KR100571105B1 - 상동 재조합에 의해 포유동물 세포의 특정 부위에 유전자를 삽입시키는 방법 및 이를 달성하기 위한 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상동 재조합에 의해 포유동물 세포내의 표적 부위에 목적하는 DNA를 부위 특이적으로 삽입하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 목적하는 DNA가 마커 플라스미드로 미리 마킹된 소정의 전사적으로 활성적인 부위에 삽입된 세포주의 재현가능한 선택법을 제공한다. 본 방법은 고수준의 포유동물 단백질, 특히 면역글로불린을 분비하는 포유동물 세포주를 제조하는데 특히 적합하다. 본 클로닝 방법에 사용되는 벡터 및 벡터 결합물이 제공된다.

Description

상동 재조합에 의해 포유동물 세포의 특정 부위에 유전자를 삽입시키는 방법 및 이를 달성하기 위한 벡터 {METHOD FOR INTEGRATING GENES AT SPECIFIC SITES IN MAMMALIAN CELLS VIA HOMOLOGOUS RECOMBINATION AND VECTORS FOR ACCOMPLISHING THE SAME}
본 발명은 포유동물 세포의 게놈내의 특정 위치에 목적하는 외인성 DNA를 삽입함을 목적으로 하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 포유동물 게놈에서 전사적으로 활성인 표적 부위("핫 스팟(hot spot)")을 확인하고, 상동 재조합에 의해 이 부위에 목적하는 DNA를 삽입하는 신규한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 선택적으로 외인성 DNA와 함께 증폭가능한 선별 마커, 예를 들어, DHFR을 공동삽입시켜 이 위치에서 목적하는 DNA를 유전자 증폭시킬 수 있는 능력을 제공한다. 추가로 본 발명은 상기 사항을 달성하기에 적합한 신규 벡터의 구조물을 제공하며, 상기 방법으로 제조되는, 표적 핫 스팟에 삽입된 목적하는 외인성 DNA를 함유하는 포유동물 세포주를 제공한다.
원핵 생물 및 진핵 생물 둘 모두에서 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 확립되어 있다. 단백질 제조에 있어서 포유동물 세포는 박테리아 또는 효모보다 현저한 이점을 제공하며, 이는 포유동물 세포가 재조합적으로 발현된 단백질을 정확히 어셈블링하고, 글리코실화하며, 번역후 수식할 수 있기 때문이다. 숙주 세포로 트랜스펙션된 후, 재조합 발현 구조물은 염색체외 엘리먼트로서 유지되거나 숙주 세포 게놈에 삽입될 수 있다. 안정적으로 트랜스펙션된 포유동물 세포주의 제조는 일반적으로 후자에 관련된 것이다; 약물 내성 유전자(우세한 선별 마커)와 함께 관심있는 유전자를 코드화하는 DNA 구조물을 숙주 세포로 도입시킨 후, 약물의 존재하에 성장시켜 외인성 DNA가 성공적으로 삽입된 세포를 선택할 수 있다. 많은 경우에, 관심있는 유전자는, 후에 유전자 증폭 처리될 수 있는 약물 내성 선별 마커에 결합된다. 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코드화하는 유전자가 이러한 목적에 가장 일반적으로 사용된다. 메토트렉세이트, 즉 DHFR의 경쟁적 억제제의 존재하의 세포 성장은 DHFR 유전자의 증폭에 의해 DHFR 생성을 증가시킨다. DNA의 플랭킹 영역이 또한 증폭되기 때문에, 트랜스펙션된 세포주에서 DHFR 결합된 유전자의 결과적인 공동증폭은 단백질 생성을 증가시켜, 관심있는 유전자의 고수준 발현을 유도한다.
이러한 방법이 성공적인 것으로 입증되었지만, 삽입 사건의 무작위성으로 인해 상기 시스템에는 많은 문제가 여전히 존재한다. 발현 수준이 유전자좌에서 국소적인 유전적 환경(이러한 현상은 하기 문헌에 잘 설명되어 있으며, 일반적으로 "위치 효과"로 불림)에 의해 크게 영향을 받기 때문에, 이러한 문제들이 발생한다[참고 문헌: Al-Shawi et al, Mol. Cell. Biol., 10:1192-1198(1990); Yoshimura et al, Mol. Cell. Biol., 7:1296-1299(1987)]. 포유동물 DNA의 대다수가 전사적으로 불활성인 상태에 있기 때문에, 무작위 삽입 방법은 삽입된 DNA의 전사적 운명에 대한 조절을 제공하지 못한다. 결과적으로, 삽입된 유전자의 발현 수준에서의 광범한 변화가 삽입 부위에 따라 발생할 수 있다. 예를 들어, 게놈의 불활성 또는 전사적으로 "휴지(silent)"인 영역으로 외인성 DNA가 삽입되면 발현을 거의 또는 전혀 유도하지 못한다. 반대로, 전사적으로 활성인 부위로 삽입되면 높은 발현을 유도할 수 있다.
따라서, 연구 목적이 유전공학에서 전형적으로 목적하는 결과인 고수준의 유전자 발현을 획득하는데 있다면, 이러한 고수준 생산 클론을 발견하기 위해서는 일반적으로 많은 트랜스펙턴트(transfectant)를 스크리닝하는 것이 요구된다. 또한, 게놈으로 외인성 DNA가 무작위로 삽입되면 일부 경우에, 중요한 세포 유전자를 붕괴시켜, 변형된 표현형을 유도할 수 있다. 이러한 인자는 고수준 발현을 하며 안정적인 포유동물 세포주의 제조를 복잡하고 어렵게 만든다.
최근에, 본 발명자들의 연구소에서는 포유동물 유전자 발현에서 번역적으로 손상된 우세한 선별 마커를 함유하는 DNA 벡터의 사용 방법을 설명하였다(이는 1993년 11월 3일에 U.S. 일련 번호 제 08/147,696호로 출원되어 특허된 미국 특허 제 5,648,267호에 기재되어 있다).
이러한 벡터는 우세한 선별 마커로서 번역적으로 손상된 네오마이신 인산전이효소(neo) 유전자를 함유하며, 관심있는 유전자(들)와 함께 DHFR 유전자가 삽입된 인트론을 함유하도록 인공적으로 처리되었다. 발현 구조물로서의 이러한 벡터의 사용은 생성된 약물 내성 콜로니의 총 수를 현저하게 감소시켜, 통상적인 포유동물 발현 벡터에 대한 스크리닝 절차를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 이러한 시스템을 이용하여 수득된 클론의 상당 비율이 고수준 발현 클론이다. 이러한 결과는 명백히 neo 선별 마커에 대해 이루어진 변형에 기인된 것이다. neo 유전자의 번역 손상으로 인해서, 트랜스펙션 세포는 약물 선택에 대해 생존할 정도로 충분히 neo 단백질을 생성하지 못하여, 전반적인 약물 내성 콜로니의 수가 감소된다. 추가적으로, 높은 비율의 살아남은 클론은, 기저 전사 수준이 높은 게놈에서 부위로 삽입된 발현 벡터를 함유할 것이며, 이는 neo의 과다생산을 초래하여 세포가 neo 유전자의 손상을 극복할 수 있게 한다. 동시에, neo에 결합된 관심있는 유전자는 유사하게 증가된 수준으로 전사될 것이다. 이러한 동일한 이점은 neo내에 생성된 인공적인 인트론으로 인한 결과라는 것 또한 사실이며, 생존은 기능적 neo 유전자의 합성에 의존적이며, 이는 neo 인트론의 정확하고 효과적인 스플라이싱에 의존한다. 게다가, 이러한 기준은 벡터 DNA가 이미 전사적으로 매우 활성인 영역으로 삽입된다면, 더욱 충족될 것이다.
전사적으로 활성인 영역으로 벡터를 삽입한 후, 유전자 증폭은 DHFR 유전자에 대한 선택에 의해 수행된다. 이러한 시스템을 이용하므로써, 고수준의 단백질(>55pg/c/d)을 분비하는 수개(<10) 복사체의 벡터를 함유하며, 저수준의 메토트렉세이트(50nM)를 사용하여 선택된 클론을 수득하는 것이 가능하다. 게다가, 이는 비교적 단시간내에 달성될 수 있다. 그러나, 증폭에서의 성공은 변수가 많다. 일부 전사적으로 활성인 부위는 증폭될 수 없어서, 특정 부위로부터의 빈도 및 범위는 예측할 수 없다.
종합적으로, 이러한 번역적으로 손상된 벡터를 사용하면 무작위 삽입의 방법보다는 현저한 개선을 나타낸다. 그러나, 언급된 바와 같이, 삽입 부위에 대한 조절 결여로 인한 문제점이 중요한 관심거리로 남아있다.
무작위 삽입의 문제점을 극복하기 위한 한 방법은 유전자 표적화(targeting)에 의한 것이며, 이것에 의해 외인성 DNA는 숙주 게놈내의 특이적 유전자좌로 유도된다. 외인성 DNA는 발현 벡터내의 DNA 서열과 게놈내의 상응하는 상동 서열 사이에서 발생하는 상동 재조합에 의해 삽입된다. 그러나, 이러한 유형의 재조합은 효모 및 다른 진균류에서 자연적으로 높은 빈도로 발생하는 반면, 이보다 고등인 진핵 생물에서는 매우 드물게 발생한다. 포유동물 세포에서, 상동 재조합 빈도 대 비상동(무작위 삽입) 재조합의 빈도는 1/100 내지 1/5000으로 보고되어 있다[참조: Capecchi, Science, 244:1288-1292(1989); Morrow and Kucherlapati, Curr. Op. Biotech., 4:577-582(1993)].
