JPH11299491A - 改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法 - Google Patents
改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 L-システインによる阻害を受け難くなったセ
リンアセチルトランスフェラーゼの提供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列において、51位のア
スパラギン以外のアミノ酸が14個以上欠失しており、51
位のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されているアミ
ノ酸配列からなるセリンアセチルトランスフェラーゼ；
前記のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子；前記のセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え
体DNA；前記の組み換え体DNAを含む形質転換体または形
質導入体；及び、前記の形質転換体または形質導入体を
培地に培養し、培養物からセリンアセチルトランスフェ
ラーゼを採取することを特徴とするセリンアセチルトラ
ンスフェラーゼの製造法。
リンアセチルトランスフェラーゼの提供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列において、51位のア
スパラギン以外のアミノ酸が14個以上欠失しており、51
位のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されているアミ
ノ酸配列からなるセリンアセチルトランスフェラーゼ；
前記のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子；前記のセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え
体DNA；前記の組み換え体DNAを含む形質転換体または形
質導入体；及び、前記の形質転換体または形質導入体を
培地に培養し、培養物からセリンアセチルトランスフェ
ラーゼを採取することを特徴とするセリンアセチルトラ
ンスフェラーゼの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、改変セリンアセチ
ルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及び改変セリン
アセチルトランスフェラーゼの製造法に関する。
ルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体DNA及び改変セリン
アセチルトランスフェラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】セリンアセチルトランスフェラーゼ(EC
2.3.1.30、以下、「SAT」と略称する。)は、微生物や高
等植物等においてはO-アセチルセリンスルフィドラーゼ
と共にL-システインの合成に関与している。これら両遺
伝子を微生物に組み込むことによってL-システインを効
率よく生産する試みがなされている（特開平9-9982号公
報）。
2.3.1.30、以下、「SAT」と略称する。)は、微生物や高
等植物等においてはO-アセチルセリンスルフィドラーゼ
と共にL-システインの合成に関与している。これら両遺
伝子を微生物に組み込むことによってL-システインを効
率よく生産する試みがなされている（特開平9-9982号公
報）。
【０００３】この際SATは、合成されたL-システインに
よって強くフィードバック阻害を受けるため、ここで用
いられるSATとしては、野生型のSATではなく、L-システ
インによるフィードバック阻害を受けない、あるいは受
け難くなった変異株より取得したSATを用いた方が効率
よくL-システインを生産することができると考えられ
る。
よって強くフィードバック阻害を受けるため、ここで用
いられるSATとしては、野生型のSATではなく、L-システ
インによるフィードバック阻害を受けない、あるいは受
け難くなった変異株より取得したSATを用いた方が効率
よくL-システインを生産することができると考えられ
る。
【０００４】しかしながら、 L-システインによるフィ
ードバック阻害を受け難くなった改変SATとしては、こ
れまでDenk等によって報告された256位のアミノ酸残基
がメチオニン残基からイソロイシン残基に変換された変
異SAT(J. Gen. Microbiol., 133, 515-525, (1987))、D
E 195 39 952 A1に記載の97位から273位迄のアミノ酸残
基を置換したもの、または227位以降の領域を欠失した
ものが知られているのみであり、これら改変SATにおい
ても、L-システインによる阻害は完全に解除されるに至
っていないのが実情である。
ードバック阻害を受け難くなった改変SATとしては、こ
れまでDenk等によって報告された256位のアミノ酸残基
がメチオニン残基からイソロイシン残基に変換された変
異SAT(J. Gen. Microbiol., 133, 515-525, (1987))、D
E 195 39 952 A1に記載の97位から273位迄のアミノ酸残
基を置換したもの、または227位以降の領域を欠失した
ものが知られているのみであり、これら改変SATにおい
ても、L-システインによる阻害は完全に解除されるに至
っていないのが実情である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
問題点を解決すべくなされたものであり、その目的とす
るところは、 L-システインによる阻害が更に緩和され
た改変SAT及びその生産手段を提供することにある。
問題点を解決すべくなされたものであり、その目的とす
るところは、 L-システインによる阻害が更に緩和され
た改変SAT及びその生産手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を行なった結果、天然型SAT
のアミノ酸配列からいくつかのアミノ酸を欠失させると
ともに、特定部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換させ
ることによって、前記のDenk等によって報告された変異
SAT及びDE 195 39 952 A1に記載のC末端欠失の改変SAT
よりも更にL-システインによるフィードバック阻害が緩
和されたSATを得て、本発明を完成させるに至った。
を解決するために鋭意研究を行なった結果、天然型SAT
のアミノ酸配列からいくつかのアミノ酸を欠失させると
ともに、特定部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換させ
ることによって、前記のDenk等によって報告された変異
SAT及びDE 195 39 952 A1に記載のC末端欠失の改変SAT
よりも更にL-システインによるフィードバック阻害が緩
和されたSATを得て、本発明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち、本願の第1の発明は、配列番号
１に示されるアミノ酸配列において、51位のアスパラギ
ン以外のアミノ酸が14個以上欠失しており、51位のアス
パラギンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列
からなるセリンアセチルトランスフェラーゼである。ア
ミノ酸の欠失は、連続的なものであっても、不連続なも
のであってもよい。欠失しているアミノ酸はC末端から1
4個〜25個、特に20個のアミノ酸であるとよい。また、5
