KR20000069395A - 트리파레독신, 발현 플라스미드, 제조방법, 용도, 시험 시스템및 의약 제제 - Google Patents

트리파레독신, 발현 플라스미드, 제조방법, 용도, 시험 시스템및 의약 제제 Download PDF

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Abstract

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 신규의 효소인 트리파레독신(tryparedoxin), 크리티디아 파시쿨라타(Crithidia fasciculata)로부터의 그 분리, 유전학적으로 형질전환된 박테리아에서의 그 산생방법 및 트리파노소마 박멸제의 발견을 위한 분자 목표물질로서의 용도를 제공한다.

Description

트리파레독신, 발현 플라스미드, 제조방법, 용도, 시험 시스템 및 의약 제제{TRYPAREDOXIN, EXPRESSION PLASMID, PROCESS OF PRODUCTION, USE, TEST SYSTEM AND PHARMACEUTICAL PREPARATION}
트리파노소마티데속(Trypanosomatidae屬)에 속하는 편모가 있는 원충 동물 기생충은 열대 및 아열대 지역에서 가장 유행하는 인간 병원체에 속한다. 이들 생물은 라이프 사이클이 복잡하며, 어떤 것들은 미국 샤가스병(Chagas' disease) (Trypanosoma cruzi), 아프리카 수면증(T. brucei gambiense 및 T. b. rhodesiense), 동양종(東洋腫)(oriental sore) (Leishmania tropica), 칼라 아자르(kala azar) (L. donovani) 및 점막피부 레이슈마니아증(mucocutaneous leishmaniasis) (L. brasiliensis) 등의 생명을 약화시키거나 위협하는 각종 질환의 병원생물이다. 기타 감염 숙주로서는 식물(Phytomonas종), 곤충(Crithidia 및 Leptomonas종) 및 가축(T. congolense, T. b. brucei, T. evansi) 등, 다양하다. 인간 병원체의 대다수는 야생으로서 지방 풍토성이기도 하다. 전세계적으로 트리파노소마 감염증 및 레이슈마니아 감염증으로 고통받고 있는 사람들이 3천만 이상이나 되는 것으로 추정되고 있다(World Health Organisation, 1996). 이제까지의 백신주사 정책은 실패되었고 현재 치료에 사용되고 있는 대부분의 화학요법제들은 효능과 독성면에서 만족스럽지 못하다(Risse, 1993). 예컨대 샤가스병 치료에 널리 사용되고 잇는 의약인 니푸르티목스(Nifurtimox)는 과산화물 감응성 기생충 뿐만 아니라 숙주에 대해 영향을 미치는 비특이적인 산화환원 사이클러(redox cycler)이다. 따라서 트리파노소마티드에서의 산화제에 대한 방어 시스템은 상동성 숙주 대사와는 실질적으로 상이한데, 여기에 대해서는 보다 특이적인 트리파노소마 박멸제의 개발을 위한 강력한 목표분야로 거론되고 있다(Fairlamb, 1996; Jacoby et al., 1996).
기생충으로서 트리파노소마티드는 숙주 방어 반응에서 생성되는 초과산화 라디칼, 과산화 수소 및 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase) 생성물 등의 각종 반응성 산소종(oxygen species)에 불가피하게 노출된다. 그러나 이러한 산화성 스트레스에 대처할 수 있는 능력은 놀랍게도 약한 것으로 보인다. 이들은 식세포 유래의 초과산화물을 제거하는 철함유 슈퍼옥사이드 디스무타아제를 가지고 있기는 하지만 (LeTrant et al., 1983), 이들은 숙주 미생물의 주요 히드로과산화물(hydroperoxide) 대사 효소들(Chance et al., 1979;, 1989)인 카탈라아제 및 글루타티온 과산화 효소가 모두 결핍되어 있다(Doucampo, 1990).
또한, 이들은 포유동물 세포에서의 주요 항산화성 술피드릴 화합물인 글루타티온(GSH)을 현저하게 저농도로 함유하기도 한다. 그 대신, 이들은 항산화 방어계에 있어서 중추적 역할을 하는 것으로 믿고 있는 트리파노티온 [trypanothione; T(SH)2; N1,N8-비스(글루타티오닐)스페르미딘]으로 알려진 특이한 GSH 유도체를 생성한다(Fairlamb et al., 1985; Fairlamb and Cerami, 1992).
T(SH)2를 H2O2에 의해 산화시켜 상응한 고리형 디술파이드 (TS2)로 변환할 수 있으며, 이것은 트리파노티온 환원효소에 의해 NADPH을 이용하여 재생된다(Bailey et al., 1993; Jacoby et al., 1996). 그러나 T(SH)2와 H2O2의 반응이 효소에 의해 촉진되는가 하는 것이 논쟁의 주제로 되어 있다. 트리파노소마티드의 조추출물 (crude extract)에 대해서는 T(SH)2의존성 과산화 효소 활성이 거듭하여 보고되어 있다(Penketh and Klein, 1986; Henderson et al., 1987; Penketh et al., 1987). 그러나 적절한 효소 자체를 결코 정제할 수 없었고(Handerson et al., 1987; Penketh et al., 1987), 그 존재에 관해 의문이 제기되었다(Penketh and Klein, 1986). T. cruzi의 여러가지 생육단계에 관한 최근의 체계적인 연구 결과에서도 H2O2에 의한 T(SH)2의 비효소적 산화반응은 이러한 종(種)에서의 완만한 히드로과산화물 대사에 완전히 기인하는 것이라 하고 있다(Carnieri et al., 1993).
본 발명은 신규의 효소인 트리파레독신(tryparedoxin), 크리티디아 파시쿨라타(Crithidia fasciculata)로부터의 그 분리, 유전학적으로 형질전환된 박테리아에서의 그 산생방법 및 트리파노소마 박멸제의 발견을 위한 분자 목표물질로서의 용도에 관한 것이다.
도 1은 크리티디아 파시쿨라타(C. fasciculata)에서의 NADPH로부터 히드로과산화물로의 환원 당량의 흐름도. TR = 트리파노티온 환원효소; T(SH)2= 트리파노티온; TS2=트리파노티온 디술파이드; TXN = 트리파레독신; TXNPx = 트리파레독신 과산화 효소; ROOH = 히드로과산화물
도 2는 트리파레독신 I 유전자를 함유한 삽입물의 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열. 단백질 서열분석에 의해 확인된 부분서열은 밑줄이 있고, PCR 산물을 얻는데 사용된 프라이머에 상응한 서열은 이중밑줄이 있음.
도 3은 C. 파시쿨라타(C. fasciculata)로부터 분리된 트리파레독신 II의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. 개시코돈과 정지코돈은 굵은 글씨로 되어 있음. 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에서의 유전자의 1/3이 분석된 Pvu II 부위의 위치는 이중밑줄이 있음. WCPPC 티오레독신 유사 모티프는 밑줄이 있음.
도 4는 은염색된 SDS-PAGE (8∼25%)에서의 C. fasciculata 유래의 트리파노티온 매개 히드로퍼옥시다아제 대사계의 성분. 레인 2 = 세포 파쇄물의 추출물; 레인 3 = 트리파노티온 환원효소; 레인 4 = 트리파레독신 과산화 효소; 레인 5 = 트리파레독신 I. 레인 1 및 6은 분자량 표준임.
