JP2001505773A

JP2001505773A - トリパレドキシン発現プラスミド、産生方法、使用、試験系および薬剤

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Publication number: JP2001505773A
Application number: JP52624498A
Authority: JP
Inventors: レオポルト・フローエ; エヴァーソン・ノヘセケ; ヘンリック・カリス; マリサ・モンテマルティーニ
Original assignee: レオポルト・フローエ; エヴァーソン・ノヘセケ; ヘンリック・カリス; マリサ・モンテマルティーニ
Priority date: 1996-12-12
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2001-05-08
Also published as: BR9714010A; AU5856398A; EP0944718A2; NZ335968A; US20030082202A1; IL130272A0; AU746917B2; US6432671B1; KR20000069395A; WO1998026051A3; WO1998026051A2; CA2275175A1; US20050143559A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規の酵素、トリパレドキシン、Crithidia fasciculataからのそれの単離、遺伝的に形質転換した細菌中でのそれの製造方法、および殺トリパノソーマ薬の発見のための分子標的としてのそれの使用を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】トリパレドキシン発現プラスミド、産生方法、使用、試験系および薬剤序論トリパノソーマ（Trypanosoma）科の寄生鞭毛虫は、熱帯および亜熱帯において最も流布しているヒト病原体の一つである。これらの生物体は複雑な生活環を有し、それらのいくつかは衰弱性のまたは致死的な疾患、例えばアメリカシャーガス病（American Chagas'disease）（Trypanosoma cruzi）、アフリカ睡眠病（ African sleeping sickness）（T．brucei gambienseおよびT.b.rhodesiense）、東方腫（oriental sore）（Leishmania tropica）、カラ・アザール（kala az ar）（L．donovani）、および粘膜皮膚リーシュマニア症（mucocutaneous leish maniasis）（L．brasiliensis）の作因である。その他は、植物（phytomonas種）、昆虫（CrithidiaおよびLeptomonas種）および家畜（T．congolense、T．b． brucei，T．evansi）といったように、種々の宿主に感染する。ヒト病原体の多くは、野生生物に固有でもある。全世界で、３０００万人以上がトリパノソーマおよびリーシュマニア（Leishmania）に感染していると見積もられる（世界保健機構、１９９６）。ワクチン接種戦略は、今日まで失敗に終わっており、治療のために現在用いられている化学療法薬のほとんどが効能および毒性の両方に関して、不十分である（Risse，1993）。例えば、シャーガス病の治療に広く用いられている薬剤であるニフルチモックス（Nifurtimox）は、過酸化物感受性寄生生物だけでなく、宿主にも影響を及ぼす非特異的レドックスサイクラーである。したがって、類似の宿主代謝と実質的に異なるトリパノソーマ類における酸化物質に対する防御機構は、より特異的な殺トリパノソーマ薬の開発にとって可能性のある標的領域として論じられてきた（Fairlamb，1996;Jacoby et al.，1996）。寄生生物として、トリパノソーマ類は、宿主防御反応中に生成される種々の反応性酸素種、例えばスーパーオキシドラジカル（superoxide radical）、過酸化水素（hydrogen peroxide）およびミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）生成物に不可避的に曝露される。しかしながら、このような酸化ストレスに対処するそれらの能力は、意外に弱いと考えられる。それらは貪食細胞由来のスーパーオキシドを掃去するための鉄含有スーパーオキシドジスムターゼ（superoxide dismutase）を有する（LeTrant et al.，1983）が、それらのほとんどが、宿主生物体の主要ヒドロペルオキシド（hydroperoxide）代謝酵素である（Chance et al.，1979;Flohe，1989）カタラーゼ（catalase）とグルタチオンペルオキシダーゼ（glutathione peroxidase）の両方を欠く（Docampo ，1990）。それらは、哺乳類細胞における主要な抗酸化剤スルフヒドリル（sulf hydryl）化合物であるグルタチオン（ＧＳＨ）も著しく低濃度で含有する。その代わりに、それらは、トリパノチオン（trypanothione）（Ｔ（ＳＨ）₂；Ｎ¹，Ｎ⁸−ビス（グルタチオニル）スペルミジン）（図１）として知られる独特のＧＳＨ誘導体を生成するが、これは、それらの抗酸化防御機構で中心的役割を演じると考えられる（Fairlamb et al.，1985;Fairlamb and Cerami，1992）。Ｔ（ＳＨ）₂はＨ₂Ｏ₂により酸化されて対応する環状ジスルフィド（ＴＳ₂）（図１）に酸化されることができ、トリパノチオンレダクターゼ（trypanothione reduct ase）（ＴＲ；Bailey et al.，1993;Jacoby et al.，1996）によりＮＡＤＰＨを消費して再生される（図１）。しかしながら、Ｔ（ＳＨ）₂のＨ₂Ｏ₂との該反応が酵素により触媒されるか否かは、論議の対象であった。Ｔ（ＳＨ）₂依存性ペルオキシダーゼ活性は、トリパノソーマ類の粗抽出物に関して繰り返し報告された（Penketh and Klein，1986;Henderson et al.，1987;Penketh et al.，1987 ）。しかしながら、関連する酵素的存在は精製されず（Henderson et al.，1987 ;Penketh et al.，1987）、その存在についての疑問が提起された（Penketh and Klein，1986）。T．cruziの種々の発育段階についての近年の系統的研究は、Ｈ₂ Ｏ₂によるＴ（ＳＨ）₂の非酵素的酸化がこの種における緩慢なヒドロペルオキシド代謝十分説明し得るかもしれないとさえ、結論した（Carnieri et al.