포유동물 세포에서 상동 재조합을 설명하는 초기 보고중 하나는 마우스 섬유아세포에서 유도된 인공 시스템을 포함하였다[참조: Thomas et al, Cell, 44:419-428 (1986)]. 숙주 게놈으로 삽입된 neo 유전자의 비기능성 변이체를 함유하는 세포주를 생성시킨 후, 상이한 변이를 함유하는 neo의 제 2 비기능적 복사체로 표적화하였다. 기능적 neo 유전자의 재구성은 단지 유전자 표적화에 의해서만 발생할 수 있었다. 상동 재조합체를, G418 내성 세포를 선택하여 동정하고, 내성 클론으로부터 분리된 게놈성 DNA를 분석하여 확인하였다.
최근에, 항체 분비 세포의 내인성 유전자좌에서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 대체하기 위해 상동 재조합을 이용하는 방법이 보고되었다[참조: 펠(Fell) 등의 U.S. 특허 제 5,202,238호(1993)]. 그러나, 이러한 특정 방법은 광범위하게 적용될 수 없는데, 그 이유는 이것이 면역글로불린을 내인적으로 발현하는 세포, 예를 들어 B 세포 및 골수종 세포에서의 면역글로불린의 생성에 제한되기 때문이다. 또한, 발현이 하나의 복사체 유전자 수준으로 제한되는데, 그 이유는 상동 재조합 후 공동증폭이 포함되지 않기 때문이다. 이러한 방법은 기능적인 면역글로불린을 제조하는 데 두개의 별도의 삽입 사건, 즉 경쇄 유전자 삽입 후, 중쇄 유전자 삽입이 필요하다는 사실에 의해 추가로 복잡해진다.
이러한 유형의 시스템의 추가적인 예는 NS/0 세포에 보고되어 있으며, 여기서는 재조합 면역글로불린은 면역글로불린 감마 2A 유전자좌로의 상동 재조합에 의해 발현된다[참조: Hollis et al, 국제 특허 출원 PCT/IB95 (00014)]. 이러한 부위에서 획득된 발현 수준은 하나의 복사체 삽입물로부터 약 20pg/cell/day로 아주 높다. 그러나, 상기 예에서와 같이, 발현은 증폭가능 유전자가 이 시스템에서 공동삽입되지 않기 때문에 이 수준으로 제한된다. 또한, 다른 연구자들이 NS/O 세포에서 발현된 재조합 단백질의 비정상적인 글리코실화에 대해 보고하였으며[참조: Flesher et al, Biotech. and Bioeng., 48:399-407 (1995)], 따라서 이러한 방법의 적용이 제한된다.
박테리오파지 P1으로부터의 cre-loxP 재조합 시스템은 진핵세포에서 유전자 표적화의 수단으로서 적합되어 사용되었다. 특히, cre 재조합효소 및 일련의 lox 함유 벡터를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 게놈으로 외인성 DNA를 부위 특이적으로 삽입하는 방법이 설명되어 있다[참조: Fukushige and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7905-7909(1992)]. 이러한 시스템은 동일한 염색체 위치에서 재현가능한 발현을 제공한다는 점에서 흥미를 끈다. 그러나, 유전자 발현이 최적인 염색체 부위를 확인하기 위한 노력이 기울여지지 않았으며, 상기 예에서와 같이, 발현은 이 시스템에서의 하나의 복사체 수준으로 제한되어 있다. 또한, 이 시스템은, 포유동물 세포에서 기능적인 재조합효소의 발현이 요구된다는 사실에 의해 복잡해진다.
효모 세포 뿐만 아니라 포유동물 세포에서 유전적 조작의 유용한 수단을 제공하기 위해, 도입된 DNA 서열과 이것의 내인성 염색체 유전자좌 사이의 상동 재조합을 이용하는 방법이 또한 보고되어 있다[참조: Bradley et al, Meth. Enzymol., 223:855-879(1993); Capecchi, Science, 244:1288-1292(1989); Rothstein et al, Meth. Enzymol., 194:281-301(1991)]. 현재까지, 대부분의 포유동물 유전자 표적화 연구는 마우스 배아 간 (ES) 세포에서 선택된 표적 유전자좌의 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 유전자 붕괴("넉아웃(knockout)")에 관한 것이었다. 이러한 "넉아웃" 마우스 모델의 출현은 과학자가 특이적 구조-기능 문제를 조사하고, 무수한 마우스 유전자의 생물학적 중요성을 조사할 수 있게 해주었다. 이러한 연구 분야는 또한, 잠재적 유전자 치료 적용에서 중요한 의미를 갖는다.
또한, 유전자 증폭이 요구되지 않는 NSO 세포에서 전사적으로 활성인 부위로 의도적으로 표적화된 벡터가 셀-테크(Cell-tech)(Kent, U.K.)에 의해 최근 보고되었다[참조: Peakman et al, Hum. Antibod. Hybridomas, 5:65-74(1994)]. 그러나, 이러한 증폭되지 않은 세포에서 면역글로불린 분비 수준은 20pg/c/d을 초과하지 않는 반면, 증폭된 CHO 세포에서는, 100pg/c/d의 분비 수준이 달성된 것으로 보고되었다(Id.).
전사적으로 활성인 것으로 공지된 게놈에서 소정 부위로 외인성 DNA의 삽입을 재현가능하게 제공하는 유전자 표적화 시스템을 개발하는 것이 매우 바람직하다. 또한, 이러한 유전자 표적화 시스템이 삽입후 삽입된 DNA의 공동증폭을 추가로 촉진할 경우 바람직하다. 이러한 시스템의 설계는 포유동물 세포에서 관심있는 임의의 클로닝된 유전자의 높은 수준의 재현가능한 발현을 가능하게하며, 많은 연구자에게 상당한 관심을 불러일으킬 것이 분명하다.
본 출원에서, 본 발명자들은 두개의 상이한 벡터내에 함유된 두개의 인공 기질 사이에 발생하는 상동 재조합을 기초로 하는 신규한 포유동물 발현 시스템을 제공한다. 특히, 이 시스템은 "마킹(marking)" 벡터 및 "표적화(targeting)" 벡터로서 언급된 두개의 신규한 포유동물 발현 벡터의 조합을 이용한다.
본질적으로, 마킹 벡터는 전사적으로 활성인 포유동물 게놈의 부위 즉, 유전자 발현 수준이 높은 부위를 확인하고 마킹할 수 있다. 이 부위는 게놈에서 "핫 스팟"으로 간주될 수 있다. 마킹 벡터의 삽입 후, 본 발현 시스템은 또 다른 DNA 즉, 표적화 벡터를 두 벡터에 공통적인 DNA 서열 사이에 발생하는 상동 재조합에 의해 이 부위에 삽입시킬 수 있다. 이 시스템은 다른 상동 재조합 시스템보다 현저한 이점을 제공한다.
포유동물 세포에 사용된 대부분의 다른 상동 시스템과는 달리, 본 시스템은 배경(background)을 나타내지 않았다. 따라서, 단지 벡터가 무작위 삽입된 세포는 선택에서 생존하지 못한다. 따라서, 표적화 플라스미드로 클로닝된 관심있는 임의의 유전자는 마킹된 핫 스팟으로부터 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 본 유전자 발현 방법은 상기에 상세하게 설명된 무작위 삽입 시스템 고유의 문제점을 실질적으로 또는 완전히 해결하였다. 게다가, 이러한 시스템은 포유동물 게놈의 동일한 전사적으로 활성인 부위에서 임의의 재조합 단백질의 재현가능한 고수준 발현을 제공한다. 또한, 유전자 증폭은, 증폭가능하며 우세한 선별 마커(예를 들어, DHFR)를 마킹 벡터의 일부로서 포함하므로써 이러한 특정한 전사적으로 활성인 부위에서 수행될 수 있다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 포유동물 세포의 특이적 부위에 목적하는 DNA를 표적화하는 개선된 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 더욱 특이적 목적은 상동 재조합에 의해 포유동물 세포의 특이적 부위에 목적하는 DNA를 표적화하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 특이적 목적은 포유동물 세포에서 목적하는 DNA의 부위 특이적 삽입을 달성하기 위한 신규한 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고수준의 발현을 제공하는 소정의 부위에 삽입된 목적하는 DNA를 함유하는 신규한 포유동물 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 더욱 특이적 목적은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 목적하는 DNA의 부위 특이적 삽입을 달성하기 위한 신규한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 더욱 특이적인 또 다른 목적은 포유동물 세포내의 고수준의 발현을 제공하는 소정의 염색체 부위에 면역글로불린 유전자 또는 임의의 그밖의 유전자를 삽입하는 신규한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 특이적 목적은 포유동물 세포내의 고수준의 발현을 제공하는 소정의 부위에 면역글로불린 유전자를 삽입하기에 적합한 신규한 벡터 및 벡터 배합물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고수준의 발현을 제공하는 소정의 부위에 삽입된 면역글로불린 유전자를 함유하는 포유동물 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 더욱 특이적 목적은 고수준의 발현을 제공하는 CHO 세포로 면역글로불린을 삽입하는 신규한 방법 및 CHO 세포로 면역글로불린 유전자의 이러한 삽입을 제공하는 신규한 벡터 및 벡터 배합물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 특이적 목적은 고수준의 발현을 제공하는 소정의 위치에 삽입된 면역글로불린 유전자를 함유하고 더 많은 양의 기능적 면역글로불린을 분비하기 위해 메토트렉세이트 선택에 의해 증폭된 신규한 CHO 세포주를 제공하는데 있다.