도 5는 MALDI-TOF-MS에 의한 분자질량 측정 기록 그래프. C. fasciculata 유래의 순수한 트리파레독신 I (기록 그래프 A), 요오도아세트아미드에 노출된 트리파레독신 I (기록 그래프 B), 요오도아세트아미드에 의해 유도된 T(SH)2-환원 트리파레독신 I (기록 그래프 C), 및 요오도아세트아미드와 N-에틸말레이미드에 의해 유도된 T(SH)2-환원 트리파레독신 I (기록 그래프 D). 기록 그래프 C 및 D에 나온 질량 증분(增分)은 카르복시아미도메틸 잔기 하나의 부가 (측정치 54 Da, 이론치 57 Da) 및 카르복시아미도메틸 잔기 하나와 N-에틸숙신이미드 잔기 하나가 부가 (측정치 185 Da, 이론치 182 Da) 된 것에 각각 상응함.
도 6은 C. fasciculata에서 분리한 각 성분으로부터 복구된 NADPH 의존성 히드로과산화물 대사. 과산화 효소 활성은 분리된 두가지 단백질, 트리파레독신 I (TXN I) (A) 및 트리파레독신 과산화 효소 (TXNPx) (B)와, T(SH)2(E) 및 트리파노티온 환원효소 (TR) (F)에 의존함. TR을 첨가한 직후에 관찰된 (F)에서의 비교적 높은 활성은 그 기질인 TS2의 축적에 기인한 것임. H2O2(D) 및 t-bOOH (C)에서 반응이 비교적 빠름에 유의할 것임. 각 시험은 0.1 mM NADPH, 16.5 ㎍/㎖ 트리파레독신 과산화 효소, 12 ㎍/㎖ 트리파레독신 I, 45 μM T(SH)2, 45 μM 히드로과산화물 및 0.4 U/㎖ TR을 사용하여 27℃에서 실시되었음. NADPH 소모량을 340 nm에서 광도계법으로 측정하였음.
도 7은 케노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 티오레독신 유사 단백질(TLP/CE)과 트리파레독신 I의 펩티드 단편과의 서열 정열. 트리파레독신 I를 트립신(Tryp) 또는 엔도프로테이나아제 Glu-C (Glu-C)로써 분해하였음. 별표는 보존된 잔기를 나타냄.
도 8은 초음파 파쇄된 대장균(E. coli) BL21(DE3)pET24a 세포(■) 및 E. coli BL21(DE3)pET/TXN II H6 세포(●)의 각 상청액에서 측정된 His 태그(tag) 함유 트리파레독신 II의 비활성. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 첨가에 의한 유전자 발현유도는 화살표로 나타나 있음.
도 9는 His 태그를 함유한 발현된 트리파레독신 II의 웨스턴 블롯 분석. SDS-PAGE는 Pharmacia Phast System에서 8∼25% 기울기 겔에서 환원조건하에 실시하였으며, 각 샘플에 대해서는 Pharmacia Phast System을 사용하여 PVDF 멤브레인에 대해 전기 블로팅(electroblotting)을 하였음. 순수한 C. fasciculata 트리파레독신 I에 대해 생장된 항체를 함유한 토끼 전(全)혈청(1:500 희석)을 1차 항체로 사용하고, 앤티-토끼 염소항체(Sigma)를 2차 항체로 사용하였음. 레인 1 = 유도 6시간후의 E. coli BL21(DE3) pET/TXN II H6 세포의 상청액; 레인 2 = 정제된 재조합 트리파레독신 II; 레인 3 = C. fasciculata 유래의 진품 트리파레독신 I.
도 10은 초음파 파쇄된 E. coli BL21(DE3)pET24a 세포(■) 및 E. coli BL21(DE3)pET/TXN II 세포(◆)의 각 상청액에서 측정된 트리파레독신 II의 비활성. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 첨가에 의한 유전자 발현유도는 화살표로 나타나 있음.
도 11은 발현된 트리파레독신 II의 웨스턴 블롯 분석. SDS-PAGE는 Pharmacia Phast System에서 8∼25% 기울기 겔에서 환원조건하에 실시하였으며, 각 샘플에 대해서는 Pharmacia Phast System을 사용하여 PVDF 멤브레인에 대해 전기 블로팅(electroblotting)을 하였음. 순수한 C. fasciculata 트리파레독신 I에 대해 생장된 항체를 함유한 토끼 전(全)혈청(1:500 희석)을 1차 항체로 사용하고, 앤티-토끼 염소항체(Sigma)를 2차 항체로 사용하였음. 레인 1 = C. fasciculata 유래의 진품 트리파레독신 I, 레인 2 = 유도 6시간후의 E. coli BL21(DE3) pET/TXN II 세포의 상청액.
도 12는 His 태그를 함유한 발현된 트리파레독신 II의 SDS-PAGE. SDS-PAGE는 Pharmacia Phast System에서 8∼25% 기울기 겔에서 환원조건하에 실시하였으며, 각 겔은 제조자의 추천에 따라 은으로 단백질을 염색하였음. 레인 2 = 유도 6시간후의 E. coli BL21(DE3) pET24a 세포의 상청액; 레인 2 = 유도 6시간후의 E. coli BL21(DE3) pET/TXN II H6 세포의 상청액; 레인 3 = 정제된 재조합 트리파레독신 II; 레인 4 = C. fasciculata 유래의 진품 트리파레독신 I. 레인 1 및 6은 분자량 표준.
본 발명은 트리파노소마티드에서의 히드로과산화물 대사가 특질상 효소성이기는 하지만 숙주 미생물의 공지의 대사 경로와는 구별된다는 발견(Nogoceke et al., 1997)에 근거하는 것이다. 이전에 알려진 트리파노티온 환원효소(TR)와는 달리 기생 경로 (parasitic pathway)는 도 1에 나온 바와 같이 NADPH를 이용하는 히드로과산화물의 환원을 아울러 촉진하는 소위 트리파레독신(TXN) 및 트리파레독신 과산화 효소(TXNPx) 등의 두가지의 신규 단백질을 포함하고 있다. 이소(iso) 형태의 트리파레독신은 한가지 종(species)에 존재한다.
산화환원 효소의 이러한 형태의 특이성에 의해 숙주 미생물에서의 부작용을 유발함이 없이 기생 대사(parasitic metabolism)를 억제할 수 있는 가능성이 제공된다.