，199 3）。本発明はトリパノソーマ類におけるヒドロペルオキシド代謝が事実上酵素的であるが、しかし宿主生物のいかなる既知の代謝経路とも異なるという発見（Nogo ceke et al.，1997）に基づいている。従来から知られているトリパノチオンレダクターゼ（ＴＲ）とは別に、寄生生物的経路は、トリパレドキシン（trypared oxin）(ＴＸＮ）およびトリパレドキシンペルオキシダーゼ（tryparedoxin pero xidase）（ＴＸＮＰｘ）と呼ばれる２つの新規のタンパク質を包含し、これらは共に、図１に示したようにＮＡＤＰＨを消費してヒドロペルオキシドの還元を触媒する。トリパレドキシンの異性体（isoform）は、１つの種に存在する。オキシドレダクターゼのこのカスケードの独自性は、宿主生物体に副作用を引き起こさずに、該寄生生物の代謝を阻害する可能性を提供する。したがって、本発明の一実施態様は、我々がトリパレドキシン（トリパノチオン：ペルオキシレドキシンオキシドレダクターゼ）と名付けた、そしてトリパノチオンの還元等量をペルオキシレドキシン（peroxiredoxin）型タンパク質、例えばトリパレドキシンペルオキシダーゼに転移するそれらの能力を特徴とするタンパク質に関する。ペルオキシ−レドキシンおよびペルオキシ−レドキシン型タンパク質に関しては、Chae等（J．Biol．Chem.，269（1994）27670-24678および PNAS USA，91（1994）7017-7021）、およびＥＰ９６１２００１６．９号またはＰＣＴ／ＥＰ９７／０４９９０を参照とする。トリパレドキシンは、多発現的機能を有する普遍的なレドックス媒介物質であるチオレドキシン触媒部位と同様の触媒部位を示す。典型的なチオレドキシンは、いかなるトリパノソーマ類にも見出されていない。したがって、トリパノソーマ類では、トリパレドキシンは、細胞のチオール／ジスルフィド平衡に依存する、リボヌクレオチドの還元、分化、転写調節またはその他の調節作用のような種々の代謝機能において、チオレドキシンの代わりに用いられると考えられる。トリパレドキシンの多様な生物学的機能の可能性はさらに、下記のように、同一種における一つ以上のトリパレドキシンの共存によっても示唆される。本発明のタンパク質は、トリパノソーマ科の一つの種を用いて調製され得る、および／またはそれから単離され得ることを特徴とする。さらに、本発明のタンパク質は、それらの調製および／または単離が遺伝子工学により、特にオリゴヌクレオチド配列を有し、配列番号：１（図２）のアミノ酸配列またはそのあらゆる有用な部分をコードするプローブとしてオリゴヌクレオチドを用いて実施され得ることを特徴とする。さらに、本発明のタンパク質は、１５〜１９ｋＤａの分子量を特徴とすることができる。さらに、本発明のタンパク質は、ＷＣＰＰＣモチーフと、トリパノチオンによりタンパク質ジスルフィド結合の還元を触媒することとを特徴とすることができる。さらに、本発明のタンパク質は、（ａ）アミノ酸配列、配列番号：２（図３、位置１〜１５０）を有するか、または（ｂ）当該（ａ）と相同であり、配列番号：２と同数か、少ないか、わずかに少ないかまたはより多いアミノ酸を有し、アミノ酸配列、配列番号：１または配列番号：２を包含するかまたは有するタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であることができる。さらに、（ｂ）のタンパク質は、配列番号：１または配列番号：２と少なくとも７０％、特に少なくとも７５％相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質であることができる。本発明の別の実施態様は、前記のいずれかのタンパク質の発現のためのおよび当該タンパク質をコードする核酸配列を包含するプラスミドに関する、。本発明のプラスミドは、特にCrithidia fasciculataのトリパレドキシンをコードするＤＮＡ配列を包含し得る。さらに、本発明のプラスミドは、それ自体既知の方法で単離するために設計される、機能的に有効なトリパレドキシンの誘導体をコードするＤＮＡ配列を包含し得る。さらに、本発明のプラスミドは、該トリパレドキシンがＨｉｓタグにより誘導体化される、機能的に有効なトリパレドキシンの誘導体をコードするＤＮＡ配列を包含し得る。本発明のさらに別の実施態様は、それ自体既知の方法で遺伝子工学により配列番号：２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて産生されることを特徴とする本発明のタンパク質の製造方法に関する。本発明の方法は、該製造が本発明のプラスミドを用いて実行されることを特徴とすることができる。さらに、本発明の方法は、宿主が細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および細胞培養（異種発現）から成る群から選択されることを特徴とすることができる。さらに、本発明の方法は、大腸菌（E.coli）が宿主として用いられることを特徴とすることができる。本発明のさらに別の実施態様は、当該タンパク質の活性を阻害する阻害物質を試験し、回収するための本発明のタンパク質の使用に関する。本発明のさらに別の実施態様は、本発明のまたは本発明の方法により得られるタンパク質の触媒活性を試験するための試験系であって、それぞれ、トリパノチオン、トリパノチオンレダクターゼ、トリパレドキシンペルオキシダーゼ、トリパレドキシン、そしてさらに、指示薬酵素としてのヒドロペルオキシド、媒介物質、および基質を含有または包含する試験系に関する。最後に、本発明の別の実施態様は、殺トリパノソーマ活性を有し、本発明のタンパク質、または本発明の方法により得られるタンパク質の触媒活性を阻害する阻害物質から成る薬剤に関する。本発明の薬剤は、本発明の使用により、そして本発明の試験系の使用により得られることを特徴とすることができる。本発明を以降、図および実施例により詳細に説明する。図１．C．fasciculataにおけるＮＡＤＰＨからヒドロペルオキシドへの還元当量の変化ＴＲ＝トリパノチオンレダクターゼ（trypanothione reductase）Ｔ（ＳＨ）₂＝トリパノチオン（trypanothione）ＴＳ₂＝トリパノチオンジスルフィド（trypanothione disulphide）ＴＸＮ＝トリパレドキシン（tryparedoxin）ＴＸＮＰｘ＝トリパレドキシンペルオキシダーゼ（tryparedoxin peroxidase）ＲＯＯＨ＝ヒドロペルオキシド図２．