JPH11225785A - 内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化 - Google Patents
内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化Info
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- JPH11225785A JPH11225785A JP10342234A JP34223498A JPH11225785A JP H11225785 A JPH11225785 A JP H11225785A JP 10342234 A JP10342234 A JP 10342234A JP 34223498 A JP34223498 A JP 34223498A JP H11225785 A JPH11225785 A JP H11225785A
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、細胞における遺伝子発現を最適化
するための方法を提供する。 【解決手段】 真核細胞中に内在する核酸配列の発現を
変化させる方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）第１の
異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択され
る、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺
伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部
位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、か
つ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の
核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、を含む第１のベクタ
ーでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトした
細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培
養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単
離する、ことを特徴とする上記方法。
するための方法を提供する。 【解決手段】 真核細胞中に内在する核酸配列の発現を
変化させる方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）第１の
異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択され
る、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺
伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部
位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、か
つ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の
核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、を含む第１のベクタ
ーでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトした
細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培
養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単
離する、ことを特徴とする上記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞における遺伝
子発現を最適化するための方法に関する。第１の面で
は、相同的組換えによって異種発現制御配列および／ま
たは増幅遺伝子を細胞のゲノムに導入することによる、
真核細胞中に内在する標的遺伝子の発現を変化させる方
法に関し、また、部位特異的リコンビナーゼにより媒介
される挿入外来ＤＮＡの切除、および他の異種発現制御
配列および／または増幅遺伝子によるその置換に関す
る。本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させるた
めの、相同的組換えによる、アクチベータータンパク質
またはアクチベータータンパク質複合体（例えば、低酸
素症誘導因子（ＨＩＦ））が結合する１または数個の核
酸配列の、真核細胞のゲノムへの導入に関する。さらに
本発明は、レポーター遺伝子の発現を測定することによ
る、標的遺伝子の発現に及ぼす５’側または３’側の非
コード核酸断片の影響を試験するための方法に関する。
さらに本発明は、リコンビナーゼ標的配列を含有するＤ
ＨＦＲ陰性真核細胞の作製方法、およびリコンビナーゼ
標的配列中に挿入された核酸配列の発現に関する。
子発現を最適化するための方法に関する。第１の面で
は、相同的組換えによって異種発現制御配列および／ま
たは増幅遺伝子を細胞のゲノムに導入することによる、
真核細胞中に内在する標的遺伝子の発現を変化させる方
法に関し、また、部位特異的リコンビナーゼにより媒介
される挿入外来ＤＮＡの切除、および他の異種発現制御
配列および／または増幅遺伝子によるその置換に関す
る。本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させるた
めの、相同的組換えによる、アクチベータータンパク質
またはアクチベータータンパク質複合体（例えば、低酸
素症誘導因子（ＨＩＦ））が結合する１または数個の核
酸配列の、真核細胞のゲノムへの導入に関する。さらに
本発明は、レポーター遺伝子の発現を測定することによ
る、標的遺伝子の発現に及ぼす５’側または３’側の非
コード核酸断片の影響を試験するための方法に関する。
さらに本発明は、リコンビナーゼ標的配列を含有するＤ
ＨＦＲ陰性真核細胞の作製方法、およびリコンビナーゼ
標的配列中に挿入された核酸配列の発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞における遺伝子発現は、例えば、い
わゆるハウスキーピング遺伝子では構成的に起こってお
り、また、調節することができる。調節された発現は、
細胞の特定の発達段階で発現されたり、環境条件に変化
があるときにのみ発現される遺伝子の場合に、特に必要
である。
わゆるハウスキーピング遺伝子では構成的に起こってお
り、また、調節することができる。調節された発現は、
細胞の特定の発達段階で発現されたり、環境条件に変化
があるときにのみ発現される遺伝子の場合に、特に必要
である。
【０００３】発現はコード核酸配列と機能的に結合して
いるプロモーターにより転写レベルで調節され、プロモ
ーターの活性はリプレッサーおよびアクチベーターによ
り制御することができる。遺伝子の非コード核酸配列へ
のリプレッサーまたはアクチベーターの結合は、プロモ
ーターの活性を低下または増大させうる（L. Stryer,Bi
ochemie, Chapter 12, "Spektrum der Wissenschaft, V
erlagsgesellschaft", Heidelberg, 1990）。細胞に含
まれるリプレッサーまたはアクチベーターの量は、例え
ば環境条件のような要因により調節される。低酸素誘導
因子（hypoxia-inducible factor：ＨＩＦ）は、Ｏ2 供
給の減少により誘導されるアクチベーターの一例であ
り、エリトロポエチン遺伝子の発現を増加させる（Blan
chard K.L.ら, 「ヒトエリトロポエチン遺伝子の低酸素
誘導：それぞれステロイド受容体応答要素を含有するプ
ロモーターとエンハンサーとの協力」, (1992), Mol. C
ell.Biol. 12, 5373-5385；Wang G.L. and Semenza G.
L., 「低酸素誘導因子１の特性決定および低酸素による
ＤＮＡ結合活性の調節」, (1993), J. Biol. Chem.,26
8, 21513-21518；Wang G.L.ら, 「低酸素誘導因子１は
細胞内Ｏ2 圧により調節される塩基性-ヘリックス-ルー
プ-ヘリックス-ＰＡヘテロ二量体である」, (1995), Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514）。
いるプロモーターにより転写レベルで調節され、プロモ
ーターの活性はリプレッサーおよびアクチベーターによ
り制御することができる。遺伝子の非コード核酸配列へ
のリプレッサーまたはアクチベーターの結合は、プロモ
ーターの活性を低下または増大させうる（L. Stryer,Bi
ochemie, Chapter 12, "Spektrum der Wissenschaft, V
erlagsgesellschaft", Heidelberg, 1990）。細胞に含
まれるリプレッサーまたはアクチベーターの量は、例え
ば環境条件のような要因により調節される。低酸素誘導
因子（hypoxia-inducible factor：ＨＩＦ）は、Ｏ2 供
給の減少により誘導されるアクチベーターの一例であ
り、エリトロポエチン遺伝子の発現を増加させる（Blan
chard K.L.ら, 「ヒトエリトロポエチン遺伝子の低酸素
誘導：それぞれステロイド受容体応答要素を含有するプ
ロモーターとエンハンサーとの協力」, (1992), Mol. C
ell.Biol. 12, 5373-5385；Wang G.L. and Semenza G.
L., 「低酸素誘導因子１の特性決定および低酸素による
ＤＮＡ結合活性の調節」, (1993), J. Biol. Chem.,26
8, 21513-21518；Wang G.L.ら, 「低酸素誘導因子１は
細胞内Ｏ2 圧により調節される塩基性-ヘリックス-ルー
プ-ヘリックス-ＰＡヘテロ二量体である」, (1995), Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514）。
【０００４】さらに、タンパク質の発現量はｍＲＮＡの
安定性に依存する。ｍＲＮＡの安定性に影響し、そのた
め発現レベルに影響するｍＲＮＡ分解酵素の認識配列が
ｍＲＮＡの３’領域に位置する（Shaw G. and Kamen,
R.,「GM-CSH mRNAの3'非翻訳領域からの保存AU配列は選
択的mRNA分解を媒介する」, Cell (1986), 659-667）。
これに関連して、ｍＲＮＡの半減期は発現されたタンパ
ク質の量に相関する。発現調節の第３のレベルは翻訳で
ある。
安定性に依存する。ｍＲＮＡの安定性に影響し、そのた
め発現レベルに影響するｍＲＮＡ分解酵素の認識配列が
ｍＲＮＡの３’領域に位置する（Shaw G. and Kamen,
R.,「GM-CSH mRNAの3'非翻訳領域からの保存AU配列は選
択的mRNA分解を媒介する」, Cell (1986), 659-667）。
これに関連して、ｍＲＮＡの半減期は発現されたタンパ
ク質の量に相関する。発現調節の第３のレベルは翻訳で
ある。
【０００５】このため遺伝子の発現は、個々のケースで
大きく異なる複雑な調節機構を受ける。
大きく異なる複雑な調節機構を受ける。
【０００６】タンパク質は、発現調節に関する知識を利
用する組換えＤＮＡ法により取得することができる（Sa
mbrookら, 1989, 「分子クローニング、実験室マニュア
ル」, Cold Spring Harbor）。そのために、適切なプロ
モーターと、さらにはタンパク質の発現およびベクター
の複製に必要な追加の配列の制御下に、対応するタンパ
ク質をコードする核酸配列を含有するベクターが使用さ
れる。次に既知の方法によりベクターを宿主細胞中に導
入し、細胞を培養して、組換えタンパク質を細胞または
培地から単離することができる。
用する組換えＤＮＡ法により取得することができる（Sa
mbrookら, 1989, 「分子クローニング、実験室マニュア
ル」, Cold Spring Harbor）。そのために、適切なプロ
モーターと、さらにはタンパク質の発現およびベクター
の複製に必要な追加の配列の制御下に、対応するタンパ
ク質をコードする核酸配列を含有するベクターが使用さ
れる。次に既知の方法によりベクターを宿主細胞中に導
入し、細胞を培養して、組換えタンパク質を細胞または
培地から単離することができる。
【０００７】原核または真核細胞を宿主細胞として使用
することができる。原核細胞、特に大腸菌（E. coli）
細胞は取扱いには問題がないが、組換えにより真核細胞
タンパク質を発現させるときには多くの難点を抱えてい
る。
することができる。原核細胞、特に大腸菌（E. coli）
細胞は取扱いには問題がないが、組換えにより真核細胞
タンパク質を発現させるときには多くの難点を抱えてい
る。
【０００８】原核および真核細胞は、発現プロセシング
経路、細胞の培地条件、およびタンパク質プロセシング
に関与するシャペロンにおいて異なっている。このため
原核細胞で産生された真核細胞タンパク質は、対応する
天然タンパク質とは決定的に異なることもある。
経路、細胞の培地条件、およびタンパク質プロセシング
に関与するシャペロンにおいて異なっている。このため
原核細胞で産生された真核細胞タンパク質は、対応する
天然タンパク質とは決定的に異なることもある。
【０００９】例えばタンパク質の折りたたみパターンお
よびタンパク質の活性が改変されるかもしれない。ま
た、原核宿主細胞のタンパク質は通常グリコシル化され
ない。しかし正しいグリコシル化パターンは、例えば薬
剤の処方のためのタンパク質の産生では、多くの場合に
有効性および寛容性にとってきわめて重大な特徴であ
る。
よびタンパク質の活性が改変されるかもしれない。ま
た、原核宿主細胞のタンパク質は通常グリコシル化され
ない。しかし正しいグリコシル化パターンは、例えば薬
剤の処方のためのタンパク質の産生では、多くの場合に
有効性および寛容性にとってきわめて重大な特徴であ
る。
【００１０】したがってグリコシル化タンパク質は、真
核宿主細胞または細胞系、例えばＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞、により産生される。真核細胞の
使用にもかかわらず、例えば非ヒト細胞においてヒトタ
ンパク質を発現させるとき、種差のために組換え産生さ
れたタンパク質に変化が生じることがあり、この方法が
多くの用途に不適切であるのはこのためである。
核宿主細胞または細胞系、例えばＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞、により産生される。真核細胞の
使用にもかかわらず、例えば非ヒト細胞においてヒトタ
ンパク質を発現させるとき、種差のために組換え産生さ
れたタンパク質に変化が生じることがあり、この方法が
多くの用途に不適切であるのはこのためである。
【００１１】タンパク質の組換え生産のために、宿主細
胞は、発現ベクターで一時的にまたは安定にトランスフ
ェクトされるが、特に大規模生産方法のためには安定に
トランスフェクトされた細胞が使用される。
胞は、発現ベクターで一時的にまたは安定にトランスフ
ェクトされるが、特に大規模生産方法のためには安定に
トランスフェクトされた細胞が使用される。
【００１２】宿主細胞のゲノム中に発現ベクター配列が
特異的でなくランダムに組み込まれると、低い産生能力
の細胞ができるか、または細胞が不安定な性質になりう
る。例えば、産生量が産生プロセスの過程で低下した
り、組換えタンパク質を発現する細胞の能力が完全に消
失したりする。
特異的でなくランダムに組み込まれると、低い産生能力
の細胞ができるか、または細胞が不安定な性質になりう
る。例えば、産生量が産生プロセスの過程で低下した
り、組換えタンパク質を発現する細胞の能力が完全に消
失したりする。
【００１３】遺伝子発現を増大させる１つの方法は遺伝
子増幅であり、この場合はタンパク質をコードする核酸
配列を増幅遺伝子に結合させる。両方の配列の増加は、
発現の増大をもたらす選択工程により達成される（Schi
mke, R.T.(編) (1982), 「遺伝子増幅」, Cold Spring
Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY）。
子増幅であり、この場合はタンパク質をコードする核酸
配列を増幅遺伝子に結合させる。両方の配列の増加は、
発現の増大をもたらす選択工程により達成される（Schi
mke, R.T.(編) (1982), 「遺伝子増幅」, Cold Spring
Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY）。
【００１４】例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）をコードする核酸を増幅遺伝子として使用すること
ができる（Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982), 「１モ
ジュールのジヒドロ葉酸レダクターゼ相補ＤＮＡ遺伝子
で同時トランスフェクションした配列の増幅と発現」,
J. Mol. Biol. 159:601 ff）。
Ｒ）をコードする核酸を増幅遺伝子として使用すること
ができる（Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982), 「１モ
ジュールのジヒドロ葉酸レダクターゼ相補ＤＮＡ遺伝子
で同時トランスフェクションした配列の増幅と発現」,
J. Mol. Biol. 159:601 ff）。
【００１５】メトトレキセートを用いて行われる選択工
程により、メトトレキセートに耐性であって、かつゲノ
ム中に２０〜５０倍増幅されたＤＨＦＲコード核酸配列
およびこれに結合した核酸配列を含有する細胞が入手で
きる（R. Knippers, 1982, "Molekulare Genetik", Thi
eme, Stuttgart）。
程により、メトトレキセートに耐性であって、かつゲノ
ム中に２０〜５０倍増幅されたＤＨＦＲコード核酸配列
およびこれに結合した核酸配列を含有する細胞が入手で
きる（R. Knippers, 1982, "Molekulare Genetik", Thi
eme, Stuttgart）。
【００１６】このような遺伝子増幅法は、ＤＨＲＦ陰性
細胞で最も有効に行われる。JP-62265992 は、例えばヒ
トＤＨＦＲ陰性細胞を記載している。しかしこの特許
は、この細胞におけるこれらの配列の相同的組換えと増
幅による発現ベクターの部位特異的組込みには言及して
いない。
細胞で最も有効に行われる。JP-62265992 は、例えばヒ
トＤＨＦＲ陰性細胞を記載している。しかしこの特許
は、この細胞におけるこれらの配列の相同的組換えと増
幅による発現ベクターの部位特異的組込みには言及して
いない。
【００１７】遺伝子増幅プロセスを行うときでさえ、細
胞の不安定性のような上述の難点は、細胞のゲノム中へ
の発現ベクターのランダムな組込みにより起こりうる。
胞の不安定性のような上述の難点は、細胞のゲノム中へ
の発現ベクターのランダムな組込みにより起こりうる。
【００１８】上述の難点は、内在性遺伝子活性化をもた
らす相同的組換えにより、選択された遺伝子座に外来Ｄ
ＮＡを部位特異的に組み込むときにのみ回避することが
できる。対応する方法は知られており、遺伝子ターゲッ
ティングと呼ばれる（WO 90/11354；WO 91/09955）。こ
のプロセスにおいて、細胞は、この細胞のゲノム中にベ
クターを組み込もうとする遺伝子座に相同な核酸配列に
より挟まれた、正の選択マーカー遺伝子を含有するベク
ターでトランスフェクトされる。相同な核酸配列の間
に、細胞中の標的遺伝子の発現を増大させるための異種
発現制御配列と、場合により標的遺伝子のコピー数を増
加させるための増幅遺伝子がさらに存在する。
らす相同的組換えにより、選択された遺伝子座に外来Ｄ
ＮＡを部位特異的に組み込むときにのみ回避することが
できる。対応する方法は知られており、遺伝子ターゲッ
ティングと呼ばれる（WO 90/11354；WO 91/09955）。こ
のプロセスにおいて、細胞は、この細胞のゲノム中にベ
クターを組み込もうとする遺伝子座に相同な核酸配列に
より挟まれた、正の選択マーカー遺伝子を含有するベク
ターでトランスフェクトされる。相同な核酸配列の間
に、細胞中の標的遺伝子の発現を増大させるための異種
発現制御配列と、場合により標的遺伝子のコピー数を増
加させるための増幅遺伝子がさらに存在する。
【００１９】既知の遺伝子ターゲッティング法の難点
は、商業目的にかなう量と質で目的タンパク質の産生を
可能にする性質の細胞を作製することが、多くの場合非
常に厄介であるということである。特に、目的の標的タ
ンパク質の発現に最適な発現制御配列および／または増
幅遺伝子の選択には、目的の組換え現象が起こっている
クローンを単離するための複雑な手順のために、極めて
時間のかかる、非常に多くの一連の相同的組換え実験が
しばしば必要となる。
は、商業目的にかなう量と質で目的タンパク質の産生を
可能にする性質の細胞を作製することが、多くの場合非
常に厄介であるということである。特に、目的の標的タ
ンパク質の発現に最適な発現制御配列および／または増
幅遺伝子の選択には、目的の組換え現象が起こっている
クローンを単離するための複雑な手順のために、極めて
時間のかかる、非常に多くの一連の相同的組換え実験が
しばしば必要となる。
【００２０】相同的組換えはまた、タンパク質機能の研
究を行うために細胞内のある遺伝子の発現をスイッチオ
フするのにも使用することができる。このために、試験
しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、胚性幹
細胞内で相同的組換えによりスイッチオフされている、
ノックアウトマウスが作り出されている。さらなるプロ
セスの工程を実施後、この遺伝子の両方の対立遺伝子の
不活化のために、その発生の開始時点からある機能性タ
ンパク質を発現することができないマウスが得られる
（Thomas, K.R., Capecchi M.R., (1987),「マウス胚由
来幹細胞における遺伝子ターゲッティングによる部位特
異的突然変異誘発法」, Cell 51:503-512）。
究を行うために細胞内のある遺伝子の発現をスイッチオ
フするのにも使用することができる。このために、試験
しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、胚性幹
細胞内で相同的組換えによりスイッチオフされている、
ノックアウトマウスが作り出されている。さらなるプロ
セスの工程を実施後、この遺伝子の両方の対立遺伝子の
不活化のために、その発生の開始時点からある機能性タ
ンパク質を発現することができないマウスが得られる
