JPWO2005007841A1 - 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びl−システインの製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のさらなる目的は、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの89〜96位に相当する前記アミノ酸配列が、配列番号4、5、6、7、8及び9から選ばれるアミノ酸配列で置換された、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼはエシェリヒア・コリ由来である、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、51位でのAsnからLys、91位でのArgからHis、および233位でのHisからTyrの置換を有する三重変異を除き、89〜96位以外の位置の1又は複数の箇所で、1又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を含む、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記DNAで形質転換され、かつL−システイン生産能を有する、エシェリヒア属細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地に培養し、同培地にL−システインを蓄積させ、同培地からL−システインを回収する、L−システインの製造法を提供することである。
酵素の三次元構造を正確に評価することにより、fbr突然変異が存在し得るタンパク質フラグメントにおける複数のアミノ酸残基の同時置換によって、天然型に近い活性レベルを持つ変異型タンパク質を構築することができる。
本発明により得られたSATの三次元構造のデータに従って、L−システインとの相互作用に必須であり、かつ、SATのL−システインに対する感受性に関与するSATの新規領域が明らかになった(実施例1参照)。
上記のようなSATの改変は、SAT活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも1残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。SATタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
本発明の細菌は、上記のような変異型cysE遺伝子が導入された、エシェリヒア属に属する細菌である。用語「エシェリヒア属細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。エシェリヒア属に属する細菌の例として、エシェリヒア・コリ(E.coli)が挙げられる。
本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養してL−システインを生成させ、培地に蓄積したL−システインを培地から回収する、L−システインの製造法を含む。
本発明において、培養、培地からのL−システインの回収および精製等は、従来の微生物を用いたアミノ酸の発酵生産法によって行ってもよい。
本発明に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、及び必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。
炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。
窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用され得る。硫黄源としては、硫酸塩およびチオ硫酸塩が使用され得る。
ミネラル類としては、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、第一鉄塩、マンガン塩などが使用され得る。
SATの三次元構造を、以下のようにして決定した。
エシェリヒア・コリで組換えSATを製造するために、ベクターpQE*(Qiagen)を使用して、SATをコードするcysE遺伝子の発現プラスミドを構築した。前記ベクターは、エシェリヒア・コリ発現ベクターpQE30を改変することにより作製された。
セレノメチオニルSATの結晶化を行った。約5日間のうちにX線回折に十分な大きさ(0.2×0.2×0.2mm)に成長した立方晶系結晶が得られた。
高エネルギー物理学研究所(筑波、日本)の放射光実験施設でビームライン6Bに設置された、Quantam4RCCD検出器(ADSC)を使用して、セレノメチオニルSAT結晶の多波長異常分散(MAD)データを収集した。X線回折データの収集前に、X線蛍光スペクトルを記録して、MADデータ収集に最適な波長を選択するのに使用した。X線蛍光スペクトル測定およびデータ収集の間、セレノメチオニルSAT結晶を、35v/v%の2−メチル−2,4−ペンタンジオール、0.1Mの2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸−NaOH(pH6.2)、および1mMのL−システインを含む低温溶媒(cryo−solvent)に対する平衡化後、95Kでフラッシュ冷却した。データを、0.9791Å(蛍光スペクトルの変曲点、f’最小)、0.9789Å(f’最大)、0.9500Å(遠隔高エネルギー波長)、および1.0500Å(遠隔低エネルギー波長)で収集した。4つのデータセット全てを、220mmの結晶対検出器距離で、かつ1画像あたり1.0°の振幅を用いて、同一結晶から収集した。DPS/MOSFLMプログラム(Rossman,M.G.,and van Beek,C.G.(1999)Acta Crystallogr.Sect.D55,1631−1640)を使用して、回折データを処理した。セレノメチオニルSATの結晶は、2.7Åまでの分解能で回折した。これは空間群R3に属し、単位胞ベクトル(unit cell dimensions)a=101.2Å、c=223.2Åを持つ。結晶は、35.3%の溶媒含有量で、非対称単位あたり4個のセレノメチオニルSAT分子(分子A,B,C、およびD)を含む。
MADデータを、CCP4(Beiley,S.(1994)Acta Crystallogr.Sect.D50,760−763)プログラムSCALEITとともにスケーリングした。SOLVEプログラム(Terwilliger,T.C.,and Berendzen,J.(1996)Acta Crystallogr.Sect.D52,743−748)を使用して、非対称単位中で予想される36個のうち19個のSe部位を決定した。CCP4中のMLPHAREプログラムで初期MAD位相を計算した。最終的な性能指数値(figure of merit value)は0.541となった(40.0−2.7Å分解能)。
図2は、SATのオリゴマー構造を示す。図1に示されるとおり、SATは32点対称の六量体構造を形成する。3つの非結晶学的2倍軸で相関する二量体が結晶学的3倍軸で相関している。
<1>無作為化フラグメントによる変異誘発
はじめに、2つのプラスミド、pMW−PompCおよびpMW−PnlpDを得た。
さらなる実験のために、エシェリヒア・コリLE392cysE::KmR株をレシピエント株として使用した。この株は、エシェリヒア・コリLE392株(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,1989)のcysE遺伝子を破壊することにより得られた。カナマイシン耐性遺伝子の導入によるcysE遺伝子の破壊は、Kushner,S.R.,H.Nagaishi,and A.J.Clark.(Proc.Natl Acad.Sci.USA,1972,69:1366−1370)により記載の方法により、JC7623株を使用して行った。
変異型SATの触媒性を、Kredich,N.M.and Tomkins,G.M.(J.Biol.Chem.,1966,241,21,4955−965)により記載される方法を若干変更して、決定した。使用したアセチルコエンザイムAおよび他の試薬は、Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)製を用いた。
L−システイン製造における変異型cysE遺伝子の発現向上の効果の評価のため、エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC47076,ATCC700926)を親株として使用した。
Claims (7)
- 野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの89〜96位に相当するアミノ酸配列が1又は複数の変異を含み、かつ、L−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
- 野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの89〜96位に相当する前記アミノ酸配列が、配列番号4、5、6、7、8及び9から選ばれるのアミノ酸配列のいずれか1つで置換され、かつ、L−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、請求項1に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
- 野生型セリンアセチルトランスフェラーゼはエシェリヒア・コリ由来である、請求項1又は2に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
- 51位でのAsnからLys、91位でのArgからHis、および233位でのHisからTyrの置換を有する三重変異を除き、89〜96位以外の位置の1又は複数の箇所で、1又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするDNA。
- 請求項5に記載のDNAで形質転換され、かつL−システイン生産能を有する、エシェリヒア属細菌。
- 請求項6に記載の細菌を培地に培養し、同培地からL−システインを回収する、L−システインの製造法。
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