トリパレドキシンＩ遺伝子を含むインサートを目的として、ゲノムライブラリーを選別するために用いたＰＣＲ産物の核酸配列及び推定アミノ酸配列タンパク配列分析により確認された部分配列は下線で、ＰＣＲ産物を得るために用いたプライマーに相当する配列は二重下線で示す。図３．C．fasciculataのゲノムライブラリーから単離されたトリパレドキシンＩＩの核酸配列及びアミノ酸配列開始コドン及び停止コドンは太字で示す。ＰｖｕＩＩ部位の位置は二重下線で表示する。ＰｖｕＩＩ部位から、オープンリーディングフレームの５’末端側遺伝子の三分の一を配列決定した。ＷＣＰＰＣチオレドキシン様のモチーフは下線で示す。図４．銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８−２５％）における、C．fasciculata由来の、トリパノチオンが介するヒドロペルオキシド代謝系の構成因子レーン２：細胞破砕抽出物レーン３：トリパノチオンレダクターゼ（trypanothione reductase）レーン４：トリパレドキシンペルオキシダーゼ（tryparedoxin peroxidase）レーン５：トリパレドキシンＩ（tryparedoxin I）レーン１及び６：分子量標準物質図５．C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩ純品（トレースＡ）、ヨードアセトアミド（iodoacetamide）処理したトリパレドキシンＩ（トレースＢ）、ヨードアセトアミド（iodoacetamide）で誘導体化したＴ（ＳＨ）₂−還元トリパレドキシンＩ（トレースＣ）、及びヨードアセトアミド（iodoacetamide）とN-エチルマレイミド（N-ethyl maleimide）で誘導体化したトリパノチオン−還元トリパレドキシンＩ（トレースＤ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる分子量決定トレースＣ及びトレースＥに見られる質量増加はそれぞれ、１分子のカルボキシアミドメチル基（得られた値は５４Ｄａ、理論値５７Ｄａ）、及び１分子のカルボキシアミドメチル基と１分子のN-エチルスクシンイミド基（得られた値は１８５Ｄａ、理論値１８２Ｄａ）の付加に相当する。図６，C．fasciculataから単離した因子で再構成したＮＡＤＰＨ依存性ヒドロペルオキシド代謝ペルオキシダーゼ活性は、トリパノチオン（Ｔ（ＳＨ）₂）（Ｅ）とトリパノチオンレダクターゼ（ＴＲ）（Ｆ）の他に、単離されたタンパク質であるトリパレドキシンＩ（ＴＸＮＩ）（Ａ）とトリパレドキシンペルオキシダーゼ（ＴＸＮＰｘ）（Ｂ）の両方に依存する。（Ｆ）においてトリパノチオンレダクターゼ（ＴＲ）添加後即時にみられる比較的高い活性は、その基質であるトリパノチオンジスルフィド（ＴＳ₂）の蓄積によるものである。その反応は、Ｈ₂Ｏ₂（Ｄ）とｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ｂＯＯＨ）（ｃ）とに匹敵するくらい早い。試験は０．１ｍＭＮＡＤＰＨ、１６．５μｇ／ｍｌトリパレドキシンペルオキシダーゼ、１２μｇ／ｍｌトリパレドキシンＩ、４５μＭトリパノチオン（Ｔ（ＳＨ）₂）、４５μＭヒドロペルオキシド、及び０．４Ｕ／ｍｌトリパレチオンレダクターゼ（ＴＲ）を用いて、２７℃で行った。ＮＡＤＰＨの消費量は３４０ｎｍの波長で光学的に測定した。図７．トリパレドキシンＩのペプチド断片と，Caenorhabditis elegansのチオレドキシン様タンパク質（ＴＬＰ／ＣＥ）の配列表トリパレドキシンＩはトリプシン（Ｔｒｙｐ）又はエンドプロテアーゼＧｌｕ −Ｃ（Ｇｌｕ−Ｃ）で消化した。^★は保存されている残基を示す。図８．大腸菌E.coli BL21(DE3)pET/T24a細胞（■）及び大腸菌E.coli BL21(DE3) pET/TXN II H6細胞（●）を音波で破砕した細胞上清中の、Ｈｉｓタグ特異的な活性を有するトリパレドキシンＩＩの測定矢印はイソプロピル−β-D-チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D-thioga lactopyranoside）添加による遺伝子の発現誘導を示す。図９．Ｈｉｓタグを含む、発現させたトリパレドキシンＩＩのウエスタンブロット解析ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下、８−２５％のグラジエントゲル中で、ファルマシアファストシステム（Pharmacia Phast System）を使用して実施し、そのサンプルをファルマシアファストシステム（Pharmacia Phast System）を使用して、ＰＶＤＦ膜上に転写した。C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩ純品に対する抗体を含むウサギ全血清（１：５００希釈）を第一抗体とし、抗ウサギヤギ抗体（Sigma）を第二抗体として用いた。レーン１；誘導６時間後の大腸菌E.coli BL21(DE3)pET/TXN II H6細胞上清レーン２；精製した組換え体トリパレドキシンＩＩレーン３；C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩ図１０．大腸菌E.coli BL21(DE3)pET/T24a細胞（■）及び大腸菌E.coli BL21(DE 3)pET/TXN II細胞（◆）を超音波で破砕した細胞上清中のトリパレドキシンＩＩの比活性測定矢印はイソプロピル−β-D-チオガラクトピラノシド（isopropyl−β-D-thiog alactopyranoside）添加による遺伝子の発現誘導を示す。図１１．発現させたトリパレドキシンＩＩのウエスタンブロット解析ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下、８−２５％のグラジエントゲル中で、ファルマシアファストシステム（Pharmacia Phast System）を使用して実施し、そのサンプルをファルマシアファストシステム（Pharmacia Phast System）を使用して、ＰＶＤＦ膜上に転写した。C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩ純品に対する抗体を含むウサギ全血清（１：５００希釈）を第一抗体とし、抗ウサギヤギ抗体（sigma）を第二抗体として用いた。レーン１：C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩレーン２：誘導６時間後の大腸菌E.coli BL21(DE3)pET/TXN II 細胞の上清図１２．