CN101194163A - 新型疗法和筛选治疗化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，所述方法包括使测试物质与蛋白酶体接触并检测它们之间导致蛋白酶体结构发生变化的相互作用。按照此方法鉴定的物质在治疗癌症以及病毒感染的细胞和细菌方面有用，并形成本发明进一步的方面。

Description

新型疗法和筛选治疗化合物的方法
本发明涉及筛选化合物的方法，用以评价该化合物杀死细胞的能力，具体而言是肿瘤细胞以及细菌细胞或病毒感染细胞，同样涉及用于治疗的杀死细胞的新型试剂，例如用于肿瘤的治疗。
HAMLET(人α-乳清蛋白制成的肿瘤细胞致死因子)(Humanα-lactalbumin made lethal to tumor cells)是一种分子复合物，其诱导肿瘤细胞的细胞死亡。实际上，这种作用对于肿瘤细胞和一些未成熟细胞是选择性的，而健康的分化细胞并不响应HAMLET而经受细胞死亡。这种选择性意味着HAMLET触及到肿瘤细胞中的独特靶标，而在耐受细胞中则未触及。
如本文所使用的，术语″HAMLET″指α-乳清蛋白的生物学活性复合物(其可以是或者可以不是人类来源的)，其可以通过从在pH4.6下被沉淀下来的乳的酪蛋白级分中分离，通过例如在EP-A-0776214中所述的阴离子交换色谱和凝胶色谱的组合而获得，或者通过在存在来自人乳酪蛋白的辅因子，如WO99/26979中所述的表征为C18:1脂肪酸的情况下将α-乳清蛋白经离子交换色谱而获得。具有相似活性的这种复合物的生物学活性变体或衍生物在例如国际专利申请号PCT/IB03/01293中被加以描述。
HAMLET在许多不同的体外肿瘤细胞系中引发凋亡样死亡(apoptosis-like death)。白血病细胞最为敏感，而癌、黑素瘤和胶质母细胞瘤细胞系均死于HAMLET，并伴有凋亡样特征。成熟的分化细胞对于HAMLET是耐受的，如其存活力以及完好的细胞形态所显示，而胚细胞则表现为部分响应。HAMLET广泛的抗肿瘤活性是似非而是的(paradoxical)，因为肿瘤细胞通常对于指导正常细胞死亡的凋亡信号是耐受的。肿瘤细胞携带着突变，该突变打乱了传统凋亡是涉及的主要信号通路，包括p53和bcl-2基因家族，而HAMLET的作用独立于这些通路，表明HAMLET复合物具有鉴别基本的细胞死亡程序的能力，该细胞死亡程序在肿瘤细胞中保持活跃，而在成熟的分化细胞中则失去了。近来，已表明HAMLET在人大鼠胶质母细胞瘤异体移植物模型中同样在体内引发了选择性肿瘤细胞凋亡，并且表明在安慰剂对照临床研究中HAMLET局部应用于皮肤乳头瘤上能够减少或消除损害。
HAMLET的细胞靶标已通过共聚焦显微术与亚细胞分级的组合而被检测[Hakansson et al.，1999 Exp Cell Res.246，451-60]。HAMLET结合于细胞表面，并进入细胞质，在那里它与线粒体相互作用并使其活化。最终，此蛋白质进入细胞核，在其中积聚。
申请人已发现耐受细胞和敏感细胞以相似的效率将HAMLET结合于其表面，表明这并不是产生差异的事件。相反，细胞核内的积聚仅在濒死细胞中发生，表明此步骤将敏感细胞与耐受细胞区分开。通过共聚焦显微术，细胞核积聚似乎是不可逆的，表明存在细胞核靶标，其在细胞核隔室内结合并保留了HAMLET。
申请人已对HAMLET的细胞核内分布进行了更加细致的检测，并已发现该蛋白质优先定位于核仁对应的区域，意味着HAMLET与涉及染色质结构调节的分子相互作用。
作为进一步研究的结果，HAMLET的核靶标被加以鉴定。令人惊讶的是发现HAMLET与特异性组蛋白以及与核小体相互作用。因此，似乎这种相互作用可能是将细胞不可逆地锁入死亡通路的事件。
不过，目前进一步的机制呈现了其自身，其被认为是产生了进一步的筛选方法，该方法将导致进一步的治疗剂和治疗机会。
本发明提供了一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，所述方法包括使测试物质与蛋白酶体接触，并检测它们之间导致蛋白酶体结构变化的相互作用。
为满足测试的要求，该测试物质应当能够与蛋白酶体(有时被称为蛋白体)以产生蛋白酶体结构改变的方式相互作用。一般而言，这些变化将包括蛋白酶体的片段化(fragmentation)。此类差异通过温育后检测蛋白酶体的结构而被适当地加以确定。
一般使用常规的凝胶分离法进行此种类型的结构检测。指示条带尺寸变化的任何的条带显著位移、或者新条带的形成都预示该测试物质已与蛋白酶体以产生结构性变化的方式相互作用。
本发明的方法可以以多种方式进行。例如，本方法可以通过使测试物质与蛋白酶体体外接触并检测它们之间的相互作用来进行。可选地或者额外地，本方法可以通过使测试物质与细胞体外接触，并确定该测试物质是否在细胞中与蛋白酶体共定位(colocalise)并相互作用来进行。
在一种实施方式中，本方法通过使测试物质与完好的蛋白酶体体外接触而实现。合适的蛋白酶体包括例如20S蛋白酶体，诸如人红细胞20S蛋白酶体。所用蛋白酶体的浓度将会影响测试的灵敏度，一般而言，将会在50至500μg/ml的范围内，例如以150μg/ml的浓度。
接触通常在生理学上可接受的pH，例如7.2的缓冲液存在的情况下进行的。适当地，蛋白酶体将在存在选择性的但是可逆的蛋白酶体抑制剂，诸如MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO，Affinity Research)的情况下经过预温育的步骤。
在一种特别优选实施方式中，该物质使蛋白酶体的α6亚基产生变化。这是因为此亚基包含一种核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)。核定位序列的准确氨基酸序列可能会变化，但是一般而言它们是富含赖氨酸的区域。一种具体的NLS序列(KKVKKK)与20S蛋白酶体的氨基酸181-186相对应。
NLS的暴露被认为在使蛋白酶体能够携带该物质进入细胞核方面是重要的，在细胞核中可以最有效地杀死细胞。如下所述，此作用是HAMLET的作用方式所独有的，其具有已知的杀死肿瘤的活性。