따라서 본 발명의 한가지 실시형태는 환원 당량의 트리파노티온을 트리파레독신 과산화 효소 등의 퍼옥시레독신형(peroxiredoxin type) 단백질에 전달할 수 있는 능력을 특징으로 하는 트리파레독신류 [트리파노티온: 퍼옥시레독신 산화환원 효소]로 불리우는 단백질에 관한 것이다. 퍼옥시레독신류 및 퍼옥시레독신형 단백질에 관해서는 문헌 [Chae et al. in J. Biol. Chem., 269 (1994) 27670∼24678 및 PNAS USA, 91 (1994) 7017-7021] 및 EP 96 120 016.9 또는 PCT/EP 97/04 990을 참고하면 된다. 트리파레독신은 다면적인 기능을 가진 보편적인 산화환원 매개체인 티오레독신의 경우와 유사한 촉매 부위를 나타낸다. 전형적인 티오레독신은 트리파노소마티드에서는 결코 발견된 적이 없다. 따라서 트리파노소마티드류에 있어서 트리파레독신은 세포의 티올/디술파이드 평형에 따라 리보뉴클레오티드의 환원, 분화, 전사 조절 또는 기타 조절과정으로서의 다양한 대사기능에 있어서 티오레독신을 대신한다는 것을 알 수 있다. 트리파레독신의 복합적인 생물학적 기능의 가능성은 아래에서 설명하는 바와 같이 동일한 종(種)에 있어서 1종 이상의 트리파레독신이 공존함으로써 더욱 시사하는 바가 크다.
본 발명에 의한 단백질은 트리파노소마티데속(屬)에 속하는 종(種)에 의하여 제조하거나 이로부터 분리하는 것을 특징으로 한다.
더욱이 본 발명에 의한 단백질은 상기한 제조방법 및/또는 분리방법을, 유전공학, 특히 올리고뉴클레오티드 서열을 가지며 서열번호 (SEQ ID NO:) 1의 아미노산 서열 (도 2) 또는 이들중의 유용한 일부를 인코우드하는 프로우브(probe)로서의 올리고뉴클레오티드에 의해 실시함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 단백질은 15∼19 kDa의 분자량을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 단백질은 WCPPC 모티프(motif)를 특징으로 하고, 트리파노티온에 의한 단백질 디술파이드 결합의 환원을 촉진하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 단백질은,
(가) SEQ ID NO 2의 아미노산 서열 (도 3에서 위치 1∼150)을 가지거나, 또는
(나) 상기한 (가)의 서열에 대해 상동(homologous)이고, SEQ ID NO 2 보다 아미노산의 수가 동일하거나 또는 이 보다 적거나 또는 약간 적거나 크며, SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 2의 아미노산 서열을 포함하거나 가진 단백질을 인코우드하는 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈되는 올리고 뉴클레오티드에 의해 인코우드되는 아미노산 서열을 가진 단백질이다.
또한, 상기 (나)에 의한 단백질은 상기 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 2에 대해 적어도 70%, 특히 적어도 75%가 상동인 아미노산 서열을 가진 단백질이다.
본 발명의 다른 실시형태는 상기한 것들 중의 어느 한가지에 의한 단백질들을 발현시키고, 상기 단백질들을 인코우드하는 핵산서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명에 의한 플라스미드는 특히 크리티디아 파시쿨라타(Crithidia fasciculata)의 트리파레독신을 인코우드하는 DNA 서열을 포함한다.
또한, 본 발명에 의한 플라스미드는 자체 공지방법으로 분리하기 위해 디자인된 트리파레독신의 기능적으로 활성인 유도체를 인코우드하는 DNA 서열을 포함한다.
또한 본 발명에 의한 플라스미드는 트리파레독신이 His 태그(tag)에 의해 유도되는 트리파레독신의 기능적으로 활성인 유도체를 인코우드하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 자체 공지방법으로 유전공학에 의해 SEQ ID NO 2의 아미노산 서열을 인코우드하는 DNA 서열에 의해 산생되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 의한 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명에 의한 플라스미드에 의해 산생을 실시하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 방법은 숙주가 박테리아, 진균류, 식물세포, 곤충세포, 포유동물 세포 및 세포 배양물(이상 발현)로 된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법은 대장균(Escherichia coli)을 숙주로 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명에 의한 단백질의 활성을 억제하는 억제물질의 시험 및 회수를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명에 의한 단백질 또는 본 발명에 의한 방법으로 수득한 단백질의 촉매활성 시험을 위한 시험계에 있어서, 이 시험계는 트리파노티온, 트리파노티온 환원효소, 트리파레독신 과산화 효소, 트리파레독신, 및 더욱이 기질, 매개체 및 지시 효소로서의 히드로과산화물을 각각 함유 또는 포함하는 시험계에 관한 것이다.
최후로, 본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 방법으로 제조되는 단백질 또는 본 발명에 의한 단백질의 촉매활성을 억제하는 억제물질을 함유하고 트리파노소마 박멸활성을 가진 의약 제제에 관한 것이다.
본 발명에 의한 의약 조성물은 본 발명에 의한 용도에 따라 제조할 수 있고 본 발명에 의한 시험계를 사용하여 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 도면 및 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
C. fasciculata 유래의 트리파레독신의 분리
C. fasciculata를 문헌(Shim and Fairlamb, 1988)에 기재된 바와 같이 100 리터 용량의 페멘터에서 배양하고, 후기 로그 배양기(log phase)에서 균체를 회수하여 0.1 mM PMSF 함유의 50 mM 인산 나트륨, pH 5.8 (완충액 B)중에 부유시킨후 동결, 해동을 2회하여 균체를 완전히 파쇄하였다. 균체 파쇄물을 25,000xg에서 30분간 원심처리하여 제거하고, 그 상청액을 완충액 B로 미리 평형화 해둔 S-Sepharose 칼럼에 가하였다. 완충액 B중의 150 mM NaCl에서 용리한 트리파레독신 과산화 효소를 10 mM 인산 나트륨 pH 6.8로 미리 평형화해 둔 히드록시애파타이트 (hydroxyapatite)(BioRad, USA) 칼럼에 직접 부하하였다.
0.4 M 인산 칼륨 pH 6.8로써 단계적으로 트리파레독신 과산화 효소를 용리하였다. 이 단백질을 20 mM Tris pH 7.6 (완충액 C)에 대해 철저히 투석하고 Resource Q 칼럼에서 완충액 C중의 0.1 M NaCl에서 용리시켜 균질상태로 정제하였다. 트리파노티온 환원효소와 트리파레독신을 함유한 S-Sepharose 칼럼의 유출액을 사용하여 트리파레독신 과산화 효소의 효소활성을 측정(실시예 2)하였다. 트리파노티온 환원효소와 트리파레독신을 함유한 S-Sepharose 칼럼의 유출액을 1 M NaOH로 pH 7.2로 조정하였다. 추출액을 3% (w/v) 황산 스트렙토마이신으로 조정하고, 50% 황산 암모늄 포화도로 한후 11,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 80% 황산 암모늄 포화도로 조정한 후 다시 원심분리하였다. 수득한 펠릿을 용해하여 1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 함유한 20 mM bis-Tris-프로판 pH 7.2 (완충액 D)에 대하여 철저하게 투석하였다. 이 효소 추출액을 DEAE-Sepharose 칼럼에 부하하고 완충액 D중에서 0.4 M KCl의 직선 기울기에서 용리하였다. 80∼120 mM KCl에서 용리하는 샘플을 한외여과 (Omegacell, Filtron, 독일)에 의해 농축하고, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 함유한 20 mM 인산 칼륨 pH 7.2 (완충액 E)로 세척하여 2'5'ADP-Sepharose 4B 칼럼에 부하하였다. 트리파노티온 환원효소를 완충액 E중에서 5 mM NADP로 용리하고 Sephacryl S-200 칼럼에서 균질하게 정제하였다. 미결합 획분을 한외여과로 농축하고, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 1 mM DTT를 함유한 50 mM Hepes pH 7.6으로 Ultrogel AcA54 (LKB, 스웨덴) 겔 여과 칼럼에서 분획하여 균질의 트리파레독신을 얻었다. 이렇게 하여 분리한 순수한 트리파레독신을 트리파레독신 I (TXN I)이라 한다. 최종 정제과정에서의 총수율은 표 1에 나와 있다.