Ｈｉｓタグを含む、発現させたトリパレドキシンＩＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下、８−２５％のグラジエントゲル中で、ファルマシアファストシステムを使用して実施し、そのゲルをタンパク質（検出）のため指示書に従って銀染色した。レーン２：誘導６時間後の大腸菌E.coli BL21(DE3)pET24a細胞上清レーン２：誘導６時間後の大腸菌E.coli BL21(DE3)pET/TXN II H6細胞上清レーン３：精製した組換え体トリパレドキシンＩＩレーン４：C．fasciculata由来のトリパレドキシンＩレーン１及び６；分子量標準物質実施例１．C．fasciculataからのトリパレドキシンの単離 C．fasciculataを、記載（Shim and Fairlamb，1988）のように１００ｌ発酵器中で培養した。該細胞を後期対数期に回収し、０．１ｍＭＰＭＳＦを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８（緩衝液Ｂ）中に懸濁し、次に凍結、融解を２回おこなって、細胞破裂を完了した。２５，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞破砕屑を除去し、緩衝液Ｂで予備平衡化したＳ−セファロースカラム上に上清を付した。トリパレドキシンペルオキシダーゼは緩衝液Ｂ中で１５０ｍＭＮａＣｌで溶離した。それを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で予備平衡させたヒドロキシアパタイト（BioRad，USA）カラム上に直接載せた。トリパレドキシンペルオキシダーゼを、０．４Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．８で段階的に溶離した。該タンパク質は、２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６（緩衝液Ｃ）に対して徹底的に透析して、Resource Qカラム上で均質に精製し、緩衝液Ｃ中で０．１ＭＮａＣｌで溶離した。トリパノチオンレダクターゼおよびトリパレドキシンを含有するＳ−セファロースカラムのフロースルーを用いて、トリパレドキシンペルオキシダーゼの酵素活性を測定し得る（実施例２参照）。トリパノチオンレダクターゼおよびトリパレドキシンを含有するＳ−セファロースカラムの該フロースルーを、１ＭＮａＯＨを用いてｐＨ７．２に調整した。該抽出物を３％（ｗ／ｖ）硫酸ストレプトマイシンに調整し、５０％硫酸アンモニウム飽和液にして、１１，０００×ｇで１０分間遠心分離した。その上清を８０％硫酸アンモニウム飽和液に調製して、再遠心分離した。そのペレットを１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴを含有する２０ｍＭビス−Ｔｒｉｓ−プロパン、ｐＨ７．２（緩衝液Ｄ）に溶解し、次に、緩衝液Ｄに対して徹底的に透析した。その酵素抽出物をＤＥＡＥ−セファロースカラムに載せて、緩衝液Ｄ中の０．４ＭＫＣｌの線状勾配で溶離した。８０〜１２０ｍＭＫＣｌで溶離する試料を限外濾過（Omegacell，Filtron，Germany）により濃縮し、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴを含有する２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２（緩衝液Ｅ）で洗浄し、２’５’ＡＤＰ−セファロース４Ｂカラムに載せた。トリパノチオンレダクターゼを緩衝液Ｅ中の５ｍＭＮＡＤＰで溶離し、Sephacryl S-200カラム上で精製して均質にした。非結合分画を限外濾過により濃縮し、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＤＴＴを含有する５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．６中でUltrogel AcA54 （LKB，Sweden）ゲル濾過カラム上で分画して、均質トリパレドキシンを得た。このようにして単離された真正トリパレドキシンを、トリパレドキシンＩ（ＴＸＮＩ）と呼称する。最終的な精製概要の最初から最後までの収量を、表１に示す。表１トリパレドキシンＩの単離過程における収量と精製係数均質な生成物を産出する精製因子を基本とすると、出発物質中のトリパレドキシンおよびトリパレドキシンペルオキシダーゼの最小濃度は、それぞれ可溶性タンパク質総量の５％および６％と概算された。該精製したタンパク質の均質性およびおよその分子量を、図４に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定される見かけのサブユニット質量（約１６０００）は、ＭＡＬＤＩにより得られた値、１６３９３±１０と矛盾しない（図５）。該２つのタンパク質のスペクトル特性の分析は、可視領域で吸収を示すあらゆる発色団的補助因子の非存在を実証した。実施例２：トリパレドキシン活性の測定本質的に、トリパレドキシン活性は、トリパレドキシンペルオキシダーゼに媒介されるヒドロペルオキシドの触媒的還元を、トリパノチオンおよびトリパノチオンレダクターゼによるＮＡＤＰＨ消費に結びつけることにより測定される。例えば、検定試料は、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ＭＨ₂Ｏ₂またはｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ｂＯＯＨ）、４５ＭＴ（ＳＨ）₂ 、１６．５μｇ／ｍｌトリパレドキシンペルオキシダーゼおよび０．３４Ｕトリパノチオンレダクターゼ中の０．１ｍＭＮＡＤＰＨと、未知量のトリパレドキシンとを含有し得る。別記しない限り、該反応はヒドロペルオキシドの付加により開始される。ジヒドロ−トリパノチオンは、記載（Fairlamb et al.，1986 ）のようにＴＳ₂（Bachem，Switzerland）の化学的還元により得られる。ｔ−ＢＯＯＨは、他のヒドロペルオキシド、例えばＨ₂Ｏ₂、リノール酸ヒドロペルオキシドまたはホスファチジルコリンヒドロペルオキシドに置き換えられ得る。図６は、トリパノチオンレダクターゼ、Ｔ（ＳＨ）₂、トリパレドキシンおよびトリパレドキシンペルオキシダーゼが、ＮＡＤＰＨによるＨ₂Ｏ₂またはアルキルヒドロペルオキシドの効率的な還元に不可欠であることを示す。したがって、 C．fasciculataのＴ（ＳＨ）₂媒介性「ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ活性」は、３つの異なるタンパク質の協調作用、即ち十分特性化されたトリパノチオンレダクターゼ（Bailey et al.