（Thomas, K.R., Capecchi M.R., (1987),「マウス胚由
来幹細胞における遺伝子ターゲッティングによる部位特
異的突然変異誘発法」, Cell 51:503-512）。
【００２１】Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を使用して、組織特異的
かつ時間特異的にある遺伝子をスイッチオフして、これ
を試験することができる。この目的のためには、２つの
ｌｏｘＰ配列により挟まれた核酸断片を細胞のゲノムに
相同的組換えにより導入し、次に細胞内で発現されるＣ
ｒｅリコンビナーゼによりゲノムから再度切断すること
ができる（Sauer B, Henderson N (1989):「哺乳動物細
胞のゲノム中に入れたｌｏｘＰ部位での部位特異的ＤＮ
Ａ組換え」, Nuc Acid Res 17:147-161；SauerB., Hend
erson N. (1990),「Ｃｒｅリコンビナーゼによる真核細
胞ゲノム中への外因性ＤＮＡの標的化された挿入」, Ne
w Biol. 5:441-449）。先行技術は、内在性遺伝子の発
現を変化させるために真核細胞ゲノム中に発現制御配列
または増幅遺伝子を部位特異的に組み込むための、Ｃｒ
ｅ−ｌｏｘ系または別の部位特異的リコンビナーゼ系の
使用には全く言及していない。
かつ時間特異的にある遺伝子をスイッチオフして、これ
を試験することができる。この目的のためには、２つの
ｌｏｘＰ配列により挟まれた核酸断片を細胞のゲノムに
相同的組換えにより導入し、次に細胞内で発現されるＣ
ｒｅリコンビナーゼによりゲノムから再度切断すること
ができる（Sauer B, Henderson N (1989):「哺乳動物細
胞のゲノム中に入れたｌｏｘＰ部位での部位特異的ＤＮ
Ａ組換え」, Nuc Acid Res 17:147-161；SauerB., Hend
erson N. (1990),「Ｃｒｅリコンビナーゼによる真核細
胞ゲノム中への外因性ＤＮＡの標的化された挿入」, Ne
w Biol. 5:441-449）。先行技術は、内在性遺伝子の発
現を変化させるために真核細胞ゲノム中に発現制御配列
または増幅遺伝子を部位特異的に組み込むための、Ｃｒ
ｅ−ｌｏｘ系または別の部位特異的リコンビナーゼ系の
使用には全く言及していない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、少な
くとも部分的に先行技術の難点を排除する、相同的組換
えによる内在性遺伝子活性化を最適化するための新しい
方法を提供することであった。
くとも部分的に先行技術の難点を排除する、相同的組換
えによる内在性遺伝子活性化を最適化するための新しい
方法を提供することであった。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本目的は、真核細胞の遺
伝子の発現量の最適化をかなり単純化する新しい方法お
よびベクター構築物を提供することにより達成される。
本発明の第１の面は、真核細胞に内在する核酸配列の発
現を変化させる方法に関し、この方法は、（ａ）細胞
を、（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺
伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）正
の選択マーカー遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（i
i）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくと
も２つの標的配列、（iv）配列（ｉ）、（ii）および
（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるよう
に細胞のゲノム内の核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）ト
ランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが
起こる条件下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により
得られた細胞を単離する、ことを特徴とする。
伝子の発現量の最適化をかなり単純化する新しい方法お
よびベクター構築物を提供することにより達成される。
本発明の第１の面は、真核細胞に内在する核酸配列の発
現を変化させる方法に関し、この方法は、（ａ）細胞
を、（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺
伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）正
の選択マーカー遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（i
i）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくと
も２つの標的配列、（iv）配列（ｉ）、（ii）および
（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるよう
に細胞のゲノム内の核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）ト
ランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが
起こる条件下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により
得られた細胞を単離する、ことを特徴とする。
【００２４】異種発現制御配列および／または増幅遺伝
子と機能的に結合している内在性遺伝子を有する細胞
が、本発明の方法により提供され、そしてこれらの配列
は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコン
ビナーゼ）の標的配列により挟まれている。この細胞
は、部位特異的リコンビナーゼの標的配列の存在によ
り、第２の異種発現制御配列および／または第２の増幅
遺伝子による第１の異種発現制御配列および／または第
１の増幅遺伝子の単純な置換が可能になるため、標的遺
伝子の発現の最適化に関する研究に非常に適している。
子と機能的に結合している内在性遺伝子を有する細胞
が、本発明の方法により提供され、そしてこれらの配列
は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコン
ビナーゼ）の標的配列により挟まれている。この細胞
は、部位特異的リコンビナーゼの標的配列の存在によ
り、第２の異種発現制御配列および／または第２の増幅
遺伝子による第１の異種発現制御配列および／または第
１の増幅遺伝子の単純な置換が可能になるため、標的遺
伝子の発現の最適化に関する研究に非常に適している。
【００２５】本発明の「部位特異的リコンビナーゼ」と
いう用語は、インテグラーゼまたはリゾルベースインベ
ルターゼクラスの部位特異的リコンビナーゼを含む、特
異的ＤＮＡ標的配列上のＤＮＡ再配列（Starkら, Trend
s Genet. 8 (1992), 432-439；AbremskiとHoess, Prote
in Engineering 5 (1992), 87-91；Khanら, NucleicAci
ds Res. 19 (1991), 851-860）、およびイントロンがコ
ードするエンドヌクレアーゼにより媒介される部位特異
的組換え（Perrinら, EMBO J. 12 (1993), 2939-2947）
を媒介するタンパク質およびタンパク質複合体を包含す
る。好ましいリコンビナーゼタンパク質は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２μ
エピソームのＦＬＰリコンビナーゼ（例えば、Falcoら,
Cell29 (1982), 573-584；Cox, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 80 (1983), 4223-4227；Konsolakiら, New Biol
ogist 4 (1992), 551-557）、大腸菌（E. coli）ファー
ジＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（例えば、SauerとHende
rson (1989)上掲）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Z
ygosaccharomyces rouxii）プラスミドｐＳＲ１からの
Ｒリコンビナーゼ（Matsuzakiら, J. Bacteriol. 172
(1990), 610-618）、クライベロミセス・ドロソフィラ
リウム（Kluyveromyces drosophilarium）プラスミドｐ
ＫＤ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, Nucleic Acid
s Res. 14(1986), 4471-4481）、クライベロミセス・ワ
ルティー（Kluyveromyces waltii）プラスミドｐＫＷ１
からのＡリコンビナーゼ（Chenら, J. Gen. Microbiol.
138 (1992), 337-345）、λ−ｉｎｔ組換え系の成分
（Landy, Annu Rev. Biochem. 5 (1989), 913-949）お
よびファージμのジン(gin)組換え系の成分（Klippel
ら, EMBO J. 12 (1993), 1047-1057）よりなる群から選
択される。さらに、部位特異的リコンビナーゼおよび核
内受容体またはそのリガンド結合ドメインから構成され
る、ヨーロッパ特許EP-B-0 707 599に記載される融合タ
ンパク質も適している。Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配
列、すなわちｌｏｘＰ配列は、本発明の方法のために特
に好ましく使用される。
いう用語は、インテグラーゼまたはリゾルベースインベ
ルターゼクラスの部位特異的リコンビナーゼを含む、特
異的ＤＮＡ標的配列上のＤＮＡ再配列（Starkら, Trend
s Genet. 8 (1992), 432-439；AbremskiとHoess, Prote
in Engineering 5 (1992), 87-91；Khanら, NucleicAci
ds Res. 19 (1991), 851-860）、およびイントロンがコ
ードするエンドヌクレアーゼにより媒介される部位特異
的組換え（Perrinら, EMBO J. 12 (1993), 2939-2947）
を媒介するタンパク質およびタンパク質複合体を包含す
る。好ましいリコンビナーゼタンパク質は、サッカロミ
セス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２μ
エピソームのＦＬＰリコンビナーゼ（例えば、Falcoら,
Cell29 (1982), 573-584；Cox, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 80 (1983), 4223-4227；Konsolakiら, New Biol
ogist 4 (1992), 551-557）、大腸菌（E. coli）ファー
ジＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（例えば、SauerとHende
rson (1989)上掲）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Z
ygosaccharomyces rouxii）プラスミドｐＳＲ１からの
Ｒリコンビナーゼ（Matsuzakiら, J. Bacteriol. 172
(1990), 610-618）、クライベロミセス・ドロソフィラ
リウム（Kluyveromyces drosophilarium）プラスミドｐ
ＫＤ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, Nucleic Acid
s Res. 14(1986), 4471-4481）、クライベロミセス・ワ
ルティー（Kluyveromyces waltii）プラスミドｐＫＷ１
からのＡリコンビナーゼ（Chenら, J. Gen. Microbiol.
138 (1992), 337-345）、λ−ｉｎｔ組換え系の成分
（Landy, Annu Rev. Biochem. 5 (1989), 913-949）お
よびファージμのジン(gin)組換え系の成分（Klippel
ら, EMBO J. 12 (1993), 1047-1057）よりなる群から選
択される。さらに、部位特異的リコンビナーゼおよび核
内受容体またはそのリガンド結合ドメインから構成され
る、ヨーロッパ特許EP-B-0 707 599に記載される融合タ
ンパク質も適している。Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配
列、すなわちｌｏｘＰ配列は、本発明の方法のために特
に好ましく使用される。
【００２６】異種遺伝子の部位非特異的組込みによるタ
ンパク質の組換え産生、およびそれに関連する不都合と
は対照的に、本発明の方法では、相同的組換えによる部
位特異的内在性遺伝子活性化の利点を利用する。
ンパク質の組換え産生、およびそれに関連する不都合と
は対照的に、本発明の方法では、相同的組換えによる部
位特異的内在性遺伝子活性化の利点を利用する。
【００２７】異種発現制御配列と増幅遺伝子との適切な
組合せの単純化された選択により、安定した特性を有す
る最適化産生クローンが、その構造と活性に関して実質
的に未変性タンパク質に対応するタンパク質の産生を可
能にする高い確率で得られる。
組合せの単純化された選択により、安定した特性を有す
る最適化産生クローンが、その構造と活性に関して実質
的に未変性タンパク質に対応するタンパク質の産生を可
能にする高い確率で得られる。
【００２８】異種発現制御配列、増幅遺伝子、正の選択
マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ標的配列に隣接す
る適切な相同配列の選択は、好ましくはWO 90/11354お
よびWO 91/09955に記載される方法により行われる。
マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ標的配列に隣接す
る適切な相同配列の選択は、好ましくはWO 90/11354お
よびWO 91/09955に記載される方法により行われる。
【００２９】さらに、相同配列はまた、例えば点突然変
異のような、発現されるタンパク質中の突然変異、個々
のアミノ酸または全アミノ酸部分の挿入および／または
欠失をもたらす修飾を含んでいるかもしれない。
異のような、発現されるタンパク質中の突然変異、個々
のアミノ酸または全アミノ酸部分の挿入および／または
欠失をもたらす修飾を含んでいるかもしれない。
【００３０】したがって本発明の方法により、内在性核
酸配列の発現レベルを単一プロセス工程で変化させるこ
とができるだけでなく、同時に内在性核酸配列のコード
領域中への突然変異の導入をも可能にする。このため本
発明の方法は、薬剤応用のためのタンパク質の産生に特
に有利である。このようなタンパク質は、タンパク質の
効力を増大させる突然変異を除けば、未変性タンパク質
に比較してさらなる改変は含まない。
酸配列の発現レベルを単一プロセス工程で変化させるこ
とができるだけでなく、同時に内在性核酸配列のコード
領域中への突然変異の導入をも可能にする。このため本
発明の方法は、薬剤応用のためのタンパク質の産生に特
に有利である。このようなタンパク質は、タンパク質の
効力を増大させる突然変異を除けば、未変性タンパク質
に比較してさらなる改変は含まない。
【００３１】本発明では、任意の真核細胞、好ましくは
哺乳動物細胞、特に好ましくはヒト細胞を使用すること
ができる。本発明の方法は、非不死化細胞（例えば、繊
維芽細胞）を用いて行うことができ、また不死化細胞
（例えば、腫瘍細胞株）を用いても行うことができる。
不死化細胞が好ましい。
哺乳動物細胞、特に好ましくはヒト細胞を使用すること
ができる。本発明の方法は、非不死化細胞（例えば、繊
維芽細胞）を用いて行うことができ、また不死化細胞
（例えば、腫瘍細胞株）を用いても行うことができる。
不死化細胞が好ましい。
【００３２】本発明の方法を実施するために使用される
溶液および培地は、好ましくは各プロセス工程において
最適な条件となるように選択される。細胞は、適切な細
胞増殖に必要な全ての物質を含有し、かつ場合により緩
衝化されている培地を使用して培養する。無血清培地で
培養することができる細胞を使用するのが好ましい。使
用される細胞は、特に好ましくはナマルワ（Namalw
a）、ＨＴ１０８０またはＨｅＬａＳ３細胞である。
溶液および培地は、好ましくは各プロセス工程において
最適な条件となるように選択される。細胞は、適切な細
胞増殖に必要な全ての物質を含有し、かつ場合により緩
衝化されている培地を使用して培養する。無血清培地で
培養することができる細胞を使用するのが好ましい。使
用される細胞は、特に好ましくはナマルワ（Namalw
a）、ＨＴ１０８０またはＨｅＬａＳ３細胞である。
【００３３】本発明の方法によって、最適な発現制御配
列、最適な増幅遺伝子の選択により、および／または発
現制御配列と増幅遺伝子との最適な組合せの選択によ
り、細胞に内在する核酸配列、すなわち標的遺伝子の発
現の最適化が可能になる。
列、最適な増幅遺伝子の選択により、および／または発
現制御配列と増幅遺伝子との最適な組合せの選択によ
り、細胞に内在する核酸配列、すなわち標的遺伝子の発
現の最適化が可能になる。
【００３４】細胞のゲノム中への組込み後の標的遺伝子
の発現に影響を及ぼす異種発現制御配列として、任意の
核酸配列を使用することができる。これは、転写開始因
子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相
互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす
影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用
により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列
は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ま
しくはウイルスプロモーターおよび最も好ましくはＣＭ
Ｖプロモーターを含有する。
の発現に影響を及ぼす異種発現制御配列として、任意の
核酸配列を使用することができる。これは、転写開始因
子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相
互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす
影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用
により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列
は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ま
しくはウイルスプロモーターおよび最も好ましくはＣＭ
Ｖプロモーターを含有する。
【００３５】異種発現制御配列はまた、３’非コード配
列を含む。３’非コード配列は、ｍＲＮＡに安定化また
は不安定化作用を及ぼし、このためその半減期を延長ま
たは短縮させることができる。ｍＲＮＡを安定化させる
配列の導入により、ｍＲＮＡの半減期を延長させて、そ
のコードするタンパク質の収量を増大させることができ
る。
列を含む。３’非コード配列は、ｍＲＮＡに安定化また
は不安定化作用を及ぼし、このためその半減期を延長ま
たは短縮させることができる。ｍＲＮＡを安定化させる
配列の導入により、ｍＲＮＡの半減期を延長させて、そ
のコードするタンパク質の収量を増大させることができ
る。
【００３６】好適な実施態様において、標的遺伝子の内
在性発現制御配列は、相同的組換えにより除去される。
これは、内在性配列がリプレッサー結合配列を含有する
ときには、特に有利である。発現はまた、ｍＲＮＡに不
安定化作用を及ぼした結果、翻訳されるタンパク質の量
を低下させる３’非コード配列によっても減少させるこ
とができる。
在性発現制御配列は、相同的組換えにより除去される。
これは、内在性配列がリプレッサー結合配列を含有する
ときには、特に有利である。発現はまた、ｍＲＮＡに不
安定化作用を及ぼした結果、翻訳されるタンパク質の量
を低下させる３’非コード配列によっても減少させるこ
とができる。
【００３７】さらに本発明の方法により、最適な増幅遺
伝子の選択が可能になる。増幅遺伝子を、好ましくは発
現可能な形態で、すなわち、適切なプロモーターと機能
的に結合させて使用し、真核細胞のゲノム中へのベクタ
ーの相同的組み込み後、標的遺伝子の近くに位置するよ
うに、ベクター内に配置する。増幅工程を行うと、細胞
内の標的遺伝子のコピー数が増大する。この結果、内在
性核酸配列の発現をさらに増大させることができる。適
切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデ
カルボキシラーゼまたはこれらの遺伝子のムテイン(mut
eins)がある。増幅遺伝子は、好ましくはＤＨＦＲ遺伝
子またはその突然変異した形態（Simonsenら, Nucleic
Acids Res.1988, 16 (5): 2235-2246）、特に内在性Ｄ
ＨＦＲ遺伝子を含有する細胞内のこれらである。
伝子の選択が可能になる。増幅遺伝子を、好ましくは発
現可能な形態で、すなわち、適切なプロモーターと機能
的に結合させて使用し、真核細胞のゲノム中へのベクタ
ーの相同的組み込み後、標的遺伝子の近くに位置するよ
うに、ベクター内に配置する。増幅工程を行うと、細胞
内の標的遺伝子のコピー数が増大する。この結果、内在
性核酸配列の発現をさらに増大させることができる。適
切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデ
カルボキシラーゼまたはこれらの遺伝子のムテイン(mut
eins)がある。増幅遺伝子は、好ましくはＤＨＦＲ遺伝
子またはその突然変異した形態（Simonsenら, Nucleic
Acids Res.1988, 16 (5): 2235-2246）、特に内在性Ｄ
ＨＦＲ遺伝子を含有する細胞内のこれらである。
【００３８】例えば、抗生物質耐性のような選択可能な
表現型をもたらす、真核細胞のための任意の適切な耐性
遺伝子を正の選択マーカーとして使用することができ
る。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは、ネオマイ