[표 1] 트리파레독신 I 분리시의 수율 및 정제계수
체적 (ml) 활성 (U) 단백질 (mg) U/mg 수율 (%) 정제계수
균체 추출물 180 386 3322 le+10 (100) (1.0)
(NH4)2SO4침전 86 134 1728 35 0.7
DEAD-Sepharose 270 136 176 36 6.4
Ultrogel AcA54 13 51 22 13 20.2
균질 생성물을 얻게 되는 정제계수에 근거하여 출발물질중의 트리파레독신 과산화 효소와 트리파레독신의 최소 농도를 추정한 결과, 총 가용성 단백질의 5% 및 6%에 달하였다. 정제 단백질의 근사 분자질량과 균질성은 도 4에 나와 있다.
SDS-PAGE에 의해 추론된 겉보기 서브유닛 질량(약 16000)은 MALDI에 의해 얻은 것인 16393±10 (도 5)과 비교할 수 있는 것이었다. 이들 두가지 단백질의 스펙트럼 특성을 분석한 결과, 가시영역에서 흡수하는 어떠한 발색성 보조인자 (chromophoric cofactor)가 존재함이 확인되었다.
실시예 2 : 트리파레독신 활성 측정
트리파노티온 및 트리파노티온 환원효소에 의한 NADPH 소모량에다 트리파레독신 과산화 효소에 의한 히드로과산화물의 접촉환원을 결합함으로써 트리파레독신의 활성을 측정한다. 예컨대, 분석용 시료중에는 1 mM EDTA, 50 M H2O2또는 t-부틸 하이드로퍼옥사이드 (t-b00H), 45 M T(SH)2, 16.5 ㎍/㎖ 트리파레독신 과산화 효소, 0.34 U 트리파노티온 환원효소, 미지의 량의 트리파레독신 및 50 mM Hepes pH 7.6중의 0.1 mM NADPH를 함유한다. 별달리 명시하지 않는한, 반응을 히드로과산화물의 첨가로써 시작한다. 디히드로트리파노티온은 문헌(Fairlamb et al., 1986)에 기재된 바에 따라 TS2의 화학적 환원처리 (Bachem, 스위스)에 의해 얻는다. t-BOOH 대신에 H2O2, 리놀레산 히드로과산화물 또는 포스파티딜콜린 히드로과산화물을 사용해도 좋다.
도 6은 NADPH에 의한 알킬 히드로과산물 또는 H2O2의 효율적인 환원반응을 위해서는 T(SH)2, 트리파레독신 및 트리파레독신 과산화 효소가 필요하다는 것을 입증하는 것이다. 따라서 C. fasciculata의 T(SH)2매개 "NADPH 과산화 효소 활성"은 세가지 구별되는 단백질, 즉 특징이 잘 알려져 있는 트리파노티온 환원효소 (Bailey et al., 1993), 트리파레독신 및 트리파레독신 과산화 효소의 동시작용 (concerted reaction)에 의해 달성된다.
실시예 3 : 부분 단백질 서열분석에 의한 트리파레독신 I의 특성화
트리파레독신 I의 N 말단은 블로킹되었기 때문에 Stone 및 Willams의 방법(1993)에 따라 소의 트립신 또는 Staphylococcus aureus 유래의 엔도프로테이나아제 Glu-C (이들 두가지는 모두 서열 결정용급 시약, Promega 사제)로서 분해하였다. 각 펩티드를 Aquapore OD-300 RP-18 칼럼에서 HPLC(Applied Biosystems 172A)에 의해 분리하고, Applied Biosystems사제의 시퀀서(sequencer)를 사용하여 온라인 C-18 역상 HPLC에 의해 자동 Edman 분해법을 실시하였다. BLAST 및 FASTA 프로그램에 의해 데이타베이스 검색을 하였다. 각 펩티드를 미합중국의 Genetics Computer Group(GCG)의 Bestfit 프로그램에 따라 정열하였다.
7개의 단편을 서열분석하여 C. 엘레간스(C. elegans)의 티오레독신 유사 단백질에 대해 정열하였다(도 7).
실시예 4 : 트리파레독신 I의 서열분석된 단편의 인코우딩 DNA 해명을 위한 이용
균체배양 및 DNA 추출:
문헌(Shim and Fairlamb, 1988)에 기재된 바에 따라 C. fasciculata (HS6)을 성장시켜 7000 rpm에서 15분 동안 원심처리하여 균체를 회수하고, 식염수(0.9% NaCl)로써 2회 세척한후 5 ml 완충액 (50 mM TrisHCl, 100 mM EDTA, 15 mM NaCl, 0.5 % SDS, 100 ㎍ ml-1Proteinase K, pH 8.0)중에 다시 부유시킨 다음 50℃에서 40분 동안 예비 인큐베이트하였다. 당량 체적의 페놀을 사용하여 게놈 DNA를 2회 추출(인큐베이션 : 60℃에서 45분; 원심분리 : 4500 rpm에서 20분)한 다음, 페놀 : 클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1)로 추출하고, 이어서 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 추출하였다. 게놈 DNA를 아세트산 나트륨과 에탄올로써 침전시켰다.
프라이머, 하이브리다이제이션 프로우브 및 서열분석 :
트리파레독신 I의 펩티드 서열(Nogoceke et al., 1997)에 근거하여 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 합성하였다. GeneAmp PCR Core 키트(Perkin Elmer)를 사용하고, 템플레이트로서의 C. fasciculata 게놈 DNA 0.2 ㎍, 10x 반응 완충액 5 ㎕, 25 mM MgCl23 ㎕, 10 μM dNTP 각각 1 ㎕, 프라이머 각각 100 pmol 및 0.25 U Taq 폴리메라아제를 사용하여 폴리메라아제 연쇄반응(PCR) 증폭을 실시하였다. 어니일링 온도를 52℃로 하였다. PCR 생성물을 아가로오스 겔로 분석하고, QIAquick PCR 키트(QIAGEN사)를 사용하여 정제하였다. 서열분석은, PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Sequencing Kit(1550V, 19 mA, 30 W, 42℃)을 사용하여 373A DNA 시퀀서(sequencer) (Applied Biosystems)에서 실시하였다.
하이브리다이제이션 프로우브(probe)로서 사용할 경우, PCR 생성물을 공급자의 지시에 따라 DlG DNA Labeling 키트(Boehringer Mannheim)를 사용하여 디곡시게닌으로 표지(labelling)하였다.