도면의 간단한 설명
도 1에는 데스몬드(Desmond)로서 언급된 본 발명에 따른 마킹 플라스미드의 맵이 도시되어 있다. 플라스미드는 트랜스펙션에 이용된 선형 형태(1b) 및 원형 형태(1a)로 도시되어 있다.
도 2(a)에는 "몰리(Molly)"로 언급된 표적화 플라스미드의 맵이 도시되어 있다. 항-CD20 면역글로불린 유전자를 코드화하는 몰리가 도시되어 있으며, 이 유전자의 발현은 실시예 1에 설명되어 있다.
도 2(b)에는 제한효소 Kpn1 및 Pac1으로 분해시킨 후의 몰리의 선형화된 형태가 도시되어 있다. 이러한 선형화된 형태를 트랜스펙션에 사용하였다.
도 3은 CHO 게놈으로 삽입된 데스몬드 서열과 뒤를 잇는 표적화 몰리 서열 사이의 위치의 가능한 정렬을 나타낸 것이다. 상동 재조합 후 데스몬드로 삽입된 몰리의 한 가능한 위치 배열이 또한 표시되어 있다.
도 4는 하나의 복사체 데스몬드 클론의 서던 분석이 도시되어 있다. 샘플은 하기와 같다:
레인 1: λHindⅢ DNA 크기 마커
레인 2: 데스몬드 클론 10F3
레인 3: 데스몬드 클론 10C12
레인 4: 데스몬드 클론 15C9
레인 5: 데스몬드 클론 14B5
레인 6: 데스몬드 클론 9B2
도 5에는 하나의 복사체 데스몬드 클론의 노던 분석이 도시되어 있다. 샘플은 하기와 같다: 패널 A: 도면에 나타난 바와 같이, CAD 및 DHFR 프로브로 프로빙된 노던. 패널 B: 나타난 바와 같이 CAD 및 HisD 프로브로 프로빙된 듀플리케이트 노던. 패널 A 및 B에 로딩된 RNA 샘플은 하기와 같다: 레인 1: 클론 9B2, 레인 2: 클론 10C12, 레인 3: 클론 14B5, 레인 4: 클론 15C9, 레인 5: HisD 및 DHFR를 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션된 CHO로부터의 대조 RNA, 레인 6: 트렌스펙션되지 않은 CHO.
도 6에는 몰리가 데스몬드로 상동 삽입되어 생성된 클론의 서던 분석이 도시되어 있다. 샘플은 하기와 같다: 레인 1: λHindⅢ DNA 크기 마커, 레인 2: 20F4, 레인 3: 5F9, 레인 4: 21C7, 레인 5: 24G2, 레인 6: 25E1, 레인 7: 28C9, 레인 8: 29F9, 레인 9: 39G11, 레인 10: 42F9, 레인 11: 50G10, 레인 12: Bg1Ⅱ로 선형화되고(상부 밴드), Bg1Ⅱ 및 KpnⅠ으로 절단된(하부 밴드) 몰리 플라스미드 DNA, 레인 13: 트랜스펙션되지 않은 데스몬드.
도 7A 내지 7N 및 7P 내지 7X는 데스몬드에 대한 서열 목록을 함유한다.
도 8A 내지 8N 및 8P 내지 8X는 항-CD20을 함유하는 몰리에 대한 서열 목록을 함유한다.
도 9는 항-CD23 유전자를 코드화하는 것으로 도시된 표적화 플라스미드 즉, "만디(Mandy)"의 맵이 도시되어 있으며, 이것의 발현은 실시예 5에 설명되어 있다.
도 10A 내지 10N 및 10P 내지 10U는 실시예 5에 설명된 항-CD23 유전자를 함유하는 "만디"의 서열 목록을 함유한다.
본 발명은 상동 재조합에 의해 포유동물 세포의 게놈내의 표적 부위에 목적하는 외인성 DNA를 삽입하는 신규한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물 세포의 게놈의 표적 부위에서 DNA의 부위 특이적 삽입을 달성하기 위한 신규한 벡터를 제공한다.
더욱 상세하게는, 본 클로닝 방법은, 포유동물 세포 게놈에 이종적인 독특한 서열을 함유하며, 상동 재조합을 위한 기질을 제공하는 "마커 플라스미드"로 포유동물 세포를 트랜스펙션한 후, 마커 플라스미드에 함유된 독특한 서열과 상동 재조합을 제공하는 서열을 함유하며, 추가로 포유동물에 삽입될 목적하는 DNA를 포함하는 "표적 플라스미드"로 트랜스펙션시키므로써, 포유동물 세포로 목적하는 DNA의 부위 특이적 삽입을 제공한다. 전형적으로, 삽입된 DNA는 면역글로불린 또는 다른 분비되는 포유동물 당단백질과 같은 관심있는 단백질을 코드화한다.
예시된 상동 재조합 시스템은 우세한 선별 마커로서 네오마이신 인산전이효소를 사용한다. 이러한 특정 마커는 하기와 같은 이전에 발표된 보고를 토대로 하여 사용하였다;
(ⅰ) neo 유전자의 변이체(초기에 언급)에 대한 표적화 및 기능 복원에 대한 입증된 능력 및
(ⅱ) 본 발명자들의 번역적으로 손상된 발현 벡터의 개발. 이 벡터에서 neo 유전자는 개재 인트론에 삽입된 관심있는 유전자와 함께 두개 엑손으로서 인공적으로 제조되고; neo 엑손은 생체내에서 정확하게 스플라이싱되고 번역되어 기능적 단백질을 생성하여, 생성된 세포군에 G418 내성을 부여한다. 이 적용에서, neo 유전자는 3개 엑손으로 분절된다. neo의 세번째 엑손은 "마커" 플라스미드상에 존재하며, 포유동물 세포로 마커 플라스미드가 삽입될 때 숙주 세포 게놈으로 삽입된다. 엑손 1 및 엑손 2는 표적화 플라스미드상에 존재하며, 하나 이상의 관심있는 유전자가 클로닝된 개재 인트론에 의해 분리된다. 표적화 벡터와 삽입된 마킹 벡터와의 상동 재조합은 neo 유전자의 모든 세 엑손의 정확한 스플라이싱을 유도하여, 기능적인 neo 단백질(G418 내성 콜로니로 선택하여 측정)이 발현된다. 현재 발현 시스템을 고안하기 전에, 본 발명자들은 포유동물 세포에서 이러한 3중 스플라이싱된 neo 구조물의 기능성을 실험적으로 시험하였다. 이러한 대조 실험의 결과는 모든 3개의 neo 엑손이 적당하게 스플라이싱되었음을 보여주었고, 이로써 본 발명이 실행가능함이 시사되었다.
그러나, 본 발명이 neo 유전자, 더욱 상세하게는 3중 분절 neo 유전자를 이용하여 예시되지만, 다른 우세한 선별 마커를 사용하는 일반적인 방법이 효과적일 수 있다.
하기에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명은 무작위 삽입 및 유전자 표적화 방법을 포함한 통상적인 유전자 발현 방법에 대한 수많은 이점을 부여한다. 특히, 본 발명은 목적하는 DNA를 포유동물 세포의 전사적으로 활성인 도메인에 부위 특이적으로 재현가능하게 삽입하는 방법을 제공한다. 게다가, 본 방법은 상동 재조합을 위한 독특한 기질로서 작용하는 인공적인 "상동" 영역 및 목적하는 DNA의 삽입을 도입하기 때문에, 본 발명의 효능은 세포가 특이적 DNA를 내생적으로 함유하거나 발현할 필요가 없게 한다. 따라서, 본 방법은 일반적으로 모든 포유동물 세포에 적용가능하며, 모든 유형의 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다.
3중 스플라이싱된 선별 마커, 예를 들어, 예시된 3중 스플라이싱된 neo 구조물의 사용은 생성된 모든 G418 내성 콜로니가 상동 재조합 사건으로부터 발생할 것을 보장한다(무작위 삽입은 기능적인 neo 유전자를 생성하지 않으며, 결과적으로 G418 선택에 대해 생존하지 못한다). 따라서, 본 발명은 목적하는 상동 재조합 사건에 대한 스크리닝을 용이하게 한다. 게다가, 상동 재조합 처리된 세포에서 추가적인 무작위 삽입의 빈도는 낮은 것으로 나타난다.