可选地，测试物质可以与细胞进行体外温育，并监测该测试物质在细胞中的位置，例如使用共聚焦显微术。在此实施方式中，测试物质被适当地标记，例如在添加之前使用可见的标记，如荧光标记。同样，蛋白酶体的标记结合剂，诸如标记的抗体或其结合片段，被与该物质共同施用，并观察其在细胞中的相对位置。具体而言，合适的蛋白酶体结合剂对蛋白酶体的催化核心是特异性的。
结合剂上的标记可以与测试物质上的标记相同或者不同。合适地，两者都是荧光标记的。
具体而言，对于检测与如上所述的蛋白酶体相互作用而相对耐受蛋白酶的化合物可能是有用的，从而它们进一步的模拟了HAMLET类型的活性。
在一种特别优选的实施方式中，本发明提供了一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使测试物质与蛋白酶接触以检测出至少是部分的蛋白酶抗性；
(b)使测试物质与蛋白酶体体外接触并检测它们之间的相互作用；或者与细胞体外接触并确定测试物质是否与其中的蛋白酶体共定位；以及
(c)选择一种物质，其被发现在步骤(a)中是蛋白酶抗性的并且根据步骤(b)与蛋白酶体相互作用或者与细胞中的蛋白酶体共定位。
步骤(a)和(b)可以按任何顺序执行。在步骤(b)中未产生阳性结果的物质可以被丢弃而不执行其它步骤
步骤(a)通过将该物质与至少一种蛋白酶进行温育而被适当地执行，所述蛋白酶是目标物种诸如哺乳动物，特别是人类的蛋白水解酶。哺乳动物的蛋白酶体表现出多达5种不同的肽酶活性，包括那些优先在疏水残基、碱性残基和酸性残基的羧基末端切开肽的活性，通常被称为胰凝乳蛋白酶样或胰蛋白酶样的活性，或者具有肽基谷氨酰-肽水解活性的酶。
合适的酶包括蛋白水解的肽酶诸如胰凝乳蛋白酶或具有胰凝乳蛋白酶样活性的酶、具有胰蛋白酶样活性的胰蛋白酶，或者具有肽基谷氨酰-肽水解活性的酶。具体而言，所述的酶是胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶。
合适地，该物质与一种以上的此类酶诸如胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶一起温育以确认耐受状态。
步骤(a)中所用的酶量将会根据酶的准确性质、所测试的物质等而有所变化。一般地，所使用酶的浓度将是在按重量计1/20至1/200的范围内。例如，胰蛋白酶可能以按重量计E/S1/50使用，而胰凝乳蛋白酶则以按重量计E/S1/100使用。
温育是在生理学上可接受的温度例如在37℃下适当地进行。
为使测试物质满足测试(a)，该物质应当表现出对蛋白酶的至少部分抗性。因此，适当地，该物质在10分钟以内的一段时间内将不会被完全降解，且优选的不少于1小时。
在每一情形中，降解过程可以通过检测蛋白质片断而被测定。这可以使用常规的方法来完成，诸如在凝胶上进行蛋白质分离，例如使用凝胶电泳，且尤其是SDS-PAGE或者蛋白质免疫印迹。
以上步骤(b)将按照如上所述与本发明的方法相关的内容执行。
按照此方式鉴定的测试物质将成为抗癌药物良好的候选对象，原因是它们将模拟HAMLET的行为。然而，它们可能额外地被用于杀死不想要的细胞，诸如被病毒感染的细胞，或者细菌诸如肺炎双球菌(Pneumococci)。
用于上述方法的合适的测试物质包括化学化合物，以及蛋白质或肽。它们可以从化合物收藏库(collection)或文库中获得，或者可以被合成而用于筛选过程。
特别优选的测试物质将是蛋白质或蛋白质复合物，并且具体而言，将包括内源蛋白，其处于一种解折叠状态。
细胞质量控制系统对蛋白质的合成进行检查，以确保不稳定的或未折叠的产物被清除。新合成的蛋白质被核对，而折叠有缺陷的品种则成为蛋白酶体降解作用的目标。较大的26S蛋白酶体复合物催化泛素化蛋白的ATP依赖型降解，该泛素化蛋白被装填进圆桶形的蛋白酶体复合物的20S核心。此外，20S蛋白酶体降解解折叠的蛋白质，其无需泛素标签被识别。内源性的错折叠蛋白质未充分清除可能会激活解折叠蛋白质反应(the unfolded protein response，UPR)，并伴有生长停滞(growtharrest)和调亡，不过用以降解从细胞外环境进入细胞的解折叠蛋白质的机制尚未被讨论过。
申请人已研究了针对HAMLET的死亡反应是否涉及蛋白质的解折叠状态，以及蛋白酶体的识别。结果表明蛋白酶体的受损以及解折叠蛋白质的过载是响应于HAMLET的肿瘤细胞死亡的一种基本特征。
成熟的经折叠的蛋白质可以被分泌进入细胞外环境，它们在其中履行其功能。三级构象的改变可能是在对环境信号变更作出响应时发生的，不过，多肽链的解折叠被认为是暴露新的结构域并获得功能多样性的机制。申请人已发现解折叠蛋白的摄入通过扰乱清除内源性错折叠蛋白质的细胞机器而引起肿瘤细胞的死亡。肿瘤细胞死亡是由HAMLET引发的，其为部分解折叠的α-乳清蛋白和脂肪酸辅因子的复合物。
20S蛋白酶体被激活，但是HAMLET复合物被缓慢降解，而反过来该蛋白酶体在结构上被改变。核定位序列(NLS)被暴露，而肿瘤细胞通过将HAMLET和激活的蛋白酶体移入细胞核而作出响应，在细胞核中，染色质结构中的蛋白酶体依赖型变化发生。因此，降解HAMLET的失败以及受挫的蛋白酶体的反应导致核内积聚和肿瘤细胞死亡。20S蛋白酶体在防御外源性解折叠蛋白方面的这种作用以前尚未被描述过。对蛋白酶体的“抢劫”似乎有可能与细胞对其他解折叠蛋白的反应相关，包括那些从细胞外环境中进入细胞的蛋白质。
解折叠蛋白反应(UPR)已经演化为一种使细胞能够在不需要的蛋白质发生积聚的情况下存活的机制。内在的解折叠蛋白的生理学清除是通过细胞溶质中ER-相关的降解作用、通过分子伴侣和折叠酶(foldase)以及通过对转录和翻译的影响而产生的蛋白质合成的抑制来完成的。生长停滞可能源于泛素系统的失活以及通过20S蛋白酶体进行的细胞周期蛋白的功能障碍的再生(dysfunctional recycling)。26S蛋白酶体的失灵同样可能会由于阻碍了IκB抑制物的降解而削弱NF-κB依赖型转录活性。但是，如果解折叠蛋白负担超过正常ER-稳态的临界水平，似乎蛋白酶体的压力可能导致细胞死亡。