1位のアスパラギンはセリン、バリン、イソロイシン、
アルギニン、システイン、ロイシン、アラニン、チロシ
ン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、グルタ
ミン酸、グルタミン、グリシンまたはトリプトファンに
置換されているとよい。
１に示されるアミノ酸配列において、51位のアスパラギ
ン以外のアミノ酸が14個以上欠失しており、51位のアス
パラギンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列
からなるセリンアセチルトランスフェラーゼである。ア
ミノ酸の欠失は、連続的なものであっても、不連続なも
のであってもよい。欠失しているアミノ酸はC末端から1
4個〜25個、特に20個のアミノ酸であるとよい。また、5
1位のアスパラギンはセリン、バリン、イソロイシン、
アルギニン、システイン、ロイシン、アラニン、チロシ
ン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、グルタ
ミン酸、グルタミン、グリシンまたはトリプトファンに
置換されているとよい。
【０００８】本願の第2の発明は、前記のセリンアセチ
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。その
一例として、配列番号７に示される塩基配列からなるＤ
ＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。本願の第3の
発明は、前記のセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え
体DNAである。
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。その
一例として、配列番号７に示される塩基配列からなるＤ
ＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。本願の第3の
発明は、前記のセリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組み換え
体DNAである。
【０００９】本願の第4の発明は、前記の組み換え体DNA
を含む形質転換体または形質導入体である。形質転換体
としては、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))(FERM P-164
58)が挙げられる。本願の第5の発明は、前記の形質転換
体または形質導入体を培地に培養し、培養物からセリン
アセチルトランスフェラーゼを採取することを特徴とす
るセリンアセチルトランスフェラーゼの製造法である。
を含む形質転換体または形質導入体である。形質転換体
としては、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))(FERM P-164
58)が挙げられる。本願の第5の発明は、前記の形質転換
体または形質導入体を培地に培養し、培養物からセリン
アセチルトランスフェラーゼを採取することを特徴とす
るセリンアセチルトランスフェラーゼの製造法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のSAT遺伝子は、以下のようにして作製すること
ができる。先ず、野生型SAT遺伝子を単離する。野生型
大腸菌、例えば、大腸菌(E.coli)1100株〔Max-Plank-In
stitute(ハイデルベルグ)より入手可能〕等からのSAT遺
伝子の単離は、例えば、前記Denk等によって報告された
遺伝子配列をもとにPCR法等によって行なうことができ
る。大腸菌1100株からのSAT遺伝子は、配列番号１に示
されるアミノ酸配列からなるSATをコードしている。
本発明のSAT遺伝子は、以下のようにして作製すること
ができる。先ず、野生型SAT遺伝子を単離する。野生型
大腸菌、例えば、大腸菌(E.coli)1100株〔Max-Plank-In
stitute(ハイデルベルグ)より入手可能〕等からのSAT遺
伝子の単離は、例えば、前記Denk等によって報告された
遺伝子配列をもとにPCR法等によって行なうことができ
る。大腸菌1100株からのSAT遺伝子は、配列番号１に示
されるアミノ酸配列からなるSATをコードしている。
【００１１】次いで、このようにして単離された野生型
SAT遺伝子をベクターに挿入する。本発明において用い
ることのできるベクターとしては、例えば、バクテリオ
ファージベクターDNA、プラスミドベクターDNA等が挙げ
られる。これらベクターに野生型SAT遺伝子を組み込ん
だ組み換えDNAを用いて、SAT遺伝子を改変するのであ
る。
SAT遺伝子をベクターに挿入する。本発明において用い
ることのできるベクターとしては、例えば、バクテリオ
ファージベクターDNA、プラスミドベクターDNA等が挙げ
られる。これらベクターに野生型SAT遺伝子を組み込ん
だ組み換えDNAを用いて、SAT遺伝子を改変するのであ
る。
【００１２】配列番号１記載のアミノ酸配列において、
51位のアスパラギン以外のアミノ酸が14個以上、好まし
くはC末端より14から25個、最も好ましくは20個のアミ
ノ酸が欠失され、かつ51位のアスパラギンが他のアミノ
酸、例えば、セリン、バリン、イソロイシン、アルギニ
ン、システイン、ロイシン、アラニン、チロシン、ヒス
チジン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、
グルタミン、グリシン、トリプトファン等に置換された
アミノ酸配列をコードするDNAを得るには、種々の方法
を用いることができる。例えば、欠失変異を生じさせる
ために遺伝子を変異原処理する方法、遺伝子を選択的に
開裂し、次に、選択されたヌクレオチドを除去する方
法、オリゴヌクレオチド変異誘発法、実施例１に記載す
るようなPCRを用いる方法等が挙げられる。
51位のアスパラギン以外のアミノ酸が14個以上、好まし
くはC末端より14から25個、最も好ましくは20個のアミ
ノ酸が欠失され、かつ51位のアスパラギンが他のアミノ
酸、例えば、セリン、バリン、イソロイシン、アルギニ
ン、システイン、ロイシン、アラニン、チロシン、ヒス
チジン、プロリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、
グルタミン、グリシン、トリプトファン等に置換された
アミノ酸配列をコードするDNAを得るには、種々の方法
を用いることができる。例えば、欠失変異を生じさせる
ために遺伝子を変異原処理する方法、遺伝子を選択的に
開裂し、次に、選択されたヌクレオチドを除去する方
法、オリゴヌクレオチド変異誘発法、実施例１に記載す
るようなPCRを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】得られた組み換え体DNAを用いて、例え
ば、大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109(Takara社
製)、XL1-Blue(フナコシ社製)等を形質転換または形質
導入して種々の菌株を得る。形質転換は、例えば、D.M.
Morrisonの方法(Methods in Enzymology, 68, p.326-3
31,1979)により行なうことができる。また、形質導入
は、例えば、B. Hohnの方法(Methods in Enzymology, 6
8, p.299-309,1979)により行なうことができる。
ば、大腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109(Takara社
製)、XL1-Blue(フナコシ社製)等を形質転換または形質
導入して種々の菌株を得る。形質転換は、例えば、D.M.
