JPS61218529A - モノクローナル抗‐アルフア‐アミラーゼ‐抗体、その収得法及びこれを含有する真性糖尿病治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はモノクローナル抗−アルファ−アミラーゼ抗体
、その収得法及びこれを含有する真性糖尿病治療剤に関
する。

従来の技術 アルファ−アミラーゼ（１，４−アルファーグルカノヒ
ドロラーゼ、ＥＣ３，２，１，１）は１，４−アルファ
ーグルコシＰ結合した多糖類を麦芽糖及びマルト少糖類
に分解する。ヒトにおいてはアルファ−アミラーゼは唾
液腺（ｈ−Ｓ−Ａ）中及び膵臓（ｈ−ｐ−Ａ）中で生成
される。

このアミラーゼは食物と共に摂取された高重合体澱分を
、次いでその他の酵素によりブドウ糖に分解される小さ
な断片に消化するのに役立つ。生じたブドウ糖は血管を
通ってエネルギー消耗器官に輸送される。

血液のブｒつ糖含量はインシュリンにより調整される。

このホルモンが欠けると、例えば真性糖尿病の患者にお
ける様に、食物摂取後に過血糖症になる。このブＰつ糖
ショックを弱めるために、かつ患者が食物摂取の際に余
り制限しなくてすむように、血液中のブＰつ糖遊離を遅
くすることが望ましい。このことに対する可能性は炭水
化物の一次消化をする唾液−及び膵臓アミラーゼの阻害
である。患者の血中糖排出閾の調整はそれにより実際に
容易になる。

可能な阻害剤として、例えば小麦胚芽からの植物性蛋白
質（ビオケミ力　エル　ビオフイジカ　アクｐ　（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）第６５８巻、
第３９７〜第４０５頁（１９８１年））及び微生物から
の蛋白質及びペプチド（プリヘア、ビオケム、　　（Ｐ
ｒｅｐａｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第９巻、第２９３頁
〜第３０２頁（１９７９年）；アグリカルチュアル　ア
ンド　ビオロジカルケミストリイ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｔ、Ｃｈｅｍ、）第４４巻、第１６．７９〜１６８１
頁（１９８０年１；ホツイーザイラーズ　ツアイトシュ
リフトフユア　フイジオロギツシエ　ケエミイ（Ｈｏｐ
ｐｅ−３ｅｙｌｅＪ１’ｓ　　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、）第３６２巻、第４６５〜４６７頁（１９８１
年））がある。しかしながらこれらは著しい欠点、すな
わち例えば煩雑かつ経費のかかる分離を示す：更に、そ
れで阻害状態となる阻害剤及びアミラーゼの予備培養が
必要である。

コンブ、ビオタム。フィシオル、（Ｃｏｍｐ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、）（１９７６年）５
５Ｂ、第５６３〜５６５頁から、家兎からの抗血清がヒ
トのアルファ−アミラーゼを約８４％まで阻害すること
ができることが公知である。このポリクローナル抗体は
恐ら＜ｈ−Ｐ　−Ａ及び１−５−Ａを阻害する。かかる
ポリクローナル抗体を薬剤として使用することは考慮さ
紅なかった。

発明が解決しようとする問題点 ところで驚異的にも、酵素を非特異的に９０チより以上
阻害することができ、かつ従って特に薬剤使用に好適で
あるアルファ−アミラーゼに対するモノクローナル抗体
を生産することができることが判明した。

従って本発明の目的はヒトのアルファ−アミラーゼの酵
素活性を９０％以上非特異的に阻害するモノクローナル
抗−アルファ−アミラーゼ−抗体である。

この際非特異的に阻害するとは、抗体が唾液−アルファ
−アミラーゼ及び膵臓−アルファ−アミラーゼをほぼ同
じ程度に阻害する、すなわちこの両イン酵素の間に差違
はないことである。

この特性は薬剤としてのその使用可能性のために重要で
ある。本発明に依る抗体は、唾液−アミラーゼ並びに膵
臓−アミラーゼの精製にも使用することができ、そのた
めに有利に不動化形で使用される。