シン、カナマイシン、ジェネティシン（geneticin）ま
たはハイグロマイシン耐性遺伝子である。正の選択マー
カー遺伝子は、好ましくは発現可能な形態、すなわち、
適切なプロモーターと機能的に結合させて使用する。
表現型をもたらす、真核細胞のための任意の適切な耐性
遺伝子を正の選択マーカーとして使用することができ
る。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは、ネオマイ
シン、カナマイシン、ジェネティシン（geneticin）ま
たはハイグロマイシン耐性遺伝子である。正の選択マー
カー遺伝子は、好ましくは発現可能な形態、すなわち、
適切なプロモーターと機能的に結合させて使用する。
【００３９】負の選択マーカー遺伝子を使用する場合、
正の選択工程にさらに第２の負の選択工程を通常行う。
これの有利な点は、選択工程の実施後、同定されるクロ
ーンに含まれる擬陽性(false-positive)クローン（すな
わち、ゲノムにランダムに組み込まれるベクター）の割
合が低いことである。負の選択マーカー遺伝子は、好ま
しくはチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／または
ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
正の選択工程にさらに第２の負の選択工程を通常行う。
これの有利な点は、選択工程の実施後、同定されるクロ
ーンに含まれる擬陽性(false-positive)クローン（すな
わち、ゲノムにランダムに組み込まれるベクター）の割
合が低いことである。負の選択マーカー遺伝子は、好ま
しくはチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／または
ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
【００４０】部位特異的リコンビナーゼの標的配列が存
在する結果として、部位特異的リコンビナーゼを使用し
て、細胞のゲノムから、これらの配列の間に位置する核
酸配列を切り出すことが可能となる。標的配列の間に位
置する核酸配列は、好ましくは細胞内の対応するリコン
ビナーゼの一時的な活性化により、ゲノムから切断され
る。このリコンビナーゼの一時的な活性化は、例えば、
（ａ）細胞を、細胞内で活性であるか、または活性化す
ることができる発現制御配列と機能的に結合している、
リコンビナーゼをコードする核酸配列を含有する第２の
ベクターでトランスフェクトし、そして（ｂ）このよう
にトランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼが発現
され、かつ活性である条件下で培養し、そして（ｃ）場
合により前記細胞を単離する、ことにより行うことがで
きる。
在する結果として、部位特異的リコンビナーゼを使用し
て、細胞のゲノムから、これらの配列の間に位置する核
酸配列を切り出すことが可能となる。標的配列の間に位
置する核酸配列は、好ましくは細胞内の対応するリコン
ビナーゼの一時的な活性化により、ゲノムから切断され
る。このリコンビナーゼの一時的な活性化は、例えば、
（ａ）細胞を、細胞内で活性であるか、または活性化す
ることができる発現制御配列と機能的に結合している、
リコンビナーゼをコードする核酸配列を含有する第２の
ベクターでトランスフェクトし、そして（ｂ）このよう
にトランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼが発現
され、かつ活性である条件下で培養し、そして（ｃ）場
合により前記細胞を単離する、ことにより行うことがで
きる。
【００４１】リコンビナーゼ／核内受容体融合タンパク
質を使用する場合は、細胞の一時的な活性化はまた、核
内受容体のリガンドの制御された添加によっても行うこ
とができる。
質を使用する場合は、細胞の一時的な活性化はまた、核
内受容体のリガンドの制御された添加によっても行うこ
とができる。
【００４２】標的配列の間に位置するＤＮＡの除去後、
残りの標的配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）は、さらなる
プロセス工程に使用することができる。
残りの標的配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）は、さらなる
プロセス工程に使用することができる。
【００４３】さらなる好適な実施態様において、本方法
は、（ａ）細胞を、（ｉ）第２の異種発現制御配列およ
び第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの
配列、（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マー
カー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビ
ナーゼの少なくとも２つの標的配列、を含む第３のベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトし
た細胞を、標的配列に隣接する配列が、該細胞のゲノム
内の標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、（ｃ）
工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして（ｄ）
場合により、各場合に異なる発現制御配列および／また
は増幅遺伝子を使用して工程（ａ）〜（ｃ）を少なくと
も１回繰り返す、ことを特徴とする。
は、（ａ）細胞を、（ｉ）第２の異種発現制御配列およ
び第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの
配列、（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マー
カー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビ
ナーゼの少なくとも２つの標的配列、を含む第３のベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトし
た細胞を、標的配列に隣接する配列が、該細胞のゲノム
内の標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、（ｃ）
工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして（ｄ）
場合により、各場合に異なる発現制御配列および／また
は増幅遺伝子を使用して工程（ａ）〜（ｃ）を少なくと
も１回繰り返す、ことを特徴とする。
【００４４】このため本発明の方法により、多くの発現
制御配列、増幅遺伝子または発現制御配列と増幅遺伝子
との組合せを単純かつ迅速に試験することができる。こ
のため、それぞれ個々の標的遺伝子に対する最適な発現
／増幅系を決定するために、それぞれ個々の異種発現制
御配列およびそれぞれ個々の増幅遺伝子について、時間
および費用のかかる部位特異的組込みを行う必要がな
い。
制御配列、増幅遺伝子または発現制御配列と増幅遺伝子
との組合せを単純かつ迅速に試験することができる。こ
のため、それぞれ個々の標的遺伝子に対する最適な発現
／増幅系を決定するために、それぞれ個々の異種発現制
御配列およびそれぞれ個々の増幅遺伝子について、時間
および費用のかかる部位特異的組込みを行う必要がな
い。
【００４５】第３のベクター内の正の選択マーカー遺伝
子は、選択プロセスを単純化するため、および擬陽性ク
ローンの数を最少化するために、好ましくは第１のベク
ターのマーカー遺伝子とは異なる。
子は、選択プロセスを単純化するため、および擬陽性ク
ローンの数を最少化するために、好ましくは第１のベク
ターのマーカー遺伝子とは異なる。
【００４６】本発明に使用されるベクター内のリコンビ
ナーゼ標的配列は、天然に存在する標的配列に対応して
も、または場合により部位特異的リコンビナーゼの有効
性を損なわない突然変異を受けていてもよい。
ナーゼ標的配列は、天然に存在する標的配列に対応して
も、または場合により部位特異的リコンビナーゼの有効
性を損なわない突然変異を受けていてもよい。
【００４７】本発明のさらなる主題は、相同的組換えの
ため、特に細胞のゲノム中へのリコンビナーゼ標的配列
の部位特異的な導入のためのベクターであって、（ｉ）
発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なく
とも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（ii
i）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リ
コンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、（iv）相同
的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の１つの核
酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（ii
i）に隣接するＤＮＡ配列、および（ｖ）場合により、
負の選択マーカー遺伝子、を含むことを特徴とする上記
ベクターである。
ため、特に細胞のゲノム中へのリコンビナーゼ標的配列
の部位特異的な導入のためのベクターであって、（ｉ）
発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なく
とも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（ii
i）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リ
コンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、（iv）相同
的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の１つの核
酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（ii
i）に隣接するＤＮＡ配列、および（ｖ）場合により、
負の選択マーカー遺伝子、を含むことを特徴とする上記
ベクターである。
【００４８】さらに本発明の全てのベクターは、好まし
くは、複製の起点、選択マーカー遺伝子などのような、
適切な宿主細胞内での増殖および増加に必要な配列要素
を含有する。
くは、複製の起点、選択マーカー遺伝子などのような、
適切な宿主細胞内での増殖および増加に必要な配列要素
を含有する。
【００４９】本発明のさらに別の主題は、特に部位特異
的リコンビナーゼ系により細胞のゲノム中にＤＮＡを導
入するためのベクターであって、（ｉ）発現制御配列お
よび増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配
列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、および（iii）配
列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少
なくとも２つの標的配列、を含むことを特徴とする上記
ベクターである。
的リコンビナーゼ系により細胞のゲノム中にＤＮＡを導
入するためのベクターであって、（ｉ）発現制御配列お
よび増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配
列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、および（iii）配
列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少
なくとも２つの標的配列、を含むことを特徴とする上記
ベクターである。
【００５０】本発明のさらに別の主題は、上述の方法に
より入手可能な真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
この細胞、例えば、ヒト細胞は、好ましくは、（ａ）内
在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御
配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つ
の染色体位置が定められた配列を含有し、そして（ｂ）
この配列が、リコンビナーゼ標的配列により挟まれてい
る、ことを特徴とする。
より入手可能な真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
この細胞、例えば、ヒト細胞は、好ましくは、（ａ）内
在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御
配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つ
の染色体位置が定められた配列を含有し、そして（ｂ）
この配列が、リコンビナーゼ標的配列により挟まれてい
る、ことを特徴とする。
【００５１】本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内
在する核酸配列の発現を変化させる方法に関するもので
あり、この方法は、（ａ）細胞を、（ｉ）アクチベータ
ータンパク質（例えば、低酸素誘導因子（ＨＩＦ））と
結合する、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マー
カー遺伝子、（iii）相同的組換えが可能であるように
該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列
（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、を含むベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトし
た細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培
養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単
離する、ことを特徴とする。
在する核酸配列の発現を変化させる方法に関するもので
あり、この方法は、（ａ）細胞を、（ｉ）アクチベータ
ータンパク質（例えば、低酸素誘導因子（ＨＩＦ））と
結合する、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マー
カー遺伝子、（iii）相同的組換えが可能であるように
該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列
（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、を含むベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトし
た細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培
養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単
離する、ことを特徴とする。
【００５２】驚くべきことに、標的遺伝子の発現制御配
列の領域内、特にその調節領域内に、１または数個のア
クチベータータンパク質（核酸配列に結合することによ
り、遺伝子発現を増大させるタンパク質）と結合する核
酸配列のゲノム組込みは、標的遺伝子の発現を減少させ
ないが、これと対照的に、適切な培養条件の選択によ
り、内在性標的遺伝子の発現を増大させるか、または発
現されていない内在性標的遺伝子の発現を誘導すること
が可能である。
列の領域内、特にその調節領域内に、１または数個のア
クチベータータンパク質（核酸配列に結合することによ
り、遺伝子発現を増大させるタンパク質）と結合する核
酸配列のゲノム組込みは、標的遺伝子の発現を減少させ
ないが、これと対照的に、適切な培養条件の選択によ
り、内在性標的遺伝子の発現を増大させるか、または発
現されていない内在性標的遺伝子の発現を誘導すること
が可能である。
【００５３】適切なアクチベータータンパク質の例に
は、低酸素誘導因子ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１β、
ならびにインターフェロンコンセンサス配列（ＩＣＥ）
への結合により転写を増大させることができるインター
フェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）がある（Tanaka N.,
Kawakami T., Taniguchi T., Mol. Cell. Biol. (199
3), Aug; 13(8): 4531-4538）。
は、低酸素誘導因子ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１β、
ならびにインターフェロンコンセンサス配列（ＩＣＥ）
への結合により転写を増大させることができるインター
フェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）がある（Tanaka N.,
Kawakami T., Taniguchi T., Mol. Cell. Biol. (199
3), Aug; 13(8): 4531-4538）。
【００５４】ＨＩＦまたは他のアクチベータータンパク
質と結合する１または数個の核酸配列を、内在する標的
遺伝子に機能的に結合後、該標的遺伝子の発現を、適切
な培養条件を選択することにより調節することができ
る。特に工業的規模の製造のための、これの有利な点
は、タンパク質の発現を、製造プロセスにとって最適な
時間に誘導しうることである。このことは、培養培地上
清中の合成産物の平均滞留時間が短縮されるため、有益
である。またこれにより、タンパク質の望ましくない分
解産物の量が減少する。このことは、次の精製工程に良
い影響を及ぼし、製造コストを減少させ、かつ最終産物
が質的に改善する。
質と結合する１または数個の核酸配列を、内在する標的
遺伝子に機能的に結合後、該標的遺伝子の発現を、適切
な培養条件を選択することにより調節することができ
る。特に工業的規模の製造のための、これの有利な点
は、タンパク質の発現を、製造プロセスにとって最適な
時間に誘導しうることである。このことは、培養培地上
清中の合成産物の平均滞留時間が短縮されるため、有益
である。またこれにより、タンパク質の望ましくない分
解産物の量が減少する。このことは、次の精製工程に良
い影響を及ぼし、製造コストを減少させ、かつ最終産物
が質的に改善する。
【００５５】本発明の方法を実施するためには、１また
は数個のアクチベーター結合性核酸配列を標的遺伝子と
機能的に結合させることで充分である。好ましくは２つ
のＨＩＦ結合性核酸配列が使用される。ＨＩＦ結合性核
酸配列は、特に好ましくは、配列番号１（第一のＨＩＦ
結合ヌクレオチド配列）の５３塩基対配列、配列番号２
（第二のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の４３塩基対配
列、これらの配列の相同配列、またはストリンジェント
な条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から
選択される。
は数個のアクチベーター結合性核酸配列を標的遺伝子と
機能的に結合させることで充分である。好ましくは２つ
のＨＩＦ結合性核酸配列が使用される。ＨＩＦ結合性核
酸配列は、特に好ましくは、配列番号１（第一のＨＩＦ
結合ヌクレオチド配列）の５３塩基対配列、配列番号２
（第二のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の４３塩基対配
列、これらの配列の相同配列、またはストリンジェント
な条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から
選択される。
【００５６】２つのＨＩＦ結合性核酸配列の使用によ
り、驚くべきことに相乗効果(synergistic effect)が得
られる。これにより、これらの配列のそれぞれを単独で
使用する場合よりも、内在性核酸の発現が大きく増大す
る。
り、驚くべきことに相乗効果(synergistic effect)が得
られる。これにより、これらの配列のそれぞれを単独で
使用する場合よりも、内在性核酸の発現が大きく増大す
る。
【００５７】必要であれば、標的遺伝子の領域に導入さ
れるアクチベーター配列に結合するアクチベータータン
パク質の発現は、細胞内で誘導および／または増大させ
ることができる。これは、例えば、細胞を、（ｉ）この
細胞内の活性な発現制御配列に機能的に結合している、
アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、およ
び（ii）場合により正の選択マーカー遺伝子、を含むベ
クターでトランスフェクトすることにより達成すること
ができる。
れるアクチベーター配列に結合するアクチベータータン
パク質の発現は、細胞内で誘導および／または増大させ
ることができる。これは、例えば、細胞を、（ｉ）この
細胞内の活性な発現制御配列に機能的に結合している、
アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、およ
び（ii）場合により正の選択マーカー遺伝子、を含むベ
クターでトランスフェクトすることにより達成すること
ができる。
【００５８】その発現産物が、ゲノム中に組み込まれた
アクチベーター結合性核酸配列に結合することができ
る、アクチベータータンパク質をコードする任意の核酸
配列を使用することができる。アクチベータータンパク
質は、好ましくは、ＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ
−１βタンパク質である。内在する核酸配列が、すでに
アクチベーター結合性または好ましくはＨＩＦ結合性核
酸配列を含有するならば、細胞内の活性な発現制御配列
および場合により正の選択マーカー遺伝子に機能的に結
合している、アクチベータータンパク質または好ましく
はＨＩＦタンパク質をコードする核酸配列を含有する細
胞中にベクターを導入するだけで充分であろう。
アクチベーター結合性核酸配列に結合することができ
る、アクチベータータンパク質をコードする任意の核酸
配列を使用することができる。アクチベータータンパク
質は、好ましくは、ＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ
−１βタンパク質である。内在する核酸配列が、すでに
アクチベーター結合性または好ましくはＨＩＦ結合性核
酸配列を含有するならば、細胞内の活性な発現制御配列
および場合により正の選択マーカー遺伝子に機能的に結
合している、アクチベータータンパク質または好ましく
はＨＩＦタンパク質をコードする核酸配列を含有する細