细胞死亡反应可以通过ER中的caspase-12的活化或者通过传统的凋亡而被完成，其涉及线粒体、caspases和bcl-2/p53基因家族。
当蛋白质无法折叠并且变得无法经受蛋白酶体降解时，UPR的致死阶段被激活。错折叠可能来源于突变，其改变了二级结构并且永久地破坏了蛋白质的折叠能力，或者来源于由UV辐射或化学损伤所造成的合成后损伤。
但是，α-乳清蛋白不是突变或受损的蛋白质，而是由乳腺分泌的天然的折叠蛋白质。HAMLET可以在细胞外形成，而正是HAMLET进入肿瘤细胞胞质将肿瘤细胞暴露于解折叠形式的α-乳清蛋白。此处所报道的工作表明HAMLET被降解内在的解折叠蛋白质的细胞机器鉴定为解折叠蛋白。对HAMLET的反应表现出许多UPR的特征，但主要差异也被提及。如同其他解折叠蛋白，HAMLET被靶向至20S蛋白酶体，但HAMLET比解折叠的α-乳清蛋白更耐受降解作用。经HAMLET处理的细胞表现出ER相关的变化，包括ER膨胀，热休克反应以及翻译的终止(数据未显示)。
HAMLET已被表明能够引发线粒体反应以及caspase-依赖型染色质变化，但是HAMLET并不是通过经典的调亡作用杀死肿瘤细胞，如存在caspase抑制物时肿瘤细胞的存活所显示的。而且，肿瘤细胞的HAMLET敏感性并未由于抗-调亡的bcl-2家族成员的过量表达或者由于变体p53的表达而有所变化。因此，结果表明HAMLET是通过一种新的机制来引发细胞死亡的，该机制涉及20S蛋白酶体的活化和蛋白酶体依赖型功能紊乱。
哺乳动物蛋白酶体包括20S核心微粒(700KD)，其可能与一种或两种19S调节微粒结合。催化单元是一个圆筒，由四个堆叠环组成，每个环带有七个亚基(α1-7，β1-7，β1-7，α1-7)，而催化腔是由两个内部的β环形成，其每一个都含有3个活化的蛋白水解位点。由于对涉及细胞周期调控和染色质稳态的蛋白质的不当监测，蛋白酶体的抑制产生了一种UFR样的状态。本研究基于体外研究关注20S蛋白酶体，该体外研究表明20S蛋白酶体降解了解折叠形式的α乳清蛋白。此结果证实了HAMLET中解折叠的α乳清蛋白对于体内肿瘤细胞中20S蛋白酶体的亲合力，表明该蛋白酶体将HAMLET识别为解折叠的α乳清蛋白。
消化HAMLET复合物的失败可能引起未消化HAMLET的积压并造成解折叠蛋白的延迟装载，该蛋白占据了蛋白酶体的核心并阻碍了其他解折叠蛋白接近酶促位点。因此，HAMLET可能会通过占据而非通过抑制酶促活性来干扰20S蛋白酶体的功能。HAMLET并不是作为蛋白酶体抑制物而发挥作用，不过，蛋白酶体的活性被表明对于细胞死亡是必须的。我们推论UPR与对HAMLET的细胞死亡反应的机制不同于由蛋白酶体抑制物启动的反应。
HAMLET被表明刺激了20S蛋白酶体中的结构修饰。20S蛋白酶体片段化的证据是在与HAMLET温育几分钟后体外获得的。此前，α-亚基中的次要构象变化已被描述。对布氏锥虫(Trypanosoma brusei)的结构研究已表明11S激活物通过对α-亚基的修饰打开了蛋白酶体的入口。对酵母蛋白酶体的功能研究确认了此作用，因为α亚基的N-末端缺失足以使蛋白酶体的肽酶活性被破坏并打乱其余的孔残基。本研究检测到了α3亚基的结构修饰，表明HAMLET有可能通过诱导N末端缺失而对此亚基产生直接的影响，从而抑制核心的开放和蛋白水解作用。此外，α1和α3结构亚基如β1和β5催化亚基一样被修饰。蛋白质大小的显著减少通过PAGE和蛋白质免疫印迹在这些亚基中被发现。对细胞激动剂作出响应的蛋白酶体的片段化，以前未被描述。我们提出HAMLET引起了体内蛋白酶体的片段化，并且这可能是细胞死亡的一条重要途径。
蛋白酶体在细胞质和细胞核中均有发现，并且在细胞周期进程期间穿梭于在这些隔室之间。以前的研究已表明蛋白酶体在对调亡刺激响应时离开了细胞核，而在本研究中，HAMLET和蛋白酶体被显示为移向细胞核。对于HAMLET和20S蛋白酶体的这种核易位的一种可能的机制可被讨论。若干种蛋白酶体的亚基含有NLS KKXK基元以及与NLS互补的假定基元，并可能调节核易位。由HAMLET引起蛋白酶体片段化被提出是暴露了α6亚基中的NLS基元。这些片段可能保持附着于HAMLET/蛋白酶体复合物上，并进一步有助于HAMLET和蛋白酶体的核易位。细胞核中此类复合物的存在是通过共聚焦显微术来加以证明的，其显示了两种分子在核聚集体中完全的共定位。似乎HAMLET诱导的20S蛋白酶体结构修饰可为HAMLET和蛋白酶体的核易位提供了一种机制。
迄今为止，降解解折叠蛋白的失败仅被描述为疾病的原因。淀粉样纤维形成聚合体，其在阿尔茨海默氏症中引起细胞死亡和组织损伤，而朊蛋白疾病可能是由相似的机制引起的。对HAMLET的细胞反应与对此类错折叠蛋白质的反应相类似，但与淀粉样蛋白沉淀相反，HAMLET具有有益的作用。因此，HAMLET如何能够成为癌细胞的选择性杀手而对正常的细胞无毒呢？最重要的特征有可能是解折叠的HAMLET侵入肿瘤细胞，继而发生蛋白酶体反应。相反，淀粉样纤维似乎无法在细胞类型之间进行区分，而是在其沉积的部位引起总体的组织损伤。另一个重要的不同之处有可能是在于对蛋白水解降解的敏感度。不同于朊蛋白或淀粉样蛋白沉积，HAMLET最终是被蛋白酶体的酶类降解，这表明带有凋亡标签的濒死的肿瘤细胞和它们的HAMLET负载可能会被巨噬细胞依赖型机制所清理并从组织中去除。相反，淀粉样纤维形成持久的细胞外沉积，在此情况下的组织损伤机制或解决办法还不清楚。
因此，在进一步的方面，本发明提供了一种用于杀死细胞的试剂，其与细胞的蛋白酶体相互作用从而导致蛋白酶体结构变化，诸如片段化，前提是所述试剂不是HAMLET或它的已知生物学活性的修饰，或者它们之一的生物学活性片段。具体而言，该试剂是一种激活细胞的蛋白酶体但对该蛋白酶体的降解作用具有抗性的试剂。
在此情况下，细胞适当地是癌细胞、细菌或病毒感染的细胞。
为形成生物学活性复合物，α-乳清蛋白一般要求构象或折叠的变化，以及脂类辅因子的存在。构象的变化是通过从α-乳清蛋白中去除钙离子而被适当地实现的。在一种优选的实施方式中，这通过使用α-乳清蛋白的变体而被辅助，该变体不具有功能性的钙结合位点。
含有此类变体的生物学活性复合物被包括在如此处所用的术语HAMLET的“已知生物学活性修饰”中。这些在WO 99/26979或WO03/074547中被具体地加以说明并进行权利要求，其内容在此被通过引用并入本文。