本発明に依るモノクローナル抗体は殊にヒトのアルファ
−アミラーゼのイソ酵素を９５％又はそれ以上阻害する
。クローン７７Ｆ５　（ＮＣＡＣＣ８５０２２２０３）
及び７３Ｃ８（ＮＣＡＣＣ８５０２２２０４＞により生
成する抗体が特に有利である。前記の・ξ−セント阻害
値は、青着色の高重合体澱粉基質を用いる市販のアルフ
ァ−アミラーゼ試験に関する。低分子の基質においては
相応の阻害作用は８０％よりも多い。

この際の１低分子の“とはブドウ糖約１０単位までを有
する基質のことである。低分子基質の変換の良好な阻害
は治療的使用のために次の理由で重要である、すなわち
高分子基質は唾液アミラーゼによって先に分解され、従
って膵臓アミラーゼは腸中で実際に短鎖の基質に出合う
からである。

問題点を解決するための手段 本発明に依るモノクローナル抗体の収得のために、本発
明に依りＢａ１ｂｏ−マウスを使用し、このマウスをヒ
トの唾液−アルファ−アミラーゼで免疫し、次いで免疫
した動物の膵臓からのＢ−リフ　Ａ球を骨髄腫細胞（Ｍ
ｙｅ　Ｉ　ｏｍｚｅ　Ｉ　Ｉ　ｅｎ）と融合し、生成し
たハイツリドーマ細胞をクローニングし、唾液−及び膵
臓−アルファ−アミラーゼを比較可能に阻害するクロー
ンを分離し、かつ育種し、かつクローンにより生成した
モノクローナル抗体を収得する。

殊にマウスの免疫は水酸化アルミニウム及び百日咳菌を
共に投与して行なわれる。免疫は有利に数回繰り返され
る。良好な結果は３回〜５回の繰り返しで得られた。膵
臓からの９−リン・に球の収得は常法に依り行なわれる
。骨髄腫との融合は殊にジエイ、イムツル、メス、（Ｊ
。

１、ｍｍｏｌ、Ｍｅｔｈ、）第３９巻第２８５〜３０８
頁（１９８０年）に記載された標準方法に依り実施され
る。［３−＋）ン・ぐ球はこの際有利に過剰量で使用さ
れる。

アルファ−アミラーゼのヒトのイン酵素をほぼ同様に強
（阻害する抗体を生成するクローンの同定は、ＥＬＩＳ
Ａ−法により抗−マウス−抗体の使用下に実施される。

殊に例えばヒラ・りの抗−マウス−Ｆｃ−ガンマ−抗体
を使用スる。

種々のクローンの個々の上澄液での培養及び続いて更に
唾液アミラーゼ−ペルオキシダーゼ−接合体との、もし
くは膵臓−アルファ−アミラーゼ−ペルオキシダーゼ−
接合体との培養及びこのために公知の試薬の１種を用い
る結合したペルオキシダーゼ活性の検出により、両方の
イソ酵素と同様に強く反応するクローンが確認される。

このクローンを分離し、かつ育種する。

育種は自体公知の方法で、細胞培養で、又はマウスへの
腹腔内投与及び腹水液からのモノクローナル抗体の収得
により行なわれる。

モノクローナル抗体の純粋な分離は、同様に常用の方法
に依り、例えば陰イオン交換カラム、例えばジエチルア
ミンエタノール−基で変性したセルロース−又はアガロ
ース、−カラムを介スるクロマトグラフィーにより実施
される。

本発明に依るモノクローナル抗体は、前記の如く、特に
真性糖尿病の分野におけるアルファ−アミラーゼの阻害
のだめの薬剤として適当である。経口で行ない得る本発
明に依るモノクローナル抗体の投与においては、血中の
ブドウ糖遊離は実際に遅延され、従って血中の糖排出閾
の調整は著しく容易になる。従って本発明のも５１つの
目的は、作用物質として本発明に依るモノクローナル抗
体を、場合により常用の治療的添加剤又は賦形剤と共に
含有することを特徴とする薬剤である。有利にモノクロ
ーナル抗体の本発明に依る薬剤は自体公知の方法で、消
化されずに胃を通過し、膵臓アミラーゼがその炭水化物
分解作用を発揮する小腸ではじめて有効とされるように
カプセルに充填される。適当なカプセル充填法は当業者
には公知であり、この際詳説する必要はない。