라이브러리 구축 및 스크리닝 방법 :
DNA 1 ㎍ 당 Sau3A를 0.005 단위의 비율로 하여 게놈 DNA를 5∼30분간 부분 분해하였다. 분해효율을 아가로오스 겔에서의 전기영동에 의해 모니터링하였다. Strata Clean Resin (Stratagene)을 사용하여 DNA로부터 단백질을 제거하였다. Sau 3A부위를 dATP와 dGTR 및 Klenow 단편으로 부분적으로 보충하고, 게놈 DNA를 Lambda GEM-11 Xho I half site arms(Promega)에다 게놈 DNA(평균크기 15 kb)에 대해 DNA의 몰비 1:0.7로 하여 결합하였다. 결합된 DNA를 Packagene Lambda DNA 패키징 시스템(Promega)을 사용하여 공급자의 지시에 따라 패키지하였다. 표준 프로토콜에 따라 파아지(phage)를 사용하여 대장균 숙주 균주 LE392(Promega)를 감염시켰다. 게놈 라이브러리 5.1×103pfu를 한천위에 평판배양하였다. 플라아크를 9 cm 직경의 Biodyne-A 나일론 멤브레인에 옮기고 하이브리다이제이션 온도 54℃에서 공급자의 지시에 따라 DIG 표지된 PCR 프로우브로써 스크리닝하였다. DIG 표지된 핵산을 DIG핵산 검출 키트(Boehringer Mannheim)로써 비색법으로 검출하였다. 양성 클론을 다시 스크리닝하여 증폭시킨후 SM 완충액에 부유시켰다. 파아지를 PEG 8000으로써 침전시키고 CsCl 기울기로 정제하였다. 분리된 DNA를 제한분석 (Sac I, EcoR I, BamH I, Xho I, Neo I)에 사용하거나 PCR 반응용의 템플레이트로 사용하였다. 분해 생성물을 아가로오스 겔로부터 용리시켜 pBluescript Ⅱ KS (+/-) 파아지미드(phagemid)(Stratagene) 또는 pET24d(+) 벡터(Novagen)에다 결합하였다. 결합된 DNA를 사용하여 대장균 LE392를 형질전환하고, 형질전환된 균체를 앰피실린 (pBluescript Ⅱ KS (+/-) 파아지미드) 또는 카나마이신 (pET24d(+) 벡터) 내성에 따라 선별하고, QIAprep Spin 플라스미드 키트(Qiagen사)를 사용하여 플라스미드를 정제하여 제한효소 분해법 및 서열 분석법에 의해 분석하였다.
C. fasciculata로부터 트리파레독신 유전자의 분리 및 서열분석 :
C. fasciculata의 분리된 트리파레독신 I로부터 얻은 서열분석된 펩티드 단편(Nogoceke et al., 1997)을 Caenorhabditis elegans의 티오트레독신 유사 단백질의 확립된 추정 아미노산 서열(Chae et al., 1993)을 따라 정열하였다. 이렇게 함으로써 적당한 변성 PCR 프라이머를 C. fasciculata 게놈 DNA 유래의 PCR 생성물의 생성을 위해 디자인할 수 있었다. 이어서 약 50%의 트리파레독신 I을 코우드한 PCR 생성물을 사용하여 트리파레독신 I를 인코우드하는 완전길이의 DNA를 가진 삽입물을 위한 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 추정된 트리파레독신 I 유전자와 더불어 22 kb 삽입물을 함유한 클론을 분리하였다.
이 DNA를 제한효소 Sac I으로 분해하여 삽입물로부터 파아지 아암(phage arm)을 분리하고 제한효소 Nco I으로 분해하였다. 서어든 블롯을 하여 한개의 6 kb 단편을 표지된 PCR 생성물과 하이브리다이즈하였다. 이 단편을 pET24d(+) 벡터 (Novagen)에다 서브클로닝하였다. 이어서, 클로닝된 단편을 제한효소 Pvu II로 분해한 다음 1 kb 단편의 분리와 클로닝을 하였다. 이 단편을 서열분석한 결과, 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 5' 말단에서 트리파레독신에 대해 인코우딩하는 유전자의 1/3만을 함유하고 있었다(도 3). 이렇게 하여 얻은 DNA 서열은 분리된 트리파레독신 I 유래의 펩티드 서열과 완전히 일치하였다.
실시예 5 : 새로운 트리파레독신 유전자 (TXN II)의 분리
실시예 4에서 얻은 정보를 사용하여 새로운 프라이머를 설계하고, 6 kb 단편으로부터 직접 완전 유전자를 서열분석하였다. 이전에 얻은 PCR 생성물은 분리된 유전자의 상응한 영역에 대해 그 아미노산 서열에 있어서 약 60% 동일하였다. 완전 길이의 인코우딩 DNA와 추정 아미노산 서열은 도 3에 나와 있다. 이 유전자는 분자질량 17000의 단백질에 대해 인코우드하는 한편, C. 파시쿨라타로부터 분리된 천연의 트리파레독신 I의 분자질량은 16393±10이다(Nogoceke et al., 1997).
실시예 6 : 대장균에서의 트리파레독신 II의 이상발현
클로닝된 6 kb 단편에 함유된 트리파레독신 유전자를, Nde I 부위를 가지며 코우딩 서열의 5' 말단을 오우버랩(overlap)하는 전방향 프라이머(forward primer) A (5'-TCGTGATTCCGTTCCGCATATGTCAGGGC-3')와, 코우딩 서열의 3' 말단을 오우버랩하며 Xho I부위를 가진 역방향 프라이머(reverse primer) B (5'-GCAACTCAA TCGCTCCCCTCGAGCTTCTTGGCCTCC-3')를 사용하여 증폭하였다. 따라서 로이신과 글루타메이트 잔기가 부가되고 정지코돈은 삭제되어 단백질은 그 카르복실 말단에 6개의 히스티틴 잔기를 가지게 된다. Expand High Fidelity 폴리메라아제 혼합물과 완충액(Boehringer Mannheim)을 사용하고 어니일링 온도 50℃에서 신장온도를 1 사이클당 10초 증가시키는 10∼20 사이클의 조건하에서 상기와 마찬가지로 증폭을 하였다. 증폭된 코우딩 영역을 Nde I 및 Xho I로써 분해하고, 동일한 효소로 처리되고 탈포스포릴화된 pET24a(+) 벡터(Novagen)에 결합하였다. 수득한 플라스미드 (pET/TXN II H6)를 사용하여 대장균(E. coil) BL21(DE3)을 형질전환하였다. 형질전환된 균체를 카나마이신 내성에 따라 선별하고 플라스미드를 정제하여 서열분석하였다.
역방향 프라이머 B 대신에 역방향 프라이머 C (5'-CAGCAACTCAATGGATCCTCATTACTTCTTGGCC-3')를 사용하고 동일한 방법을 사용하여 카르복실 말단에서 아무런 변화없이 트리파레독신 II를 발현시켰다. 이 경우에 있어서, 클로닝 단계에서의 분해처리를 Nde I 및 BamH I로 실시했을때 역방향 프라이머에는 여분의 정지코돈 및 이 여분의 정지 코돈의 5' 말단에서의 BamH I 부위를 가지고 있었다. 수득한 플라스미드를 pET/TXN II로 명명하고, 이것을 사용하여 E. coli BL21(DE3)을 형질전환하였다. 혈질전환된 균체를 카나마이신 내성에 따라 선별하고 플라스미드를 정제하여 서열분석을 하였다.