Morrisonの方法(Methods in Enzymology, 68, p.326-3
31,1979)により行なうことができる。また、形質導入
は、例えば、B. Hohnの方法(Methods in Enzymology, 6
8, p.299-309,1979)により行なうことができる。
【００１４】上記のようにして得られた形質転換体また
は形質導入体、例えば、SAT生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を用いてSATを生産するには、下記
のような培養により行なうことができる。上記微生物の
培養は、通常の微生物の培養に通常用いられる合成ない
し天然培地を用いて行なうことができる。上記微生物を
培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆も
しくは小麦麹等の窒素源に、リン酸２水素カリウム、リ
ン酸水素２カリウム、硫酸第２鉄、硫酸マグネシウム、
塩化第２鉄等の無機塩類、必要により、糖質原料、ビタ
ミン等を適宜添加したものが用いられる。
は形質導入体、例えば、SAT生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を用いてSATを生産するには、下記
のような培養により行なうことができる。上記微生物の
培養は、通常の微生物の培養に通常用いられる合成ない
し天然培地を用いて行なうことができる。上記微生物を
培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆も
しくは小麦麹等の窒素源に、リン酸２水素カリウム、リ
ン酸水素２カリウム、硫酸第２鉄、硫酸マグネシウム、
塩化第２鉄等の無機塩類、必要により、糖質原料、ビタ
ミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１５】この際、培地のpHは、5-9、好ましくは、7
-8に苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア水等で調整され
る。培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件
で行なうのが好ましい。培養温度は、20-45℃、好まし
くは30-42℃が適当である。このようにして得られた培
養物、あるいは培養物から遠心分離、または限外濾過、
もしくは通常の濾過等の操作により得られた生菌体、そ
の乾燥菌体、生菌体を自己消化、各種破砕あるいは各種
音波処理等を施すことにより得られる菌体処理物及びこ
れらの菌体の抽出物より得られる酵素含有物はSATの酵
素源として用いることができる。
-8に苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア水等で調整され
る。培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件
で行なうのが好ましい。培養温度は、20-45℃、好まし
くは30-42℃が適当である。このようにして得られた培
養物、あるいは培養物から遠心分離、または限外濾過、
もしくは通常の濾過等の操作により得られた生菌体、そ
の乾燥菌体、生菌体を自己消化、各種破砕あるいは各種
音波処理等を施すことにより得られる菌体処理物及びこ
れらの菌体の抽出物より得られる酵素含有物はSATの酵
素源として用いることができる。
【００１６】なお、上記菌体の処理物からSATを分離精
製することも可能である。得られた粗酵素液からSATを
単離精製するには、通常の酵素精製に用いられる方法が
使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ
法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法、等電点沈澱法
等を適宜組み合わせて酵素精製を行なうのが好ましい。
本発明のSATは、天然型SAT（例えば、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列からなるSAT）と同様の酵素活性を有
するが、L-システインによる阻害を受け難い。
製することも可能である。得られた粗酵素液からSATを
単離精製するには、通常の酵素精製に用いられる方法が
使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イ
オン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ
法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法、等電点沈澱法
等を適宜組み合わせて酵素精製を行なうのが好ましい。
本発明のSATは、天然型SAT（例えば、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列からなるSAT）と同様の酵素活性を有
するが、L-システインによる阻害を受け難い。
【００１７】本発明のSATの一例として、配列番号１に
示されるアミノ酸配列において、C末端から20個のアミ
ノ酸が欠失しており、51位のアスパラギンがセリン、バ
リン、イソロイシン、アルギニン、システイン、ロイシ
ン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、フェ
ニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン、グリシンま
たはトリプトファンに置換されているSATが挙げられ
る。このSATの理化学的性質は、安定pH、至適pH、至適
温度及び温度安定性等については、J.Biol.Chem.,vol.2
41,p.4955〜4965,(1966)に記載のSATの性質と同様であ
り、分子量及びL-システインによる阻害は、以下に示す
通りである。
示されるアミノ酸配列において、C末端から20個のアミ
ノ酸が欠失しており、51位のアスパラギンがセリン、バ
リン、イソロイシン、アルギニン、システイン、ロイシ
ン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、フェ
ニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン、グリシンま
たはトリプトファンに置換されているSATが挙げられ
る。このSATの理化学的性質は、安定pH、至適pH、至適
温度及び温度安定性等については、J.Biol.Chem.,vol.2
41,p.4955〜4965,(1966)に記載のSATの性質と同様であ
り、分子量及びL-システインによる阻害は、以下に示す
通りである。
【００１８】 1.分子量：約30,000（SDS-PAGE法） 110,000(ゲル濾過カラムクロマトグラフィー) 2.L-システインによる阻害：250μMのL-システイン存在
下で、L-システイン非存在下でのSATの活性を100とした
ときの相対活性が28％以上。SATは、含硫アミノ酸、例
えば、L-システイン、L-シスチン等の製造に用いること
ができるので、本発明のSATは極めて有用なものであ
る。
下で、L-システイン非存在下でのSATの活性を100とした
ときの相対活性が28％以上。SATは、含硫アミノ酸、例
えば、L-システイン、L-シスチン等の製造に用いること
ができるので、本発明のSATは極めて有用なものであ
る。
【００１９】
（１）SAT遺伝子cysの単離及びこれをもつ組み換え体プ
ラスミドの作製 大腸菌(E.coli)1100株〔Max-Plank-Institute(ハイデル
ベルグ)より入手〕からのcysE遺伝子の単離は、特開平9
-9982号公報に記載の方法に従った。SAT 遺伝子cysE
は、前記Denk等によって報告された遺伝子塩基配列をも
とにPCR法を用いて単離した。簡単に説明すると、SATの
N末端側及びC末端側に相当する配列からなるオリゴヌク
レオチドをDNAシンセサイザー(Model 302、アプライド
バイオシステムス社製) で常法により合成した。次に、
これら合成オリゴヌクレオチドをプライマーDNAとして
用い、in vitroのDNA増幅によりcysE遺伝子を増幅し
た。
ラスミドの作製 大腸菌(E.coli)1100株〔Max-Plank-Institute(ハイデル
ベルグ)より入手〕からのcysE遺伝子の単離は、特開平9
-9982号公報に記載の方法に従った。SAT 遺伝子cysE
は、前記Denk等によって報告された遺伝子塩基配列をも
とにPCR法を用いて単離した。簡単に説明すると、SATの
N末端側及びC末端側に相当する配列からなるオリゴヌク
レオチドをDNAシンセサイザー(Model 302、アプライド
バイオシステムス社製) で常法により合成した。次に、
これら合成オリゴヌクレオチドをプライマーDNAとして
用い、in vitroのDNA増幅によりcysE遺伝子を増幅し
た。
【００２０】次いで、増幅された約１kbのフラグメント