상기를 토대로 하여, 본 발명의 현저한 이점은 상응하는 단백질을 높은 수준으로 분비하는 목적하는 DNA를 함유하는 고수준 생산 콜로니, 즉 세포주를 확인하기 위해 스크리닝되어야 하는 콜로니의 수를 사실상 감소시킨다는 점이라는 것이 명백하다. 평균적으로, 삽입된 목적하는 DNA를 함유하는 클론은 약 5 내지 20개의 콜로니를 스크리닝하여 확인될 수 있다(표준의 무작위 삽입을 이용할 경우 스크리닝 해야 하는 몇 천개의 콜로니, 또는 이전에 설명된 인트론성 삽입 벡터를 이용할 경우 스크리닝 해야 하는 수 백개의 콜로니와 비교). 또한, 삽입 부위가 미리 선택되며, 전사적으로 활성인 도메인을 함유하기 때문에, 이러한 부위에서 발현되는 모든 외인성 DNA가 이와 유사하게 즉, 고수준으로 관심있는 단백질을 생성한다.
게다가, 본 발명은 증폭가능한 유전자가 마킹 벡터의 삽입시에 삽입될 수 있게 한다는 점에서 추가의 이점이 있다. 따라서, 목적하는 유전자가 상동 재조합에 의해 이 부위로 표적화된다면, 본 발명은 유전자의 발현이 유전자 증폭에 의해 추가로 증가될 수 있게 한다. 이점에 있어서, 상이한 게놈성 부위는 유전자 증폭에 대한 상이한 능력을 가진다는 것은 종래 문헌에 보고되어 있다[참조: Meinkoth et al, Mol. Cell Biol., 7:1415-1424 (1987)]. 따라서, 본 방법은 전사적으로 활성이고 용이하게 증폭될 수 있는 특이적 부위에 관심있는 목적하는 유전자를 위치시킬 수 있다는 추가의 이점이 있다. 따라서, 이러한 고수준 생산체를 분리하는데 요구되는 시간을 현저하게 줄일 수 있다.
특히, 고수준의 발현 포유동물 세포주를 작제하기 위한 통상적인 방법은 6 내지 9개월이 소모되지만, 본 발명은 이러한 클론을 평균적으로 단지 약 3 내지 6개월 후에 분리시킬 수 있다. 이는 통상적으로 분리된 클론이 만족할 만한 수준의 유전자 발현에 도달하기 위해서는 일반적으로 약물 내성 유전자 증폭이 3 라운드 이상 수행되어야 한다는 사실에 기인한다. 상동적으로 생성된 클론이 고수준 발현 부위인 소정의 부위로부터 생성되기 때문에, 만족할만한 수준의 생성에 도달하는 데 필요한 증폭 라운드 횟수가 줄어든다.
추가로, 본 발명은 고수준 생산체 클론을 재현가능하게 선택할 수 있으며, 이 벡터는 낮은 복사체 수, 전형적으로는 하나의 복사체로 삽입된다. 이는 클론의 안정성을 증진시키고, 높은 복사체 수와 관련된 다른 잠재적인 불리한 역효과를 피할 수 있다는 이점을 갖는다. 상기에 언급된 바와 같이, 본 상동 재조합 시스템은 하기에서 더욱 상세히 설명될 "마커 플라스미드" 및 "표적화 플라스미드"의 배합물을 사용한다.
전사적으로 핫 스팟을 확인하고 마킹하는데 사용되는 "마커 플라스미드"는 하나 이상의 하기 서열을 포함한다:
(ⅰ) 상동원으로서 작용하고 (제 2 표적 플라스미드에 함유된 DNA와 함께) 상동 재조합을 가능하게 하는, 포유동물 세포의 게놈에 대해 이종성이거나 독특한 DNA의 영역. 더욱 상세하게는, 상기 DNA의 독특한 영역 (ⅰ)은 일반적으로 포유동물 세포 게놈에 일반적으로 존재하지 않으며, 또한 포유동물 세포의 게놈에 함유된 DNA와 현저한 상동성 또는 서열 동일성을 갖지 않은 박테리아 DNA, 바이러스 DNA, 효모 합성 DNA, 또는 그밖의 DNA를 포함한다. 본질적으로 이 서열은 상동 재조합에 의해 숙주 세포 게놈과 현저히 재조합되지 않는 포유동물 DNA에 대해 충분히 상이해야만 한다. 이러한 독특한 DNA의 크기는 일반적으로 약 2 내지 10 kb이거나, 이보다 높으며, 몇명 다른 연구자는 상동 영역의 크기가 증가함에 따라 표적화된 재조합의 빈도가 증가된다는 것을 확인하였기 때문에 더욱 바람직하게는 약 10kb 이상이다[참조: Capecchi, Science, 244:1288-1292(1989)].
제 2 표적 벡터의 서열과의 상동 재조합을 위한 부위로서 작용하는 독특한 DNA 크기의 상한은 주로 잠재적인 안정성 제약에 의해 규정된다(DNA가 너무 크다면, 염색체로 용이하게 삽입되지 않으며, 매우 큰 DNA로 작업하는 것은 어렵다).
(ⅱ) 선별 마커 DNA의 단편, 전형적으로 우세한 선별 마커 유전자의 엑손을 포함하는 DNA. 이 DNA의 유일한 본질적인 특징은 표적 플라스미드에 함유된 서열과 함께 발현되지 않는다면 기능적인 선별 마커 단백질을 코드화하지 않는다는 점이다. 전형적으로, 표적 플라스미드는 우세한 선별 마커 유전자의 나머지 엑손을 포함할 것이다(이들은 "표적화" 플라스미드에 포함되지 않음). 본질적으로, 기능적인 선별 마커는 상동 재조합이 발생할 경우에만 생성되어야 한다(표적 플라스미드에 함유된 선별 마커 DNA 단편의 일부(들)와 함께 이러한 마커 DNA (ⅰ) 서열의 결합 및 발현을 유도).
상기한 바와 같이, 본 발명은 두 벡터에서 "분절"되어 있는 우세한 선별 마커로서 네오마이신 인산전이효소 유전자의 사용을 예시한다. 그러나, 다른 선별 마커, 예를 들어, 살모넬라 히스티디놀 탈수소효소 유전자, 히그로마이신 인산전이효소 유전자, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자, 아데노신 탈아미노효소 유전자, 글루타민 합성효소 유전자 및 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소 유전자 또한 적합할 수 있다.
(ⅲ) 선별 마커가 선별 마커 DNA (ⅱ)와 상이한, 기능적인 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA. 이 선별 마커는 마커 플라스미드가 세포 DNA로 성공적으로 삽입되는 포유동물 세포를 성공적으로 선택할 수 있게 한다. 더욱 바람직하게는, 마커 플라스미드가 벡터의 반대쪽 말단에 위치한 두개의 이러한 우세한 선별 마커 DNA를 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 각종 선별 약제를 이용하여 삽입물을 선택할 수 있고, 추가로 전체 벡터를 함유하는 세포를 선택할 수 있기 때문에 이점이 있다. 또한, 하나의 마커는 이미 언급된 바와 같이 유전자 증폭을 촉진시키기 위한 증폭가능한 마커일 수 있다. 다른 일반적으로 공지된 선별 마커 뿐만 아니라, (ⅱ)에 기재된 우세한 선별 마커가 사용될 수 있다.
게다가, 마커 플라스미드는 선택적으로 희소(rare) 엔도누클레아제 제한 부위를 추가로 포함할 수 있다. 이는 이들이 절단을 촉진할 수 있기 때문에 잠재적으로 바람직하다. 만약 존재한다면, 이러한 희소 제한 부위는 상동 재조합을 위한 기질로서 작용하는 독특한 영역의 중간에 가깝게 위치해야 한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 약 12개 이상의 누클레오티드일 것이다. 유사한 방법에 의한 이중 가닥 파괴부의 도입이 상동 재조합의 빈도를 증진시키다는 것은 보고되어 있다[참조: Choulika et al, Mol. Cell. Biol., 15:1968-1973(1995)]. 그러나, 이러한 서열이 반드시 존재할 필요는 없다.
"표적화 플라스미드"는 적어도 하기 서열을 포함할 것이다:
(1) 마커 플라스미드에 함유된 DNA의 동일한 독특한 영역 또는 이것과 충분한 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 영역으로서, 상기 DNA는 마커 플라스미드내의 독특한 영역 (ⅰ)과 상동 재조합에 의해 결합될 수 있다. 마커 플라스미드내의 DNA의 독특한 영역 (1)의 설명에 있어서, 적합한 유형의 DNA는 상기에 설명되어 있다.
(2) 우세한 선별 마커의 나머지 엑손, 이중 한 엑손은 상기 마커 플라스미드내에 (ⅱ)로서 포함된다. 이러한 DNA 단편의 본질적인 특징은, 표적 플라스미드가 상동 재조합에 의해 삽입되는 경우에만(이러한 재조합은 상기 DNA와 마커 플라스미드내에 함유된 선별 마커 DNA의 다른 단편의 결합을 유도한다), 상기 DNA 단편은 기능적인(선별) 마커 단백질을 유도하며, 추가로, 목적하는 외인성 DNA를 삽입시킬 수 있다는 점이다. 전형적으로, 이러한 DNA는 인트론에 의해 분리된 선별 마커 DNA의 나머지 엑손을 포함할 것이다. 예를 들어, 이 DNA는 neo 유전자의 처음 두 엑손을 포함할 수 있으며, 마커 플라스미드는 세번째 엑손(neo의 후방 세번째)을 포함할 수 있다.