E. coli BL21(DE3) pET/TXN IIH6을 30 ㎍ 카나마이신/ml을 함유한 LB배지중에서 25℃ 및 180 rpm에서 0.9∼1.0의 A600까지 생육시킨 다음, 트리파레독신 II 유전자의 발현을 1 mM 이소프로필- -D-티오갈락토피라노시드로써 유도하였다. pET24a 플라스미드를 함유한 E. coli BL21(DE3)을 동일한 방법으로 생육시켰다. 각기 상이한 시간에서 채취한 샘플을 원심분리하고, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA 완충액에 다시 부유시켜 초음파 파쇄한후 원심분리하였다. 효소활성을 Nogoceke 등의 방법(1997)으로 측정하였다. 단백질 농도는 소혈청 알부민을 표준으로 하는 쿠우마시이 브릴리안트 블루-G 시약 (BioRad)를 사용하여 측정하였다. 형질전환된 박테리아의 유도후 초음파 파쇄된 균체의 상청액에서 트리파레독신 활성을 검출하였다. 활성은 유도 6시간후에 최대로 증가하였고 대조에서는 활성이 전혀 발견되지 않았다(도 8). 이 유도에 의해 겉보기 분자질량 18000의 새로운 단백질이 축적되었는데, 이것은 앤티-트리파레독신 항체가 순수한 C. fasciculata 트리파레독신 II에 대해 증가했다는 사실로부터 확인되었다(도 9).
E. coli BL21(DE3) pET/TXN II을 30 ㎍ 카나마이신/ml을 함유한 LB배지중에서 25℃ 및 180 rpm에서 0.9∼1.0의 A600까지 생육시킨 다음, 트리파레독신 II 유전자의 발현을 1 mM 이소프로필- -D-티오갈락토피라노시드로써 유도하였다. pET24a 플라스미드를 함유한 E. coli BL21(DE3)을 동일한 방법으로 생육시켰다. 각기 상이한 시간에서 채취한 샘플을 원심분리하고, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA 완충액에 다시 부유시켜 초음파 파쇄한후 원심분리하였다. 효소활성을 Nogoceke 등의 방법(1997)으로 측정하였다. 단백질 농도는 소혈청 알부민을 표준으로 하는 쿠우마시이 브릴리안트 블루-G 시약 (BioRad)를 사용하여 측정하였다. 형질전환된 박테리아의 유도후 초음파 파쇄된 균체의 상청액에서 트리파레독신 활성을 검출하였다. 활성은 유도 6시간후에 최대로 증가하였고 대조에서는 활성이 전혀 발견되지 않았 다(도 10). 이 유도에 의해 겉보기 분자질량 18000의 새로운 단백질이 축적되었는데, 이것은 앤티-트리파레독신 항체가 순수한 C. fasciculata 트리파레독신 II에 대해 증가했다는 사실로부터 확인되었다(도 11).
실시예 7 : 재조합 트리파레독신 II의 정제 및 특성화
E. coli BL21(DE3) pET/TXN II H6을 30 ㎍ 카나마이신/ml 함유한 LB 배지에서 25℃ 및 180 rpm에서 0.9∼1.0의 A600까지 생육시킨 다음, 트리파레독신 II 유전자의 발현을 1 mM 이소프로필- -D-티오갈락토피라노시드로써 유도하였다. 6시간후 배양물을 원심분리하고 -20℃에서 저장하거나, 혹은 균체를 0.05배 배양물 체적의 바인딩 완충액(binding buffer) (5 mM 이미다졸, 500 mM NaCl 및 20 mM Tris-HCl pH 7.9)중에 다시 부유시켰다. 균체 부유액을 얼음위에서 초음파 처리하고 4℃ 및 13000 rpm에서 40분간 원심분리하였다. 상청액을, Ni2+를 충전하여 바인딩 완충액으로 평형화해둔 His Bind 수지(Novagen) 칼럼에 1시간당 약 10배 칼럼체적의 유속으로 가하였다. 이 칼럼을, 10배 체적의 바인딩 완충액, 6배 체적의 500 mM NaCl, 100 mM 이미다졸 함유 20 mM Tris-HCl pH 7.9 완충액으로 세척하였다. 트리파레독신은 500 mM 이미다졸 함유의 완충액중에서 용리하였다. 활성획분을 한데 모아 1 mM DTT 및 1 mM EDTA 함유의 50 mM Tris-HCl pH 7.6 완충액에 대하여 즉시에 투석하였다. 트리파레독신 II는 500 mM 이미다졸에서 용리되었고, SDS-PAGE 처리한 다음 은염색함으로써 순수함이 판명되었다(도 12).
이 단백질의 N 말단 서열분석으로부터 초기의 메티오닌이 없어진 것이 확인되었으므로 첫번째 20개 아미노산을 확인할 수 있었다. 발현된 트리파레독신 II는 SDS-PAGE에서 진품의 트리파레독신 I 보다 약간 큰 약 18000의 분자질량을 나타내었다(도 12). 재조합 및 진품 트리파레독신 과산화 효소 사이의 분자질량의 차이는 재조합 효소의 C 말단에 부가된 추가의 아미노산(로이신, 글루타메이트 및 6개의 히스티딘 잔기)에 주로 상응한 것이었다.
정제된 재조합 효소는 진품 효소의 비활성 2.3 U/mg에 비하여 비활성이 7.7 U/mg이었다.
실시예 8 : 억제활성 조사
실시예 2에 기재된 시험계는 트리파레독신 I의 특이한 억제를 위한 화합물을 스크리닝하는데 용이하게 적용할 수 있다. 한가지 예로서 N-에틸말레이드(NEM), 요오도아세트아미드(IAM) 및 페닐아르신 옥사이드(phenylarsine oxide) (PAO) 등의 S-알킬화제에 의한 트리파레독신 과산화 효소의 억제에 대하여 설명한다 (표 2).
트리파레독신을 추정된 환원성 기질[T(SH)2]의 첨가 또는 무첨가의 50 mM Hepes, 1 mM EDTA, pH 7.6중에서 예비 인큐베이트한 다음 저해제와 반응시키고, 실시예 2에 기재된 바에 따라 22℃에서 그 활성을 체크하였다. 분자질량의 변화를 MALDI-TOF-MS에 의해 측정하였다(도 5).
[표 2] 트리파레독신의 유도과정
단백질 예비처리 유도 질량증가B 잔존활성[%]
트리파레독신 (9.5 μM) 116 mM T(SH)2: 22℃에서 15분 --- --- -100
없음a 3 mM IAM:22℃에서 30분 4±3(0) 83±5
1.16 mM T(SH)2: 22℃에서 15분 3 mM IAM:22℃에서 30분 57±3(57)c 0±5
3 mM NEM:22℃에서 30분 251±3(250)d 24±5
3 mM PAO:22℃에서 30분 154±3 (152)c n.d.e
트리파레독신을 추정된 환원성 기질과 함께 50 mM Hepes, 1 mM EDTA, pH 7.6중에서 예비 인큐베이트한 다음 요오도아세트아미드 (IAM), NEM 또는 페닐아르신 옥사이드 (phenylarsine oxide) (PAO)와 반응시켰다. 분자질량의 변화를 MALDI-TOF-MS에 의해 측정하였다. 잔존활성은 1.0 μM 트리파레독신 과산화 효소와 0.6 μM 트리파레독신과 더불어 1 mM T(SH)2를 사용하여 22℃에서 측정하였다.
a 비환원성 조건하에서 저장.
b 괄호속의 수치는 예측된 질량 증가분을 나타냄.
c 유도제 1 분자.
d 유도제 2 분자.
e 가역적 저해; 시험시의 타임 스케일내에서 얻은 활성.
