CN101265467A - 一种定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

概括的说，本发明涉及保留催化活性的、某些位点突变为非天然氨基酸的尿酸氧化酶蛋白。具体地说，本发明涉及被赋予了新的化学性质的尿酸氧化酶，其含有的非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸使其可以特异性的与相应的修饰剂相连。

Description

一种定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的尿酸氧化酶，其定点引入的非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸使其具有可以特异性的与相应修饰剂相连的性质。

背景技术

尿酸是鸟、爬行动物和灵长类动物，包括人体内嘌呤代谢的产物。在大部分哺乳动物中，尿酸进一步被尿酸氧化酶氧化成尿囊素。由于人的尿酸氧化酶基因产生了突变，编码序列中被引入了提前终止密码子，因此不能表达尿酸氧化酶。尿酸在体内溶解度低，过量积累易导致高尿酸血症的发生，甚至形成尿酸晶体，该晶体可沉淀在关节、皮肤和肾中，常可导致关节炎(痛风)、肾衰竭、代谢性酸中毒和高钾血症等。

目前治疗用尿酸氧化酶仅在少数国家可用。欧洲自20世纪80年代起就已从黄曲霉中提取了尿酸氧化酶，并以商品名Uricozyme销售上市。在欧洲此药物被广泛研究，临床结果显示病人在使用几分钟内，体内的尿酸水平迅速降低，同时，该药物长期以来被用来治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症(Overling，F.和Lang，J.M等，1974；Robert，A.，Corberand，J.和Regneir，C.等，1976)。

虽然黄曲霉尿酸氧化酶对治疗在短暂化疗过程中出现的急性高尿酸血症有效，但对于治疗复发性痛风或痛风石性痛风存在缺点。由于该尿酸酶为外源性蛋白，多次注射后易导致体内尿酸氧化酶抗体的产生，尿酸氧化酶功效迅速降低，并已发生了包括过敏性反应在内的严重反应(Brogard等，1972；Montagnac和Schillinger，1990)。尿酸氧化酶的强抗原性和尿酸氧化酶的短循环半衰期可通过聚乙二醇(PEG)修饰来克服(Chen，R.H.等，1981；Nishimara，H.，Matsushima，A.和Inada，Y.等，1981；Savoca，K.V.，Davis，F.F.和Palczuk，N.C.，1984；Tsuji，J.等，1985)。PEG结合到蛋白质后大大降低了被修饰蛋白质的抗原性。Davis等用PEG-尿酸氧化酶治疗病人，血清中尿酸含量在注射后60分钟内下降到不能检测的水平，且在32小时内保持不可检测水平。Davis等注意到PEG-5,000尿酸氧化酶在治疗高尿酸血症中提供了优于天然尿酸氧化酶的潜力。Williams在专利聚乙二醇或聚环氧乙烷-尿酸氧化酶结合物及其应用(US 6,576,235)中提及了用PEG修饰尿酸氧化酶得到的结合物，该结合物相对于未结合的尿酸氧化酶仍保留至少约75％的裂解尿酸的活性，并且该结合物基本上没有免疫原性。

但现有的PEG修饰尿酸氧化酶方法均是针对某些氨基酸通过非定点修饰获得，采用此技术进行修饰，其修饰位点无法选择，所得修饰产物为混合物(包括多修饰物和单修饰物多个异构体)，各修饰产物结构相似，分离纯化十分困难。并且，有些活性中心的氨基酸被修饰，影响修饰产物的活性。因此近年来定点修饰成为该领域的研究热点和重要研究方向，有人曾尝试通过选择蛋白质中含有巯基的半胱氨酸作为修饰位点来达到定点修饰的目的，但由于该类氨基酸在蛋白质折叠过程中起重要作用，常位于活性中心，针对此类氨基酸的修饰常会降低被修饰蛋白生物活性。也曾有人尝试利用氨基保护剂将蛋白质中能与PEG反应的赖氨酸ε氨基等封闭，用具有与α氨基优势反应的PEG修饰剂进行N端的氨基修饰，再将氨基保护剂去除，得到N端PEG修饰的蛋白质衍生物。但反应过程复杂，对实验条件要求高，不适于活性位点在N端的蛋白质。

大多数已知生物的基因编码二十种常见氨基酸以合成生物所必需的蛋白质。普通氨基酸的侧链仅含有少量的功能基团，羧酸、氨基、羟基和巯基，其余就是更为简单的烷基或疏水基团。用基因工程手段扩大编码氨基酸的范围，如光活性氨基酸一对叠氮基苯丙氨酸可以扩大蛋白质的应用范围。叠氮基团在天然蛋白质中不存在，它们可参与一系列的化学反应，叠氮基团可与炔基形成稳定的偶联结构。从而提供了新的蛋白质修饰方法。