(3) 표적 플라스미드는 또한 목적하는 DNA, 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드를 코드화하는, 바람직하게는 플라스미드내에 함유된 선별 마커 DNA 단편내에 삽입된 DNA를 포함한다. 전형적으로, DNA는 선별 마커 DNA의 엑손 사이에 포함된 인트론내에 삽입될 것이다. 이는 표적 플라스미드 및 마커 플라스미드의 상동 재조합이 발생할 경우, 목적하는 DNA가 또한 삽입된다는 것을 확실히 해준다. 이러한 인트론은 자연적으로 발생하거나, 우세한 선별 마커 DNA 단편내로 공학처리될 수 있다.
이러한 DNA는 임의의 목적하는 단백질, 바람직하게는 약제학적 또는 다른 바람직한 특성을 갖는 단백질을 코드화할 것이다. 가장 전형적으로, DNA는 포유동물 단백질을 코드화할 것이며, 제공된 현재의 실시예에서는, 이는 면역글로불린 또는 면역부착소 (immunoadhesin)이다. 그러나 본 발명은 면역글로불린의 생성으로 제한되는 것은 아니다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 클로닝 방법은 그 효과를 위해 임의의 특이적 포유동물 서열(들)이 존재할 필요가 없기 때문에 어떤 포유동물 세포에도 적합하다. 일반적으로, 이러한 포유동물 세포는 단백질 발현에 전형적으로 사용되는 것들, 예를 들어, CHO 세포, 골수종 세포, COS 세포, BHK 세포, Sp2/0 세포, NIH 3T3 및 HeLa 세포를 포함할 것이다. 하기 실시예에서는 CHO 세포를 사용하였다. 이것의 이점은 적합한 성장 배지의 이용가능성, 배양시 고밀도의 성장 및 효과적인 성장 능력, 및 면역글로불린과 같은 포유동물 단백질을 생물학적 활성 형태로 발현하는 능력을 들 수 있다.
또한, CHO 세포는 면역글로불린의 발현을 위해 발명자들이 이러한 세포를 이전에 사용했기 때문에 주로 선택된다(번역적으로 손상된 우세한 선별 마커를 함유하는, 이전에 설명된 벡터를 이용). 따라서, 본 연구는 발현을 위한 이러한 세포를 이용하는데 있어서 상당한 경험을 갖추어져 있다. 그러나, 하기 실시예를 토대로 하여, 다른 포유동물 세포로 유사한 결과가 수득될 것임을 예상하는 것은 온당한 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 포유동물 세포의 형질전환 또는 트랜스펙션은 통상적인 방법에 따라 달성될 것이다. 전형적인 벡터의 작제 및 삽입물을 생성하는데 있어서의 이들의 용도가 하기 실시예에 설명되어, 본 발명이 더욱 잘 이해될 것이다.
실시예 1
마커 및 표적화 플라스미드 DNA 벡터의 설계 및 제조
"데스몬드"로서 기재된 본원의 마커 플라스미드를 하기 DNA 엘리먼트로부터 조립하였다:
(a) 뮤린 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR), 이는 전사 카세트에 혼입되어 있으며, DHFR 개시 부위의 5"에 마우스 베타 글로빈 프로모터 및 정지 코돈의 3"에 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. DHFR 전사 카세트를 TCAE6으로부터 분리하였으며, 발현 벡터는 이 연구소에서 이전에 제조되었다[참조: Newman et al, 1992, Bio-technology, 10:1455-1460].
(b) 대장균 β-갈락톡시다아제 유전자 - pSV-b-갈락토시다아제 조절 벡터로서 프로메가(Promega)로부터 카달로그 # E1081로서 구입가능.
(c) 바쿨로바이러스 DNA, pBAKPAK8로서 클론테크(Clontech)로부터 카달로그 # 6145-1로서 구입가능.
(d) 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 및 SV40 바이러스로부터의 프로모터 및 인핸서 엘리먼트를 포함하는 카세트. 본 카세트를 발현 벡터 TCAE8의 유도체를 사용하여 PCR로부터 제조하였다[참조: Reff et al, Blood, 83:435-445(1994)]. 인핸서 카세트를, 먼저 다중 클로닝 부위의 삽입으로 인해 개질시켜놓은 바쿨로바이러스 서열에 삽입하였다.
(e) 대장균 GUS(글루쿠로니다아제(glucuronidase) 유전자), pB101로서 클론테크로부터 구입가능(카달로그 # 6017-1).
(f) 개똥벌레 루시페라아제(luciferase) 유전자, pGEM-Luc로서 프로메가로부터 구입가능(카달로그 # E1541).
(g) 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 히스티디놀 탈수소효소 유전자(HisD). 이 유전자는 원래 [Donahue et al, Gene, 18:47-59(1982)]로부터 얻었고, 이를 후에 이 유전자의 5'에 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터를 포함하고 이 유전자의 3'에 SV40 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 전사 카세트로 혼입시켰다.
(a)-(g)에 설명된 DNA 엘리먼트를 pBR 유도된 플라스미드 주쇄에 결합시켜 "상동"으로서 첨부된 도면에 언급된 DNA의 7.7kb 연속 스트레치를 생성하였다. 여기에서 상동은 포유동물 게놈의 일부는 아니지만 동일한 상동 DNA서열을 공유하는 트랜스펙션된 플라스미드 사이의 상동 재조합을 촉진하는데 사용되는 DNA의 서열을 의미한다.
(h) TN5로부터의 네오마이신 인산전이효소 [Davis and Smith, Ann. Rev. Micro., 32:469-518 (1978)]. 완전한 neo 유전자를 pBluescript(등록상표) SK-(스트라타젠 카달로그 # 212205)로 서브클로닝하여 유전자 조작을 용이하게 하였다. 그 후, 합성 링커를 neo의 아미노산 51 및 52에 대한 코돈 맞은편에 존재하는 독특한 Pst1 부위로 삽입시켰다. 상기 링커는 neo 유전자내에서 인공적인 스플라이스 도너 부위, 개재 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위를 생성시켜, neo 엑손 1 및 2로서 언급되는 두개의 별도의 엑손을 생성시키는 데 필요한 DNA 엘리먼트를 코드화하였다. Neo 엑손 1은 neo의 처음 51개 아미노산을 코드화하는 반면, 엑손 2는 단백질의 나머지 203개 아미노산 및 정지 코돈을 코드화한다. 또한, Not1 클로닝 부위를 인트론내에 생성시켰다.
neo 엑손 2을 추가로 세분화하여 neo 엑손 2 및 3를 생성시켰다. 이는 하기에 의해 달성된다: PCR 프라이머의 세트를 neo 엑손 1, 인트론 및 엑손 2의 처음 111 2/3개 아미노산을 코드화하는 DNA 영역을 증폭시키기 위해 설계하였다. 3' 프라이머는 엑손 2의 아미노산 111을 위한 코돈의 두번째 누클레오티드 바로 뒤의 새로운 5' 스플라이스 부위의 도입을 유도하여, 새로운 더 작은 엑손 2을 생성시켰다. 원래의 엑손 1, 인트론 및 새로운 엑손 2를 코드화하는 DNA 단편을 서브클로닝하고, pBR 기재 벡터에서 증식시켰다. 원래의 엑손 2의 나머지는 PCR 증폭의 또 다른 라운드를 위한 주형으로서 사용하였으며, 이는 "엑손 3"를 생성시켰다. 증폭의 이러한 라운드를 위한 5' 프라이머는, 새롭게 생성된 엑손 3의 5'쪽, 즉 아미노산 111을 위한 코돈의 최종 누클레오티드 앞의 새로운 스플라이스 억셉터 부위를 도입시켰다. 생성된 neo의 세개의 엑손은 하기 정보를 코드화한다: 엑손 1 - neo의 처음 51개 아미노산, 엑손 2 - 이후의 111 2/3개 아미노산, 엑손 3 - 최종 91 1/3개 아미노산 및 neo 유전자의 번역 정지 코돈.
Neo 엑손 3을 상기 DNA 엘리먼트와 함께 마킹 플라스미드 "데스몬드"로 혼입시켰다. Neo 엑손 1 및 2를 표적화 플라스미드 "몰리"에 혼입시켰다. 엑손 1 및 2사이의 인트론내에 생성된 Not1 클로닝 부위를 후속 클로닝 단계에 사용하여, 표적화 플라스미드에 관심있는 유전자를 삽입하였다.
또한, 제 2 표적화 플라스미드 "만디"를 제조하였다. 이 플라스미드는 "몰리"에 함유된 원래의 HisD 및 DHFR 유전자가 불활성화된 것을 제외하고는 "몰리"와 거의 동일하다(벡터상의 일부 제한 부위는 변화됨). 데스몬드 세포주가 히스티디놀의 존재하에 더이상 배양되지 않기 때문에 이러한 변화를 주었으며, 따라서, HisD 유전자의 제 2 복사체를 함유할 필요가 없는 것으로 여겨진다. 또한, DHFR 유전자가 불활성화되어 있어서, 단지 하나의 DHFR 유전자, 즉, 데스몬드 마킹된 부위에 존재하는 유전자가 임의의 생성된 세포주에서 증폭되는 것을 확실하게 해준다. "몰리"를 하기 개질에 의해 "만디"로 유도하였다:
(ⅰ) 합성 링커를 DHFR 코딩 영역의 중간에 삽입하였다. 이러한 링커는 정지 코돈을 생성시키며, DHFR 코딩 영역의 나머지를 프레임 밖으로 이동시켜, 유전자가 제기능을 발휘하지 못하게 하였다.