如此处所用，表达方式“变体”指与基础蛋白质同源的多肽或蛋白质，其适当地是人或牛α乳清蛋白，但其不同于其所来源的基础序列，因为该序列中的一个或多个氨基酸被其他氨基酸所取代。氨基酸取代可能被称为“保守型”，如果一种氨基酸被具有广泛相似特性的不同氨基酸所替代。非保守型取代是其中氨基酸被不同类型的氨基酸所取代。宽泛的说，在不改变多肽的生物学活性的情况下，非保守型取代可能更少。适当地，变体将会是至少60％同一的，优选地至少70％，更优选地80％或85％，且特别优选的是90％、95％或98％或者更高的同一性。
在为确定同一性程度而比较氨基酸序列时，程序诸如BESTFIT和GAP(两者均来自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)softwarepackage)。BESTFIT，例如，比较两种序列并产生最相似片段的最佳比对。GAP使序列能够沿其全长进行比对，并通过在任一序列中适当地插入空缺而找到最佳的比对。适当地，在本发明的上下文中，当讨论序列同一性时，是通过沿序列全长进行比对来完成比较的。
术语“其片段”指给定氨基酸序列的任一部份，其将形成与包括完整的α-乳清蛋白氨基酸序列的复合物具有相似活性的复合物。
具体而言，该试剂将包括蛋白质或包含蛋白质(除α乳清蛋白或其变体以外)的蛋白质复合物，该蛋白质至少是部分解折叠或错折叠的。该蛋白质可以是内源性蛋白质。优选地，其在解折叠状态下被稳定化，例如通过合适辅因子的存在。在HAMLET的情况下，合适的辅因子是在人乳的含酪蛋白级分中发现的脂类或脂肪酸，诸如cis C18:1:9或C18:1:11脂肪酸，或者具有相似构型的不同脂肪酸。具体而言，辅因子是油酸。
蛋白质的解折叠，例如形成被称为″apo″的状态，可以使用常规方法来完成。例如，蛋白质诸如α-乳清蛋白在暴露于低pH时经历构象转换。A状态或熔化小球状态具有天然的二级结构，但与天然状态相比，很好定义的三级结构更少。α-乳清蛋白的相似状态同样可以在中性pH下，在去除紧密结合的Ca2+离子时，在还原二硫键时或者在升高温度时形成。
然而，可替换地，该试剂可以包括突变形式内源性蛋白，其中结合位点，诸如钙结合位点，或半胱氨酸结合位点已被破坏，以致该蛋白质的折叠无法被细胞识别为天然折叠形式。
在另一个实施方式中，该试剂可包括内源性蛋白质，其是使用重组的方法在非天然的细胞类型中形成的，这导致了该蛋白质不正确折叠。例如，在原核细胞中表达真核蛋白可能导致不同折叠的蛋白，其可能是不同糖基化方法的结果。因此，重组的内源性哺乳动物蛋白，在原核宿主诸如E.coli中表达，可能形成本发明的试剂。
为了测试该试剂是否具有所需的活性，如上所阐述的筛选方法应当被应用于它们。
为了近一步模拟HAMLET的活性，该试剂可进一步包含靶向试剂(targeting reagent)，其对于肿瘤细胞或未分化细胞是特异性的，诸如肿瘤特异性抗体或其结合片段。
如有必要，它们可以包括合适的易位因子或与之融合，该易位因子使它们能够穿过细胞。易位因子的实例包括来自HIV的tat蛋白或I型单纯疱疹病毒被膜蛋白VP22，或者它们的功能性片段或同源物(参见例如WO 98/32866，以及如WO 99/11809中所述的穿膜肽(Antennapedia)的同源域。)
根据本发明又进一步的方面，提供了一种杀死细胞的方法，所述方法包括将有效量的上述试剂导入细胞。
当该试剂是蛋白质或肽，诸如在靶细胞中以所需的折叠状态表达的突变的内源蛋白或肽时，该蛋白质或肽可以进行细胞内表达。在此情况下，细胞与载体诸如能够进入细胞的质粒载体或病毒载体接触，此载体包含编码该试剂的核酸序列，并在该细胞中表达该序列。载体的具体实例可包括病毒载体，诸如腺病毒或痘病毒载体。
编码此类试剂的核酸也可以是新型的，并可以构成本发明的进一步方面。这些核酸可以被用于载体转化，该载体用以使该试剂在细胞中进行体内表达。它们也可以使用重组的方法用于生产该试剂本身。
因此，这些核酸将会被整合入合适的表达载体，其被用于转化宿主细胞，该细胞可以是真核的或原核的，但优选地是原核细胞。这些载体和细胞构成了本发明进一步的方面。
具体而言，此类试剂将应用于病症诸如癌症的治疗，并且这些方法还构成了本发明进一步的方面。包含此类试剂的药物组合物构成了本发明的另一方面，其中该试剂与制药上可接受的载体组合，以适宜的剂量单位，并遵照本领域的标准惯例。
现在，本发明将通过实施例的方式进行具体描述，参考如下所述的附图。
图1.HAMLET侵入肿瘤细胞。A549肺癌细胞中HAMLET(A，B)和α-乳清蛋白(C)的结合与摄入。(D)流式细胞术定量。(E)肿瘤细胞(人成胶质瘤细胞、人肾癌细胞(A498)和正常细胞(星形胶质细胞和人肾细胞(HRTEC))之间的HAMLET摄入差异。将细胞用34μM的HAMLET或α-乳清蛋白处理1小时。共聚焦图像显示了经Alexa Fluor 568标记的HAMLET(上图)以及相对应的光学透射图像(下图)。
图2.HAMLET复合物。(A)HAMLET是来自人乳的α-乳清蛋白和油酸的分子复合物。当牢固结合的Ca2+离子被释放时，HAMLET的形成有赖于α-乳清蛋白采取部分解折叠的构象的倾向。因此，此蛋白变为部分解折叠并暴露出脂肪酸结合位点，此位点允许油酸(C18:9，9cis)与之相互作用并使部分解折叠的蛋白构象稳定。此结构已被用人α-乳清蛋白，PDB ID：1HML(54)和MOLMOL 2K.2(55)的晶体结构生成。(B)近UVCD光谱学。在无EDTA的磷酸钠缓冲液中记录光谱。天然α-乳清蛋白(浅灰色)具有源于酪氨酸残基的最小值250nm和源于色氨酸残基的最大值290nm。部分解折叠的α-乳清蛋白(黑色)和HAMLET(中度灰色)显示出在解折叠蛋白质特有的酪氨酸和色氨酸区域中降低的椭圆率。(C-D)HAMLET部分耐受蛋白酶体酶类的降解作用。天然α-乳清蛋白、HAMLET和部分解折叠的α-乳清蛋白使用蛋白酶体酶类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行体外蛋白水解。片段通过SDS-PAGE检测。
