gcaatcgggg tgttgaagtt 420 ctttatttag aaaaactagc cgctgaggcg ttagtagata aaaaacttcg agaagaattt 480 gttgatcgta ttttaaaaga aggacaggcc gacgtaaatg ttgcacatca aactttaaaa 540 gaatatttac tttccttttc aaatgaagaa ttaattcaaa aaattatggg cggtgtacgg 600 aaaaacgaaa ttgaaacaag taagaagaca catttatatg aattaatgga agatcattat 660 ccgttttact tagatccaat gcctaattta tattttactc gtgatccagc agctagcgtg 720 ggcgatggct taacgataaa taagatgaga gaaccagcgc gtagacgtga atcattattc 780 atggagtaca tcattaaata tcatccaaga tttgcaaaac ataatgtacc aatctggtta 840 gatcgtgatt ataaatttcc aattgaaggt ggcgacgagc taattttaaa tgaagaaaca 900 attgcgattg gagtatctgc tcgtacttca gctaaagcaa ttgaacgttt agcaaaaaat 960 ctctttagcc gacaaaataa aattaagaaa gtgttagcaa tagaaattcc aaaatgccga 1020 gcatttatgc atttagatac agtatttaca atggttgatt atgataagtt tacaattcac 1080 ccagctattc aagggccaaa agggaatatg aatatttata ttttagaaaa aggagcagat 1140 gaggaaactc ttaaaattac acatcgtact tctttaatgg aagcattaaa agaggtatta 1200 gacttaagtg aattagttct tattccatgt ggaggaggag atgtaattgc ttctgctcgt 1260 gaacaatgga atgatggctc gaacacatta gcaatcgcgc caggtgtagt tgttacatat 1320 gatcgcaact atgtatccaa tacgttatta cgggaacacg gtatagaagt gattgaggtg 1380 ctaagttcag aattatctcg tggtcgtggg ggtccacgtt gcatgagtat gccaattgtt 1440 cgtaaagata tttaa 1455 <210> 46 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD without Linker <400> 46 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 47 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD with Linker <400> 47 Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Ser Leu Ala Glu Ala Lys 1 5 10 15 Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu 35 40 45 Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 50 55 <210> 48 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD1 without Linker <400> 48 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 49 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD1 with Linker <400> 49 Gly Ser His His His His His His Ala Asn Ser Leu Ala Glu Ala Lys 1 5 10 15 Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr 20 25 30 Lys Arg Leu Ile Asn Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu 35 40 45 Lys Leu His Ile Leu Ala Ala Leu Pro 50 55 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 50 Gly Ser His His His His His His Ala Asn Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 51 Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 52 Asp Glu Ala Val Asp Ala Asn Ser 1 5 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 53 Gly Ser Gly Gly 1

Claims (30)

  1. 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질이 아르기닌 데이미나제의 활성을 보유하고 또한 혈청 알부민에 결합 가능하도록 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 형성하기 위해 아르기닌 데이미나제를 포함하는 제2 부위에 융합되는 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩타이드 또는 알부민-결합 단백질(들)로부터 선택된 1개 또는 2개의 성분을 포함하는 제1 부위를 포함하고, 상기 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질은 서열번호 40을 포함하는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 부위의 2개의 성분이 동일한, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 부위의 2개의 성분이 상이한, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질은 하나 이상의 링커 분자(linker molecule)(들)를 추가로 포함하는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 링커 분자가 서열 번호 50, 51, 52, 53, 또는 세린-글리신-세린(SGS) 아미노산 서열로부터 선택된 서열을 포함하는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 폴리-N 또는 His tag를 더 포함하는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  7. 청구항 1에 있어서, 아르기닌 데이미나제가 마이코플라스마(Mycoplasma), 락토코쿠스(Lactococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토코쿠스(Steptococcus), 에스케리키아(Escherichia), 마이코박테리움(Mycobacterium) 또는 바실러스(Bacillus) 미생물로부터 생산된 아르기닌 데이미나제로부터 선택되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 마이코플라스마 아르기니니(Mycoplasma arginini), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 마이코플라스마 아르트리티디스(Mycoplasma arthritidis), 마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 플레코글로씨키다(Pseudomonas plecoglossicida), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas putida) 또는 이의 조합으로부터 생산되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  9. 삭제
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질이 N-말단 시스테인 잔기를 지닌 아르기닌 데이미나제를 알부민-결합 도메인의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응시킴으로써 아르기닌 데이미나제 및 알부민-결합 도메인이 공유 결합에 의해 연결되도록 하여 형성되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질이 N-말단 시스테인 잔기를 지닌 알부민-결합 도메인을 아르기닌 데이미나제의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응시킴으로써 아르기닌 데이미나제 및 알부민-결합 도메인이 공유 결합에 의해 연결되도록 하여 형성되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열 번호 42 및 서열 번호 43을 사용하고 N-말단 시스테인 잔기를 지닌 상기 아르기닌 데이미나제를 알부민-결합 도메인의 C-말단에서 반응성 티오에스테르와 반응시킴으로써 상기 아르기닌 데이미나제 및 상기 알부민-결합 도메인이 공유 결합에 의해 연결되도록 하여 형성되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  13. 환자에게 임상적 유효량의 융합 단백질을 투여하여 아르기닌의 고갈을 촉진시키는 것을 포함하는, 환자의 암을 치료하기 위한 의약의 제조시 사용되는 청구항 1 내지 청구항 8, 청구항 10 내지 청구항 12 중의 어느 한 항에 따른 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 암이 췌장암, 백혈병, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 유방암, 간암, 비인강암, 식도암, 전립샘 암, 위암 또는 뇌암인, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질.
  15. 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 작제하는 단계, 상기 융합 유전자를 벡터내로 삽입하는 단계, 상기 벡터를 숙주 유기체내로 삽입하는 단계 및 청구항 1의 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 포함하는 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 청구항 1의 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 정제 단계가 크로마토그래피에 의해 수행되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 정제 단계가 조 단백질의 가용성 분획으로부터 수행되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 정제 단계가 조 단백질의 불용성 분획으로부터 수행되는, 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  20. 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩타이드 또는 알부민-결합 단백질(들)과, 아르기닌 데이미나제를 포함하는 제2 부위 사이의 인테인 매개된 단백질 연결에 의한, 청구항 1의 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질의 제조 방법.
  21. 약제학적으로 허용되는 담체 속에 청구항 1의 알부민-결합 아르기닌 데이미나제 융합 단백질을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, pH가 5.5 내지 9.5의 범위인, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, pH가 7.4인, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, pH가 6.5인, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
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