(ii) HisD 유전자의 일부를 결실시키고, 유전자의 프로모터와 개시 코돈이 결여된 PCR 생성된 HisD 단편으로 대체하였다.
도 1에는 마커 플라스미드인 "데스몬드"내의 이들 DNA 엘리먼트의 배열이 도시되어 있다. 도 2에는 제 1 표적화 플라스미드인 "몰리"내의 이들 엘리먼트의 배열이 도시되어 있다. 도 3에는 몰리 DNA를 데스몬드 마킹된 CHO 세포에 표적화시키고, 삽입시킨 후의 다양한 DNA 엘리먼트의, CHO 게놈내에서의 가능한 배열이 도시되어 있다. 도 9에는 표적화 플라스미드인 "만디"가 도시되어 있다.
상기 나열된 DNA 엘리먼트로부터의 마킹 및 표적화 플라스미드의 작제를 통상적인 클로닝 기법을 사용하여 수행하였다 [참조: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al, eds., 1987, John Wiley and Sons]. 모든 플라스미드를 대장균 XLI 블루 (Stratagene, cat. # 200236)에서 증식시키고, 유지시켰다. 대규모 플라스미드 제조물을 제조업자의 지시에 따라, 프로메가 위자드 맥시프렙 DNA 정제 시스템 (등록상표: Promega Wizard Maxiprep DNA Purification System)을 사용하여 준비하였다.
실시예 2
마킹된 CHO 세포주의 작제
1. 마킹된 CHO 세포주를 생성시키기 위한 세포 배양 및 트랜스펙션 절차
마커 플라스미드 DNA를 Bst1107I로 37℃에서 밤새 분해시킴으로써 선형화시켰다. 선형화된 벡터를 에탄올 침전시키고, 멸균 TE에 1㎎/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 선형화된 벡터를 하기와 같이 일렉트로포레이션에 의해 DHFR-차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)인 DG44 세포[참조: Urlaub et al, Som. Cell and Mol. Gen., 12:555-566 (1986)]에 도입시켰다.
지수 증식하는 세포를 원심분리에 의해 취하고, 빙냉 SBS(수크로오스 완충 용액, 272mM 수크로오스, 7mM 인산나트륨, pH 7.4, 1mM 염화마그네슘) 중에서 1회 세척한 후, SBS에 107개 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 얼음 상에서 15분간 인큐베이션시킨 후, 세포 현탁액 0.4㎖를 1회용 일렉트로포레이션 큐벳에서 선형화된 DNA 40㎍과 혼합시켰다. 세포에, 230볼트, 전기용량 400㎌, 저항 13Ω으로 설정된 BTX 일렉트로셀(electrocell) 조작기(manipulator) (San Diego, CA)를 사용하여 충격을 주었다. 그 후, 충격을 받은 세포를 예비가온시킨 CHO 증식 배지(CHO-S-SFMII, Gibco/BRL, 카달로그 # 31033-012) 20㎖와 혼합시키고, 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 일렉트로포레이션시킨 지 48시간 후, 플레이트에 선택 배지 (데스몬드에 의한 트랜스펙션의 경우, 선택 배지는 히포크산틴 또는 티미딘을 비함유하고 히스티디놀 2mM이 보충된 CHO-S-SFMII (Sigma 카달로그 # H6647)임)를 공급하였다. 플레이트를 선택 배지에, 30일 이하 동안, 또는 일부 웰이 세포 증식을 나타낼 때까지 유지시켰다. 그 후, 이들 세포를 96 웰 플레이트로부터 분리하여, 최종적으로 이들 세포가 항상 선택 배지에서 유지되는 120㎖ 스피너 플라스크로 증식시켰다.
실시예 3
마킹된 CHO 세포주의 특징화
(a) 서던 분석
게놈 DNA를 안정하게 증식하는 모든 데스몬드 마킹된 CHO 세포로부터 분리시켰다. DNA를 제조업자의 지시에 따라, 인비트로겐 이지(등록상표: Invitrogen Easy) DNA 키트를 사용하여 분리시켰다. 그 후, 게놈 DNA를 HindIII로 37℃에서 밤새 분해시키고, DHFR 유전자에 특이적인 PCR 생성된 디옥시게닌 라벨링된 프로브를 사용하여 서던 블롯을 수행하였다. 하이브리드화 및 세척을 제조업자의 지시에 따라, 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)의 DIG 이지(easy) hyb (카달로그 # 1603 558) 및 DIG 워시 앤드 블록 버퍼 세트(Wash and Block Buffer Set) (카달로그 # 1585 762)를 사용하여 수행하였다. DHFR 프로브에 하이브리드화하는 단일 밴드를 함유하는 DNA 샘플은 플라스미드의 하나의 복사체가 삽입된 하나의 세포로부터 생성된 데스몬드 클론인 것으로 추정되었다. 이들 클론을 추가 분석을 위해 보존시켰다. 분리된 45개의 HisD 내성 세포주 중에서, 5개만이 하나의 복사체 삽입물이었다. 도 4에는 이들 하나의 복사체 데스몬드 클론 중의 전체 5개를 함유하는 서던 블롯이 도시되어 있다. 클론명은 도면 설명에 제공되어 있다.
(b) 노던 분석
전체 RNA를, 모든 하나의 복사체 데스몬드 클론으로부터 제조업자의 지시에 따라 TRIzol(등록상표) 시약(Gibco/BRL cat # 15596-026)을 사용하여 분리하였다. 각각의 클론으로부터의 RNA 10 내지 20㎍을 이중 포름알데히드 겔 상에서 분석하였다. 생성되는 블롯을 (i) DHFR 메세지, (ii) HisD 메세지 및 (iii) CAD 메세지에 대한 PCR 생성된 디옥시게닌 라벨링된 DNA 프로브에 의해 프로빙하였다. CAD는 우리딘 생합성에 관여하는 삼작용성 단백질로서[참조: Wahl et al, J. Biol. Chem., 254, 17:8679-8689 (1979)], 모든 세포 타입에서 동일하게 발현된다. 이것은 여기에서는 내부 대조표준으로서 사용되어 RNA 로딩을 정량하는 것을 돕는다. 하이브리드화 및 세척을 전술한 뵈링거 만하임 시약을 사용하여 수행하였다. 노던 분석의 결과를 도 5에 도시하였다. His D 및 DHFR 메세지 둘 모두의 최고 수준을 나타내는 하나의 복사체 데스몬드 클론은 도면의 두 패널 모두에서 레인 4에 도시된 클론 15C9 였다. 이 클론을 "마킹된 세포주"로서 정하고, CHO에서의 차후 표적화 실험에 사용하였고, 실험예는 하기 단락에 나타내었다.
실시예 4
데스몬드 마킹된 CHO 세포에서의 항-CD20 항체의 발현
B 세포 표면 항원 CD20을 인식하는 키메라 항체 C2B8은 본 발명자들의 실험실에서 이미 클로닝되고, 발현된 것이다. [참조: Reff et al, Blood, 83:434-45 (1994)]. C2B8 경쇄 및 중쇄 유전자와 함께 필요한 조절 엘리먼트 (진핵 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널)를 포함하는 DNA 단편 4.1kb를 pBR 유도된 클로닝 벡터에 함유된 neo 유전자의 엑손 1과 2 사이에 생성시킨 인공 인트론에 삽입시켰다. 새롭게 생성된 이 5kb DNA 단편(neo 엑손 1, C2B8 및 neo 엑손 2를 포함)을 절제시키고, 표적화 플라스미드 몰리를 어셈블링하기 위해 사용하였다. 몰리의 작제에 사용된 그 밖의 DNA 엘리먼트는 이미 확인된 마킹 플라스미드인 데스몬드를 작제하기 위해 사용한 DNA 엘리먼트와 동일하였다. 몰리의 전체 맵을 도 2에 도시하였다.
표적화 벡터인 몰리를 트랜스펙션시키기 전에 Kpn1 및 Pac1으로 분해시킴으로써 선형화시키고, 에탄올 침전시키고, 멸균 TE에 1.5㎎/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 선형화된 플라스미드를, 80㎍ DNA가 각각의 일렉트로포레이션에 사용된다는 것을 제외하고는, 본질적으로 기술된 바와 같은 지수 증식하는 데스몬드에 도입시켰다. 일렉트로포레이션시킨 지 48시간 후, 96 웰 플레이트에, 제네티신(Geneticin) 400㎍/㎖ (G418, Gibco/BRL 카달로그 # 10131-019)이 보충된 선택 배지 CHO-SSFMII를 보충하였다. 플레이트를 선택 배지 중에서 30일 이하로, 또는 일부 웰이 세포 증식을 나타낼 때까지 유지시켰다. 이러한 증식은 하나의 G418 내성 세포의 클론성 증식의 결과인 것으로 추정되었다. 모든 G418 내성 웰로부터의 상층액을 표준 ELISA 기법에 의해 C2B8 생성에 대해 검정하였고, 모든 생성된 클론을 120㎖ 스피너 플라스크로 증식시켜, 추가로 분석하였다.