をアガロースゲル電気泳動により常法により精製単離
し、T4 DNA polymeraseを作用させて平滑化した。プラ
スミドベクターpBR322 DNA(Takara製) をEcoRI及びNruI
で消化後、DNA blunting Kit(Takara製)で平滑末端とし
た。次に、常法に従って、アガロースゲル電気泳動を行
ない、GENECLEAN II KIT（フナコシ(株)製）により複製
起点を含む約3.4 kbのDNA断片を取得した。得られたDNA
をT4 DNA ligaseにより環状にした後、EcoRIで切断し、
直鎖にした。
をアガロースゲル電気泳動により常法により精製単離
し、T4 DNA polymeraseを作用させて平滑化した。プラ
スミドベクターpBR322 DNA(Takara製) をEcoRI及びNruI
で消化後、DNA blunting Kit(Takara製)で平滑末端とし
た。次に、常法に従って、アガロースゲル電気泳動を行
ない、GENECLEAN II KIT（フナコシ(株)製）により複製
起点を含む約3.4 kbのDNA断片を取得した。得られたDNA
をT4 DNA ligaseにより環状にした後、EcoRIで切断し、
直鎖にした。
【００２１】次いで、配列番号２に記載の大腸菌ラクト
ースオペロン等に由来するプロモーター、オペレータ
ー、リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調
節領域並びにHpaI切断部位及びマルチクローニングサイ
トを含むDNA配列をDNA Synthesizer Model 392 (アプラ
イドバイオシステムズ社製)を用いて合成し、上記で得
られたEcoRI断片と連結して発現ベクターpUTE100を作製
した。
ースオペロン等に由来するプロモーター、オペレータ
ー、リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調
節領域並びにHpaI切断部位及びマルチクローニングサイ
トを含むDNA配列をDNA Synthesizer Model 392 (アプラ
イドバイオシステムズ社製)を用いて合成し、上記で得
られたEcoRI断片と連結して発現ベクターpUTE100を作製
した。
【００２２】上記で平滑化した約1kbのDNA断片をpUTE10
0のHpaIサイトに導入し、組み換え体プラスミドpOHE100
を得た。大腸菌JM109(Takara社製)を該組み換え体プラ
スミドpOHE100を用いD.M.Morrisonの方法によりて形質
転換し、形質転換体、すなわち、大腸菌JM109(pOHE100)
を得た。この形質転換体よりプラスミドDNAを回収し、
それにコードされているcysE遺伝子の塩基配列を解析し
たところ、配列番号１に示されているアミノ酸配列をコ
ードしていることが確認された。
0のHpaIサイトに導入し、組み換え体プラスミドpOHE100
を得た。大腸菌JM109(Takara社製)を該組み換え体プラ
スミドpOHE100を用いD.M.Morrisonの方法によりて形質
転換し、形質転換体、すなわち、大腸菌JM109(pOHE100)
を得た。この形質転換体よりプラスミドDNAを回収し、
それにコードされているcysE遺伝子の塩基配列を解析し
たところ、配列番号１に示されているアミノ酸配列をコ
ードしていることが確認された。
【００２３】（２）C末端20アミノ酸欠失変異導入SATプ
ラスミドの作製 C末端部分の20アミノ酸を欠失したSATプラスミドの作製
は、PCR法を用いて行なった。先ず、発現ベクターpUTE1
00の遺伝子塩基配列をもとにcysE遺伝子の終止コドンTA
Aから始まる配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド
と、cysE遺伝子の終止コドンの上流61位から上流へ向か
う配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドをDNA Synthe
sizer Model 392を用いて、常法により合成した。
ラスミドの作製 C末端部分の20アミノ酸を欠失したSATプラスミドの作製
は、PCR法を用いて行なった。先ず、発現ベクターpUTE1
00の遺伝子塩基配列をもとにcysE遺伝子の終止コドンTA
Aから始まる配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド
と、cysE遺伝子の終止コドンの上流61位から上流へ向か
う配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドをDNA Synthe
sizer Model 392を用いて、常法により合成した。
【００２４】これら合成オリゴヌクレオチドをプライマ
ーDNAとして用い、組み換え体プラスミドpOHE100に対
し、DNA Thermal cycler (Perkin-Elmer社製)及びKOD D
NA polymerase (TOYOBO社製)を使ってPCRを行なった。
反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行ない、増幅さ
れた約4.4kbのフラグメントをGENECLEAN II (フナコシ
社製)により回収した。次いで、このフラグメントの5'
末端をT4 polynucleotidekinase (TOYOBO社製)を用いて
リン酸化し、更にTakara ligation Kit ver. 2(Takara
社製)により分子内ライゲーションを行ない、環状プラ
スミドを得た。次に、このプラスミドを用いて大腸菌JM
109を形質転換し、形質転換体、大腸菌JM109(pOHE100-2
0)を得た。
ーDNAとして用い、組み換え体プラスミドpOHE100に対
し、DNA Thermal cycler (Perkin-Elmer社製)及びKOD D
NA polymerase (TOYOBO社製)を使ってPCRを行なった。
反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行ない、増幅さ
れた約4.4kbのフラグメントをGENECLEAN II (フナコシ
社製)により回収した。次いで、このフラグメントの5'
末端をT4 polynucleotidekinase (TOYOBO社製)を用いて
リン酸化し、更にTakara ligation Kit ver. 2(Takara
社製)により分子内ライゲーションを行ない、環状プラ
スミドを得た。次に、このプラスミドを用いて大腸菌JM
109を形質転換し、形質転換体、大腸菌JM109(pOHE100-2
0)を得た。
【００２５】得られた形質転換体よりプラスミドDNAを
回収した。それにコードされているcysE遺伝子の塩基配
列を確認したところ、3'末端から60塩基欠失しているこ
とが判かり、C末端から20アミノ酸を欠失したSATをコー
ドしていることが明らかになった。
回収した。それにコードされているcysE遺伝子の塩基配
列を確認したところ、3'末端から60塩基欠失しているこ
とが判かり、C末端から20アミノ酸を欠失したSATをコー
ドしていることが明らかになった。
【００２６】（３）51位のアミノ酸置換体SATの作製 51位のアミノ酸がアスパラギンから他のアミノ酸に置換
したSATプラスミドの作製は、PCR法を用いて行なった。
先ず、組み換え体プラスミドpOHE100-20の遺伝子塩基配
列をもとにcysE遺伝子の145位の塩基から始まる配列番
号５に記載のオリゴヌクレオチドと、cysE遺伝子の144
位から上流へ向かう配列番号６に記載のオリゴヌクレオ
チドをDNA Synthesizer Model 392を用いて、常法によ
り合成した。
したSATプラスミドの作製は、PCR法を用いて行なった。
先ず、組み換え体プラスミドpOHE100-20の遺伝子塩基配
列をもとにcysE遺伝子の145位の塩基から始まる配列番
号５に記載のオリゴヌクレオチドと、cysE遺伝子の144
位から上流へ向かう配列番号６に記載のオリゴヌクレオ
チドをDNA Synthesizer Model 392を用いて、常法によ
り合成した。
【００２７】これら合成オリゴヌクレオチドをプライマ
ーDNAとして用い、pOHE100-20に対し、DNA Thermal cyc
ler及びKOD DNA polymeraseを使ってPCRを行なった。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動を行ない、増幅され
た約4.4kbのフラグメントをGENECLEAN II(フナコシ社
製)により回収した。次いで、このフラグメントの5'末
端をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化し、更
にTakara ligation Kit ver. 2により分子内ライゲーシ
ョンを行ない、環状プラスミドを得た。次に、このプラ
