JPH02176464A - 薬物とタンパクとの結合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） （式中、Ａはタンパク、ｍは１〜１５、ｎは７〜１２で
あり、Ｘはジフェニルヒダントイン若しくはフエノバル
ビタール又はその誘導体である。）で表される薬物とタ
ンパクとの結合物に関する。

本発明の薬物とタンパクとの結合物は対応する薬物のイ
ムノアッセイに利用することができる。

（従来の技術） てんかん治療のためには治療に用いた薬剤であるところ
の例えばジフェニルヒダントイン若しくはフエノバルビ
タールの血中濃度を測定する必要がある。そのために特
公昭６３−８４２７に代表される如き ることができる。

が開発され、それを用いた該薬剤のイムノアッセイが確
立されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来知られている化合物を用いたイムノ
アッセイでは、該薬物に対する測定感度が低いという欠
点を有していた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、抗てんかん剤であるジフェニルヒダント
イン若しくはフェノバルビタールの血中濃度の測定のた
めに前記一般式（１）で表される結合物を開発し、イム
ノアッセイに用いたところ高感度に該薬物を測定できる
ことを見出し本発明を完成した。

本発明の前記一般式（１）で表される薬物とタンパクと
の結合物は以下の如き方法に従い製造す〔第一工程〕 本工程は前記一般式（ＩＩ）で表される化合物を酸処理
することにより、前記一般式（Ｉｌｌ）で表される化合
物を製造するものである。

本発明の前記一般式（ｎ）で表される化合物は、ジフェ
ニルヒダントイン若しくはフェノバルビタール又はその
誘導体をアルカリ処理後、一般式％式％（） で表される化合物を反応させることにより得ることがで
きる。

本工程に用いる酸としては、臭酸が好適に使用される。

反応は酢酸溶媒中、室温で容易に進行する。

〔第二工程〕

本工程は前記第一工程で得られる前記一般式（ＩＩＩ）
で表される化合物を所謂ペプチド合成における活性エス
テル法を用い、タンパクに結合させることにより、前記
一般式（１）で表される本発明の化合物を製造するもの
である。

本発明に用いることができるタンパクとしては、例えば
、血清アルブミン、ヘモシアニンあるいはデヒドロゲナ
ーゼなどの酵素を用いることができる。

本工程は、水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドを、前記一般式（Ｉ［［）で表される化合物
と反応させコハク酸イミドエステルを形成し、次いで、
例えば、約ｐＨ８の炭酸緩衝液中、室温にてタンパクを
反応させるものである。

尚、本発明の前記一般式中のｍは、反応の際に使用する
タンパクと前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の反
応量、及びそのタンパクの有する結合性アミノ基の数に
よって決まるが、イムノアッセイに有効に用いるために
は使用タンパク、反応量等により適宜コントロールし、
ｍの値を１−１５の範囲で得る。ｍの値が１５以上の化
合物は、アッセイの際の競合反応のためには好ましいと
は言いがたい。

（作用） 本発明の前記一般式（１）で表される化合物は、例えば
マイクロプレートを用いた薬物のイムノアッセイにおい
て使用される。とりわけ、前記一般式中のｎが７〜１２
の化合物は、従来この分野で知られていた化合物に比べ
極めて有効に作用する。

（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

尚、化合物の同定にあたっては、Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋１１
ｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｐａｔｈ、　Ｐｈａｒ＋ｓ、、工」主）　、
　　７６７　（１９７３）に記載の方法に従った。

実施例１．１ ３−（Ｎ−ジフェニルヒダントインル）プロビオン酸の
合成 ジフェニルヒダントイン３００ｍｇをジメチルホルムア
ミド６ｍｆｆ１に溶解し、これに５３ｍｇの６０％水素
化ナトリウムを攪拌しながら加えた。

次に、３−ブロムプロピオン酸ベンジルエステルの２８
９ｍｇを加え、６０〜８０゛Ｃで３時間攪拌した後、氷
片を数個加えて反応を停止した。この反応液に水２０ｍ
ｆを添加して反応物をクロロホルムで抽出した。このク
ロロホルム溶液を減圧乾燥した後、生成物を再び少量の
クロロホルムに溶解し、展開溶媒にクロロホルムを用い
てシリカゲルの薄層クロマトグラフィーにて精製した。

中間生成物の３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）プ
ロピオン酸ベンジルエステルのバンドを酢酸エチルで抽
出して減圧乾燥した後、得られた油状物に２５％の臭化
水素酢酸溶液３ｍｌを加え室温で一夜攪拌した。この反
応液に２０ｍ１の水を加え、クロロホルムで反応物を抽
出し、クロロホルムを展開溶媒に用いてシリカゲルの薄
層クロマトグラフィーで精製した。ゲルから酢酸エチル
で抽出し、減圧乾燥して目的の３−（Ｎ−ジフェニルヒ
ダントイニル）プロピオン酸を得た。