표적화된 세포를 분비하는 항체의 특징화
몰리 표적화 플라스미드에 의한 전체 50회의 일렉트로포레이션을 이 실험에서 수행하였고, 각각을 별개의 96개 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 전체 10개의 생존가능한 항-CD20 항체 분비 클론을 수득하고, 120㎖ 스피너 플라스크로 증식시켰다. 게놈 DNA를 모든 클론으로부터 분리한 후, 서던 분석을 수행하여, 클론이 하나의 상동 재조합 사건을 나타내는 지 또는 추가의 무작위 삽입이 동일한 세포에서 발생하였는 지를 결정하였다. DNA 분리 및 서던 하이브리드화를 위한 방법은 이전 단락에 기재된 방법과 동일하였다. 게놈 DNA를 EcoRI로 분해시키고, CD20 중쇄 불변 영역의 절편에 대한 PCR 생성된 디곡시게닌 라벨링된 프로브로 프로빙하였다. 이 서던 분석의 결과를 도 6에 나타내었다. 도면에 도시된 바와 같이, 10개의 클론 중의 8개가 CD20 프로브에 하이브리드화하는 단일 밴드를 나타내며, 이는 하나의 상동 재조합 사건이 이들 세포에서 발생하였음을 나타낸다. 10개 중의 2개, 즉, 클론 24G2 및 28C9는, 게놈내의 어느 곳에서의 추가 무작위 삽입을 나타내는 추가의 밴드(들)의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 전체 10개의 이들 클론 중의 항-CD20 항체의 발현 수준을 조사하였으며, 이것에 대한 데이터를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
상동 삽입물을 분비하는 항-CD20의 발현 수준
클론 항-CD20 (pg/c/d)
20F4 3.5
25E1 2.4
42F9 1.8
39G11 1.5
21C7 1.3
50G10 0.9
29F9 0.8
5F9 0.3
28C9★ 4.5
24G2★ 2.1
★ 이들 클론은 항-CD20의 추가의 무작위 삽입된 복사체를 함유하였다. 따라서, 이들 클론의 발현 수준은 상동 부위 및 무작위 부위 둘 모두로부터의 기여를 반영한다.
발현 수준은 개개의 클론에 의해 분비되는 1일 당 세포 당 피코그램 (pg/c/d)로서 나타나며, 120㎖ 스피너 플라스크로부터 취한 샘플에 대해 3회의 개별 ELISA로부터 수득된 평균 수준을 나타낸다.
데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 최고 및 최저 클론 사이에는 약 10배의 항체 분비의 편차가 있다. 이것은, 항-CD20 유전자가 동일한 데스몬드 마킹된 부위에 모두 삽입된다는 사실로 인해 본 발명자들은 모든 클론으로부터 유사한 발현 수준을 기대했기 때문에 약간 의외였다. 그럼에도 불구하고, 관찰된 발현 범위는 임의의 통상적인 무작위 삽입법 또는 본 발명자들의 번역 손상된 벡터 시스템을 사용하는 경우의 범위와 비교하여 극히 좁았다.
최고 생산 단일 복사체 삽입물인 클론 20F4을 추가 실험을 위해 선택하였다. 표 2 (하기)는 이 클론의 7일간 생성 작업으로부터의 ELISA 및 세포 배양 데이터를 나타낸다.
표 2:
20F4에 대한 7일간 생성 작업 데이터
일 생존율 (%) 생존수/㎖ (x 105) Tx2 (시간) ㎎/ℓ pg/c/d
1 96 3.4 31 1.3 4.9
2 94 6 29 2.5 3.4
3 94 9.9 33 4.7 3.2
4 90 17.4 30 6.8 3
5 73 14 8.3
6 17 3.5 9.5
클론 20F4를 0일째에 120㎖ 스피너 플라스크에 2x105㎖로 시딩하였다. 이후 6일간, 세포수를 계수하고, 배증 시간을 계산하고, 상층액의 샘플 1㎖를 플라스크로부터 취하여, 분비된 항-CD20에 대해 ELISA에 의해 분석하였다.
이 클론은 이 ELISA 데이터를 기준으로 하여 평균적으로 항체 3 내지 5pg/c/d을 분비한다. 이것은 이미 개발된 번역 손상된 무작위 삽입 벡터를 사용하여 본 발명자들의 실험실에서 이미 수득한 기타 고수준 발현 단일 복사체 클론으로부터 수득한 발현 수준과 동일하였다. 이 결과는 다음과 같다:
(1) 데스몬드 마킹 벡터에 의해 마킹된 CHO 게놈내의 부위는 전사적으로 매우 활성이기 때문에, 재조합 단백질을 발현시키는 우수한 부위를 나타내고,
(2) 상동 재조합에 의한 표적화는 본 발명의 벡터를 사용하여 달성될 수 있으며, 이는 이러한 시스템을 무작위 삽입법에 대한 생존가능하고 바람직한 대안 시스템으로 만들기에 충분히 높은 빈도로 발생한다.
이 시스템의 효능을 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은 이 부위가 증폭가능하여, 유전자 발현 및 단백질 분비의 더 높은 수준을 생성시킨다는 것을 또한 입증하였다. 증폭을, 2.5 x 104개 세포/㎖의 밀도에서 시작하는 20F4 세포의 연속 희석물을 96 웰 조직 배양 디쉬에 플레이팅하고, 이들 세포를 5, 10, 15 또는 20nM 메토트렉세이트가 보충된 배지 (CHO-SSFMII)에서 배양함으로써 달성하였다. 항체 분비 클론을 표준 ELISA 기법을 사용하여 스크리닝하고, 최고 생산 클론을 증식시키고, 추가로 분석하였다. 이 증폭 실험을 하기 표 3에 요약하였다.
표 3:
20F4 증폭의 요약
MTX (nM) 검정된 웰의 개수 96웰의 발현 수준 (mg/l) 증식된 웰의 개수 스피너로부터의 발현 수준 (pg/c/d)
10 56 3-13 4 10-15
15 27 2-14 3 15-18
20 17 4-11 1 ND
20F4의 메토트렉세이트 증폭은 상기 표에 표시된 메토트렉세이트 농도를 사용하여, 텍스트에 기재된 바와 같이 구성하였다. 모든 생존 96 웰 콜로니로부터의 상층액을 ELISA에 의해 검정하고, 이들 클론에 의해 발현된 항-CD20의 범위를 칼럼 3에 나타내었다. 이들 결과를 기초로 하여, 최고 생산 클론을 120㎖ 스피너로 증식시키고, 수 차례의 ELISA를 스피너 상층액에 대해 수행하여, 칼럼 5에 나타난 발현 수준 pg/c/d를 결정하였다.
본 데이터에 의해 이 부위가 메토트렉세이트의 존재하에 증폭될 수 있음이 명백하게 입증된다. 10 및 15nM 증폭으로부터의 클론은 약 15 내지 20pg/c/d 생산하는 것으로 밝혀졌다.
20F4-15A5로 표시된 15nM 클론이 최고 발현 세포주로서 선택되었다. 이 클론은 22개 웰만이 증식하는 96 웰 플레이트로부터 유래하며, 이로써, 단일 세포로부터 생성된 것으로 추정되었다. 20F4-15A5로 표시된 15nM 클론이 최고 발현 세포주로서 선택되었다. 이 클론은 22개 웰만이 증식하는 96 웰 플레이트로부터 유래하며, 이로써, 단일 세포로부터 생성된 것으로 추정되었다. 그 후, 클론을 추가 1 라운드의 메토트렉세이트 증폭시켰다. 전술된 바와 같이, 배양액의 연속 희석물을 96 웰 디쉬에 플레이팅하고, 200, 300 또는 400nM 메토트렉세이트로 보충된 CHO-SS-FMII 배지에서 배양하였다. 생존 클론을 ELISA에 의해 스크리닝하고, 몇몇 최고 생산 클론을 스피너 배양액으로 증식시켜, 추가 분석하였다. 이 두 번째 증폭 실험을 표 4에 요약하였다.
표 4:
20F4-15A5 증폭의 요약
MTX (nM) 검정된 웰의 개수 96웰의 발현 수준 (mg/l) 증식된 웰의 개수 스피너로부터의 발현 수준 (pg/c/d)
200 67 23-70 1 50-60
250 86 21-70 4 55-60
300 81 15-75 3 40-50
20F4-15A5의 메토트렉세이트 증폭을 텍스트에 기재된 바와 같이 구성하고, 검정하였다. 개수가 칼럼 4에 표시되어 있는 최고 생산 웰을 120㎖ 스피너 플라스크에 증식시켰다. 이들 웰로부터 유래된 세포주의 발현 수준을 칼럼 5에서 pg/c/d로서 나타내었다.
최고 생산 클론은 250nM 메토트렉세이트 증폭으로부터 유래하였다. 20F4-15A5-250A6으로 표시된 250nM 클론은 웰만이 증식된 96개 웰 플레이트로부터 유래하며, 이로써, 단일 세포로부터 생성된 것으로 추정되었다. 종합해 볼 때, 표 3 및 4의 데이터는 2 라운드의 메토트렉세이트 증폭이 포유동물 세포에서의 면역글로불린의 최대 분비 능력에 근접하는 60pg/세포/일의 발현 수준에 도달하기에 충분하다는 것을 강력하게 나타낸다 [참조: Reff, M.E., Curr. Opin. Biotech., 4:573-576 (1993)]. 단지 2회의 증폭 단계에 의해 이 분비 능력에 도달하는 능력은 이 상동 재조합 시스템의 이용성을 추가로 증가시킨다. 전형적으로, 무작위 삽입 방법은 이 발현 수준에 도달하기 위해 2회 보다 많은 증폭 단계를 필요로 하며, 증폭의 용이성 관점에서 신뢰성이 낮은 것이 일반적이다. 따라서, 상동 시스템은 포유동물 세포에서 고수준의 유전자 발현을 달성하는 보다 효율적이고 시간 절약적 방법을 제공한다.