，1993）、トリパレドキシンおよびトリパレドキシンペルオキシダーゼにより達成される。実施例３：部分タンパク質シーケンシングによるトリパレドキシンＩの特性化該トリパレドキシンＩのＮ−末端はブロックされているため、StoneとWilliam s（1993）にしたがって、ウシトリプシンまたは黄色ブドウ球菌（Staphylococcu s aureus）からのエンドプロテアーゼであるＧｌｕ−Ｃ（ともにシーケンシング等級、promega）のいずれかで該タンパク質を消化した。Aquapore OD-300 RP-18 カラム上でのＨＰＬＣ（Applied Biosystems 172A）により、ペプチドを分離した。オンラインＣ−１８逆相ＨＰＬＣにより、Applied Biosystems，Inc.，シーケンサーを用いて、自動エドマン分解を実施した。データベース検索は、ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラムを用いて実施した。Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Genetilcs Computer Group（GCG）,Madison，Wisconsin，USA）により、ペプチドを配列比較した。７つの断片をシーケンシングし、C．elegansのチオレドキシン様タンパク質と並列対応することができた（図７）。実施例４：コードするＤＮＡ推定のためのトリパレドキシンＩのシーケンシング断片の使用細胞培養およびＤＮＡ抽出：ShimとFairlamb（1988）が記載したように、C．f asciculata（ＨＳ６）を増殖させた。７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して該細胞を回収し、食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で２回洗浄し、５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。再懸濁細胞を５０℃で４０分間予備インキュベートした。ゲノムＤＮＡを等容量のフェノールで２回抽出し（インキュベーション：６０℃で４５分；遠心分離：４５００ｒｐｍで２０分）、ついでフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）およびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。ゲノムＤＮＡを酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび配列分析：トリパレドキシンＩのペプチド配列に基づき（Nogoceke et al.，1997）、縮退オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。０．２μｇのC．fasciculataゲノムＤＮＡを鋳型として、５μ１の１０×反応緩衝液、３μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、各々１μｌの１０μＭｄＮＴＰ、各々１００ｐｍｏｌのプライマーおよび０．２５ＵＴａｑポリメラーゼを用いてGeneAmp PCR Coreキット（Perkin Elmer）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施した。５２℃のアニーリング温度を用いた。該ＰＣＲ産物をアガロースゲルにより分析し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（QIAGEN Inc.）を用いて精製した。PRISM Ready Reaction Dy eDeoxyターミネーターシーケンシングキット（１５５０Ｖ、１９ｍＡ、３０Ｗ、４２℃）を用いて、３７３ＡＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems）上で、シーケンシングを実施した。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合は、該ＰＣＲ産物を、供給元が提供した使用説明書にしたがって、ＤＩＧＤＮＡラベリングキット（Boehringer Mannheim）を用いて、ジゴキシゲニンで標識した。ライブラリー構築およびスクリーニング法：ゲノムＤＮＡを、０．００５のＳａｕ３Ａ／μｇＤＮＡの比率単位で、５〜３０分間、部分的に消化した。アガロースゲル上の電気泳動により、消化の効率をモニタリングした。StrataClean樹脂（stratagene）を用いて、ＤＮＡからタンパク質を取り出した。Ｓａｕ３Ａ部位をｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ、ならびにクレノウ断片で部分的に再充填（refill）した。該ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ（平均サイズ１５ｋｂ）のモル比１：０．７で、ラムダＧＥＭ−１１ＸｈｏＩハーフサイトアーム（prom ega）にライゲーションした。供給元の使用説明書にしたがって、PackageneラムダＤＮＡパッケージングシステム（promega）を用いて、ライゲーションしたＤＮＡをパッケージした。標準プロトコールにより、ファージを用いて大腸菌（E. coli）宿主ＬＥ３９２株（Promega）を感染させた。５．１ｘ１０³ｐｆｕのゲノムライブラリーを寒天上に播種した。プラークを直径９ｃｍのBiodyne-Aナイロン膜に移して、供給元の使用説明書にしたがって、しかし５４℃のハイブリダイゼーション温度を用いて、ＤＩＧ標識ＰＣＲプローブを用いてスクリーニングした。ＤＩＧ核酸検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて、比色法により、ＤＩＧ標識核酸を検出した。陽性クローンを再スクリーニングし、増幅して、ＳＭ緩衝液中に懸濁した。ＰＥＧ８０００によりファージを沈殿させて、ＣｓＣｌ勾配中で精製した。単離したＤＮＡは、制限分析用（ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ）に、またはＰＣＲ反応用の鋳型として用いた。消化生成物をアガロースゲルから溶離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋／−）ファージミド（Stratagene）またはｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクター（Novagen）にライゲーションした。