本発明を次の実施例につき詳説する。

実施例 例１ ヒトの唾液−アミラーゼを用いるＢａ１ｂｏ−マウスの
免疫 Ｂａ１ｂｃ−マウスを百日咳菌を有する水酸化アルミニ
ウム中のヒトの唾液アミラーゼ１００μ２で免疫する。

約８週間のリズムでそのつどアジ壬）々ント５ｏμ２で
更に３回〜Φ回免疫する。融合の４日前に生理食塩水中
の唾液アミラ−ゼ５０μｔでの最後の免疫を実施する。

例２ マウス−肺臓細胞と骨髄腫細胞との融合肺臓細胞とＡｔ
　８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０　）又＆！Ｓ
ｐ　２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１　）−骨髄腫細
胞との融合は、ジェイ。

イムモル、　メ７．（Ｊ、Ｉｍｍｏｌ、Ｍｅｔｈ、）　
　第３９巻第２８５〜３０８頁（１９８０年）に依る標
準方法により実施される。融合比膵臓対骨髄腫細胞は５
：１である。融合生産物を１０２４の培養シャーレ（コ
スタ−（Ｃｏｓｔａｒ）の）上に播種し、１培養鉢当り
腹膜滲出細胞５．１０’と共に育種する。陽性−次培養
物を融合後３〜４週間螢光−活性化細胞−選別機を用い
てクローニングする。細胞を個々に９６−コスタ−（Ｃ
Ｏ５ｔａｒ）プレート上に分類し、腹膜滲出−細胞２．
１０’と共に育種する。

例３ アミラーゼ結合抗体についての試験 陽性−次培養物を同定するためＫ、もしくは免疫したマ
ウスの血清中又はハイプリＰ細胞の培養上澄液中又は腹
水中のアミラーゼ生成抗体の濃度及び特異性を把握する
ために、ＥＬＩＳＡを試験原理として使用する。このた
めに９６−プレート（Ｎｕｎｃ社）をヒツジ−抗−マウ
スＦｃｊ　　−抗体で被覆する。非特異的結合のために
ウシ血清アルブミン（生理食塩水中２％の）で後被覆す
る。次いで抗体を含有する試料と共に、又はその種々の
希釈物と共に培養する。次いで培養を唾液アミラーゼ−
ペルオキシダーゼ−（ＰＯＤ　）−接合体と共に、又は
膵臓アミラーゼ−にルオキシダーゼー（ＰＯＤ）−接合
体と共に実施する。結合したＰＯＤの活性をＡＢＴＳ（
２，２’−アノノ、クー〔３−エチル−ベンズチアゾリ
ンスルホネート（６）））を用いてｐＨ＝４．４で測定
し、かつ結合したマウス−抗体ための尺度として直接吸
光を測定する。唾液アミラーゼ−ＰＯＤ及び膵臓アミラ
ーゼ−ＰＯＤと同様に高い吸光を示すクローンを腹水生
産物中に装入し、モノクローナル抗体をその膵臓アミラ
ーゼ及び唾液アミラーゼに対する阻害作用について調べ
る。

例仝 マウス−腹水を介するモノクローナル抗体の生産 メスのＢａ１ｂｃ−マウスにプリスタン（Ｐｒ　ｉｓｔ
ａｎ）（ＥＧＡ−Ｃｈｅｍｉｅ社製）ｏ、５−を腹腔□
内に７日間の間隔で２回注射する。マウス１匹当りその
つとクローン７７Ｆ５又は７３Ｃ８のハイブリドーマ細
胞約５．１０６を腹腔内に接種する。細胞系統に応じて
８〜１４日間後に１回〜３回腹水を抜く。これをＤＥＡ
Ｅ−カラムを介して精製し、純粋なモノクローナル抗体
が得られる。

例５ モノクローナル抗体の阻害作用の試験 試験すべきモノクローナル抗体を含有する腹水を５０ミ
リモル（ｍＭ）燐酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．０（へ溶液Ａ
）で希釈する（へ溶液Ｂ）。阻害作用ハ濃度約１００ｏ
ｒ：Ｊ／ｌ　及び約２０００σ／ｌ　の唾液アミラーゼ
及び膵臓アミラーゼ溶液について（イーリンガー　マン
ハイム（ＢＯｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ＞
社、Ｋａ　ｔ、　Ｂｅｓ　ｔ。