スミドを用いて大腸菌JM109を形質転換し、形質転換
体、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))を得た。
ーDNAとして用い、pOHE100-20に対し、DNA Thermal cyc
ler及びKOD DNA polymeraseを使ってPCRを行なった。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動を行ない、増幅され
た約4.4kbのフラグメントをGENECLEAN II(フナコシ社
製)により回収した。次いで、このフラグメントの5'末
端をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化し、更
にTakara ligation Kit ver. 2により分子内ライゲーシ
ョンを行ない、環状プラスミドを得た。次に、このプラ
スミドを用いて大腸菌JM109を形質転換し、形質転換
体、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))を得た。
【００２８】得られた形質転換体より組み換え体プラス
ミドDNAを回収した。それにコードされているcysE遺伝
子の塩基配列を確認したところ、51位のアスパラギンが
他のアミノ酸に置換しているものが得られた。該形質転
換体のうち、51位のアスパラギンがチロシンに置換され
た形質転換体、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16458として
寄託されている。この形質転換体のプラスミドDNAは、
配列番号７に示される塩基配列を有している。
ミドDNAを回収した。それにコードされているcysE遺伝
子の塩基配列を確認したところ、51位のアスパラギンが
他のアミノ酸に置換しているものが得られた。該形質転
換体のうち、51位のアスパラギンがチロシンに置換され
た形質転換体、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-16458として
寄託されている。この形質転換体のプラスミドDNAは、
配列番号７に示される塩基配列を有している。
【００２９】また、51位のアスパラギンがセリンに置換
された形質転換体のプラスミドDNAは、配列番号8に示さ
れる塩基配列を有している。同様に、51位のアスパラギ
ンがバリンに置換された形質転換体のプラスミドDNAは
配列番号9に示される塩基配列を、51位がイソロイシン
に置換された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号10
に示される塩基配列を、51位がアルギニンに置換された
形質転換体のプラスミドDNAは配列番号11に、51位がシ
ステインに置換された形質転換体のプラスミドDNAは配
列番号12に、51位がロイシンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号13に、51位がアラニンに置換
された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号14に示さ
れる塩基配列を、さらに、51位がヒスチジンに置換され
た形質転換体のプラスミドDNAは配列番号15に示される
塩基配列を、51位がプロリンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号16に示される塩基配列を、51
位がフェニルアラニンに置換された形質転換体のプラス
ミドDNAは配列番号17に示される塩基配列を、51位がグ
ルタミン酸に置換された形質転換体のプラスミドDNAは
配列番号18に示される塩基配列を、51位がグルタミンに
置換された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号19に
示される塩基配列を、51位がグリシンに置換された形質
転換体のプラスミドDNAは配列番号20に示される塩基配
列を、51位がトリプトファンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号21に示される塩基配列をそれ
ぞれ有している。
された形質転換体のプラスミドDNAは、配列番号8に示さ
れる塩基配列を有している。同様に、51位のアスパラギ
ンがバリンに置換された形質転換体のプラスミドDNAは
配列番号9に示される塩基配列を、51位がイソロイシン
に置換された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号10
に示される塩基配列を、51位がアルギニンに置換された
形質転換体のプラスミドDNAは配列番号11に、51位がシ
ステインに置換された形質転換体のプラスミドDNAは配
列番号12に、51位がロイシンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号13に、51位がアラニンに置換
された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号14に示さ
れる塩基配列を、さらに、51位がヒスチジンに置換され
た形質転換体のプラスミドDNAは配列番号15に示される
塩基配列を、51位がプロリンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号16に示される塩基配列を、51
位がフェニルアラニンに置換された形質転換体のプラス
ミドDNAは配列番号17に示される塩基配列を、51位がグ
ルタミン酸に置換された形質転換体のプラスミドDNAは
配列番号18に示される塩基配列を、51位がグルタミンに
置換された形質転換体のプラスミドDNAは配列番号19に
示される塩基配列を、51位がグリシンに置換された形質
転換体のプラスミドDNAは配列番号20に示される塩基配
列を、51位がトリプトファンに置換された形質転換体の
プラスミドDNAは配列番号21に示される塩基配列をそれ
ぞれ有している。
【００３０】（4）SATの製造 前記のC末端を欠失したSATをコードする組み換え体プラ
スミドを保持した大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))をTY
培地（１％バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキ
ストラクト、0.5%塩化ナトリウム、pH7.0）5ml中に接種
し、37℃で12時間振とう培養した。得られた培養物１ml
を、滅菌した50mlのTY培地の入った200ml容枝付き三角
フラスコに分注し、37℃で振とう培養して、クレットユ
ニットが約100になったところでIPTGを終濃度1mMになる
よう添加して約4時間振とう培養を続けた。培養終了
後、培養液を4℃で15分間遠心分離して菌体を集め、1mM
EDTA、1mMジチオスレイトール（以下、「DTT 」と略称
する。）を含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)に懸濁し
たのち、超音波破砕し、粗酵素液とした。
スミドを保持した大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))をTY
培地（１％バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキ
ストラクト、0.5%塩化ナトリウム、pH7.0）5ml中に接種
し、37℃で12時間振とう培養した。得られた培養物１ml
を、滅菌した50mlのTY培地の入った200ml容枝付き三角
フラスコに分注し、37℃で振とう培養して、クレットユ
ニットが約100になったところでIPTGを終濃度1mMになる
よう添加して約4時間振とう培養を続けた。培養終了
後、培養液を4℃で15分間遠心分離して菌体を集め、1mM
EDTA、1mMジチオスレイトール（以下、「DTT 」と略称
する。）を含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)に懸濁し
たのち、超音波破砕し、粗酵素液とした。
【００３１】〔実施例２〕実施例１で得られた粗酵素液
（5から10μg蛋白質相当量）をセリン5mM、アセチルCo-
A0.1mM、EDTA1mM、DTT1mMを含む50mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.6)0.75mlに加え、30℃で20分間反応させた。反応
終了後、直ちに遠心分離（15,000r.p.m.、5分）を行な
い、沈澱を除き反応液を得た。反応の前後の反応液の23
2nm の吸光度の変化を測定し、以下の力価の測定法に従
って本酵素の活性を求めた。
（5から10μg蛋白質相当量）をセリン5mM、アセチルCo-
A0.1mM、EDTA1mM、DTT1mMを含む50mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.6)0.75mlに加え、30℃で20分間反応させた。反応