到目前为止，还没有定点引入叠氮基团的尿酸氧化酶的报道，本发明提供了定点引入对叠氮基苯丙氨酸的尿酸氧化酶，并提供了得到这种突变尿酸氧化酶的方法。

发明内容

本发明总的目的是提供了一种新型的定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶及其制备方法，该尿酸氧化酶的特征为所述的突变尿酸氧化酶中某一个或几个位点氨基酸定点突变为对叠氮基苯丙氨酸，该叠氮基团使其可以特异性的与相应的修饰剂相连。

本发明提供了一种可由大肠杆菌中重组表达的，定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶，该尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧化酶的催化活性。在本发明的一个具体实施方案中，通过构建pACYC-tRNA和pBR-T10两种质粒，分别表达Methanococcus jannaschii属的tRNA(tRNA^Tyr)和酪氨酰tRNA合成酶(Mj TyrRs)，利用这一套蛋白质翻译系统使非天然氨基酸掺入到蛋白质中，从而造成蛋白质的定点突变。突变型Mj TyrRs以及tRNA^Tyr之间满足下列关系：(1)tRNA^Tyr不能利用宿主菌的酪氨酰tRNA酶，只能被突变型Mj TyrRs酰化；(2)突变型Mj TyrRs只能酰化tRNA^Tyr，不能酰化其它的tRNA。因此，突变型Mj TyrRs与tRNA^Tyr之间的关系是正交性的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交性的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其他的tRNA。获得的正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统(orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNApair)，使非20种常见氨基酸的对叠氮基苯丙氨酸与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到尿酸氧化酶蛋白中。通过将带有琥珀密码子的尿酸氧化酶基因插入到pACYC-tRNA质粒中，与pBR-T10一起转染大肠杆菌工程菌，即可通过在发酵液中添加对叠氮基苯丙氨酸获得突变尿酸氧化酶。

在其后的SDS-PAGE和Western Blotting检测中，技术人员可以看到，当上述正交系统条件齐备时，可以获得突变尿酸氧化酶，而当条件缺失时，工程菌无法表达尿酸氧化酶。本发明提供了5种选优的突变尿酸酶，Uox¹²³，Uox¹⁷⁰，Uox²⁶⁵，Uox^123，170，Uox^{123，170，265}分别在标注位点引入了对叠氮基苯丙氨酸，并对其活性进行了比较，这5种选优突变尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧化酶90％以上的催化活性。

附图说明

图1显示的是突变尿酸酶工程菌发酵液纯化后的SDS-PAGE检测，用于鉴定表达的尿酸氧化酶。图中1-9号电泳道分别对应：1：pACYC-tRNA-Uox+pBR-T10 2：pACYC-tRNA-Uox+N₃-Phe  3：pBR-T10+N₃-Phe 4：天然尿酸氧化酶5：Uox¹²³ 6：Uox¹⁷⁰ 7：Uox²⁶⁵ 8：Uox^123，170 9：Uox^{123，170，265}，9种不同的工程菌发酵情况。其中，第1道未添加N₃-Phe，第2道工程菌中不含有pBR-T10质粒，第3道工程菌中不含有pACYC-tRNA-Uox质粒，来源于野生型的尿酸氧化酶为第4道作为阳性对照。5-9道为5种不同的突变尿酸氧化酶。从图中可以看到只有当pACYC-tRNA-Uox，pBR-T10与N₃-Phe三者同时具备时才能表达突变尿酸氧化酶，缺一不可。

图2显示的是突变尿酸氧化酶的Western Blotting鉴定，野生型尿酸氧化酶为1道作为阳性对照。2-6到为5种不同的突变尿酸氧化酶。

具体实施方式

实施例1

实施步骤1对叠氮基苯丙氨酸的合成

对硝基苯丙氨酸一水合物适量溶于水与等体积二氧六环的混合溶液中，反应体系温度降至4℃。缓慢滴加三乙胺，再一次性加入(Boc)₂O(二碳酸二叔丁酯)适量，先于0～4℃反应30min，再于常温下反应过夜。

反应停止后，蒸发溶剂，加水稀释，一倍体积乙醚洗一次。再加入柠檬酸溶液调节pH至酸性。用乙酸乙酯充分萃取，合并有机相，MgSO₄充分干燥，有机相浓缩得黄色粘稠液体，加石油醚冰浴重结晶，得到白色针晶。

将6.2g该白色结晶溶于150ml甲醇溶液中，常温下，钯-活性C氢化3-6小时。蒸发溶剂得微黄色固体，用乙酸乙酯-石油醚重结晶。

结晶溶于HCl-甲醇(摩尔比1∶1)的水溶液中，用亚硝酸钠与上述混合液反应30-50分钟得到重氮盐。缓慢滴加NaN₃的水溶液，保持0℃，继续反应30-50分钟。乙酸乙酯提取分离。有机相浓缩后呈深红色粘稠液体。