Ｎｏ、５６８５８９の市販のアミラーゼ試薬を用いて３
７℃で測定する）試験する。アミラーゼ溶液及びそのつ
と２つの対照を前もって混合する： Ｉ：アミラーゼ溶液１００μｌ十溶液Ｂ２０μｌ■：ア
ミラーゼ溶液１００μｌ十溶液Ａ２０μ１ＩＩＩ：溶液
Ａ　ｌ　００　ｐａｌ十溶液８２０ｍ混合物を１０分間
振盪し、その後混合物２５μｌ　ｌ−のつと、専一ニト
ロフェニルマルトへプタソイドを用いるアルファ−アミ
ラーゼの測定のための市販の試薬（ベーリンガーマンハ
イム社製、Ｋａｔ、Ｂｅ５ｔ、Ｎｏ、５６８５８９　）
１０００μｌに加える。活性は３７℃で指示通りに測定
される。残余活性は次の式に依り計算される： 活性■ 残余活性はヒトの唾液−及びヒトの膵臓アミラーゼで、
活性約１００００／ｌ　　で、並びに活性約２０００Ｔ
＋／ｌ　で、１５％〜２０％となり、すなわちＭＡＫ’
ｓの阻害作用は８０％〜８５％になる。

例６ 基質として着色澱粉を用いるＭＡＫ′ｓの阻害作用の試
験 ヒトの唾液アミラーゼ−及びヒトの膵臓アミラーゼ−溶
液を、例５に相応して、試験すべきＭＡＫ’ｓを含有す
る腹水試料及び溶液Ａ及び日と混合し、その後に１０分
間振盪する。混合物Ｉ、ＩＩ及びｌｌｌ５０μｌを、青
着色の高重合体澱粉基質を用いる市販のアルファ−アミ
ラーゼ−試験（ファルマシア　ダイアグノスティックス
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）Ａ
Ｂ。

ウプサラ、スウェーデン、Ｋａｔ、Ｂｅ５ｔ、Ｎｏ。

９３−９８６−２−１３９３−０２　”）に使用し、３
７℃で相応に指示通りに画定する。残余活性は例５に相
応して計算される。ヒトの唾液−及びヒトの膵臓アミラ
ーゼで５％である。高重合体基質での阻害率は従って９
５％である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、人のアルファ−アミラーゼの酵素活性を９０％以上
   非特異的に阻害するモノクローナル抗−アルファ−アミ
   ラーゼ−抗体。 ２、９５％又はそれ以上阻害する、特許請求の範囲第１
   項記載のモノクローナル抗体。 ３、モノクローナル抗体７７Ｆ５、ＮＣＡＣＣ８５０２
   ２２０３である、特許請求の範囲第１項記載のモノクロ
   ーナル抗体。 ４、モノクローナル抗体７３Ｃ８、ＮＣＡＣＣ８５０２
   ２２０４である特許請求の範囲第１項記載のモノクロー
   ナル抗体。 ５、人のアルファ−アミラーゼの酵素活性を９０％以上
   非特異的に阻害するモノクローナル抗−アルファ−アミ
   ラーゼ−抗体を収得するために、マウスをアルファ−ア
   ミラーゼで免疫し、免疫にした動物の脾臓からのＢ−リ
   ンパ球を骨髄腫と共に融合し、生じたハイブリドーマ細
   胞をクローニングし、唾液及び膵臓からのアルファ−ア
   ミラーゼを比較可能に強く阻害するクローンを分離しか
   つ育種し、かつそれから生じたモノクローナル抗体を収
   得することを特徴とするモノクローナル抗体の収得法。 ６、水酸化アルミニウム及び百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅ
   ｌｌａ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の投与下で免疫化を実施
   する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、分離したクローンを細胞培養で又は腹水中で育種す
   る特許請求の範囲第５項または第６項に記載の方法。 ８、作用物質として、ヒトのアルファ−アミラーゼの酵
   素活性を９０％以上非特異的に阻害するモノクローナル
   抗−アルファ−アミラーゼ−抗体を、場合により常用の
   治療的添加剤及び賦形剤と共に含有する真性糖尿病治療
   剤。