图3.HAMLET与20S蛋白酶体的共定位。(A-C)将A549细胞与34mM HAMLET温育1小时后演化出的三种典型的细胞类型。共聚焦图像显示了带有相应的光学透射图像的Alexa Fluor 568标记HAMLET和20S蛋白酶体染色情况。底部的图示显示了共定位像素/区域(膜泡、细胞质室以及核室)的百分比。黄色人工覆盖图定义了每种细胞类型的共定位像素。
图4.功能性蛋白酶体涉及HAMLET和蛋白酶体易位至肿瘤细胞的细胞核。(A，B)细胞提取物的细胞质级分和细胞核级分中的蛋白酶体活性，该提取物来自用34μM HAMLET或α-乳清蛋白处理1小时的A549细胞。用蛋白酶体抑制剂MG132预处理1小时。蛋白酶体的活性是以从蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶特异性底物suc-LLVY-AMC释放的AMC进行监测的。结果表示为对照细胞提取物活性的百分比。(C，D)A549细胞与34μM HAMLET±MG132温育1小时后，20S蛋白酶体染色强度和蛋白酶体的定位。共聚焦图像显示了20S的染色情况。(E-F)HAMLET在活细胞中的细胞定位±蛋白酶体活性的抑制。A549细胞用MG132或Lactacystin预处理1小时并进一步用34μM HAMLET温育。
图5.HAMLET引发20S蛋白酶体的结构修饰。哺乳动物蛋白酶体包括20S核心微粒(700kD)，其可能与一个或两个19S调节微粒结合。催化单元是一种由四个堆叠环组成的圆筒，每环带有七个亚基(α1-7，β1-7，β1-7，α1-7)，且催化腔由两个内部β-环形成，其每一个都含有三个活性蛋白水解位点。(A)将HAMLET、α-乳清蛋白(34μM)与12μg人20S蛋白酶体混合20分钟后进行PAGE。经HAMLET-处理后，对20S蛋白酶体亚基的若干变化进行检测(见箭头)。将样品在变性的4-12％Bis-Tris(NuPAGE)上跑并用Amido Black染色。(B)用针对人20S蛋白酶体α/β亚基的多克隆抗体通过蛋白质免疫印迹加以证实。HAMLET引发了分子量＜20kDa的新蛋白酶体条带的形成。(C)20S蛋白酶体以及具体地α6亚基的结构，其被HAMLET所修饰。对应于氨基酸181-186的NLS(KKVKKK)在序列中以及在相应的结构域中用浅灰色表示。加下划线的氨基酸表示通过质谱检测的序列。结构是用牛20S晶体结构PDBID：1IRU(31)和MOLMOL 2K.2(55)生成的。
图6.由HAMLET造成的肿瘤细胞死亡部分地依赖于功能性蛋白酶体。对HAMLET的形态学变化(A，B)和染色质反应(C，D)以及由MG132造成的蛋白酶体抑制的作用。A549细胞在用34μM HAMLET刺激之前，在载玻片上生长3小时±用MG132预温育1小时。对于染色质反应，将细胞在4％PFA中固定并用DNA标记物TOPRO-3染色。
实施例
材料与方法
天然α-乳清蛋白、未折叠的α-乳清蛋白和HAMLET。α-乳清蛋白是由人乳中纯化而来(Svensson et al.Proc.Natl.Acad Sci.USA(2000)97：4221-4226)或者购自Sigma(St.Louis，MO，U.S.A.)。如所述，HAMLET由解折叠的α-乳清蛋白制得(Svensson et al.supra)。简而言之，将该蛋白质用EDTA解折叠，并通过离子交换色谱，在一种经C18:1，9cis脂肪酸预处理的DEAE-Trisacryl M(BioSepra，France)柱上与油酸结合。为进行实时共聚焦显微观察，将HAMLET偶联于Alexa Fluor 568(Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon，U.S.A.)。
蛋白水解作用。天然α-乳清蛋白、HAMLET或者部分解折叠的α-乳清蛋白用蛋白酶体酶类进行体外蛋白水解。蛋白样品被溶解于10mM乙酸铵，pH7.5。天然α-乳清蛋白中存在200μM乙酸钙，而解折叠的乳清蛋白是在200μM EDTA中。将混合物与胰蛋白酶(E/S按重量计1/50)和胰凝乳蛋白酶(分别为E/S按重量计1/100)一起温育，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测片段化。
细胞系。人肺癌细胞系A549(CCL 185，ATCC)、人成胶质细胞瘤D54和人肾癌A498(HTB44，ATCC)如所述进行培养(Hakansson et al.(1994)Infect.Immnun.62：2707-2714，Hedlund et al.J.Exp.Med.(1996)183 1037-1044)。人非转化的星形胶质细胞(CC-2565，Cambrex，LaJolla，CA，USA)，按照生产商使用说明接受补充了抗坏血酸、rhEGF、GA-1000、胰岛素、L-谷酰胺和3％FBS的星形胶质细胞生长培养基。人肾上皮细胞，HRTEC，如所述，分离自3岁男孩的肾脏。
细胞成像。从组织培养瓶中收获细胞，并使其在补充了5％胎牛血清(FCS)的各种培养基中(见上)附着于8-孔载玻片(0.1×106)(Nalge Nunc，Naperville，IL，USA)3小时。将附着的细胞用PBS清洗两遍，暴露于0.5mg/ml Alexa Fluor 568标记的HAMLET或α-乳清蛋白(在RPMI培养基中，Gibco/BRL，Life Technology Ltd.补充了非必需氨基酸(1∶100稀释，NEAA)、1mM丙酮酸钠和50μg/ml的庆大霉素)并在37℃下温育。在用HAMLET或α-乳清蛋白温育1小时后，加入5％FCS。将细胞在PBS中清洗一次，并在LSM 510 META系统(Carl Zeiss AB，Germany)中通过共聚焦显微术加以分析。共聚焦扫描是用同一设置进行记录。光学切片为1.0μm。荧光强度使用LSM META 510软件套装(Carl Zeiss AB)进行定量。为测量亚细胞室(表面，Su；细胞质，Cy；细胞核，Nu)中的荧光强度，将感兴趣的区域(ROIs)根据相应的微分干涉相差(DIC)图像进行手动定位。