胞中にベクターを導入するだけで充分であろう。
【００５９】アクチベータータンパク質をコードする核
酸配列と機能的に結合している発現制御配列は誘導可能
であり、このため、例えば、ホルモンまたは重金属の添
加によるなどの適切な培養条件により、活性化のための
さらに別の方法が提供される。これにより、製造プロセ
スにとって最適な時間に、内在性標的遺伝子の発現が誘
導可能である。
酸配列と機能的に結合している発現制御配列は誘導可能
であり、このため、例えば、ホルモンまたは重金属の添
加によるなどの適切な培養条件により、活性化のための
さらに別の方法が提供される。これにより、製造プロセ
スにとって最適な時間に、内在性標的遺伝子の発現が誘
導可能である。
【００６０】構成的に活性な発現制御配列を使用するこ
との利点は、アクチベータータンパク質が、培地へのア
クチベーターの添加とは無関係に構成的に発現されるこ
とである。
との利点は、アクチベータータンパク質が、培地へのア
クチベーターの添加とは無関係に構成的に発現されるこ
とである。
【００６１】アクチベータータンパク質結合性核酸配列
が、ＨＩＦ結合性核酸配列であるならば、標的遺伝子の
発現は、例えば、適切な培養条件により、例えば、０．
１〜２％のＯ2 濃度で誘導することができる。
が、ＨＩＦ結合性核酸配列であるならば、標的遺伝子の
発現は、例えば、適切な培養条件により、例えば、０．
１〜２％のＯ2 濃度で誘導することができる。
【００６２】本発明のさらなる主題は、相同的組換えの
ためのベクターであって、（ｉ）アクチベータータンパ
ク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、（ii）正
の選択マーカー遺伝子、（iii）相同的組換えが可能で
あるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同で
ある、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
ためのベクターであって、（ｉ）アクチベータータンパ
ク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、（ii）正
の選択マーカー遺伝子、（iii）相同的組換えが可能で
あるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同で
ある、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００６３】本発明のさらに別の主題は、上述の方法の
１つにより入手可能な、真核細胞、好ましくはヒト細胞
である。この細胞は、好ましくは、細胞中に内在する遺
伝子と機能的に結合している、少なくとも１つの異種の
染色体位置が定められたアクチベータータンパク質／複
合体結合性核酸断片を含有することを特徴とする。アク
チベータータンパク質結合性核酸断片は、ある標的遺伝
子に最適なアクチベーター配列の単純な同定を可能にす
る、上に説明される部位特異的組換え系により、ゲノム
内で置換することができる。
１つにより入手可能な、真核細胞、好ましくはヒト細胞
である。この細胞は、好ましくは、細胞中に内在する遺
伝子と機能的に結合している、少なくとも１つの異種の
染色体位置が定められたアクチベータータンパク質／複
合体結合性核酸断片を含有することを特徴とする。アク
チベータータンパク質結合性核酸断片は、ある標的遺伝
子に最適なアクチベーター配列の単純な同定を可能にす
る、上に説明される部位特異的組換え系により、ゲノム
内で置換することができる。
【００６４】本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内
在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、そ
の発現に及ぼす影響を試験する方法に関するものであ
り、この方法は、（ａ）細胞を、（ｉ）レポーター遺伝
子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、ま
たは活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの５’側および／または
３’側の非コード核酸断片、を含むベクターでトランス
フェクトし、（ｂ）細胞を、発現制御配列が活性である
条件下で培養し、そして（ｃ）レポーター遺伝子の発現
を測定する、ことを特徴とする。
在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、そ
の発現に及ぼす影響を試験する方法に関するものであ
り、この方法は、（ａ）細胞を、（ｉ）レポーター遺伝
子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、ま
たは活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの５’側および／または
３’側の非コード核酸断片、を含むベクターでトランス
フェクトし、（ｂ）細胞を、発現制御配列が活性である
条件下で培養し、そして（ｃ）レポーター遺伝子の発現
を測定する、ことを特徴とする。
【００６５】標的遺伝子の最適な発現速度を達成するた
めに、ゲノム内の標的遺伝子の領域にどのように異種発
現制御配列を配置するべきか、および標的遺伝子の領域
からの５’および／または３’非コード配列の存在また
は非存在が発現にどのような影響を及ぼすかは、本発明
の方法により簡便に求めることができる。試験ベクター
は、好ましくは一時的に細胞にトランスフェクトさせ、
レポーター遺伝子の発現を測定する。このように、異種
発現制御配列と標的遺伝子の多くの取り合わせまたは多
くの異なる発現制御配列を、迅速かつ安価に試験するこ
とができる。異種発現制御配列は、転写開始因子または
ＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用す
ることができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がア
クチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒
介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好まし
くはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイ
ルスプロモーターそして最も好ましくはＣＭＶプロモー
ターである。本発明の方法は、特にさらに複雑なプロセ
ス工程を含むプロセスにおいて、顕著なコスト削減に貢
献する。これは、例えば、ある細胞型における特定の内
在性核酸配列の発現を増大させようとする、マウス、ヒ
ツジまたはウシのようなトランスジェニック動物の生産
における場合である。
めに、ゲノム内の標的遺伝子の領域にどのように異種発
現制御配列を配置するべきか、および標的遺伝子の領域
からの５’および／または３’非コード配列の存在また
は非存在が発現にどのような影響を及ぼすかは、本発明
の方法により簡便に求めることができる。試験ベクター
は、好ましくは一時的に細胞にトランスフェクトさせ、
レポーター遺伝子の発現を測定する。このように、異種
発現制御配列と標的遺伝子の多くの取り合わせまたは多
くの異なる発現制御配列を、迅速かつ安価に試験するこ
とができる。異種発現制御配列は、転写開始因子または
ＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用す
ることができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がア
クチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒
介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好まし
くはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイ
ルスプロモーターそして最も好ましくはＣＭＶプロモー
ターである。本発明の方法は、特にさらに複雑なプロセ
ス工程を含むプロセスにおいて、顕著なコスト削減に貢
献する。これは、例えば、ある細胞型における特定の内
在性核酸配列の発現を増大させようとする、マウス、ヒ
ツジまたはウシのようなトランスジェニック動物の生産
における場合である。
【００６６】標的遺伝子領域からの非コード核酸断片
５’または３’は、好ましくはレポーター遺伝子の５’
側または３’側でのそのゲノムの配置に従って、ベクタ
ー内で配置される。
５’または３’は、好ましくはレポーター遺伝子の５’
側または３’側でのそのゲノムの配置に従って、ベクタ
ー内で配置される。
【００６７】細胞内でその発現を検出することができる
当業者に公知のレポーター遺伝子はすべて使用され得
る。好ましくは、クロラムフェニコール(chloroampheni
col)−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコー
ドするレポーター遺伝子が用いられる。一方、目的のタ
ンパク質、例えばＥＰＯなどをコードするレポーター遺
伝子（免疫学的方法、例えばＥＬＩＳＡによってその発
現を検出することができる）を使用することも可能であ
る。
当業者に公知のレポーター遺伝子はすべて使用され得
る。好ましくは、クロラムフェニコール(chloroampheni
col)−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコー
ドするレポーター遺伝子が用いられる。一方、目的のタ
ンパク質、例えばＥＰＯなどをコードするレポーター遺
伝子（免疫学的方法、例えばＥＬＩＳＡによってその発
現を検出することができる）を使用することも可能であ
る。
【００６８】好ましい実施態様においては、標的遺伝子
の異なる5'または／および3'非コード核酸断片を含む少
なくとも２個のベクターを、異なる細胞にそれぞれトラ
ンスフェクトし、その異なる細胞におけるレポーター遺
伝子の発現を当業者に公知の方法を用いて測定する。異
種発現制御配列をどこに配置すればある一定の宿主細胞
に対して最適な発現を生じさせることができるかを本発
明の方法を用いて容易に確立することができる。
の異なる5'または／および3'非コード核酸断片を含む少
なくとも２個のベクターを、異なる細胞にそれぞれトラ
ンスフェクトし、その異なる細胞におけるレポーター遺
伝子の発現を当業者に公知の方法を用いて測定する。異
種発現制御配列をどこに配置すればある一定の宿主細胞
に対して最適な発現を生じさせることができるかを本発
明の方法を用いて容易に確立することができる。
【００６９】本発明のさらなる局面は、ＤＨＦＲ−陰性
真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくはヒト
細胞を取得する方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）部
位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１個の標的
配列、（ii）配列（ｉ）に隣接し、相同的組換えを可能
にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配
列に相同であるＤＮＡ配列、ならびに（iii）任意に正
の選択マーカー遺伝子および任意に負の選択マーカー遺
伝子を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞を、ベクターの相同
的組換えが生じる条件下で培養し、そして（ｃ）工程
（ｂ）により得られた細胞を単離することを特徴とす
る、前記方法に関する。本発明による方法においては、
前記のリコンビナーゼ標的配列および相同配列は、上記
で説明したようにして選択され、使用される。
真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくはヒト
細胞を取得する方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）部
位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１個の標的
配列、（ii）配列（ｉ）に隣接し、相同的組換えを可能
にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配
列に相同であるＤＮＡ配列、ならびに（iii）任意に正
の選択マーカー遺伝子および任意に負の選択マーカー遺
伝子を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞を、ベクターの相同
的組換えが生じる条件下で培養し、そして（ｃ）工程
（ｂ）により得られた細胞を単離することを特徴とす
る、前記方法に関する。本発明による方法においては、
前記のリコンビナーゼ標的配列および相同配列は、上記
で説明したようにして選択され、使用される。
【００７０】正の選択マーカー遺伝子は、存在する場合
には、ＤＨＦＲ遺伝子と相同である配列の間に配置され
る。負の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、相
同配列の外側に配置される。
には、ＤＨＦＲ遺伝子と相同である配列の間に配置され
る。負の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、相
同配列の外側に配置される。
【００７１】相同的組換えがＤＨＦＲ遺伝子座で生じた
後は、その細胞は機能性ＤＨＦＲタンパク質を合成する
ことができない。この場合、ベクターの配列を、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子のプロモーターが不活性化されるように、また
は／およびＤＨＦＲ遺伝子のコード配列中の挿入または
欠失により機能性ＤＨＦＲタンパク質がそれ以上合成さ
れ得ないように配列することができる。
後は、その細胞は機能性ＤＨＦＲタンパク質を合成する
ことができない。この場合、ベクターの配列を、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子のプロモーターが不活性化されるように、また
は／およびＤＨＦＲ遺伝子のコード配列中の挿入または
欠失により機能性ＤＨＦＲタンパク質がそれ以上合成さ
れ得ないように配列することができる。
【００７２】ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の両方を不活
性化するために、まず細胞を本発明によるベクターでト
ランスフェクトし、次いで選択し、単離する。ＤＨＦＲ
遺伝子の対立遺伝子の一つはこれらの細胞中で不活性化
される。すなわちそれらの細胞はＤＨＦＲ遺伝子に対し
てヘテロ接合性（＋／−）である。次に、これらの細胞
は、第１のベクターとは異なった、好ましくは正の選択
マーカー遺伝子を含む本発明によるベクターを用いて再
びトランスフェクトされ得る。選択工程後、ＤＨＦＲ対
立遺伝子の両方が不活性化されている細胞が得られる。
一方、選択圧力を増大させることにより遺伝子変換を生
じさせることができ、したがって、対立遺伝子の両方を
不活性化することができる（例えば、Mortensenら, Mo
l. Cell.Biol. 12(1992), 2391-2395を参照された
い）。
性化するために、まず細胞を本発明によるベクターでト
ランスフェクトし、次いで選択し、単離する。ＤＨＦＲ
遺伝子の対立遺伝子の一つはこれらの細胞中で不活性化
される。すなわちそれらの細胞はＤＨＦＲ遺伝子に対し
てヘテロ接合性（＋／−）である。次に、これらの細胞
は、第１のベクターとは異なった、好ましくは正の選択
マーカー遺伝子を含む本発明によるベクターを用いて再
びトランスフェクトされ得る。選択工程後、ＤＨＦＲ対
立遺伝子の両方が不活性化されている細胞が得られる。
一方、選択圧力を増大させることにより遺伝子変換を生
じさせることができ、したがって、対立遺伝子の両方を
不活性化することができる（例えば、Mortensenら, Mo
l. Cell.Biol. 12(1992), 2391-2395を参照された
い）。
【００７３】本発明による方法によって、遺伝子増幅処
理において使用した場合に内在性ＤＨＦＲタンパク質を
合成しないという利点を有するＤＨＦＲ陰性細胞が得ら
れる。選択工程を行ってＤＨＦＲタンパク質をコードす
る核酸配列に結合する異種核酸配列を増幅させる場合、
内在性ＤＨＦＲ遺伝子の発現産物は干渉作用を持たない
ので、遺伝子増幅の効率が高まる。
理において使用した場合に内在性ＤＨＦＲタンパク質を
合成しないという利点を有するＤＨＦＲ陰性細胞が得ら
れる。選択工程を行ってＤＨＦＲタンパク質をコードす
る核酸配列に結合する異種核酸配列を増幅させる場合、
内在性ＤＨＦＲ遺伝子の発現産物は干渉作用を持たない
ので、遺伝子増幅の効率が高まる。
【００７４】選択可能な表現型をもたらすのに適した選
択マーカー遺伝子はすべて正の選択マーカー遺伝子、例
えば抗生物質耐性として使用することができる。正の選
択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましく
は、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまた
はハイグロマイシン耐性遺伝子である。
択マーカー遺伝子はすべて正の選択マーカー遺伝子、例
えば抗生物質耐性として使用することができる。正の選
択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましく
は、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまた
はハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００７５】当業者に公知の負の選択マーカー遺伝子は
すべて使用することができ、負の選択マーカー遺伝子を
コードする核酸配列は、好ましくは、チミジンキナーゼ
遺伝子（ＴＫ）または／およびヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰ
ＲＴ）である。
すべて使用することができ、負の選択マーカー遺伝子を
コードする核酸配列は、好ましくは、チミジンキナーゼ
遺伝子（ＴＫ）または／およびヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰ
ＲＴ）である。
【００７６】リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配
列を、対応するリコンビナーゼの一過性活性化により、
例えば、（ａ）細胞を、かかる細胞内で活性である発現
制御配列に機能的に結合しリコンビナーゼをコードする
核酸配列を含むベクターでトランスフェクトし、（ｂ）
かかる手法でトランスフェクトされた細胞を、リコンビ
ナーゼが発現され、活性であるような条件下で培養し、
そして（ｃ）任意に細胞を単離することによって細胞の
ゲノムから切り出すことができる。
列を、対応するリコンビナーゼの一過性活性化により、
例えば、（ａ）細胞を、かかる細胞内で活性である発現
制御配列に機能的に結合しリコンビナーゼをコードする
核酸配列を含むベクターでトランスフェクトし、（ｂ）
かかる手法でトランスフェクトされた細胞を、リコンビ
ナーゼが発現され、活性であるような条件下で培養し、
そして（ｃ）任意に細胞を単離することによって細胞の
ゲノムから切り出すことができる。
【００７７】本発明による方法によれば、ＤＨＦＲ遺伝
子を不活性化するだけでなく、細胞のゲノムから、リコ
ンビナーゼ標的遺伝子配列の間に位置するＤＨＦＲ遺伝
子の配列を、導入選択マーカー遺伝子と、リコンビナー
ゼ介在反応によって切り出すことも可能である。
子を不活性化するだけでなく、細胞のゲノムから、リコ
ンビナーゼ標的遺伝子配列の間に位置するＤＨＦＲ遺伝
子の配列を、導入選択マーカー遺伝子と、リコンビナー
ゼ介在反応によって切り出すことも可能である。
【００７８】リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配
列が正の選択マーカー遺伝子を含む場合、この配列を含
む細胞は抗生物質耐性である。したがって、当業者に公
知の方法によって細胞を容易に選択することができる。
列が正の選択マーカー遺伝子を含む場合、この配列を含
む細胞は抗生物質耐性である。したがって、当業者に公
知の方法によって細胞を容易に選択することができる。
【００７９】本発明の方法によって産生されたＤＨＦＲ
陰性細胞のさらなる利点は、その特性を当業者に公知の
方法によって特徴づけることができ、したがって細胞を
その他の方法に使用することができるということであ
る。さらに、ＤＨＦＲ遺伝子座に導入されたリコンビナ
ーゼ標的配列は、ゲノムへの核酸配列の部位特異的組込
みを可能にする。
陰性細胞のさらなる利点は、その特性を当業者に公知の
方法によって特徴づけることができ、したがって細胞を
その他の方法に使用することができるということであ
る。さらに、ＤＨＦＲ遺伝子座に導入されたリコンビナ
ーゼ標的配列は、ゲノムへの核酸配列の部位特異的組込
みを可能にする。
【００８０】さらなる好ましい実施態様は、異種ＤＨＦ
Ｒ遺伝子を真核細胞に導入する方法において、上記の方
法の一つによって得られるＤＨＦＲ陰性細胞を、（ａ）
（ｉ）任意に、好ましくは第１のベクターの正の選択マ
ーカー遺伝子とは異なる正の選択マーカー遺伝子、（i
i）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、（iii）部分配列
（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞ
れが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリ
コンビナーゼ標的配列に隣接しており、発現可能な状態
にある、タンパク質をコードする増幅される核酸配列を
含む第３のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）その
トランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼ標的配
列に挟まれている核酸配列が細胞のゲノム内にすでに存
在しているリコンビナーゼ標的配列に組み込まれるよう
な条件下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得ら
れた細胞を単離することを特徴とする前記方法に関す
る。
Ｒ遺伝子を真核細胞に導入する方法において、上記の方
法の一つによって得られるＤＨＦＲ陰性細胞を、（ａ）
（ｉ）任意に、好ましくは第１のベクターの正の選択マ
ーカー遺伝子とは異なる正の選択マーカー遺伝子、（i
i）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、（iii）部分配列