본 출원의 개시내용은 EP 96 120 015.1호의 것도 포함하고 있다.
이 설명한 바와 같이 본 발명은 신규의 효소인 트리파레독신 (tryparedoxin), 크리티디아 파시쿨라타(Crithidia fasciculata)로부터의 그 분리, 유전학적으로 형질전환된 박테리아에서의 그 산생방법 및 트리파노소마 박멸제의 발견을 위한 분자 목표물질로서의 용도를 제공한다.
인용문헌
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: Flohe, Leopold
(B) STREET: Mascheroder Weg 1
(C) CITY: Braunschweig
(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTAL CODE (ZIP): 38124
(A) NAME: Nogeceke, Everson
(B) STREET: Mascheroder Weg 1
(C) CITY: Braunschweig
(E) COUNTRY: Germany
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(A) NAME: Kalisz, Henryk
(B) STREET: Mascheroder Weg 1
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(E) COUNTRY: Germany
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(A) NAME: Montemartini, Marisa
(B) STREET: Mascheroder Weg 1
(C) CITY: Braunschweig
(E) COUNTRY: Germany
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(ii) TITLE OF INVENTION: Tryparedoxin, Expression plasmid, process for
production, use, test system and pharmaceutical
preparation
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 15
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
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(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
CAGCAACTCA ATGGATCCTC ATTACTTCTT GGCC 34
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 80 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Gly Lys Val Leu Phe Phe Tyr Phe Ser Ala Ser Trp Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Arg Gly Phe Thr Pro Gln Leu Ile Glu Phe Tyr Asp Lys Phe His Glu
20 25 30
Ser Lys Asn Phe Glu Val Val Phe Cys Ser Trp Asp Glu Glu Glu Asp
35 40 45
Gly Phe Arg Gly Tyr Phe Ala Lys Met Pro Trp Leu Ala Val Pro Phe
50 55 60
Ala Gln Ser Glu Ala Val Gln Lys Leu Ser Lys His Phe Asn Val Glu
65 70 75 80
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 240 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
GGSAARCTRG TSTTCTTCTA CTTCTCCGCG AGCTGGTGCC CGCCGTGCGC GGGCTTCACG 60
CCGCAGCTGA TCGAGTTCTA CGACAAGTTC CACGAGTCGA AGAACTTCGA GGTTGTGTTC 120
TGCACGTGGG ACGAGGAGGA GGACGGCTTT GCGGGCTACT TCGCGAAGAT GCCGTGGCTT 180
GCGGTGCCGT TTGCGCAGAG CGAGGCGGTG CAGAAGCTGT CGAASCASTT CAACGTCGAG 240
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 150 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
Met Ser Gly Leu Lys Lys Phe Phe Pro Tyr Ser Thr Asn Val Leu Lys
1 5 10 15
Gly Asp Ala Ala Asp Ile Ala Leu Pro Ser Leu Ala Gly Lys Thr Val
20 25 30
Phe Phe Tyr Phe Ser Ala Ser Trp Cys Pro Pro Cys Arg Ala Phe Thr
35 40 45
Pro Gln Leu Ile Glu Phe Tyr Lys Ala His Ala Glu Lys Lys Asn Phe
50 55 60
Glu Val Met Leu Ile Phe Trp Asp Glu Ser Ala Glu Asp Phe Lys Asp
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Lys Met Pro Trp Leu Ala Leu Pro Phe Glu Asp Arg Lys
85 90 95
Gly Met Glu Phe Leu Thr Thr Gly Phe Asp Val Lys Ser Ile Pro Thr
100 105 110
Leu Val Gly Val Glu Ala Asp Ser Gly Asn Ile Ile Thr Thr Gln Ala
115 120 125
Arg Thr Met Val Val Lys Asp Pro Glu Ala Lys Asp Phe Pro Trp Pro
130 135 140
Asn Val Glu Ala Lys Lys
145 150
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 453 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
ATGTCAGGGC TGAAGAAGTT CTTCCCTTAC AGCACAAACG TGCTGAAGGG TGCTGCTGCG 60
GATATCGCGC TCCCCTCGCT GGCGGGCAAG ACCGTATTCT TCTACTTCTC CGCGAGCTGG 120
TGCCCGCCGT GCCGGGCCTT CACGCCGCAG CTGATCGATT TTTACAAGGC CCACGCGGAG 180
AAGAAGAACT TCGAGGTGAT GCTCATCTCC TGGGATGAGT CAGCAGAGGA CTTTAAGGAC 240
TACTACGCGA AGATGCCGTG GCTGGCATTG CCGTTTGAAG ACCGCAAAGG GATGGAGTTC 300
TTGACGACCG GCTTCGATGT GAAGTCGATC CCAACCTTGG TGGGCGTCGA GGCGGACTCG 360
GGAAACATCA TCACAACGCA GGCGCGTACG ATGGTGGTGA AGGACCCGGA AGCAAAGGAT 420
TTTCCGTGGC CCAACGTGGA GGCCAAGAAG TAA 453
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 727 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
GAAGTATCTT GTAGTGGTAC ACTTCTCACA TACAACACAA CTTATTCTTT GCTTTTTCAC 60
TTTGTCTGTG TGTTGAAGCA CTCGCACATC ACGCCTCGTT GCCGCACCGC GCACAAGGCT 120
CTACGGTTTC GCTCACGCTG AGTCGGGGTG CATGTATCAC ACCCTTCTCT ACGACTTTCG 180
TGATTCCGTT CCGCACATGT CAGGGCTGAA GAAGTTCTTC CCTTACAGCA CAAACGTGCT 240
GAAGGGTGCT GCTGCGGATA TCGCGCTCCC CTCGCTGGCG GGCAAGACCG TATTCTTCTA 300
CTTCTCCGCG AGCTGGTGCC CGCCGTGCCG GGCCTTCACG CCGCAGCTGA TCGATTTTTA 360
CAAGGCCCAC GCGGAGAAGA AGAACTTCGA GGTGATGCTC ATCTCCTGGG ATGAGTCAGC 420
AGAGGACTTT AAGGACTACT ACGCGAAGAT GCCGTGGCTG GCATTGCCGT TTGAAGACCG 480
CAAAGGGATG GAGTTCTTGA CGACCGGCTT CGATGTGAAG TCGATCCCAA CCTTGGTGGG 540
CGTCGAGGCG GACTCGGGAA ACATCATCAC AACGCAGGCG CGTACGATGG TGGTGAAGGA 600
CCCGGAAGCA AAGGATTTTC CGTGGCCCAA CGTGGAGGCC AAGAAGTAAA GGGGAGCGAT 660
TGAGTTGCTG CAGGCGTGCG TGAAGCACCT TTATATTTTT CCTTTTTCTT CTCCTGTAGG 720
CTGCGTG 727
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 140 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:
Met Ser Leu Leu Ala Gly Val Lys Leu Glu Lys Arg Asp Lys Thr Leu
1 5 10 15