該ライゲーションしたＤＮＡを用いて、大腸菌（E.coli）ＬＥ３９２を形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋／−）ファージミド）またはカナマイシン（ｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクター）耐性により選択し、プラスミドをQIApre pスピンプラスミドキット（Qiagen Inc.）を用いて精製し、制限酵素消化およびシーケンシングにより分析した。 C．fasciculataからのトリパレドキシン遺伝子の単離およびシーケンシング：C．fasciculataの単離トリパレドキシンＩから得られシーケンシングしたペプチド断片（Nogoceke et al.，1997）は、Caenorhabditis elegansのチオレドキシン様タンパク質の確定された推定アミノ酸配列に並列対応することができた。これにより、該C．fasciculataゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物の生成のための適切な縮退ＰＣＲプライマーを設計することができた。トリパレドキシンＩの約５０％をコードする（図２）このＰＣＲ産物は、トリパレドキシンＩをコードする全長ＤＮＡを含有する挿入物を得るためのゲノムライブラリーをスクリーニングするために次に用いられた。推定トリパレドキシンＩ遺伝子を有する２２ｋｂ挿入物を含有するクローンを単離した。そのＤＮＡを、挿入物からファージアームを分離するために制限酵素ＳａｃＩで消化し、そして制限酵素ＮｃｏＩを用いて消化した。サザンブロットを実施し、６ｋｂの断片を標識ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションした。該断片は、ｐＥＴ２４ｄ（＋）ベクター（No vagen）中にサブクローニングした。その後制限酵素ＰｖｕＩＩでクローン化断片を消化して、１ｋｂ断片を単離し、クローニングした。この断片をシーケンシングすると、それは、オープンリーディングフレームの５’末端のトリパレドキシンをコードする遺伝子の３分の１だけを含有していた（図３）。このようにして得られた該ＤＮＡ配列は、単離トリパレドキシンＩから得られたペプチド配列と完全に一致した。実施例５：新規のトリパレドキシン遺伝子（ＴＸＮＩＩ）の単離実施例４から得られた情報を用いて、新規のプライマーを設計し、完全遺伝子を６ｋｂ断片から直接シーケンシングした。先に得られたＰＣＲ産物は、単離した遺伝子の対応する領域と、そのアミノ酸配列が約６０％同一である。全長をコードするＤＮＡおよびその推定アミノ酸配列を図３に示す。該遺伝子は分子量１７０００のタンパク質をコードするが、一方、C．fasciculataから単離される天然トリパレドキシンＩの分子量は１６３９３±１０である（Nogoceke et al.,19 97）。実施例６:大腸菌におけるトリパレドキシンＩＩの異種発現クローン化した６ｋｂ断片に含有されるトリパレドキシン遺伝子を、ＮｄｅＩ部位を含有し、コード配列の５’末端と重複する前方プライマ−Ａ(5'-TCG TG A TTC CGT TCC GCA TAT GTC AGG GC-3')と、コード配列の３’末端と重複し、ＸｈｏＩ部位を含有する逆プライマーＢ(5-GCA ACT CAA TCG CTC CCC TCG AGC TT C TTG GCC TCC-3')を用いてＰＣＲにより増幅した。その結果、ロイシンおよびグルタミン酸残基が付加し、停止コドンは欠失して、タンパク質はそのカルボキシル末端に６個のヒスチジン残基を含有するようになる。前記のように増幅を実施したがしかし、Expand High Fidelityポリメラーゼ混合物および緩衝液（Boeh ringer Mannheim）を用い、５０℃のアニーリング温度をとし、伸長温度を１０〜２０周期の間、１０秒増分／周期で増大させた。増幅したコード領域をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同一酵素で処理して、脱リン酸化したｐＥＴ２４ａ（＋）ベクター（Novagen）にライゲーションした。その結果生じたプラスミド（ｐＥＴ／ＴＸＮＩＩＨ６）を用いて、E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換細胞をカナマイシン耐性により選択し、該プラスミドを精製し、シーケンシングした。同一手順で、しかし逆プライマーＢの代わりに逆プライマーＣ（5'-CAG CAA C TC AAT GGA TCC TCA TTA CTT CTT GGC C-3'）を用いてトリパレドキシンＩＩを発現させたが、カルボキシル末端に変化は認められなかった。この場合、該逆プライマーは余分の停止コドンおよび該余分の停止コドンの５’末端のＢａｍＨＩ部位を含有し、クローニング工程のための消化はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて実施された。その結果生じたプラスミドはｐＥＴ／ＴＸＮＩＩと呼称し、これを用いてE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。該形質転換細胞をカナマイシン耐性により選択し、該プラスミドを精製し、シーケンシングした。 E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ／ＴＸＮＩＩＨ６を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、２５℃で１８０ｒｐｍでＡ₆₀₀が０．９〜１．０になるまで増殖させ、次に１ｍＭイソプロピル− −Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いてトリパレドキシンＩＩ遺伝子の発現を誘導した。ｐＥＴ２４ａプラスミドを含有するE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を、同一方法で増殖させた。異なる時点で採取した試料を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁し、音波処理して、遠心分離した。No goceke et al.，（1997）の方法と同様に酵素活性を測定し、標準物質としてのウシ血清アルブミンとともにクーマシーブリリアントブルー−Ｇ試薬（BioRad）を用いてタンパク質濃度を決定した。形質転換した細菌の誘導後、トリパレドキシン活性の顕著な増大が音波処理した細胞の上清で検出された。