終了後、直ちに遠心分離（15,000r.p.m.、5分）を行な
い、沈澱を除き反応液を得た。反応の前後の反応液の23
2nm の吸光度の変化を測定し、以下の力価の測定法に従
って本酵素の活性を求めた。
【００３２】力価の測定法 1mM L-セリン、0.1mMアセチルCoA及び1mM Na2EDTAを含
む、50mM Tris-HCl(pH7.6)0.75mlに適当量のSAT溶液10
μlを添加し、30℃で反応させ、232nmの吸光度の減少を
U2000形ダブルビーム分光高度計（日立製作所製）にて
測定した。 酵素活性の１単位は、30℃、pH7.6におい
て1分間に1μmolのアセチルCoAを消費する酵素量と定義
した。また、力価の算出は、上記条件下のアセチルCoA
の分子吸光係数を4.2とし、次式に従って行なった。 酵素液1mlあたりの活性(U/ml)=(ΔA232/4.2)x(750/10) なお、ΔA232は、単位時間（１分間）あたりの232nmの
吸光度減少量である。その結果、本酵素は、1〜2 U/ml
の活性を有していた。
む、50mM Tris-HCl(pH7.6)0.75mlに適当量のSAT溶液10
μlを添加し、30℃で反応させ、232nmの吸光度の減少を
U2000形ダブルビーム分光高度計（日立製作所製）にて
測定した。 酵素活性の１単位は、30℃、pH7.6におい
て1分間に1μmolのアセチルCoAを消費する酵素量と定義
した。また、力価の算出は、上記条件下のアセチルCoA
の分子吸光係数を4.2とし、次式に従って行なった。 酵素液1mlあたりの活性(U/ml)=(ΔA232/4.2)x(750/10) なお、ΔA232は、単位時間（１分間）あたりの232nmの
吸光度減少量である。その結果、本酵素は、1〜2 U/ml
の活性を有していた。
【００３３】〔実施例３〕L-システインによる阻害の解
除効果を以下のようにして調べた。実施例２に示した活
性測定条件の組成の反応液にL-システインを添加して反
応を行ない、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))(本発明の
形質転換体)、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952
A1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSA
T活性を測定した。その結果は、図１に示す通りであっ
た。図１より明らかなように、本発明の形質転換体のSA
T活性は、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952 A1
記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSAT活
性より優れていることが判る。
除効果を以下のようにして調べた。実施例２に示した活
性測定条件の組成の反応液にL-システインを添加して反
応を行ない、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))(本発明の
形質転換体)、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952
A1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSA
T活性を測定した。その結果は、図１に示す通りであっ
た。図１より明らかなように、本発明の形質転換体のSA
T活性は、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952 A1
記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSAT活
性より優れていることが判る。
【００３４】〔実施例４〕大腸菌JM109(pOHE100-20(N51
Y))以外の形質転換大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))の保
持するSATについてもL-システインによる阻害の解除効
果を調べた。実施例３と同様に、実施例２に示した活性
測定条件の組成の反応液にL-システインを添加して反応
を行ない、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))(本発明の形
質転換体)、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952 A
1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSAT
活性を測定した。その結果を次表に、システイン非存在
下でのSAT活性を100としたときのシステイン250μM存在
下での相対活性で表した。
Y))以外の形質転換大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))の保
持するSATについてもL-システインによる阻害の解除効
果を調べた。実施例３と同様に、実施例２に示した活性
測定条件の組成の反応液にL-システインを添加して反応
を行ない、大腸菌JM109(pOHE100-20(N51X))(本発明の形
質転換体)、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 195 39 952 A
1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)1100株のSAT
活性を測定した。その結果を次表に、システイン非存在
下でのSAT活性を100としたときのシステイン250μM存在
下での相対活性で表した。
【００３５】
【表１】
【００３６】上記の表より明らかなように、本発明の形
質転換体のSAT活性は、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 19
5 39 952 A1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)11
00株のSAT活性より優れていることが判る。
質転換体のSAT活性は、大腸菌JM109(pOHE100-20)(DE 19
5 39 952 A1記載に相当するもの)及び大腸菌(E.coli)11
00株のSAT活性より優れていることが判る。
【００３７】
【発明の効果】本発明により、前記のDenk等によって報
告された変異型SAT及びDE 195 39 952A1に記載の改変SA
TよりもL-システインによるフィードバック阻害が更に
緩和された改変SATが得られた。本発明の改変SATを用い
れば、L-システイン、L-シスチン等の含硫アミノ酸を効
率よく製造できる。
告された変異型SAT及びDE 195 39 952A1に記載の改変SA
TよりもL-システインによるフィードバック阻害が更に
緩和された改変SATが得られた。本発明の改変SATを用い
れば、L-システイン、L-シスチン等の含硫アミノ酸を効
率よく製造できる。
【００３８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Research Institute of Innovative Technology for the Earth <120> Modified serine acetyltransferase <130> P98-0536 <140> <141> <150> JP97/275594 <151> 1997-10-08 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser Met Asp Met 245 250 255 Asp Gln His Phe Asn Gly Ile Asn His Thr Phe Glu Tyr Gly Asp Gly 260 265 270 Ile <210> 2 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of the DNA comprising expression regulatory region, HpaI site and multicloning site. <220> <222> 1..4 <223> 相補鎖が存在しない <220> <222> 126 <223> 相補鎖は3'→5'方向にこの位置からのびる <220> <222> 126 <223> 一本鎖DNA「3'-ttaa-5'」を有する <400> 2 aattcggtac cggatccgct agctttacat tatgcttccg gctcgtataa tgtgatggaa 60 ttgtgagcgg ataacaattc catcgttagg aggttttagt taactaaact agtagatctg 120 gtaccg 126 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of