（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞ
れが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリ
コンビナーゼ標的配列に隣接しており、発現可能な状態
にある、タンパク質をコードする増幅される核酸配列を
含む第３のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）その
トランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼ標的配
列に挟まれている核酸配列が細胞のゲノム内にすでに存
在しているリコンビナーゼ標的配列に組み込まれるよう
な条件下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得ら
れた細胞を単離することを特徴とする前記方法に関す
る。
【００８１】正の選択マーカー遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子
および所望のタンパク質をコードする標的遺伝子は、そ
れぞれ、細胞内で活性であるか活性化することができる
発現制御配列に機能的に結合されていることが好まし
い。内部リボソーム結合部位(internal ribosomal bind
ing sites)を有するポリシストロン性構築物も原則とし
て可能である。しかしながら、標的遺伝子の増幅される
核酸配列は、別個のプロモーターによって誘導されるべ
きである。特に好ましい発現制御配列は、ウイルスプロ
モーター／エンハンサーである。タンパク質の発現に
は、ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。
および所望のタンパク質をコードする標的遺伝子は、そ
れぞれ、細胞内で活性であるか活性化することができる
発現制御配列に機能的に結合されていることが好まし
い。内部リボソーム結合部位(internal ribosomal bind
ing sites)を有するポリシストロン性構築物も原則とし
て可能である。しかしながら、標的遺伝子の増幅される
核酸配列は、別個のプロモーターによって誘導されるべ
きである。特に好ましい発現制御配列は、ウイルスプロ
モーター／エンハンサーである。タンパク質の発現に
は、ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。
【００８２】異種配列の細胞のゲノムへの本発明による
組み込みを部位特異的手法で行うことにより、異種配列
とゲノム配列との干渉を排除することは都合がよい。し
たがって、このことによって不安定な産生クローンなど
のさらに上記したような欠点が回避される。
組み込みを部位特異的手法で行うことにより、異種配列
とゲノム配列との干渉を排除することは都合がよい。し
たがって、このことによって不安定な産生クローンなど
のさらに上記したような欠点が回避される。
【００８３】タンパク質をコードする異種核酸配列の発
現速度を増大させるために、メトトレキセートとともに
公知の処理工程によって増幅工程を行うことができる。
現速度を増大させるために、メトトレキセートとともに
公知の処理工程によって増幅工程を行うことができる。
【００８４】本発明のさらなる主題は、（ｉ）任意に正
の選択マーカー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核
酸配列、ならびに（iii）部分配列（ｉ）、（ii）およ
び（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側およ
び3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配
列に隣接している、所望のタンパク質をコードする発現
可能な状態にある核酸配列を含むベクターである。
の選択マーカー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核
酸配列、ならびに（iii）部分配列（ｉ）、（ii）およ
び（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側およ
び3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配
列に隣接している、所望のタンパク質をコードする発現
可能な状態にある核酸配列を含むベクターである。
【００８５】本発明のさらに別の主題は、（ｉ）任意に
正の選択マーカー遺伝子、（ii）各場合において配列
（ｉ）に隣接する少なくとも１個のリコンビナーゼ標的
配列、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接し、相同
的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在する
ＤＨＦＲ核酸配列と相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iv）任意に、相同配列（iii）の外側、好ましくは3'
側に位置する負の選択マーカー遺伝子を含む、相同的組
換え用のベクターである。
正の選択マーカー遺伝子、（ii）各場合において配列
（ｉ）に隣接する少なくとも１個のリコンビナーゼ標的
配列、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接し、相同
的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在する
ＤＨＦＲ核酸配列と相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iv）任意に、相同配列（iii）の外側、好ましくは3'
側に位置する負の選択マーカー遺伝子を含む、相同的組
換え用のベクターである。
【００８６】さらに、本発明は、上記の方法の一つによ
って得ることができる真核細胞、好ましくはヒト細胞に
関する。この細胞は、（ａ）ＤＨＦＲをコードする少な
くとも１個の内在性核酸配列が不活性化され、好ましく
は内在性対立遺伝子の両方が不活性化されており、そし
て（ｂ）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列がＤ
ＨＦＲをコードする前記核酸配列の領域においてゲノム
に組み込まれていることを特徴とする。
って得ることができる真核細胞、好ましくはヒト細胞に
関する。この細胞は、（ａ）ＤＨＦＲをコードする少な
くとも１個の内在性核酸配列が不活性化され、好ましく
は内在性対立遺伝子の両方が不活性化されており、そし
て（ｂ）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列がＤ
ＨＦＲをコードする前記核酸配列の領域においてゲノム
に組み込まれていることを特徴とする。
【００８７】最後に、本発明のさらに別の主題は、
（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、（ii）所望のタ
ンパク質をコードする核酸配列、ならびに（iii）少な
くとも１個のリコンビナーゼ標的配列を含む、内在性Ｄ
ＨＦＲ遺伝子座の領域にある異種核酸配列によって特徴
づけられる、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、（ii）所望のタ
ンパク質をコードする核酸配列、ならびに（iii）少な
くとも１個のリコンビナーゼ標的配列を含む、内在性Ｄ
ＨＦＲ遺伝子座の領域にある異種核酸配列によって特徴
づけられる、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００８８】本発明を、下記の実施例、図面および配列
プロトコールによって説明する。配列番号３は、ｌｏｘ
Ｐ配列を示す。
プロトコールによって説明する。配列番号３は、ｌｏｘ
Ｐ配列を示す。
【００８９】
【実施例】実施例１ ＣＭＶプロモーターの制御下およ
びＨＩＦの過剰発現下でのエリスロポエチン遺伝子の発
現 ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ
（図３を参照されたい）を遺伝子的に改変したＨｅＬａ
Ｓ３細胞にトランスフェクトした。ＥＰＯ発現を制御す
るＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターは、細
胞内の、ＥＰＯ対立遺伝子のエリスロポエチン遺伝子
（ＥＰＯ）翻訳開始部位に最も近いところに導入され
た。細胞は、通常、24時間、107 細胞当たり１μｇのエ
リスロポエチンを産生する。トランスフェクションの24
時間前に、細胞を６ウェルプレート当たり６×104 細胞
の濃度で継代した。トランスフェクションの当日、細胞
をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートし
た。混合物には、ウェル当たり、各ベクター1.25μｇ、
10μｌＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim 1202375）を2
0mM Hepes緩衝液に最終容量が75μｌになるように加え
たものが含まれていた。混合物を室温で10〜15分間プレ
インキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり３
mlの培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間インキ
ュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、完全培地中で５日間培養した。３、４および５日目
に上清100μlをそれぞれ取り出し、エリスロポエチンＥ
ＬＩＳＡで分析した。このアッセイは５日目に完了し、
細胞数を測定した。ウェル当たりのエリスロポエチンの
量をその細胞数に対して計算した（図３を参照された
い）。
びＨＩＦの過剰発現下でのエリスロポエチン遺伝子の発
現 ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ
（図３を参照されたい）を遺伝子的に改変したＨｅＬａ
Ｓ３細胞にトランスフェクトした。ＥＰＯ発現を制御す
るＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターは、細
胞内の、ＥＰＯ対立遺伝子のエリスロポエチン遺伝子
（ＥＰＯ）翻訳開始部位に最も近いところに導入され
た。細胞は、通常、24時間、107 細胞当たり１μｇのエ
リスロポエチンを産生する。トランスフェクションの24
時間前に、細胞を６ウェルプレート当たり６×104 細胞
の濃度で継代した。トランスフェクションの当日、細胞
をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートし
た。混合物には、ウェル当たり、各ベクター1.25μｇ、
10μｌＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim 1202375）を2
0mM Hepes緩衝液に最終容量が75μｌになるように加え
たものが含まれていた。混合物を室温で10〜15分間プレ
インキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり３
mlの培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間インキ
ュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、完全培地中で５日間培養した。３、４および５日目
に上清100μlをそれぞれ取り出し、エリスロポエチンＥ
ＬＩＳＡで分析した。このアッセイは５日目に完了し、
細胞数を測定した。ウェル当たりのエリスロポエチンの
量をその細胞数に対して計算した（図３を参照された
い）。
【００９０】この実施例は、異種発現制御配列（ＣＭＶ
プロモーター）がエリスロポエチン遺伝子の対立遺伝子
のプロモーター領域に導入されていてもＨＩＦによるエ
リスロポエチンの誘導は可能であるということを示すも
のである。エリスロポエチン濃度の測定値の増大は、対
立遺伝子の両方における１個またはそれ以上の低酸素誘
導因子の協同作用を示すものである。
プロモーター）がエリスロポエチン遺伝子の対立遺伝子
のプロモーター領域に導入されていてもＨＩＦによるエ
リスロポエチンの誘導は可能であるということを示すも
のである。エリスロポエチン濃度の測定値の増大は、対
立遺伝子の両方における１個またはそれ以上の低酸素誘
導因子の協同作用を示すものである。
【００９１】したがって、内在性核酸配列発現を、異種
発現制御配列を導入することによって増大させることが
できるということは明らかである。アクチベーター（Ｈ
ＩＦ）が結合性核酸配列が発現制御配列内に存在する細
胞内で発現する場合、かかる遺伝子の発現はさらに増大
され得る。対応する配列がこの遺伝子座に存在しない場
合、それらの配列を本発明の方法により相同的組換えに
よってゲノム内に特異的に導入することができる。
発現制御配列を導入することによって増大させることが
できるということは明らかである。アクチベーター（Ｈ
ＩＦ）が結合性核酸配列が発現制御配列内に存在する細
胞内で発現する場合、かかる遺伝子の発現はさらに増大
され得る。対応する配列がこの遺伝子座に存在しない場
合、それらの配列を本発明の方法により相同的組換えに
よってゲノム内に特異的に導入することができる。
【００９２】実施例２ 内在性核酸配列の発現を増大さ
せるための発現制御配列の最適化された配置 内在性遺伝子の5'側の配列は発現を刺激することがで
き、そして抑制特性を有するものである。異種発現制御
配列をゲノムの標的遺伝子の5'側に導入する場合、発現
レベルは内在性5'配列によって影響される。異種発現制
御配列によって標的遺伝子の最適発現を得るためには、
かかる異種発現制御配列は、その異種発現制御配列の活
性が標的遺伝子の5'側にある非コード配列によって低減
されないように配置されなければならない。特定の配置
は、個々の配列エレメントの共同作用を得るために都合
がよいであろう。異種発現制御配列の種々の配置を試験
するために、すなわち、例えば標的遺伝子のコード配列
の翻訳開始部位からどのくらいの距離のところに異種発
現制御配列を細胞のゲノムに組み込まなければならない
かを決定するために、標的遺伝子の異なる5'非コード核
酸断片を有する異なるベクターを試験した（図４を参照
されたい）。図４に記載されたベクターでＨｅＬａＳ３
細胞をトランスフェクトし、レポーター遺伝子であるβ
−ガラクトシダーゼの発現を測定した（図５を参照され
たい）。
せるための発現制御配列の最適化された配置 内在性遺伝子の5'側の配列は発現を刺激することがで
き、そして抑制特性を有するものである。異種発現制御
配列をゲノムの標的遺伝子の5'側に導入する場合、発現
レベルは内在性5'配列によって影響される。異種発現制
御配列によって標的遺伝子の最適発現を得るためには、
かかる異種発現制御配列は、その異種発現制御配列の活
性が標的遺伝子の5'側にある非コード配列によって低減
されないように配置されなければならない。特定の配置
は、個々の配列エレメントの共同作用を得るために都合
がよいであろう。異種発現制御配列の種々の配置を試験
するために、すなわち、例えば標的遺伝子のコード配列
の翻訳開始部位からどのくらいの距離のところに異種発
現制御配列を細胞のゲノムに組み込まなければならない
かを決定するために、標的遺伝子の異なる5'非コード核
酸断片を有する異なるベクターを試験した（図４を参照
されたい）。図４に記載されたベクターでＨｅＬａＳ３
細胞をトランスフェクトし、レポーター遺伝子であるβ
−ガラクトシダーゼの発現を測定した（図５を参照され
たい）。
【００９３】アッセイの24時間前に、細胞を10センチメ
ートルペトリ皿当たり１×106 細胞の濃度で継代した。
トランスフェクションの当日に、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴ
ＡＰ混合物とともにインキュベートした。この混合物に
は、各ベクター（Ａ３−１７８、Ａ３−１７７、Ａ３−
１７５、Ａ３−１８１またはｐＮＡＳＳβ。図４を参照
されたい）１pmolを60μｌＤＯＴＡＰ(Boehringer Mann
heim 1202375)に加えて20mMＨＥＰＥＳ緩衝液で300μｌ
にしたものが含まれていた。この混合物を室温で10〜15
分間インキュベートした。細胞をペトリ皿当たり６mlの
血清を含まない培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６
時間プレインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ緩
衝液で２回洗浄し、完全培地中で22時間培養した。β−
ガラクトシダーゼ発現を測定するために、細胞を200μ
ｌＰＢＳ中で単離し、-20℃に凍結し、解凍することに
よって溶解させた。溶解物10μｌを基質（3.29mMクロロ
フェノールレッド−β−Ｄガラクトピラノシド(Boehrin
ger Mannheim 884308)、100mM ＨＥＰＥＳ、150mM NaC
l、２mM MgCl2 、１％ＢＳＡ、0.1％Triton-X100、１
％アジ化ナトリウム、pH７）で１：１０に希釈した。試
料を１：２段階に希釈して、暗赤色に発色するまで96ウ
ェルプレート中で37℃にてインキュベートした。次い
で、試料を570／580nm、または550nmで測定した。
ートルペトリ皿当たり１×106 細胞の濃度で継代した。
トランスフェクションの当日に、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴ
ＡＰ混合物とともにインキュベートした。この混合物に
は、各ベクター（Ａ３−１７８、Ａ３−１７７、Ａ３−
１７５、Ａ３−１８１またはｐＮＡＳＳβ。図４を参照
されたい）１pmolを60μｌＤＯＴＡＰ(Boehringer Mann
heim 1202375)に加えて20mMＨＥＰＥＳ緩衝液で300μｌ
にしたものが含まれていた。この混合物を室温で10〜15
分間インキュベートした。細胞をペトリ皿当たり６mlの
血清を含まない培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６
時間プレインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ緩
衝液で２回洗浄し、完全培地中で22時間培養した。β−
ガラクトシダーゼ発現を測定するために、細胞を200μ
ｌＰＢＳ中で単離し、-20℃に凍結し、解凍することに
よって溶解させた。溶解物10μｌを基質（3.29mMクロロ
フェノールレッド−β−Ｄガラクトピラノシド(Boehrin
ger Mannheim 884308)、100mM ＨＥＰＥＳ、150mM NaC
l、２mM MgCl2 、１％ＢＳＡ、0.1％Triton-X100、１
％アジ化ナトリウム、pH７）で１：１０に希釈した。試
料を１：２段階に希釈して、暗赤色に発色するまで96ウ
ェルプレート中で37℃にてインキュベートした。次い
で、試料を570／580nm、または550nmで測定した。
【００９４】図５に示したように、レポーター遺伝子の
発現は、ベクターＡ３−１７８でトランスフェクトされ
た細胞中で最も高かった。このベクターにおいては、異
種発現制御配列はコード配列の翻訳開始部位に近接して
いる。
発現は、ベクターＡ３−１７８でトランスフェクトされ
た細胞中で最も高かった。このベクターにおいては、異
種発現制御配列はコード配列の翻訳開始部位に近接して
いる。
【００９５】したがって、この方法を用いることによ
り、内在性標的遺伝子の最適発現を得るためには宿主細
胞のゲノム内の異種発現制御配列のいずれの配置を選択
しなければならないかを簡単且つ迅速に決定することが
できる。
り、内在性標的遺伝子の最適発現を得るためには宿主細
胞のゲノム内の異種発現制御配列のいずれの配置を選択
しなければならないかを簡単且つ迅速に決定することが
できる。
【００９６】実施例３ ＤＨＦＲ陰性細胞の産生 第１の工程では、本発明による組換え用ベクターを調製
した。第２の工程ではこれらのベクターでヒト細胞系を
トランスフェクトし、相同的組換えイベントをスクリー
ニングした。この方法では、最初にＤＨＦＲ遺伝子の一
つの対立遺伝子を不活性化することができ、次いで第２
の対立遺伝子を不活性化することができた。
した。第２の工程ではこれらのベクターでヒト細胞系を
トランスフェクトし、相同的組換えイベントをスクリー
ニングした。この方法では、最初にＤＨＦＲ遺伝子の一
つの対立遺伝子を不活性化することができ、次いで第２
の対立遺伝子を不活性化することができた。
【００９７】相同的組換え用のＤＨＦＲベクター ヒトＤＨＦＲ遺伝子は染色体５に位置しており、６個の
エキソンに分かれた30kbを含む。プロモーターの一部、
エキソン２の一部およびエキソン１全体を含む1.8kbのE
coRI断片を用いて相同的組換え用ベクターを調製した。
エキソン１をApaI消化により除去し、生じたギャップ
（0.45kb）にリンカーを介してＮｅｏ（1.4kb）または
Ｈｙｇ（2.2kb）耐性遺伝子を挿入した。これらのリン
カーには、アダプター(adaptor)ヌクレオチドに加えて
最小配列TAT TG AAG CAT ATT ACA TACGAT ATG CTT CAA
TA（ｌｏｘＰ配列）が含まれている。このリンカー配列
は同じ向きに配列され、耐性遺伝子は好ましくはＤＨＦ
Ｒ遺伝子に対してアンチセンスである。耐性遺伝子が挿
入された後、相同領域は伸びた。このため、ベクターを
3'領域由来のEcoRI断片（6.0kb）によって伸長させた
（図６）。この方法では、本発明による標的構築物ｐＮ
ＤＩ（11.5kb）およびｐＨＤＩ（12.3kb）が得られた。
エキソンに分かれた30kbを含む。プロモーターの一部、
エキソン２の一部およびエキソン１全体を含む1.8kbのE
coRI断片を用いて相同的組換え用ベクターを調製した。
エキソン１をApaI消化により除去し、生じたギャップ
（0.45kb）にリンカーを介してＮｅｏ（1.4kb）または
Ｈｙｇ（2.2kb）耐性遺伝子を挿入した。これらのリン
カーには、アダプター(adaptor)ヌクレオチドに加えて
最小配列TAT TG AAG CAT ATT ACA TACGAT ATG CTT CAA
TA（ｌｏｘＰ配列）が含まれている。このリンカー配列
は同じ向きに配列され、耐性遺伝子は好ましくはＤＨＦ
Ｒ遺伝子に対してアンチセンスである。耐性遺伝子が挿
入された後、相同領域は伸びた。このため、ベクターを
3'領域由来のEcoRI断片（6.0kb）によって伸長させた
（図６）。この方法では、本発明による標的構築物ｐＮ
ＤＩ（11.5kb）およびｐＨＤＩ（12.3kb）が得られた。
【００９８】相同的組換えが完了した後、エキソン１全
体（アミノ酸１〜28）およびＤＨＦＲ遺伝子のプロモー
ターの一部が除去されていた。細胞は、もはや機能的Ｄ