活性は誘導後６時間で最大になるまで増加し、対照では活性は見出されなかった（図８）。誘導により、見かけの分子量１８０００の新規のタンパク質が蓄積し、これは純粋C ．fasciculataトリパレドキシンＩにする抗トリパレドキシン抗体で認識された（図９）。 E.coli ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ／ＴＸＮＩＩを、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、２５℃で１８０ｒｐｍでＡ₆₀₀が０．９〜１．０になるまで増殖させ、次に１ｍＭイソプロピル− −Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いてトリパレドキシンＩＩ遺伝子の発現を誘導した。ｐＥＴ２４ａプラスミドを含有するE.coliＢＬ２１（ＤＥ３）を、同一方法で増殖させた。異なる時点で採取した試料を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁し、音波処理して、遠心分離した。Nogoceke e t al.，（1997）の方法と同様に酵素活性を測定し、標準物質としてのウシ血清アルブミンとともにクーマシーブリリアントブルー−Ｇ試薬（BioRad）を用いてタンパク質濃度を決定した。形質転換した細菌の誘導後、トリパレドキシン活性の顕著な増大が音波処理細胞の上清で検出された。活性は誘導後６時間で最大になるまで増加し、対照では活性は見出されなかった（図１０）。誘導により見かけの分子量１８０００の新規のタンパク質が蓄積し、これは純粋C．fasciculata トリパレドキシンＩに対する抗トリパレドキシン抗体で認識された（図１１）。実施例７：組換えトリパレドキシンＩＩの精製および特性化 E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ／ＴＸＮＩＩＨ６を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、２５℃および１８０ｒｐｍでＡ₆₀₀が０．９〜１．０になるまで増殖させ、次に１ｍＭイソプロピル− −Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いてトリパレドキシンＩＩ遺伝子の発現を誘導した。６時間後、該培養液を遠心分離し、−２０℃で保存するか、または０．０５培養容積の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）中に再懸濁した。該細胞懸濁液を氷上で音波処理し、１３０００ｒｐｍで、４℃で４０分間、遠心分離した。Ｎｉ²⁺でチャージし、結合緩衝液で平衡化したHis結合樹脂（Novagen）カラムに、約１０カラム容量／時間の流量で上清を付した。該カラムを１０容量の結合緩衝液および１００ｍＭイミダゾールを含有する６容量の５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ７．９緩衝液で洗浄した。トリパレドキシンは、５００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液中に溶離した。活性画分を貯留し、ただちに１ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭＥＤＴＡを含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６の緩衝液に対して、透析した。トリパレドキシンＩＩは５００ｍＭイミダゾールで溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の銀染色により、純粋であることが示された（図１２）。このタンパク質のＮ−末端のシーケンシングにより、最初のメチオニンが欠失していることが示され、我々は最初の２０個のアミノ酸を確定することができた。発現したトリパレドキシンＩＩはＳＤＳ−ＰＡＧＥで約１８０００の分子量を示し（図１２）、真正トリパレドキシンＩよりわずかに大きかった。組換え体と真正トリパレドキシンペルオキシダーゼとの分子量の差は、主に組換え酵素のＣ− 末端に付加された付加アミノ酸（ロイシン、グルタミン酸および６個のヒスチジン残基）に相当した。該精製組換え酵素は、真正酵素の２．３Ｕ／ｍｇに比して、７．７Ｕ／ｍｇの比活性を有した。実施例８：阻害試験実施例２に記載した試験系は、トリパレドキシンＩの特異的阻害に関する化合物をスクリーニングするのに容易に適応される。一例として、Ｓ−修飾剤、例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）およびフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）によるトリパレドキシンペルオキシダーゼの阻害について述べる（表２）。５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６中で、推定還元基質（Ｔ（ＳＨ）₂）を用いて、または用いずに、トリパレドキシンを予備インキュベートした後、阻害剤と反応させて、本質的に実施例２に記載したようにして、２２℃で活性を調べた。分子量の変化を、ＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ−ＭＳにより確定した（図５）。表２トリパレドキシン誘導体化概要５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６中で、推定還元基質を用いてトリパレドキシンを予備インキュベートした後、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、ＮＥＭまたはフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）と反応させた。分子量の変化を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確定した。１ｍＭＴ（ＳＨ）₂ を１．０μＭトリパレドキシンペルオキシダーゼおよび０．６μＭトリパレドキシンとともに用いて、２２℃で活性を測定した。 ^a 非還元条件下で保存。 ^b 括弧内の値は予測質量増分を示す。 ^c １分子の誘導剤。 ^d ２分子の誘導剤。 ^e 可逆的阻害；活性は試験の時間内に回復した。本開示はＥＰ９６１２００１５．１号の開示も包含する。そのコピーを添付する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/28 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人マリサ・モンテマルティーニドイツ連邦共和国Ｄ―38124 ブラウンシュバイクマッシェローダーヴェーク１ (72)発明者レオポルト・フローエドイツ連邦共和国Ｄ―38124 ブラウンシュバイクマッシェローダーヴェーク１ (72)発明者エヴァーソン・ノヘセケドイツ連邦共和国Ｄ―38124 ブラウンシュバイクマッシェローダーヴェーク１ (72)発明者ヘンリック・カリスドイツ連邦共和国Ｄ―38124 ブラウンシュバイクマッシェローダーヴェーク１ (72)発明者マリサ・モンテマルティーニドイツ連邦共和国Ｄ―38124 ブラウンシュバイクマッシェローダーヴェーク１