the expression vector pUTE100. <400> 3 taaaactaaa ctagtagatc tgg 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of the expression vector pUTE100. <400> 4 tgatggctta tcgctgtctg g 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of the recombinant plasmid pOHE100-20 <400> 5 ctggcgnnna agctgtcatc gcca 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of the recombinant plasmid pOHE100-20 <400> 6 catgtagctc agtgcactgc c 21 <210> 7 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 7 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg tac aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Tyr Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 8 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 8 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg tcg aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Ser Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc 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Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 16 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 16 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg cct aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Pro Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 17 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 17 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg ttt aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Phe Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 18 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 18 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg gaa aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Glu Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 19 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 19 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg caa aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Gln Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 20 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 20 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg ggg aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Gly Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250 <210> 21 <211> 759 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(759) <400> 21 atg tcg tgt gaa gaa ctg gaa att gtc tgg aac aat att aaa gcc gaa 48 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 gcc aga acg ctg gcg gac tgt gag cca atg ctg gcc agt ttt tac cac 96 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 gcg acg cta ctc aag cac gaa aac ctt ggc agt gca ctg agc tac atg 144 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 ctg gcg tgg aag ctg tca tcg cca att atg cct gct att gct atc cgt 192 Leu Ala Trp Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 gaa gtg gtg gaa gaa gcc tac gcc gct gac ccg gaa atg atc gcc tct 240 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 gcg gcc tgt gat att cag gcg gtg cgt acc cgc gac ccg gca gtc gat 288 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 aaa tac tca acc ccg ttg tta tac ctg aag ggt ttt cat gcc ttg cag 336 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 gcc tat cgc atc ggt cac tgg ttg tgg aat cag ggg cgt cgc gca ctg 384 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 gca atc ttt ctg caa aac cag gtt tct gtg acg ttc cag gtc gat att 432 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 cac ccg gca gca aaa att ggt cgc ggt atc atg ctt gac cac gcg aca 480 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg Gly Ile Met Leu Asp His Ala Thr 145 150 155 160 ggc atc gtc gtt ggt gaa acg gcg gtg att gaa aac gac gta tcg att 528 Gly Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Val Ile Glu Asn Asp Val Ser Ile 165 170 175 ctg caa tct gtg acg ctt ggc ggt acg ggt aaa tct ggt ggt gac cgt 576 Leu Gln Ser Val Thr Leu Gly Gly Thr Gly Lys Ser Gly Gly Asp Arg 180 185 190 cac ccg aaa att cgt gaa ggt gtg atg att ggc gcg ggc gcg aaa atc 624 His Pro Lys Ile Arg Glu Gly Val Met Ile Gly Ala Gly Ala Lys Ile 195 200 205 ctc ggc aat att gaa gtt ggg cgc ggc gcg aag att ggc gca ggt tcc 672 Leu Gly Asn Ile Glu Val Gly Arg Gly Ala Lys Ile Gly Ala Gly Ser 210 215 220 gtg gtg ctg caa ccg gtg ccg ccg cat acc acc gcc gct ggc gtt ccg 720 Val Val Leu Gln Pro Val Pro Pro His Thr Thr Ala Ala Gly Val Pro 225 230 235 240 gct cgt att gtc ggt aaa cca gac agc gat aag cca tca 759 Ala Arg Ile Val Gly Lys Pro Asp Ser Asp Lys Pro Ser 245 250