Val Asp Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Lys Ala Val Gly Phe Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala His Trp Cys Pro Pro Cys Arg Gly Phe Thr Pro Ile Leu Lys
35 40 45
Asp Phe Tyr Glu Glu Val Glu Asp Glu Phe Glu Val Val Phe Val Ser
50 55 60
Phe Asp Arg Ser Glu Ser Asp Leu Lys Met Tyr Met Ser Glu His Gly
65 70 75 80
Asp Trp Tyr His Ile Pro Tyr Gly Asn Asp Ala Ile Lys Glu Leu Ser 85 90 95
Thr Lys Tyr Gly Val Ser Gly Ile Pro Ala Leu Ile Ile Val Lys Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Glu Val Thr Lys Asp Gly Arg Asn Asp Val Gln Asn Gly
115 120 125
Lys Asp Pro Lys Ala Thr Val Ala Lys Trp Lys Ala
130 135 140
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 37 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:
Ser Leu Ala Gly Lys Leu Val Phe Phe Tyr Phe Ser Ala Ser Trp Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Arg Gly Phe Thr Pro Gln Leu Ile Glu Phe Tyr Asp Lys
20 25 30
Phe His Glu Ser Lys
35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:
Met Pro Trp Leu Ala Val Pro Phe Ala Gln Ser Trp Ala Val Gln Lys
1 5 10 15
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12:
His Phe Asn Val Glu Ser Ile Pro Thr Leu Ile Gly Val Asp Ala Asp
1 5 10 15
Ser Gly Asp Val Val Thr Thr Arg
20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:
Ala Thr Leu Val Lys Asp Pro Glu Gly Glu Gln Phe Pro Ser Lys Asp
1 5 10 15
Ala
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 7 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:
Phe Tyr Asp Lys Phe His Glu
1 5
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
Ser Ile Pro Thr Leu Ile Gly Val Asp Ala Asp Ser Gly Asp Val Val
1 5 10 15
Thr Thr Arg Ala Arg Ala Xaa Leu Val Lys
20 25

Claims (21)

  1. 환원당량의 트파노티온 [T(SH)2]을 퍼옥시레독신에 전달할 수 있는 능력을 가진 것을 특징으로 하는 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 트리파노소마티데속에 속하는 종에 의하여 제조할 수 있고, 혹은 트리파노소마티데속에 속하는 종으로부터 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제조 및/또는 분리를, 유전공학 특히 아래의 서열번호(SEQ ID NO) 1에서의 단일 밑줄 또는 2중 밑줄 부분을 특징으로 하는 프로우브로서의 아래의 서열번호(SEQ ID NO) 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 일부 혹은 상기 서열의 부분서열, 특히 아래의 서열번호(SEQ ID NO) 1의 부분서열에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 분자량 15∼19 kDa를 특징으로 하는 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 제3항에 의한 서열번호 (SEQ ID NO) 1의 아미노산 서열을 포함하거나 가진 단백질.
  6. 서열번호 (SEQ ID NO) 2 (도 3)의 아미노산 서열을 포함하거나 가진 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, WCPPC 모티프(도 3)를 특징으로 하고, 단백질 디술파이드류, 특히 퍼옥시레독신, 특히 트리파레독신 과산화 효소 (TXNPx)의 트리파노티온 [T(SH)2]에 의한 환원을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 단백질.
  8. (가) 아래의 서열번호 (SEQ ID NO) 2의 아미노산 서열 (도 3의 위치 1∼150)을 가지거나,
    (나) 상기 (가)의 서열에 대해 상동이고, 동일한 수 또는 적은수 또는 약간 적거나 약간 큰 수의 아미노산을 가지며, SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 2의 아미노산 서열을 가진 단백질을 인코우드하는 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈 (1 M NaCl 농도 및 온도 적어도 25℃)되는 올리고뉴클레오티드에 의해 인코우드되는 아미노산 서열을 가진 단백질.
  9. 제8항의 (나)에 있어서, 상기 제8항의 (가)에 의한 서열과 적어도 70%, 특히 적어도 75%가 상동이고, 또는 아미노산의 수에 있어서 SEQ ID NO 2와 30개 이하, 특히 25개 이하, 바람직하게는 20개 이하의 차이를 가진 아미노산 서열을 가진 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 의한 단백질을 발현시키고, 상기 단백질을 인코우드하는 핵산을 포함하는 플라스미드.
  11. 제10항에 있어서, 제8항에 의한, 특히 크리티디아 파시쿨라타의 단백질 (트리파레독신 = TXN)을 인코우드하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드.
  12. 자체 공지의 방법으로 분리하기 위해 디자인된 제 8 항에 의한 단백질 (트리파레독신 = TXN)의 기능적으로 활성인 유도체를 발현하며, 상기 유도체를 인코우드하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드.
  13. 제12항에 있어서, 트리파레독신이 His 태그에 의해 유도되는 제 8 항에 의한 단백질(트리파레독신 = TXN)의 기능적으로 활성인 유도체를 인코우드하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드.
  14. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 있어서, 자체 공지의 방법으로 유전공학에 의해 제3항에 의한 서열번호 (SEQ ID NO) 1의 서열의 부분서열 또는 서열번호 (SEQ ID NO) 1의 서열의 올리고뉴클레오티드 또는 그 일부에 의해 산생되는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
  15. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 있어서, 제10항 내지 제13항중의 어느 한 항에 의한 플라스미드에 의해 산생을 하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 숙주가 박테리아, 진균류, 효모, 식물 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세포 배양물(이형 발현)로 된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 대장균을 숙주로 사용하는 방법.
  18. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 의한 단백질 또는 제14항 내지 제17항중의 어느 한 항에 의한 방법으로 수득되는 단백질의, 상기 단백질의 활성을 억제하는 억제물질의 시험 및 회수를 위한 용도.
  19. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 의한 단백질 또는 제14항 내지 제17항중의 어느 한 항에 의한 방법으로 수득되는 단백질의 촉매활성 시험을 위한 시험계에 있어서, 이 시험계는 트리파노티온[T(SH)2], 트리파노티온 환원효소(TR) 및 트리파레독신 과산화 효소(TXNPx), 그 활성이 측정되는 단백질, 이에 부가하여 지시효소로서의 히드로과산화물, 매개체 및 기질을 각각 함유 또는 포함하는 단백질의 촉매활성 시험을 위한 시험계.
  20. 제1항 내지 제9항중의 어느 한 항에 의한 단백질 또는 제14항 내지 제17항중의 어느 한 항에 의한 방법으로 수득되는 단백질의 촉매활성을 억제하는 억제물질을 함유하고, 트리파노소마 박멸활성을 가진 의약제제.
  21. 제20항에 있어서, 제17항 또는 제18항에 의한 용도에 의하여 수득되고, 또는 제19항에 의한 시험계를 사용함으로써 수득되는 의약제제.
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