ＨＦＲタンパク質を発現することはできない。
体（アミノ酸１〜28）およびＤＨＦＲ遺伝子のプロモー
ターの一部が除去されていた。細胞は、もはや機能的Ｄ
ＨＦＲタンパク質を発現することはできない。
【００９９】細胞のトランスフェクション 使用されるヒト細胞系は、染色体５について倍数体であ
る必要はなく、ＭＴＸ選択下で維持されている必要はな
い。いずれの場合においても、２以上の対立遺伝子が不
活性化されなければならない。
る必要はなく、ＭＴＸ選択下で維持されている必要はな
い。いずれの場合においても、２以上の対立遺伝子が不
活性化されなければならない。
【０１００】ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ATCC CCL-2.2） 細胞を、組織培養フラスコ内、ＲＰＭＩ１６４０培地、
10％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミンおよび１mM
ＭＥＭ（非必須アミノ酸）中で培養した。インキュベー
ションを37℃、５％ＣＯ2 で行った。エレクトロポレー
ション緩衝液には20mM Ｈｅｐｅｓ、138mM NaCl、５m
M KCl、0.7mM Na2HPO4 、６mM Ｄ−グルコース一水
和物、pH 7.0が含まれていた。10μｇの線状化ベクター
ＤＮＡ（ｐＮＤＩ）を１×107 細胞に960μＦおよび250
Ｖでエレクトロポレーションした（Biorad Gene Pulse
r）。エレクトロポレーション後、600μg/ml Ｇ４１８
（ジェネティシン(geneticin) Boehringer Mannheim）
を含む培地中に細胞を回収して培養した。10日間選択を
行った後（培地は２日毎に交換する）、陽性クローンを
単離して拡大増殖させた。
10％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミンおよび１mM
ＭＥＭ（非必須アミノ酸）中で培養した。インキュベー
ションを37℃、５％ＣＯ2 で行った。エレクトロポレー
ション緩衝液には20mM Ｈｅｐｅｓ、138mM NaCl、５m
M KCl、0.7mM Na2HPO4 、６mM Ｄ−グルコース一水
和物、pH 7.0が含まれていた。10μｇの線状化ベクター
ＤＮＡ（ｐＮＤＩ）を１×107 細胞に960μＦおよび250
Ｖでエレクトロポレーションした（Biorad Gene Pulse
r）。エレクトロポレーション後、600μg/ml Ｇ４１８
（ジェネティシン(geneticin) Boehringer Mannheim）
を含む培地中に細胞を回収して培養した。10日間選択を
行った後（培地は２日毎に交換する）、陽性クローンを
単離して拡大増殖させた。
【０１０１】ＨＴ１０８０細胞（ATCC CCL-121） 細胞を、ＨｅＬａ Ｓ３細胞について記載したようにし
て10％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミンおよび１mM
ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地を用いて培養
し、選択した。
て10％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミンおよび１mM
ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地を用いて培養
し、選択した。
【０１０２】Ｎａｍａｌｗａ細胞（ATCC CRL-1432） この細胞系は懸濁細胞系であり、それに対応して培養し
なければならない。この培地は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞に
ついて記載したものと一致する。トランスフェクション
後、細胞を40個の96-ウェルプレートに分配した。陽性
クローンを48−、24−、12−および６−ウェルプレート
で拡大増殖させた。１mg/ml Ｇ４１８を用いて選択を行
った。
なければならない。この培地は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞に
ついて記載したものと一致する。トランスフェクション
後、細胞を40個の96-ウェルプレートに分配した。陽性
クローンを48−、24−、12−および６−ウェルプレート
で拡大増殖させた。１mg/ml Ｇ４１８を用いて選択を行
った。
【０１０３】ＤＨＦＲ陰性（＋／−）細胞の検出 ベクターの挿入をサザンブロット分析またはＰＣＲによ
って検出した。相同的組換えが正しく生じている場合、
EcoRI消化後、Ｎｅｏ遺伝子の挿入によって形成された
2.9kbのバンドならびに無傷ＤＨＦＲ遺伝子に該当する
1.8kbのバンドが検出された（図７ｃ）。混合クローン
（サザンブロットにおいてはバンド強度の比が同等でな
い）をＦＡＣＳにおける単細胞沈着(single cell depos
ition)によって分離し、サブクローニンングし、続いて
拡大増殖させた。陽性として同定されたクローン中では
ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つが不活性化されてい
た。
って検出した。相同的組換えが正しく生じている場合、
EcoRI消化後、Ｎｅｏ遺伝子の挿入によって形成された
2.9kbのバンドならびに無傷ＤＨＦＲ遺伝子に該当する
1.8kbのバンドが検出された（図７ｃ）。混合クローン
（サザンブロットにおいてはバンド強度の比が同等でな
い）をＦＡＣＳにおける単細胞沈着(single cell depos
ition)によって分離し、サブクローニンングし、続いて
拡大増殖させた。陽性として同定されたクローン中では
ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つが不活性化されてい
た。
【０１０４】ＤＨＦＲ陰性（−／−）細胞の産生 ＤＨＦＲ対立遺伝子（＋／−）が不活性化されている細
胞クローンは、新たな相同的組換えを行うことができ
る。この目的のために、細胞クローンを上記のようにし
てベクターｐＨＤＩの線状化ＤＮＡ10μｇを用いてトラ
ンスフェクトした。選択は、ハイグロマイシンＢ（Boeh
ringer Mannheim）500μg/mlを含む培地中で行った。
胞クローンは、新たな相同的組換えを行うことができ
る。この目的のために、細胞クローンを上記のようにし
てベクターｐＨＤＩの線状化ＤＮＡ10μｇを用いてトラ
ンスフェクトした。選択は、ハイグロマイシンＢ（Boeh
ringer Mannheim）500μg/mlを含む培地中で行った。
【０１０５】培地中のＧ４１８の濃度が高くなると、Ｄ
ＨＦＲ+/- 細胞における選択圧力が増大し、ＤＨＦＲ
-/- 細胞が得られた。遺伝子変換によって第２のＤＨＦ
Ｒ対立遺伝子が活性化される原因となる染色体内組換え
が生じた。ＤＨＦＲ-/- 細胞には２個の不活性化ＤＨＦ
Ｒ対立遺伝子が含まれており、もはやテトラヒドロ葉酸
を合成することはできない。したがって、チミジン、グ
リシンおよびプリンを培地に加えなければならない（補
足）。任意に細胞をα- 培地（Gibco BRL）で培養し
た。
ＨＦＲ+/- 細胞における選択圧力が増大し、ＤＨＦＲ
-/- 細胞が得られた。遺伝子変換によって第２のＤＨＦ
Ｒ対立遺伝子が活性化される原因となる染色体内組換え
が生じた。ＤＨＦＲ-/- 細胞には２個の不活性化ＤＨＦ
Ｒ対立遺伝子が含まれており、もはやテトラヒドロ葉酸
を合成することはできない。したがって、チミジン、グ
リシンおよびプリンを培地に加えなければならない（補
足）。任意に細胞をα- 培地（Gibco BRL）で培養し
た。
【０１０６】ＤＨＦＲ-/- 細胞を、上記のようにして検
出した。ホモ接合性ＤＨＦＲ陰性細胞では野生型バンド
（1.8kb）が検出可能であった。ｐＤＨＩでトランスフ
ェクトした細胞は、相同的組換え後、EcoRIサザンブロ
ットにおいて新たな3.7kbのバンドを示した（図７
ｃ）。
出した。ホモ接合性ＤＨＦＲ陰性細胞では野生型バンド
（1.8kb）が検出可能であった。ｐＤＨＩでトランスフ
ェクトした細胞は、相同的組換え後、EcoRIサザンブロ
ットにおいて新たな3.7kbのバンドを示した（図７
ｃ）。
【０１０７】ＤＨＦＲ陰性細胞（−／−）の使用 本発明による細胞をタンパク質の大量生産に使用するこ
とができる。この目的のために、本発明によるベクター
（図８）およびＣｒｅリコンビナーゼをコードする発現
ベクターでＤＨＦＲ-/- 細胞をトランスフェクトした。
ＣｒｅリコンビナーゼによってＤＨＦＲ遺伝子座から抗
生物質耐性が除かれ、本発明によるベクターがＤＨＦＲ
-/- 細胞のゲノムのｌｏｘＰ配列に組み込まれた。細胞
は再び抗生物質感受性になり、チミジン、グリシンおよ
びプリン補足から独立した。
とができる。この目的のために、本発明によるベクター
（図８）およびＣｒｅリコンビナーゼをコードする発現
ベクターでＤＨＦＲ-/- 細胞をトランスフェクトした。
ＣｒｅリコンビナーゼによってＤＨＦＲ遺伝子座から抗
生物質耐性が除かれ、本発明によるベクターがＤＨＦＲ
-/- 細胞のゲノムのｌｏｘＰ配列に組み込まれた。細胞
は再び抗生物質感受性になり、チミジン、グリシンおよ
びプリン補足から独立した。
【０１０８】補足なしの培地を用いることによって、ま
たは培養培地に適当な抗生物質を加えることによって選
択を行うことができる。この場合、抗生物質は、細胞の
ゲノムからＣｒｅリコンビナーゼによって除去された耐
性遺伝子に対応するものである。ｌｏｘＰ配列に組み込
まれたベクターが正の選択マーカー遺伝子を含む場合に
は、この抗生物質を培地に添加することによって選択を
行うことができる。
たは培養培地に適当な抗生物質を加えることによって選
択を行うことができる。この場合、抗生物質は、細胞の
ゲノムからＣｒｅリコンビナーゼによって除去された耐
性遺伝子に対応するものである。ｌｏｘＰ配列に組み込
まれたベクターが正の選択マーカー遺伝子を含む場合に
は、この抗生物質を培地に添加することによって選択を
行うことができる。
【０１０９】遺伝子増幅による産生量の増大 細胞の組換えタンパク質の産生量を増大させるために、
細胞に導入されたＤＨＦＲ遺伝子および異種タンパク質
をコードする異種核酸配列を増幅するメトトレキセート
（ＭＴＸ）選択を行った。増幅を行うために、細胞をＭ
ＴＸの濃度を上昇させながら（100〜1000mM）培養し
た。増幅の程度は、比較(comparative)サザンブロット
のデンシトメーター評価(densitometric evaluation)に
よって監視した（ＭＴＸ添加前、添加中および添加後に
行った）。増幅工程後に得られた本発明による細胞に
は、ｌｏｘＰ遺伝子座に導入ＤＨＦＲ遺伝子および挿入
異種核酸配列の多数のコピーが含まれていた。これらの
細胞は、異種核酸の高産生量を特徴とする。
細胞に導入されたＤＨＦＲ遺伝子および異種タンパク質
をコードする異種核酸配列を増幅するメトトレキセート
（ＭＴＸ）選択を行った。増幅を行うために、細胞をＭ
ＴＸの濃度を上昇させながら（100〜1000mM）培養し
た。増幅の程度は、比較(comparative)サザンブロット
のデンシトメーター評価(densitometric evaluation)に
よって監視した（ＭＴＸ添加前、添加中および添加後に
行った）。増幅工程後に得られた本発明による細胞に
は、ｌｏｘＰ遺伝子座に導入ＤＨＦＲ遺伝子および挿入
異種核酸配列の多数のコピーが含まれていた。これらの
細胞は、異種核酸の高産生量を特徴とする。
【０１１０】本発明の好ましい実施態様を説明の一部と
して下記に示す。 １．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる
方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）第１の異種発現制
御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なく
とも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（ii
i）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リ
コンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、（iv）配列
（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組
換えが可能であるように該細胞のゲノム内の核酸部分と
相同であるＤＮＡ配列を含む第１のベクターでトランス
フェクトし、（ｂ）トランスフェクトした細胞を、該ベ
クターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、こと
を特徴とする前記方法。
して下記に示す。 １．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる
方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）第１の異種発現制
御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なく
とも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（ii
i）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リ
コンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、（iv）配列
（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組
換えが可能であるように該細胞のゲノム内の核酸部分と
相同であるＤＮＡ配列を含む第１のベクターでトランス
フェクトし、（ｂ）トランスフェクトした細胞を、該ベ
クターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、こと
を特徴とする前記方法。
【０１１１】２．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘ
Ｐ配列を使用する、１項に記載の方法。 ３．細胞がヒト細胞である、１項または２項に記載の方
法。 ４．細胞が不死化細胞である、１〜３項のいずれか１項
に記載の方法。 ５．細胞がＨＴ１０８０細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞また
はＨｅＬａ Ｓ３細胞である、４項に記載の方法。
Ｐ配列を使用する、１項に記載の方法。 ３．細胞がヒト細胞である、１項または２項に記載の方
法。 ４．細胞が不死化細胞である、１〜３項のいずれか１項
に記載の方法。 ５．細胞がＨＴ１０８０細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞また
はＨｅＬａ Ｓ３細胞である、４項に記載の方法。
【０１１２】６．異種発現制御配列が、プロモーター／
エンハンサー、好ましくはウイルスプロモーター、特に
好ましくはＣＭＶプロモーターを含む、１〜５項のいず
れか１項に記載の方法。 ７．異種発現制御配列が3'−非コード配列を含む、１〜
６項のいずれか１項に記載の方法。 ８．異種配列を、内在する核酸配列の内在性発現制御配
列が相同的組換えによって除去されるように選択する、
１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
エンハンサー、好ましくはウイルスプロモーター、特に
好ましくはＣＭＶプロモーターを含む、１〜５項のいず
れか１項に記載の方法。 ７．異種発現制御配列が3'−非コード配列を含む、１〜
６項のいずれか１項に記載の方法。 ８．異種配列を、内在する核酸配列の内在性発現制御配
列が相同的組換えによって除去されるように選択する、
１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１３】９．正の選択マーカー遺伝子が、ネオマイ
シン、カナマイシン、ジェネティシン(geneticin)、ま
たはハイグロマイシン耐性遺伝子である、１〜８項のい
ずれか１項に記載の方法。 １０．前記ベクターが、１項（ａ）（iv）に記載の相同
配列の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子をさら
に含有する、１〜９項のいずれか１項に記載の方法。 １１．リコンビナーゼ標的配列間に位置する核酸配列
を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼの
一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出す、１〜
１０項のいずれか１項に記載の方法。
シン、カナマイシン、ジェネティシン(geneticin)、ま
たはハイグロマイシン耐性遺伝子である、１〜８項のい
ずれか１項に記載の方法。 １０．前記ベクターが、１項（ａ）（iv）に記載の相同
配列の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子をさら
に含有する、１〜９項のいずれか１項に記載の方法。 １１．リコンビナーゼ標的配列間に位置する核酸配列
を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼの
一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出す、１〜
１０項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１４】１２．（ａ）細胞を、（ｉ）第２の異種発
現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少
なくとも１つの配列、（ii）好ましくは第１のベクター
の正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー
遺伝子、および（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接
する少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、を含む
さらなるベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トラン
スフェクトした細胞を、標的配列により挟まれている配
列が細胞のゲノム内の標的配列に組み込まれる条件下で
培養し、（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離
し、そして（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を、
各場合において異なる発現制御配列および／または増幅
遺伝子を用いて少なくとも１回繰り返すことを特徴とす
る、１項に記載の方法。
現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少
なくとも１つの配列、（ii）好ましくは第１のベクター
の正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー
遺伝子、および（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接
する少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、を含む
さらなるベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トラン
スフェクトした細胞を、標的配列により挟まれている配
列が細胞のゲノム内の標的配列に組み込まれる条件下で
培養し、（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離
し、そして（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を、
各場合において異なる発現制御配列および／または増幅
遺伝子を用いて少なくとも１回繰り返すことを特徴とす
る、１項に記載の方法。
【０１１５】１３．相同的組換えのためのベクターであ
って、（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択さ
れる、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー
遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、
部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配
列、（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノ
ム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）およ
び（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および（ｖ）場合に
より、負の選択マーカー遺伝子を含む前記ベクター。
って、（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択さ
れる、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー
遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、
部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配
列、（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノ
ム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）およ
び（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および（ｖ）場合に
より、負の選択マーカー遺伝子を含む前記ベクター。
【０１１６】１４．（ｉ）異種発現制御配列および増幅
遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）
正の選択マーカー遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（i
i）に隣接する、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的
配列、（iv）場合により、負の選択マーカー遺伝子を含
むベクター。
遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）
正の選択マーカー遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（i