実施例１゜２ ３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）吉草酸の合成 ジフェニルヒダントイン３００ｍｇをジメチルホルムア
ミド６ｒｒ＋４２に溶解し、これに５３ｍｇの６０％水
素化ナトリウムを攪拌しながら加えた。

次に、５−ブロム吉草酸ベンジルエステルの３２３ｍｇ
を加え、６０−８０°Ｃで３時間撹拌した後、木片を数
個加えて反応を停止した。この反応液に水２０ｍｌを添
加して反応物をクロロホルムで抽出した。このクロロホ
ルム溶液を減圧乾燥した後、生成物を再び少量のクロロ
ホルムに溶解し、展開溶媒にクロロホルムを用いてシリ
カゲルの薄層クロマトグラフィーにて精製した。中間生
成物の３＝（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）吉草酸ヘ
ンシルエステルのハンドを酢酸エチルで抽出して減圧乾
燥した後、得られた油状物に２５％の臭化水素酢酸溶液
３ｍｌを加え室温で一夜撹拌した。この反応液に２０ｍ
ｆの水を加え、反応物をクロロホルムで抽出し、展開溶
媒にクロロホルムを用いてシリカゲルの薄層クロマトグ
ラフィーで精製した。ゲルを酢酸エチルで抽出し、減圧
乾燥して目的の３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）
吉草酸を得た。

実施例１．　３ ３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）カプリル酸の合
成 ジフェニルヒダントイン３００ｍｇをジメチルホルムア
ミド６ｍｆに溶解し、これに５３ｒｎｇの６０％水素化
ナトリウムを攪拌しながら加えた。

次に、８−ブロムカプリル酸ベンジルエステルの３７３
ｍｇを加え、６０−８０°Ｃで３時間攪拌した後、氷片
を数個加えて反応を停止した。この反応液に水２０ｍ２
を添加して反応物をクロロホルムで抽出した。このクロ
ロホルム溶液を減圧乾燥した後、生成物を再び少量のク
ロロホルムに溶解し、展開溶媒にクロロホルムを用いて
シリカゲルの薄層クロマトグラフィーにて精製した。中
間生成物の３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）カプ
リル酸ベンジルエステルのバンドを酢酸エチルで抽出し
て減圧乾燥した後、得られた油状物に２５％の臭化水素
酢酸溶液３ｍｊ２を加え室温で一夜攪拌した。この反応
液に２０ｍ２の水を加え、反応物をクロロホルムで抽出
し、展開溶媒にクロロホルムを用いてシリカゲルの７ｉ
Ｊ層クロマトグラフィーで精製した。ゲルを酢酸エチル
で抽出し、減圧乾燥して目的の３−（Ｎ−ジフェニルヒ
ダントイニル）カプリル酸を得た。

ＩＲ，２９５０，２Ｂ８０，１７２０，１４６０゜１４
３０．１１８５ｃｍ−’ 実施例２．　１ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と３−（Ｎ−ジフェニル
ヒダントイニル）プロピオン酸または３−（Ｎ−ジフェ
ニルヒダントイニル）カプリル酸の結合物の調製 ３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）プロピオン酸２
．５　ｍ　ｇまたは３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニ
ル）カプリル酸３．１　ｍ　ｇを各々５０μｌのジメチ
ルホルムアミドに溶解し、これに２０ｍｇ　／　ｍ　ｌ
の水溶性カルボジイミドジメチルホルムアミド溶液７３
μｒと５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドジメチルホルムアミド溶液１８μ２をそれぞ
れに加えた。室温で２時間反応させた後、各反応液１５
μ！を牛血清アルブミン５ｍｇを溶解した０、　３　Ｍ
炭酸水素ナトリウム水溶液０．５　ｍ　ｌに各々加え、
室温で３時間放置した。

この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにかけ、２
０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，０（Ｐ　Ｂ　Ｓ
　）で溶出した。タンパク分画を集め、目的の各結合物
を得た。ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量の結果、ウシ血
清アルブミン１分子当り、３−（Ｎ−ジフェニルヒダン
トイニル）プロピオン酸は６個、３（Ｎ−ジフェニルヒ
ダントイニル）カプリル酸ハ５個それぞれ結合していた
。

実施例２．２ ヘモシアニン（ＫＬＨ）と３−（Ｎ−ジフェニルヒダン
トイニル）吉草酸の結合物の調製３−（Ｎ−ジフェニル
ヒダントイニル）吉草酸２、７　ｍ　ｇを５０μｌのジ
メチルホルムアミドに溶解し、これに２０ｍｇ／ｍｌ！
の水溶性カルボジイミドジメチルホルムアミド溶液７９
μ℃と５０ｍ　ｇ　／　ｍβのＮ−ヒドロキシコハク酸
イミドジメチルホルムアミド溶液２０μｉを加え、室温
で２時間反応させた。この反応液をすべてヘモシアニン
３０ｍｇを含む０．３　Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３
．０　ｒｎ　ｌに加え、室温で３時間放置した。その後
、反応液をセファデックスＧ−２５カラムにかけ、ＰＢ
Ｓで溶出してタンパク分画を集め、目的の結合物を得た
。ＴＮＢＳを用いたアミノ基定量の結果、ヘモシアニン
−分子当り３−〔Ｎ−ジフェニルヒダントイニル吉草酸
は、約２０個結合していた。