Claims

【特許請求の範囲】１．トリパノチオン（Ｔ（ＳＨ）₂）の還元当量をペルオキシレドキシンに転移させる能力を特徴とするタンパク質。２．トリパノソーマ科の一つの種から調製される、および／またはそれから単離され得ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のタンパク質。３．調製および／または単離が遺伝子工学により、特に下記の配列、配列番号：１のオリゴヌクレオチドまたはその一部により、あるいはプローブとしての以下の配列、配列番号：１の部分配列、特にプローブが前記配列上の単一または二重線の部分を特徴とする配列番号：１の部分配列により実施され得ることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載のタンパク質：４．１５〜１９ｋＤａの分子量を特徴とする先行する請求の範囲のいずれかに記載のタンパク質。５．請求の範囲第３項記載の配列番号：１のアミノ酸配列を包含するかまたは有するタンパク質。６．配列番号：２（図３）のアミノ酸配列を包含するかまたは有するタンパク質。７．ＷＣＰＰＣモチーフ（図３）と、トリパノチオン（Ｔ（ＳＨ）₂）によりタンパク質ジスルフィドの、特にペルオキシレドキシンの、特にトリパレドキシンペルオキシダーゼ（ＴＸＮＰｘ）の還元を触媒することとを特徴とする、先行する請求の範囲のいずれかに記載のタンパク質。８．以下の、（ａ）アミノ酸配列、配列番号：２（図３、位置１〜１５０）、を有するか、または（ｂ）当該（ａ）と相同であり、同数か、少ないか、わずかに少ないかまたはより多いアミノ酸を有し、そしてアミノ酸配列、配列番号：１または配列番号：２を有するタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な（１ＭＮａＣｌ濃度および少なくとも２５℃の温度で）オリゴヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する、タンパク質。９．当該請求の範囲第８項記載の（ａ）と少なくとも７０％、特に少なくとも７５％相同であるおよび／または配列番号：２とそのアミノ酸数が３０個まで、特に２５個まで、好ましくは２０個まで異なるアミノ酸配列を有する請求の範囲第８項記載の（ｂ）のタンパク質。１０．先行する請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載のタンパク質の発現のための、そして当該タンパク質をコードする核酸を包含するプラスミド。１１．特にCrithidia fasciculataの請求の範囲第８項記載のタンパク質(トリパレドキシン＝ＴＸＮ)をコードするＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第１０項記載のプラスミド。１２．それ自体既知の方法での単離を目的として設計された請求の範囲第８項記載のタンパク質（トリパレドキシン＝ＴＸＮ）の、機能的に有効な誘導体の発現のためのプラスミドであって、当該誘導体をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。１３．該トリパレドキシンがＨｉｓタグにより誘導体化される、請求の範囲第８項記載のタンパク質（トリパレドキシン＝ＴＸＮ）の機能的に活性な誘導体をコードするＤＮＡ配列を含有する請求の範囲第１２項記載のプラスミド。１４．配列番号：１のオリゴヌクレオチドまたはその任意の一部により、あるいは請求の範囲第３項記載のプローブとしての配列番号：１の配列の部分配列により、それ自体既知の方法で遺伝子工学により製造されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。１５．該製造が請求の範囲第１０項乃至第１３項のいずれかに記載のプラスミドにより実行されることを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。１６．宿主が細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または細胞培養（異種発現）から成る群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。１７．大腸菌が宿主として用いられることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。１８．前記タンパク質の活性を阻害する阻害物質を試験し、回収することを目的とする請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載の、あるいは請求の範囲第１４項乃至第１７項のいずれかに記載の方法により得られるタンパク質の使用。１９．請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の、または請求の範囲第１４項〜第１７項のいずれかに記載の方法により得られるタンパク質の触媒活性を試験するための試験系であって、それぞれ、トリパノチオン（Ｔ（ＳＨ）₂）、トリパノチオンレダクターゼ（ＴＲ）、トリパレドキシンペルオキシダーゼ（ＴＸＮＰｘ）、活性が試験されるタンパク質、そしてさらに、指示薬酵素としてのヒドロペルオキシド、媒介物質、および基質を含有または包含する試験系。２０．殺トリパノソーマ活性を有し、請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記載のタンパク質、または請求の範囲第１４項乃至第１７項のいずれかに記載の方法により得られるタンパク質の触媒活性を阻害する阻害物質を包含する薬剤。２１．請求の範囲第１７項または第１８項に記載の使用により、および／または請求の範囲第１９項に記載の試験系を使用することにより得られることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の薬剤。