将附着于8-孔载玻片的A549细胞(0.1×106)用Alexa Fluor标记的HAMLET处理1小时，如上所述。将载片进一步在4％PFA中固定10分钟，在PBS中清洗一次，在0.01％PBS-Saponin/5％FCS中渗透处理20分钟并在室温下与第一抗体温育1小时，与第二抗体温育1小时。将带有解离细胞的上清在1500rpm下细胞离心5分钟至载玻片上并分别进行分析。针对20S蛋白酶体α/β亚基的单克隆抗体(PW8265，AffinityResearch，Denvon，UK)或多克隆兔抗体(PW8155，Affinity Research)被用于检测20S蛋白酶体。第二抗体是兔抗-小鼠-Alexa 488或山羊抗-兔-Alexa 488(Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon，U.S.A.)。通过共聚焦显微术进行共定位分析，使用LSM META 510软件套装(Carl Zeiss)，并且图像对应于1.0μm的细胞切片。
蛋白酶体活性。将细胞(2×106)在PBS中清洗一次并在低渗缓冲液(10mM HEPES、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.01％NP-40、0.2mM PMSF、0.5mM β-巯基乙醇，pH7.9)中重悬。将细胞在冰上膨胀10分钟。1500rpm下离心10分钟收集细胞核。收集上清作为细胞质级分并储存于-70℃。将细胞核级分重悬于低盐缓冲液(20mM HEPES、25％甘油、1.5mMMgCl2、20mM KCl、0.2mM EDTA、0.01％NP-40、0.2mM PMSF、0.5mM β-巯基乙醇，pH7.9)，随后在涡漩振荡过程中滴加高盐缓冲液(20mM HEPES、25％甘油、1.5mM MgCl2、1M KCl、0.2mM EDTA、0.01％NP-40、0.2mM PMSF、0.5mM β-巯基乙醇，pH7.9)以提取核蛋白。细胞核级分作为上清在16000rpm下离心30分钟加以收集并储存于-70℃直至使用。使用BSA作为标准，用DC蛋白检验对总蛋白浓度进行定量(BioRad，CA，U.S.A.)。荧光底物Suc-Leu-Leu-VAL-Tyr-7-酰胺-甲基香豆素(suc-LLVY-AMC，25mM)，其对蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶活性为特异性的，加入至20mM TRIS-HCl(pH7.5，总体积200μl)中的10μg细胞提取物中。在37℃下，使用Novostar荧光分光光度计(BMG，Offenburg，Germany)在350/440nm激发/发射波长下监测该反应30分钟。
蛋白酶体的抑制。将细胞用25μM选择性的但是可逆的蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO，Affinity Research)预温育1小时。为了体外研究，用MGl32预温育15分钟。不可逆的蛋白酶体抑制剂Lactacystin(1.5μM)被用于HAMLET定位研究以验证蛋白酶体抑制作用的效果。
HAMLET与20S蛋白酶体的体外混合。
HAMLET、α-乳清蛋白(34μM)在20μl反应缓冲液(20mM Tris，pH7.2，1mM EDTA，1mM DTT)中与3μg人红细胞20S蛋白酶体一起温育1小时。蛋白酶体的抑制作用是通过与25μM MGl32(Calbiochem)一起预温育10分钟而被诱导的。将样品在变性4-12％Bis-Tris(NuPAGE)上跑，并免疫印迹至PVDF膜，用针对20Sα/β亚基(1∶1000)的第一小鼠多克隆抗体(PW8155，Affinity Research)和偶联于HRP的第二兔抗小鼠抗体(1∶1000)进行检测。第二块同样的凝胶被印迹并用小鼠单克隆α-乳清蛋白抗体(DAKO)进行探测。
MALDI-TOF(基质辅助激光解吸附/电离，飞行时间)。
在HAMLET与20S蛋白酶体进行体外混合并在SDS-PAGE上分离亚基后，挑选一些条带用以进一步鉴定。在使用M@LDITM-LR HT设备(Micromass，Manchester，England)进行质谱分析之前，将条带从凝胶中提取出来并用胰蛋白酶处理。使用MASCOT进行分析)。
对HAMLET的细胞反应。
对附着细胞和解离细胞针对经HAMLET处理后的染色质凝聚变化进行检测。将载片在4％PFA中固定10分钟，在PBS中清洗一次，用0.01％PBS-Saponin/5％FCS渗透处理20分钟并用TOPRO-3 DNA探针(Molecular Probes)染色5分钟。解离细胞在1500rpm下细胞离心(cytospin)5分钟至载玻片上并分别分析。细胞核中染色质凝聚程度是通过共聚焦显微术(LSM 510 META system，Carl Zeiss AB)和荧光强度的定量测量来加以确定的。
结果
HAMLET侵入肿瘤细胞
肿瘤细胞对HAMLET的摄入在1小时后通过共聚焦显微术进行检测，并与α-乳清蛋白进行比较(图1)。HAMLET结合于癌细胞表面，大量穿过膜进入细胞质并在细胞核中积聚(图1A和B)。肿瘤细胞经历大量的形态学变化，以凋亡样形态死亡。未处理的细胞为圆形，具有平滑的细胞轮廓，而在暴露于HAMLET以后，它们变得不规则，带有细胞质小泡，并且尺寸减小，形成凋亡小体(图1A)。天然α-乳清蛋白以更低的效率结合于肿瘤细胞，少量被内在化并且未观察到易位至细胞核(图1C)。α-乳清蛋白处理的细胞以完整的细胞形态存活至少24小时。通过流式细胞术，HAMLET-和α-乳清蛋白之间在摄入方面的巨大差异被证实(图1D)。
随后，对肿瘤细胞与相同组织来源的正常细胞进行比较(图1E)。HAMLET被恶性星形胶质细胞瘤或人肾癌细胞迅速内在化，该细胞经历了典型的形态变化。相反，在原代肾细胞培养物中几乎没有可检测到的HAMLET摄入，而且该细胞保持完好和充足的活力。人星形胶质细胞内在化一些HAMLET而并未形成更大的聚合体，而且没有易位至细胞核或产生形态或存活力的变化。我们推论HAMLET的摄入是肿瘤细胞的一种特征，该细胞以凋亡样特征死去。