実施例３ 抗体の調製 実施例２．２で調製したジフェニルヒダントインのヘモ
シアニン結合物５ｍｇを含む１ｍｌのＰＢＳを１ｍ２の
アジュバントと混合し、モルモットの皮下に注射した。

更に３週間後、上記結合物を同様に注射した。それから
２ケ月間注射を繰返し、最後の注射から１週間以内に血
液を採取し、ジフェニルヒダントインに対する抗血清を
得た。

モノクローナル抗体は上記ヘモシアニン結合物を用いて
アジュバントと共にマウスの腹腔に投与した後、肺臓細
胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール法
により融合したハイプリドーマ細胞をマウス腹腔内で増
殖させることにより腹水として得た。

実施例４ マイクロプレートを用いたジフェニルヒダントインの測
定 実施例２．１で調製したジフェニルヒダントインと牛血
清アルブミンの各結合物をそれぞれ１０μｇ　／　ｍ　
ｌのＰＢＳ溶液とし、これを９６穴のマイクロプレート
に５０μｌ／穴ずつ分注して室温で一夜放置した。この
マイクロプレートをＰＢＳで洗浄した後、ＢＳＡの１０
％ＰＢＳ溶液５０ｕｌｌを各式に分注し室温で３．５時
間放置して、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢ
Ｓで洗浄した。次に、ジフェニルヒダントインの５″希
釈液をＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液で作り、この２５μ尼と
２００倍希釈したモルモット抗血清２５μ！または１万
倍希釈した腹水２５μ２を各々、プレートの各式に分注
した。室温で１時間反応した後、０．０５％のＴｗｅｅ
ｎ　２０を含むＰＢＳで洗浄し、パーオキシダーゼで標
識した抗モルモットイムノグロブリンヤギＩｇＧまたは
抗マウスイムノグロブリンウサギＩｇＧの溶液５０μｌ
を各式に分注し、更に室温で１時間反応させた。０．０
５％のＴｓｙｅｅｎ　２０を含むＰＢＳでプレートを洗
浄し、０．１％の八ＢＴＳと１ｉＭのＨＩ３．を含む基
質液１００μｉを各式に分注して室温で３０分間反応し
た後４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。この時のジ
フェニルヒダントインの濃度とＢ／Ｂ、値の関係を図１
１図２に示した。ここで、Ｂｏはジフェニルヒダントイ
ンの濃度がＯの時の吸光度値で、Ｂは各ジフェニルヒダ
ントイン濃度における吸光度値である。また、図１はモ
ルモット抗血清を用いた時の結果を、図２はマウスの腹
水を用いた時の結果をそれぞれ示している。

（効果） 本発明の前記一般弐Ｎ）で表される結合物を使用するこ
とにより、イムノアッセイにおいて対応する薬物を極め
て高感度に測定することができる。例えばジフェニルヒ
ダントインを測定した時にＢ／Ｂ、の５０％の値で前記
一般式中のｎが２の化合物と本発明のｎが７の化合物と
比較したときに１５倍の感度の上昇が見られた。

【図面の簡単な説明】

図１は、モルモット抗血清を用いた時のジフェニルヒダ
ントインの測定結果であり、図２は、マウスの腹水を用
いた時のジフェニルヒダントインの測定結果である。 特許出ＪＩＪ人　　富士レビオ株式会社ｏ　　ｏ、ｏｏ
ｓ　　　０，１６　　　４　　　１００ジフエニルヒダ
ントイン、　　Ｍｇ／ｍ又０；ＢＳＡ−３−（Ｎ−ジフ
ェニルヒダントイニル）プロピオン酸結合物吸着プレー
ト ・；ＢＳＡ−３−（Ｎ−ジフェニルヒダントイニル）カ
プリル酸結合物吸着プレート

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）イムノアッセイに用いる、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される薬物とタンパクとの結合物（式中、Ａはタン
   パク、ｍは１〜１５、ｎは７〜１２であり、Ｘはジフェ
   ニルヒダントイン若しくはフェノバルビタール又はその
   誘導体である。）。
2. （２）タンパクが血清アルブミンである、請求項１の結
   合物。
3. （３）タンパクがヘモシアニンである請求項１の結合物
   。
4. （４）Ｘがジフェニルヒダントインである、請求項１の
   結合物。