【００３９】
配列番号２：発現調節領域、HpaI部位及びマルチクロー
ニングサイトを含むDNA配列に基づいて設計されたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号２：相補鎖が存在しない（存在位置：1..4）。 配列番号２：相補鎖は3'→5'方向にこの位置からのびる
（存在位置：126）。 配列番号２：一本鎖DNA「3'-ttaa-5'」を有する（存在
位置：126）。
ニングサイトを含むDNA配列に基づいて設計されたオリ
ゴヌクレオチド。 配列番号２：相補鎖が存在しない（存在位置：1..4）。 配列番号２：相補鎖は3'→5'方向にこの位置からのびる
（存在位置：126）。 配列番号２：一本鎖DNA「3'-ttaa-5'」を有する（存在
位置：126）。
【００４０】 配列番号３：発現ベクターpUTE100の配列に基づいて設
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：発現ベクターpUTE100の配列に基づいて設
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号５：組み換えプラスミドpOHE100-20の配列に基
づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：発現ベクターpUTE100の配列に基づいて設
計されたオリゴヌクレオチド。 配列番号５：組み換えプラスミドpOHE100-20の配列に基
づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
【００４１】 配列番号５：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：7）。 配列番号５：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：8）。 配列番号５：nはa、g、c又はtを表す（存在位置：9）。 配列番号６：組み換えプラスミドpOHE100-20の配列に基
づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１】本発明の改変セリンアセチルトランスフェラー
ゼのL-システインによる阻害の解除効果を示す図であ
る。
ゼのL-システインによる阻害の解除効果を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列にお
いて、51位のアスパラギン以外のアミノ酸が14個以上欠
失しており、51位のアスパラギンが他のアミノ酸に置換
されているアミノ酸配列からなるセリンアセチルトラン
スフェラーゼ。 - 【請求項２】 欠失しているアミノ酸がC末端から14個
〜25個のアミノ酸である請求項１記載のセリンアセチル
トランスフェラーゼ。 - 【請求項３】 51位のアスパラギンがセリン、バリン、
イソロイシン、アルギニン、システイン、ロイシン、ア
ラニン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、フェニルア
ラニン、グルタミン酸、グルタミン、グリシンまたはト
リプトファンに置換されている請求項１記載のセリンア
セチルトランスフェラーゼ。 - 【請求項４】 欠失しているアミノ酸がC末端から20個
のアミノ酸であり、51位のアスパラギンがセリン、バリ
ン、イソロイシン、アルギニン、システイン、ロイシ
ン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、フェ
ニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン、グリシンま
たはトリプトファンに置換されている請求項１記載のセ
リンアセチルトランスフェラーゼ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のセリン
アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項６】 配列番号７に示される塩基配列からなる
ＤＮＡを含む請求項５記載の遺伝子。 - 【請求項７】 請求項５または６記載の遺伝子をベクタ
ーDNAに挿入したことを特徴とする組み換え体DNA。 - 【請求項８】 請求項７記載の組み換え体DNAを含む形
質転換体または形質導入体。 - 【請求項９】 大腸菌JM109(pOHE100-20(N51Y))(FERM P
-16458)である請求項８記載の形質転換体。 - 【請求項１０】 請求項８または９記載の形質転換体ま
たは形質導入体を培地に培養し、培養物から改変セリン
アセチルトランスフェラーゼを採取することを特徴とす
る改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10285432A JPH11299491A (ja) | 1997-10-08 | 1998-10-07 | 改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-275594 | 1997-10-08 | ||
| JP27559497 | 1997-10-08 | ||
| JP10285432A JPH11299491A (ja) | 1997-10-08 | 1998-10-07 | 改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11299491A true JPH11299491A (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=26551526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10285432A Pending JPH11299491A (ja) | 1997-10-08 | 1998-10-07 | 改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11299491A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005007841A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2005-01-27 | Ajinomoto Co., Inc. | 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法 |
-
1998
- 1998-10-07 JP JP10285432A patent/JPH11299491A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005007841A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2005-01-27 | Ajinomoto Co., Inc. | 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法 |
| JPWO2005007841A1 (ja) * | 2003-07-16 | 2006-11-09 | 味の素株式会社 | 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法 |
| US7312058B2 (en) | 2003-07-16 | 2007-12-25 | Ajinomoto Co., Ltd. | Mutant serine acetyltransferase |
| JP4923573B2 (ja) * | 2003-07-16 | 2012-04-25 | 味の素株式会社 | 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法 |
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