i）に隣接する、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的
配列、（iv）場合により、負の選択マーカー遺伝子を含
むベクター。
【０１１７】１５．１〜１２項のいずれか１項に記載さ
れた方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 １６．（ａ）真核細胞中に内在する核酸配列と機能的に
結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から
選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた
配列を含有し、そして（ｂ）この配列がリコンビナーゼ
標的配列により挟まれている、真核細胞、好ましくはヒ
ト細胞。
れた方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 １６．（ａ）真核細胞中に内在する核酸配列と機能的に
結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から
選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた
配列を含有し、そして（ｂ）この配列がリコンビナーゼ
標的配列により挟まれている、真核細胞、好ましくはヒ
ト細胞。
【０１１８】１７．真核細胞中に内在する核酸配列の発
現を変化させる方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）ア
クチベータータンパク質を結合する、少なくとも１つの
核酸配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（iii）相
同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部
分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤ
ＮＡ配列、を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的
組換えが起こる条件下で培養し、そして（ｃ）工程
（ｂ）により得られた細胞を単離する、ことを特徴とす
る、前記方法。
現を変化させる方法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）ア
クチベータータンパク質を結合する、少なくとも１つの
核酸配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、（iii）相
同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部
分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤ
ＮＡ配列、を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的
組換えが起こる条件下で培養し、そして（ｃ）工程
（ｂ）により得られた細胞を単離する、ことを特徴とす
る、前記方法。
【０１１９】１８．少なくとも１つの低酸素誘導性因子
（ＨＩＦ）結合性核酸配列を使用する、１７項に記載の
方法。 １９．ＨＩＦ−結合性核酸配列を、配列番号１による53
bpの配列、配列番号２による43bpの配列、これらの配列
と相同である配列、またはストリンジェントな条件下で
これらの配列とハイブリダイズする配列から選択する、
１８項に記載の方法。
（ＨＩＦ）結合性核酸配列を使用する、１７項に記載の
方法。 １９．ＨＩＦ−結合性核酸配列を、配列番号１による53
bpの配列、配列番号２による43bpの配列、これらの配列
と相同である配列、またはストリンジェントな条件下で
これらの配列とハイブリダイズする配列から選択する、
１８項に記載の方法。
【０１２０】２０．さらに、細胞を（ｉ）この細胞の活
性発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータ
ータンパク質をコードする核酸配列、および（ii）場合
により、正の選択マーカー遺伝子を含むベクターでトラ
ンスフェクトすることを含む、１７〜１９項のいずれか
１項に記載の方法。
性発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータ
ータンパク質をコードする核酸配列、および（ii）場合
により、正の選択マーカー遺伝子を含むベクターでトラ
ンスフェクトすることを含む、１７〜１９項のいずれか
１項に記載の方法。
【０１２１】２１．アクチベータータンパク質が、ＨＩ
Ｆ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１βタンパ
ク質である、２０項に記載の方法。 ２２．細胞を0.1〜２％のＯ2濃度で培養する、１８〜２
１項のいずれか１項に記載の方法。
Ｆ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１βタンパ
ク質である、２０項に記載の方法。 ２２．細胞を0.1〜２％のＯ2濃度で培養する、１８〜２
１項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２２】２３．相同的組換えのためのベクターであ
って、（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少
なくとも１つの核酸配列、（ii）正の選択マーカー遺伝
子、（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲ
ノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（i
i）に隣接するＤＮＡ配列、を含む前記ベクター。
って、（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少
なくとも１つの核酸配列、（ii）正の選択マーカー遺伝
子、（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲ
ノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（i
i）に隣接するＤＮＡ配列、を含む前記ベクター。
【０１２３】２４．１７〜２１項のいずれか１項に記載
の方法により得られる、真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 ２５．真核細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合して
いる、アクチベータータンパク質／アクチベータータン
パク質複合体を結合する、少なくとも１つの異種の染色
体位置が定められた核酸断片を含有する、真核細胞、好
ましくはヒト細胞。
の方法により得られる、真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 ２５．真核細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合して
いる、アクチベータータンパク質／アクチベータータン
パク質複合体を結合する、少なくとも１つの異種の染色
体位置が定められた核酸断片を含有する、真核細胞、好
ましくはヒト細胞。
【０１２４】２６．真核細胞中に内在する標的遺伝子の
領域からの非コード核酸配列の、その標的遺伝子発現に
及ぼす影響を試験する方法であって、（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞
内で活性であるか、または活性化することができる異種
発現制御配列、および（ii）標的遺伝子の領域からの5'
側および／または3'側の非コード核酸断片、を含むベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）前記細胞を、発現制
御配列が活性である条件下で培養し、そして（ｃ）レポ
ーター遺伝子の発現を測定する、ことを特徴とする、前
記方法。
領域からの非コード核酸配列の、その標的遺伝子発現に
及ぼす影響を試験する方法であって、（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞
内で活性であるか、または活性化することができる異種
発現制御配列、および（ii）標的遺伝子の領域からの5'
側および／または3'側の非コード核酸断片、を含むベク
ターでトランスフェクトし、（ｂ）前記細胞を、発現制
御配列が活性である条件下で培養し、そして（ｃ）レポ
ーター遺伝子の発現を測定する、ことを特徴とする、前
記方法。
【０１２５】２７．レポーター遺伝子が、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコー
ドするものである、２６項に記載の方法。 ２８．（ａ）互いに異なる標的遺伝子の5'および／また
は3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクター
で、それぞれ異なる細胞をトランスフェクトし、そして
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を異なる細胞において測
定することを特徴とする、２６項または２７項に記載の
方法。
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−
ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコー
ドするものである、２６項に記載の方法。 ２８．（ａ）互いに異なる標的遺伝子の5'および／また
は3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクター
で、それぞれ異なる細胞をトランスフェクトし、そして
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を異なる細胞において測
定することを特徴とする、２６項または２７項に記載の
方法。
【０１２６】２９．ＤＨＦＲ陰性真核細胞を作製する方
法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）部位特異的リコンビ
ナーゼの少なくとも１つの標的配列、（ii）相同的組換
えが可能であるように細胞中に内在するＤＨＦＲ核酸配
列に相同である、配列（ｉ）に隣接するＤＮＡ配列、お
よび（iii）場合により、正の選択マーカー遺伝子、お
よび場合により、負の選択マーカー遺伝子、を含む第１
のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェ
クトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件
下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細
胞を単離することを特徴とする前記方法。
法であって、（ａ）細胞を、（ｉ）部位特異的リコンビ
ナーゼの少なくとも１つの標的配列、（ii）相同的組換
えが可能であるように細胞中に内在するＤＨＦＲ核酸配
列に相同である、配列（ｉ）に隣接するＤＮＡ配列、お
よび（iii）場合により、正の選択マーカー遺伝子、お
よび場合により、負の選択マーカー遺伝子、を含む第１
のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェ
クトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件
下で培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細
胞を単離することを特徴とする前記方法。
【０１２７】３０．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏ
ｘＰ配列を使用する、２９項に記載の方法。 ３１．正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列
が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまた
はハイグロマイシン耐性遺伝子である、２９項または３
０項に記載の方法。
ｘＰ配列を使用する、２９項に記載の方法。 ３１．正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列
が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまた
はハイグロマイシン耐性遺伝子である、２９項または３
０項に記載の方法。
【０１２８】３２．負の選択マーカー遺伝子をコードす
る核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および
／またはヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である、２９〜３
１項のいずれか１項に記載の方法。 ３３．リコンビナーゼ標的遺伝子により挟まれている配
列を、対応するリコンビナーゼの一時的な活性化によっ
て細胞のゲノムから切り出す、２９〜３２項のいずれか
１項に記載の方法。
る核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および
／またはヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である、２９〜３
１項のいずれか１項に記載の方法。 ３３．リコンビナーゼ標的遺伝子により挟まれている配
列を、対応するリコンビナーゼの一時的な活性化によっ
て細胞のゲノムから切り出す、２９〜３２項のいずれか
１項に記載の方法。
【０１２９】３４．異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞中に
導入する方法であって、（ａ）３３項に記載の方法によ
り得られた細胞を、（ｉ）好ましくは第１のベクターの
正の選択マーカー遺伝子と異なる、場合により、正の選
択マーカー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配
列、（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）から
の核酸配列のそれぞれが、少なくとも１つのリコンビナ
ーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、発現可能な
形態でタンパク質をコードする増幅すべき核酸配列、を
含む第３のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トラ
ンスフェクトした細胞を、リコンビナーゼ標的配列に隣
接する核酸配列が、細胞のゲノムに既に存在するリコン
ビナーゼ標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、そ
して（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離するこ
とを特徴とする、前記方法。
導入する方法であって、（ａ）３３項に記載の方法によ
り得られた細胞を、（ｉ）好ましくは第１のベクターの
正の選択マーカー遺伝子と異なる、場合により、正の選
択マーカー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配
列、（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）から
の核酸配列のそれぞれが、少なくとも１つのリコンビナ
ーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、発現可能な
形態でタンパク質をコードする増幅すべき核酸配列、を
含む第３のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トラ
ンスフェクトした細胞を、リコンビナーゼ標的配列に隣
接する核酸配列が、細胞のゲノムに既に存在するリコン
ビナーゼ標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、そ
して（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離するこ
とを特徴とする、前記方法。
【０１３０】３５．（ｉ）場合により、正の選択マーカ
ー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、およ
び（iii）目的のタンパク質をコードする、発現可能な
形態の核酸配列を含み、ここで、部分配列（ｉ）、（i
i）および（iii）からの各核酸配列は、少なくとも１つ
のリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接す
る、ベクター。
ー遺伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、およ
び（iii）目的のタンパク質をコードする、発現可能な
形態の核酸配列を含み、ここで、部分配列（ｉ）、（i
i）および（iii）からの各核酸配列は、少なくとも１つ
のリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接す
る、ベクター。
【０１３１】３６．相同的組換えのためのベクターであ
って、（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）それぞれの場合に配列（ｉ）に隣接する、少なく
とも１つのリコンビナーゼ標的配列（iii）相同的組換
えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配
列相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮ
Ａ配列、および（iv）相同配列（iii）の外側の、場合
により、負の選択マーカー遺伝子、を含む、前記ベクタ
ー。
って、（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）それぞれの場合に配列（ｉ）に隣接する、少なく
とも１つのリコンビナーゼ標的配列（iii）相同的組換
えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配
列相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮ
Ａ配列、および（iv）相同配列（iii）の外側の、場合
により、負の選択マーカー遺伝子、を含む、前記ベクタ
ー。
【０１３２】３７．２９〜３４項のいずれか１項に記載
の方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 ３８．（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１つの内
在性核酸配列が不活性化されており、そして（ｂ）ＤＨ
ＦＲをコードするこの核酸配列の領域のゲノム中に、少
なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が組み込まれて
いる、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
の方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 ３８．（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１つの内
在性核酸配列が不活性化されており、そして（ｂ）ＤＨ
ＦＲをコードするこの核酸配列の領域のゲノム中に、少
なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が組み込まれて
いる、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３３】３９．（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配
列、（ii）目的のタンパク質をコードする核酸配列、お
よび（iii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域内の異種核酸配
列を特徴とする、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
列、（ii）目的のタンパク質をコードする核酸配列、お
よび（iii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域内の異種核酸配
列を特徴とする、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Mannheim GmbH <120> Optimization of cells for endogenous gene activation <130> PA98-407 <150> EP application No.97 121 075.2 <151> 1997-12-1 <160> 3 <170> Windows 95 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Unknown <223> This shows a first HIF-binding nucleotide sequence. <400> 1 cctctcctct aggcccgtgg ggctggccct gcaccgccga gcttcccggg atg 53 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Unknown <223> This shows a second HIF-binding nucleotide sequence. <400> 2 ctacgtgctg tctcacacag cctgtctgac ctctcgaccc tac 43 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <223> This shows a loxP sequence. <400> 3 tattgaagca tattacatac gatatgcttc aata 34
【図１】（Ａ）は、第１のベクターとして使用される相
同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同
配列、Ｓｅｑ１：第１の異種発現制御配列、Ｒ１：正の
選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘ
Ｐ配列。（Ｂ）は、ゲノム配列を示すものであり、
（ａ）は相同的組換えの完了後のものであり、（ｂ）は
Ｃｒｅリコンビナーゼによって触媒されたｌｏｘＰ配列
に挟まれた配列の除去後のものである。（Ｃ）は、ｌｏ