上述粘稠液体溶于稍过量的含1.5NHCl的乙酸乙酯中，0～5℃反应1-2小时后，过滤获得盐酸盐结晶。分别用乙酸乙酯和二乙基醚洗涤，干燥，产物溶于水中，用稍过量的吡啶处理，于0～5℃，分离结晶，再用少量的水洗，干燥。

实施步骤2尿酸氧化酶非天然氨基酸的定点引入

构建质粒pACYC-tRNA和pBR-T10，二者分别表达Methanococcus jannaschii属的tRNA和酪氨酰tRNA合成酶(在Tyr32、Glu107、Asp158、Ile159、Leu162五个位点发生突变，分别突变为Thr32、Ser107、Pro158、Leu159、Gln162)。该正交的酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统可使对叠氮基苯丙氨酸与琥珀密码子TAG相对应。利用PCR定点突变技术，将天然尿酸氧化酶基因第123位，第170位，第265位氨基酸密码子突变为琥珀终止子TAG，构建了Uox¹²³，Uox¹⁷⁰，Uox²⁶⁵，Uox^123，170，Uox^{123，170，265}五种突变尿酸氧化酶基因，将它们分别插入至pACYC-tRNA中构建尿酸氧化酶表达质粒pACYC-tRNA-Uox。将pACYC-tRNA-Uox与pBR-T10两个质粒同时转化大肠杆菌BL21亚型，在含有甘油、亮氨酸、组氨酸和对叠氮基苯丙氨酸的培养基中37℃培养12-16h，用1mM IPTG诱导8-10h收菌。

实施步骤3含有非天然氨基酸尿酸氧化酶的分离纯化

含有突变尿酸氧化酶的发酵菌液离心后，加入超声缓冲液进行超声破碎，离心得上清液通过Ni柱进行纯化，咪唑洗脱，收集尿酸氧化酶活性部分。

表达产物纯化后，利用SDS-PAGE进行检测，图1结果表明，当缺少pACYC-tRNA-Uox，pBR-T10，对叠氮基苯丙氨酸(N₃-Phe)其中任意一种时，没有突变蛋白质表达，在三者齐备的情况下，有突变尿酸氧化酶表达。证明对叠氮基苯丙氨酸被特异性的引入尿酸氧化酶中。实施步骤4含有非天然氨基酸尿酸氧化酶的鉴定

对Uox¹²³，Uox¹⁷⁰，Uox²⁶⁵，Uox^123，170，Uox^{123，170，265}五种突变尿酸氧化酶进行Western Blotting检测：尿酸氧化酶进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶和硝酸纤维素膜夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中进行电转移，电转移条件是30mA，4h。把硝酸纤维素滤膜放在培养皿中，加入封闭液(5％BSA的TBS缓冲液)，于摇床上室温放置一小时。倒掉封闭液，用TBS漂洗液滤膜3次，每次10min。兔抗尿酸氧化酶血清与滤膜温育，室温一小时。再用TBS漂洗液洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)，摇床上缓慢摇动，室温一小时。倒掉二抗溶液，用PBST漂洗液滤膜3次，每次10min。加入底物溶液DAB显色。

图2的结果表明，Western Blotting检测证明了表达产物为突变后的尿酸氧化酶。

实施步骤5尿酸氧化酶活性检测

采用改进的尿酸氧化酶活性测定方法：纯化的尿酸氧化酶(约0.04μg)于96孔板30℃孵育，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，并与1ml新鲜配制的pH8.9，浓度为200～600μM的尿酸溶液混合。分别在尿酸氧化酶加入后的1，4，7，10，13和16分钟，从中取100μl，加入到含有100μl过氧化物酶定量检测溶液的96孔板中。过氧化物酶定量检测溶液中包括pH6，0.2M磷酸钠，1mM的3，5-二氯-2-羟基苯磺酸，0.25mM的4-磷酸钠，0.25mM4-氨基安替比林，1mM 8-乙酰唑胺黄嘌呤，25U/ml辣根过氧化酶。检测510nm处的吸收。每种条件测两个平行值。反应初速度由反应的线性范围得到。尿酸氧化酶氧化产生的H₂O₂由标准曲线获得。表1的结果表明，五种不同的突变尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧化酶大于等于90％的活性。

表1、天然尿酸氧化酶与突变尿酸氧化酶活性比较

Claims (2)

1. 一种定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶，其特征为所述的突变尿酸氧化酶中某一个或几个位点氨基酸定点突变为非天然氨基酸，其中所述的定点突变位点分别为第123位，第170位，第265位，所述的突变尿酸氧化酶保留了尿酸氧化酶的天然催化活性。

2. 根据权利要求1，其中所述的非天然氨基酸为对叠氮基苯丙氨酸。

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