HAMLET对于由蛋白酶体的酶活性产生的降解作用是具有抗性的。
HAMLET的流入将肿瘤细胞的细胞质暴露于大量部分解折叠的蛋白质。通过α-乳清蛋白的解折叠和油酸的结合而形成HAMLET的过程在图2A中被说明。天然的和解折叠的α-乳清蛋白以及HAMLET之间三级结构的差异通过圆二色(CD)谱(图2B)被加以证实。
错折叠的蛋白质在哺乳动物细胞的蛋白酶体中被降解。哺乳动物20S蛋白酶体显示出三种主要的肽酶活性，被称为胰凝乳蛋白酶样、胰蛋白酶样和肽基谷氨酰-肽水解活性。使用天然的α-乳清蛋白和部分解折叠的α-乳清蛋白作为对照，对HAMLET对于蛋白水解降解作用的敏感度进行体外检测(图2A-B)。天然α-乳清蛋白对胰蛋白酶具有抗性并在54小时后保持完好，而部分解折叠的α-乳清蛋白则在5分钟内被降解。HAMLET对胰蛋白酶比部分解折叠的α-乳清蛋白更耐受，需要六小时降解(图2C)。用胰凝乳蛋白酶也表现了HAMLET蛋白水解降解过程中相似的延迟。天然α-乳清蛋白在29小时后保持完好，部分解折叠的α-乳清蛋白在5分钟后被完全降解，而HAMLET需要2小时(图2D)。
HAMLET和20S蛋白酶体的细胞质与细胞核共定位
如果HAMLET以与内源性错折叠蛋白相同的方式被感知，那么将会预期蛋白酶体将降解此复合物。体外研究已表明20S蛋白酶体可以降解解折叠形式的α-乳清蛋白和相关的溶菌酶C以及酪蛋白，其含有解折叠形式的α-乳清蛋白。使用经Alexa-Fluor 568标记的HAMLET和针对20S蛋白酶体催化核心的抗体，对HAMLET与20S蛋白酶体间直接相互作用的可能性通过共聚焦显微术加以研究。未处理的细胞表现出微弱且相当均一的细胞质20S蛋白酶体染色而无细胞核染色。在HAMLET暴露1小时后，观察到三种共定位模式。细胞质20S蛋白酶体与HAMLET共定位，尤其是在细胞质小泡中(图3A)。其他细胞表现出强烈的细胞质共定位(89％)，在细胞核中几乎是完全的共定位(99％)，HAMLET和蛋白酶体在细胞核中形成独特的环状结构(图3B)。第三个细胞群体表现出强烈的细胞核HAMLET染色，但是非常微弱的细胞核20S蛋白酶体染色，并且似乎已经丢失了大部分细胞质(图3C)。总之，在HAMLET处理的细胞中检测到蛋白酶体染色的增强。这些结果表明在肿瘤细胞中HAMLET与蛋白酶体相互作用。
HAMLET-处理细胞中蛋白酶体的活化与再分配
使用荧光底物，在细胞质和细胞核提取物中，对HAMLET对于蛋白酶体活性的体内作用进行定量(图4A)。1小时后，细胞质蛋白酶体活性在HAMLET-处理的细胞中有所增加，但在α-乳清蛋白处理的细胞中则没有。相反，细胞核蛋白酶体活性在HAMLET处理细胞中有所降低(图4B)。蛋白酶体抑制剂MG132阻断了这种作用。结果表明在肿瘤细胞中，与HAMLET的相互作用改变了蛋白酶体的活性。
蛋白酶体的再分配在HAMLET-处理细胞而不是在α-乳清蛋白-处理细胞中被检测到(图3A且数据未显示)。20S蛋白酶体在对HAMLET的早期凋亡反应期间移向细胞质外围。细胞质蛋白酶体染色在HAMLET处理后增加至1.8倍(与对照相比p＜0.001)。此外，蛋白酶体移向细胞核，如通过在细胞核染色中的22-倍增加所示(与对照相比p＜0.001)(图4C)。再分配被证明需要蛋白酶体活性(图4C和D)。MG132抑制了HAMLET-诱导的细胞质染色以及蛋白酶体的细胞核积聚的增加(与对照相比p＜0.001)。结果表明20S蛋白酶体被HAMLET激活以及不能消化复合物引起蛋白酶体向细胞外周和细胞核再分配。
HAMLET的细胞核积聚涉及蛋白酶体活性。
由于α-乳清蛋白缺乏已知的核定位序列(NLS)，所以HAMLET向细胞核的运输尚未被解释。在本研究中，蛋白酶体的活化被表明同样涉及于HAMLET的细胞核易位(图4D-E)。利用MG132的蛋白酶体抑制作用被证明将细胞核中带有HAMLET的细胞数由55％减少至21％，且Lactacystein引起79％至34％的减少(p＜0.05)。结果表明蛋白酶体的活化对于HAMLET的细胞核摄入而言是必须的。
蛋白酶体的修饰与核定位序列的暴露。
若干个20S蛋白酶体的α亚基携带核定位序列(NLS)。KKXK基元在对某种细胞周期调节蛋白作出反应过程中被暴露，并在转录期间促进蛋白酶体的核易位。因此，由HAMLET导致的20S蛋白酶体的活化可能暴露了NLS，其反过来可能帮助蛋白酶体与HAMLET进行核易位。此假设通过混合HAMLET与完整的蛋白酶体而进行体外检测。蛋白酶体的片段化在温育20分钟后通过SDS-PAGE进行检测，并使用Mascot软件，通过质谱对该片段加以鉴定。20S蛋白酶体亚基的若干变化被加以检测(见图5A中的箭头以及在和C中的蛋白酶体的分子模型)。条带1包含结构性的α3亚基和αβ亚基，其含有完整蛋白酶体中的细胞核KKXK基元。但是，对应于□6亚基中NLS基元的大量片段在HAMLET处理后缺乏(图5C)。条带3含有结构性的β3亚基。条带4被表明含有具肽基谷氨酰基水解活性的催化亚基β1和具胰凝乳蛋白酶样活性的β5的混合物。所观察到的蛋白匹配高度显著(P值范围1.3×10-19至2.5×10-37)。片段化过程是通过使用针对蛋白酶体的α/β亚基的多克隆抗体进行蛋白质免疫印迹来加以证实的。此抗体识别分子量＜20kDa的新蛋白酶体条带(图5B)。然而，它无法识别其它新条带，如图5A中通过SDS-PAGE所示。
结果表明HAMLET引起了20S蛋白酶体中主要的结构修饰，并表明此过程暴露了HAMLET的核定位信号。
蛋白酶体活性与HAMLET-处理细胞的死亡
蛋白酶体反应在细胞死亡方面的涉及是使用细胞质和细胞核终点进行检测的。在用HAMLET温育1小时后，71％的细胞已经经历了伴有出泡并从载玻片上解离的形态学变化。蛋白酶体的抑制作用将解离减少至29％(p＜0.05，图6A)。蛋白酶体活性同样涉及染色质凝聚。在用HAMLET温育1小时后，64％的肿瘤细胞包含凝聚的或片段化的染色质，而蛋白酶体的抑制作用将染色质凝聚和片段化频率减少至31％(图6B，p＜0.01).