ｘＰ配列の間に位置する配列を含むＣｒｅリコンビナー
ゼ介在組込み用のベクターを示すものであり、（ｃ）
は、第２のベクターのｌｏｘＰ配列における組込み後の
ゲノム配列を示すものである。Ｒ２：任意にＲ１とは異
なる正の選択マーカー遺伝子、Ｓｅｑ２：第２の異種発
現制御配列。
同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同
配列、Ｓｅｑ１：第１の異種発現制御配列、Ｒ１：正の
選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘ
Ｐ配列。（Ｂ）は、ゲノム配列を示すものであり、
（ａ）は相同的組換えの完了後のものであり、（ｂ）は
Ｃｒｅリコンビナーゼによって触媒されたｌｏｘＰ配列
に挟まれた配列の除去後のものである。（Ｃ）は、ｌｏ
ｘＰ配列の間に位置する配列を含むＣｒｅリコンビナー
ゼ介在組込み用のベクターを示すものであり、（ｃ）
は、第２のベクターのｌｏｘＰ配列における組込み後の
ゲノム配列を示すものである。Ｒ２：任意にＲ１とは異
なる正の選択マーカー遺伝子、Ｓｅｑ２：第２の異種発
現制御配列。
【図２】（Ａ）は、相同的組換え用のベクターを示すも
のである。ＨＲ：相同配列、Ｒ−ボックス：正のおよび
任意に負の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有
するｌｏｘＰ配列、ＨＳＶ−ｔｋ：単純ヘルペスチミジ
ンキナーゼ。（Ｂ）は、片側だけに相同配列を有する相
同的組換え用ベクターを示すものである。
のである。ＨＲ：相同配列、Ｒ−ボックス：正のおよび
任意に負の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有
するｌｏｘＰ配列、ＨＳＶ−ｔｋ：単純ヘルペスチミジ
ンキナーゼ。（Ｂ）は、片側だけに相同配列を有する相
同的組換え用ベクターを示すものである。
【図３】図３は、ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αお
よびｐＡＲＮＴ（ｐＨＩＦ−１β）でトランスフェクト
されたＨｅＬａＳ３細胞のＣＭＶプロモーター／ＨＩＦ
−制御エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を示すものであ
り、そのＥＰＯ発現は、トランスフェクションの３、４
および５日後に細胞上清において測定されたものである
（エリスロポエチン濃度をμg/mlで示す）。ｐＨＹＧ：
制御ベクター、ｐＨＩＦ−１α：ＳＲαプロモーターの
制御下にあるＨＩＦ−１αｃＤＮＡ、ｐＡＲＮＴ：ＣＭ
Ｖプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−βｃＤＮＡ。
よびｐＡＲＮＴ（ｐＨＩＦ−１β）でトランスフェクト
されたＨｅＬａＳ３細胞のＣＭＶプロモーター／ＨＩＦ
−制御エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を示すものであ
り、そのＥＰＯ発現は、トランスフェクションの３、４
および５日後に細胞上清において測定されたものである
（エリスロポエチン濃度をμg/mlで示す）。ｐＨＹＧ：
制御ベクター、ｐＨＩＦ−１α：ＳＲαプロモーターの
制御下にあるＨＩＦ−１αｃＤＮＡ、ｐＡＲＮＴ：ＣＭ
Ｖプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−βｃＤＮＡ。
【図４】図４は、それぞれ、ＣＭＶプロモーター（Ｃ）
およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）を
含み、これらの配列の間には、異なる長さの標的遺伝子
（Ｓ）の非コード核酸断片が挿入されている、４種の異
なるベクターを示すものである。非コード核酸断片の長
さは、ベクターＡ３−１７８では０kbであり、ベクター
Ａ３−１７７では2.5kbであり、ベクターＡ３−１７５
では3.7kbであり、ベクターＡ３−１８１では5.7kbであ
る。制御ベクターｐＮＡＳＳβは、レポーター遺伝子β
−ガラクトシダーゼを含むが、ＣＭＶプロモーターを含
まない。
およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）を
含み、これらの配列の間には、異なる長さの標的遺伝子
（Ｓ）の非コード核酸断片が挿入されている、４種の異
なるベクターを示すものである。非コード核酸断片の長
さは、ベクターＡ３−１７８では０kbであり、ベクター
Ａ３−１７７では2.5kbであり、ベクターＡ３−１７５
では3.7kbであり、ベクターＡ３−１８１では5.7kbであ
る。制御ベクターｐＮＡＳＳβは、レポーター遺伝子β
−ガラクトシダーゼを含むが、ＣＭＶプロモーターを含
まない。
【図５】図５は、一連の希釈（１：２〜１：１２８）に
おける、ＨｅＬａＳ３細胞を図４のベクターでトランス
フェクトした後のレポーター遺伝子β−ガラクトシダー
ゼの発現の測定を示すものである。
おける、ＨｅＬａＳ３細胞を図４のベクターでトランス
フェクトした後のレポーター遺伝子β−ガラクトシダー
ゼの発現の測定を示すものである。
【図６】（Ａ）は、ＤＨＦＲ遺伝子座における相同的組
換え用のベクターｐＮＤＩを示すものである。正の選択
マーカー遺伝子（Ｎｅｏ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟
まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨ
ＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘ
Ｐ配列の3'側に位置している。（Ｂ）は、ＤＨＦＲ遺伝
子座における相同的組換え用のベクターｐＨＤＩを示す
ものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｈｙｇ）には２
個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相
同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列
の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
換え用のベクターｐＮＤＩを示すものである。正の選択
マーカー遺伝子（Ｎｅｏ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟
まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨ
ＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘ
Ｐ配列の3'側に位置している。（Ｂ）は、ＤＨＦＲ遺伝
子座における相同的組換え用のベクターｐＨＤＩを示す
ものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｈｙｇ）には２
個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相
同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列
の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
【図７】（Ａ）は、エキソン１、エキソン２およびエキ
ソン３ならびにそれらの間に位置するイントロンを有す
るＤＨＦＲ遺伝子のゲノム構築物を示すものである。
（Ｂ）は、図６のベクターに対応する標的構築物の概略
を示すものである。（Ｃ）は、ＤＨＦＲ遺伝子における
相同的組換え用のベクターの相同的組換えが完了した後
のゲノム構成を示すものである。ベクターｐＮＤＩを使
用した場合、EcoRI切断部位間の距離は2.9kbであり、ベ
クターｐＨＤＩを使用した場合3.7kbである。Ｎｅｏ：
ネオマイシン、Ｈｙｇ：ハイグロマイシン、kb：キロベ
ース。
ソン３ならびにそれらの間に位置するイントロンを有す
るＤＨＦＲ遺伝子のゲノム構築物を示すものである。
（Ｂ）は、図６のベクターに対応する標的構築物の概略
を示すものである。（Ｃ）は、ＤＨＦＲ遺伝子における
相同的組換え用のベクターの相同的組換えが完了した後
のゲノム構成を示すものである。ベクターｐＮＤＩを使
用した場合、EcoRI切断部位間の距離は2.9kbであり、ベ
クターｐＨＤＩを使用した場合3.7kbである。Ｎｅｏ：
ネオマイシン、Ｈｙｇ：ハイグロマイシン、kb：キロベ
ース。
【図８】図８は、それぞれ調節配列を含み、２個のｌｏ
ｘＰ配列に挟まれているタンパク質Ｘをコードする核酸
配列およびＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列を
含むベクターを示すものである。このベクターは、Ｃｒ
ｅリコンビナーゼが触媒するｌｏｘＰ配列におけるゲノ
ムへの組込みに使用することができる。
ｘＰ配列に挟まれているタンパク質Ｘをコードする核酸
配列およびＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列を
含むベクターを示すものである。このベクターは、Ｃｒ
ｅリコンビナーゼが触媒するｌｏｘＰ配列におけるゲノ
ムへの組込みに使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アン スターン ドイツ連邦共和国 ディー−82377ペンツ バーグ，カルヴェンデルシュトラーセ 10
Claims (19)
- 【請求項１】 真核細胞中に内在する核酸配列の発現を
変化させる方法であって、（ａ）細胞を、 （ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子
から選択される、少なくとも１つの配列、 （ii）正の選択マーカー遺伝子、 （iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異
的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、 （iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、か
つ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の
核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、を含む第１のベクタ
ーでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクトした
細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培
養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単
離する、ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項２】 リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ
配列を使用する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ベクターが、請求項１（ａ）（iv）
に記載の相同配列の外側に配置される負の選択マーカー
遺伝子をさらに含有する、請求項１または２に記載の方
法。 - 【請求項４】 リコンビナーゼ標的配列間に位置する核
酸配列を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナ
ーゼの一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出
す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 相同的組換えのためのベクターであっ
て、（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択され
る、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺
伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部
位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内
の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および
（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および（ｖ）場合によ
り、負の選択マーカー遺伝子、を含むことを特徴とする
上記ベクター。 - 【請求項６】（ｉ）異種発現制御配列および増幅遺伝子
から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）正の選
択マーカー遺伝子、（iii）配列（ｉ）および（ii）に
隣接する、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、
（iv）場合により、負の選択マーカー遺伝子、を含むこ
とを特徴とするベクター。 - 【請求項７】（ａ）真核細胞中に内在する核酸配列と機
能的に結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝
子から選択される、少なくとも１つの染色体位置が定め
られた配列を含有し、そして （ｂ）この配列がリコンビナーゼ標的配列により挟まれ
ている、真核細胞、好ましくはヒト細胞。 - 【請求項８】 真核細胞中に内在する核酸配列の発現を
変化させる方法であって、（ａ）細胞を、 （ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少なくと
も１つの核酸配列、 （ii）正の選択マーカー遺伝子、 （iii）相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノ
ム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）
に隣接するＤＮＡ配列、を含むベクターでトランスフェ
クトし、（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクター
の相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして（ｃ）
工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、ことを特徴
とする上記方法。 - 【請求項９】 少なくとも１つの低酸素誘導因子（ＨＩ
Ｆ）結合性核酸配列を使用する、請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】 相同的組換えのためのベクターであっ
て、（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少な
くとも１つの核酸配列、（ii）正の選択マーカー遺伝
子、（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲ
ノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（i
i）に隣接するＤＮＡ配列、を含むことを特徴とする上
記ベクター。 - 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれか１項に記載
の方法により得られる、真核細胞、好ましくはヒト細
胞。 - 【請求項１２】 真核細胞中に内在する遺伝子と機能的
に結合している、アクチベータータンパク質／アクチベ
ータータンパク質複合体と結合する、少なくとも１つの
異種の染色体位置が定められた核酸断片を含有する、真
核細胞、好ましくはヒト細胞。 - 【請求項１３】 真核細胞中に内在する標的遺伝子の領
域からの非コード核酸配列の、その標的遺伝子発現に及
ぼす影響を試験する方法であって、（ａ）細胞を、 （ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞
内で活性であるか、または活性化することができる異種
発現制御配列、および （ii）標的遺伝子の領域からの５’側および／または
３’側の非コード核酸断片、を含むベクターでトランス
フェクトし、（ｂ）該細胞を、発現制御配列が活性であ
る条件下で培養し、そして（ｃ）レポーター遺伝子の発
現を測定する、ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項１４】 ＤＨＦＲ陰性真核細胞を作製する方法
であって、（ａ）細胞を、 （ｉ）部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標
的配列、 （ii）相同的組換えが可能であるように細胞中に内在す
るＤＨＦＲ核酸配列に相同である、配列（ｉ）に隣接す
るＤＮＡ配列、および （iii）場合により、正の選択マーカー遺伝子、および
場合により、負の選択マーカー遺伝子、を含む第１のベ
クターでトランスフェクトし、（ｂ）トランスフェクト
した細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で
培養し、そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を
単離する、ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項１５】 異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞中に導
入する方法であって、（ａ）請求項１４に記載の方法に
より得られた細胞を、 （ｉ）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺
伝子と異なる、場合により、正の選択マーカー遺伝子、 （ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、 （iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）からの核
酸配列のそれぞれが、少なくとも１つのリコンビナーゼ
標的配列に５’側および３’側で隣接する、発現可能な
形態でタンパク質をコードする増幅すべき核酸配列、を
含む第３のベクターでトランスフェクトし、（ｂ）トラ
ンスフェクトした細胞を、リコンビナーゼ標的配列に隣
接する核酸配列が、該細胞のゲノムに既に存在するリコ
ンビナーゼ標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、
そして（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離す
る、ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項１６】（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺
伝子、（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、および
（iii）目的タンパク質をコードする、発現可能な形態
の核酸配列、を含み、ここで、部分配列（ｉ）、（ii）
および（iii）からの各核酸配列は、少なくとも１つの
リコンビナーゼ標的配列に５’側および３’側で隣接す
る、ことを特徴とするベクター。 - 【請求項１７】 相同的組換えのためのベクターであっ
て、（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、（i
i）それぞれの場合に配列（ｉ）に隣接する、少なくと
も１つのリコンビナーゼ標的配列、（iii）相同的組換
えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配
列に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤ
ＮＡ配列、および（iv）相同配列（iii）の外側の、場
合により、負の選択マーカー遺伝子、を含むことを特徴
とする上記ベクター。 - 【請求項１８】（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも
１つの内在性核酸配列が不活化されており、そして （ｂ）ＤＨＦＲをコードするこの核酸配列の領域のゲノ
ム中に、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が組
み込まれている、真核細胞、好ましくはヒト細胞。 - 【請求項１９】（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（ii）目的タンパク質をコードする核酸配列、および
（iii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列、を
含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域内の異種核酸配列
を特徴とする、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121075 | 1997-12-01 | ||
| DE97121075:2 | 1997-12-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11225785A true JPH11225785A (ja) | 1999-08-24 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34223498A Expired - Fee Related JP4629813B2 (ja) | 1997-12-01 | 1998-12-01 | 内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化 |
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|---|---|
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| EP (3) | EP1464705B1 (ja) |
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| TR (1) | TR199802503A2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005500841A (ja) * | 2001-07-27 | 2005-01-13 | アメリカ合衆国 | オリゴヌクレオチドを用いるインビボ部位指定変異誘発のためのシステム |
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