Claims (35)

1.一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，所述方法包括使测试物质与蛋白酶体接触，并检测它们之间导致所述蛋白酶体结构变化的相互作用。
2.根据权利要求1的方法，其通过使所述测试物质与完整的蛋白酶体体外接触，并检测与所述蛋白酶体的相互作用而实现。
3.根据权利要求2的方法，其中所述蛋白酶体是人红细胞20S蛋白酶体。
4.根据权利要求2或权利要求3的方法，其中所述蛋白酶体已经过预温育步骤，所述步骤中存在选择性的但是可逆的蛋白酶体抑制剂。
5.根据前面所述权利要求中任何一项的方法，其中所述测试物质与所述蛋白酶体之间的相互作用是通过检测所述蛋白酶体结构的片段化而进行检测的。
6.根据前面所述权利要求中任何一项的方法，其中所述蛋白酶体结构的变化是使用凝胶分离法进行检测的。
7.根据前面所述权利要求中任何一项的方法，其中选择了使所述蛋白酶体的α6亚基产生变化的物质。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述测试物质与细胞体外温育，并监测所述细胞中该测试物质的位置。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞是使用共聚焦显微术进行监测的。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述测试物质用荧光标记物进行标记。
11.根据权利要求8至10中任何一项所述的方法，其中将用于所述蛋白酶体的标记的结合剂与所述物质共同施用，并观察在所述细胞中的相对位置。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合剂是标记抗体，其对所述蛋白酶体的催化核心是特异性的。
13.一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使测试物质与蛋白酶接触以检测至少部分的蛋白酶抗性；
(b)使测试物质与蛋白酶体体外接触并检测它们之间的相互作用；或者与细胞体外接触，并确定所述测试物质是否与所述细胞中的蛋白酶体共定位；并且
(c)选择在步骤(a)中被发现为蛋白酶抗性并与蛋白酶体相互作用，或者根据步骤(b)与细胞中的蛋白酶体共定位的物质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(a)是通过将所述测试物质与至少一种蛋白酶进行温育而进行的，所述蛋白酶是哺乳动物蛋白水解酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白水解酶是胰凝乳蛋白酶或者胰蛋白酶。
16.根据权利要求13至15中任何一项的方法，其中在步骤(a)中蛋白酶抗性是通过检测由于降解所产生的蛋白质片段来检测的。
17.一种试剂，其与细胞的蛋白酶体相互作用造成其结构变化而用于杀死细胞，前提是所述试剂是HAMLET或者其已知的生物学活性修饰、或者它们两者之一的生物学活性片段以外的试剂。
18.根据权利要求17所述的试剂，其中所述蛋白酶体中的结构变化是所述蛋白酶体的片段化。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂，其中所述试剂使细胞的蛋白酶体活化，但其对于所述蛋白酶体的降解作用是具有抗性的。
20.根据权利要求17至权利要求19中任何一项所述的试剂，其为蛋白质或包含蛋白质(α-乳清蛋白或者其变体除外)的蛋白复合物，所述蛋白质至少是部分未折叠或错折叠。
21.根据权利要求17至权利要求20中任何一项所述的试剂，其包括靶向试剂，该试剂对于肿瘤细胞或者未分化细胞是特异性的。
22.根据权利要求17至权利要求21中任何一项所述的试剂，其进一步包括易位因子。
23.根据权利要求17至权利要求22中任何一项所述的试剂，其是蛋白质或肽。
24.根据权利要求17至权利要求23中任何一项所述的试剂，用于癌症的治疗。
25.一种核酸，其编码根据权利要求23所述的试剂。
26.一种表达载体或者质粒，其包括根据权利要求25所述的核酸。
27.根据权利要求26所述的表达载体或质粒，其是制药上可接受的载体。
28.一种药物组合物，包括根据权利要求17至权利要求24中任何一项所述试剂与制药上可接受的载体的组合。
29.一种药物组合物，包括根据权利要求27所述表达载体或质粒。
30.一种杀死细胞的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求17至权利要求24中任何一项的试剂或者根据权利要求27所述的表达载体或质粒导入所述细胞。
31.一种细胞，其被根据权利要求26所述的载体转化。
32.根据权利要求17至权利要求24中任何一项所述的试剂或者根据权利要求27所述的表达载体或质粒的用途，用于制备治疗癌症的药物。
33.一种筛选用于杀死细胞的测试物质的方法，基本如上文所述。
34.使用根据权利要求1至权利要求16中任何一项所述的方法鉴定的试剂，用于杀死细胞。
35.根据权利要求17所述的试剂，用于杀死细胞，基本如上文所述。
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