실시예 5
데스몬드 마킹된 CHO 세포에서의 항-사람 CD23 항체의 발현
CD23은 B 및 T 림프구에 대한 IgE의 결합을 매개하는 저친화성 IgE 수용체이다 [참조: Sutton, B.J., and Gould, H.J., Nature, 366:421-428 (1993)]. 항-사람 CD23 모노클로날 항체인 5E8은 본 발명자들의 실험실에서 최근 클로닝되고 발현된 사람 감마-1 모노클로날 항체이다. 이 항체는 1997년 2월 20일 제 08/803,085호로 출원되고 (일반 양도됨) 특허된 미국 특허 제 6,011,138호에 기재되어 있다.
5E8의 중쇄 및 경쇄 유전자를 벡터 NEOSPLA의 유도체인 포유동물 발현 벡터 N5KG1 (참조: Barnett et al, in Antibody Expression and Engineering, H.Y Yang and T. Imanaka, eds., pp27-40 (1995))에 클로닝시킨 후, 2가지 변형을 유전자에 생성시켰다. 본 발명자들은 최근 본 실험실의 그 밖의 발현 구성물 중의 중쇄와 비교하여 면역글로불린 경쇄의 약간 높은 분비율을 관찰하였다 (참조: Reff et al, 1997, 미발표된 결과). 이러한 결손을 보충하기 위해, 본 발명자들은 개시 부위의 바로 업스트림에 존재하는 강력한 프로모터/인핸서 엘리먼트를 첨가함으로써 5E8 중쇄 유전자를 변형시켰다. 후속 단계에서, 5E8 변형된 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 2.9kb DNA 단편을 N5KG1 벡터로부터 분리시켜, 표적화 벡터인 만디에 삽입시켰다. 5E8 함유 몰리의 제조 및 데스몬드 15C9 CHO 세포로의 일렉트로포레이션을 본질적으로 이전 단락에 기재된 대로 수행하였다.
종래에 기술된 프로토콜에 대한 한 가지 변형은 사용된 배양 배지의 타입이었다. 데스몬드 마킹된 CHO 세포를 재조합 인슐린 3㎎/ℓ (3㎎/㎖ 원액, Gibco-BRL, 카달로그 # AS22057)과 8mM L-글루타민 (200mM 원액, Gibco-BRL, 카달로그 # 25030-081)이 보충된 단백질 비함유 CD-CHO 배지 (Gibco-BRL, 카달로그 #AS21206)에서 배양하였다. 그 후, 트랜스펙션된 세포를 제네티신 400㎍/㎖가 보충된 상기 배지에서 선택하였다. 이 실험에서, 20회의 일렉트로포레이션을 수행하고, 96 웰 플레이트 조직 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 세포는 증식하였고, 전체 68웰에서 항-CD23을 분비시켰으며, 이들 모두는 단일 G418 세포로부터 유래하는 클론인 것으로 추정되었다. 이들 웰 중의 12개를 추가 분석을 위해 120㎖ 스피너 플라스크로 증식시켰다. 본 발명자들은 이 실험에서 분리된 클론의 증가된 수 (실시예 4에 기재된 항-CD20에 대한 10개와 비교하여 68개)는 CHO-SS-FMII 배지와 비교하여 CD-CHO 배지에서 증식된 세포의 높은 클로닝 효율 및 생존율에 기인하는 것으로 생각하였다. 스피너 배양에서 분석된 이들 클론에 대한 발현 수준은 항-CD20 클론에 대해 관찰된 수준과 거의 일치하는 0.5 내지 3pg/c/d 였다. 4H12로 표시되는 최고 생성 항-CD23 클론을 메토트렉세이트 증폭시켜서, 이것의 발현 수준을 증가시켰다. 이 증폭을 실시예 4에서 항-CD20 클론에 대해 기재된 증폭과 유사한 방식으로 구성하였다. 지수 증식하는 4H12 세포의 연속 희석물을 96 웰 조직 배양 디쉬에 플레이팅하고, 인슐린 3㎎/ℓ, 8mM 글루타민 및 30, 35 또는 40nM 메토트렉세이트가 보충된 CD-CHO 배지에서 증식시켰다. 이 증폭 실험을 표 5에 요약하였다.
표 5
2H12 증폭의 요약
MTX (nM) 검정된 웰의 개수 96웰의 발현 수준 (mg/l) 증식된 웰의 개수 스피너로부터의 발현 수준 (pg/c/d)
30 100 6-24 8 10-25
35 64 4-27 2 10-15
40 96 4-20 1 ND
수득된 최고 발현 클론은 22개 웰이 증식한 플레이트로부터 분리된 30nM 클론이었다. 4H12-30G5로 표시되는 이 클론은 항체 18 내지 22pg/c/d을 재현가능하게 분비하였다. 이것은 항 CD20 클론인 20F4(실시예 4에 기재된 15 내지 18pg/c/d를 생성시키는 클론 20F4-15A5)의 첫 번째 증폭에 대해 관찰된 발현과 동일한 범위였다. 이 데이터는 CHO에서의 이 마킹된 부위에서의 증폭이 재현가능하고 효율적이라는 결과를 추가로 뒷받침하는 기능을 한다. 이 30nM 세포주의 두 번째 증폭은 현재 진행중이다. 발현의 포화 수준은 항-CD20의 경우에서와 같이 항-CD23 항체의 단지 2회의 증폭 단계에 의해 달성가능할 것으로 예상된다.
실시예 6
데스몬드 마킹된 CHO 세포에서의 면역부착소(Immunoadhesin)의 발현
Ig 수퍼패밀리의 일원인 CTLA-4는 T 림프구의 표면에서 발견되며, 항원 특이적 T 세포 활성화에서 작용하는 것으로 생각된다 (참조: Dariavach et al, Eur. J. Immunol., 18:1901-1905 (1988); and Linsley et al, J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)). 활성화 경로에서의 CTLA-4 분자의 정확한 기능을 추가로 실험하기 위해, 사람 IgG1 불변 영역의 절단형에 결합된 CTLA-4의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 융합 단백질을 생성시켰다 (참조; Linsley et al (Id.)). 본 발명자들은 최근 플라스미드 NEOSPLA의 유도체인 포유동물 발현 벡터 BLECH1 (참조: Barnett et al, in Antibody Expression and Engineering, H.Y Yang and T. Imanaka, eds., pp27-40 (1995))에서 이 CTLA-4 Ig 융합 단백질을 발현시켰다. CTLA-4 Ig를 코드화하는 800bp 단편을 이 벡터로부터 분리시켜서, 몰리의 SacII과 Bg1II 부위 사이에 삽입시켰다.
CTLA-4Ig-몰리의 제조 및 데스몬드 클론 15C9 CHO 세포로의 일렉트로포레이션을 항-CD20에 대해 이전 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 20회의 일렉트로포레이션을 수행하고, 전술한 바와 같이 96 웰 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 18개의 CTLA-4 발현 웰을 96 웰 플레이트로부터 분리시키고, 120㎖ 스피너 단계로 진행시켰다. 그 후, 이들 각각의 클론으로부터 분리시킨 게놈 DNA에 대한 서던 분석을 수행하여 또 다른 무작위 삽입물을 함유하는 상동 클론의 수를 결정하였다. 게놈 DNA를 Bg1II로 분해하고, 사람 IgG1 불변 영역에 대한 PCR 생성된 디곡시게닌 라벨링된 프로브로 프로빙하였다. 이 분석의 결과, CTLA-4 클론의 85%만이 상동 삽입물이고; 나머지 15%가 하나의 추가 무작위 삽입물을 함유하는 것으로 나타났다. 이 결과는, 클론의 80%가 단일 상동 삽입물이라는 상기 논의된 항-CD20의 발현으로부터의 결과를 입증한다. 따라서, 본 발명자들은 이 발현 시스템이 생성된 모든 클론의 80% 이상에서 하나의 표적화된 상동 삽입물을 생성시키는 것으로 결론내릴 수 있었다.
상동 CTlA4-Ig 클론에 대한 발현 수준은 8 내지 12pg/c/d 이었다. 이것은 상기 논의된 항-CD20 항체 및 항-CD23 항체 클론에 대해 보고된 범위 보다 약간 높았다. 그러나, 본 발명자들은 인트론 삽입 벡터를 사용하는 이 분자의 발현에 의해 면역글로불린에 대해 수득된 발현 수준 보다 현저히 높은 발현 수준이 수득됨을 이미 관찰하였다. 본 발명자들은 현재로서는 이 결과를 설명할 수 없다.
실시예 7
데스몬드 마킹된 대체 CHO 세포주에 대한 항-CD20의 표적화
이전 단락에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 5개의 단일 복사체 데스몬드 마킹된 CHO 세포주를 수득하였다 (참조: 도 4와 5). 본 발명자들의 표적화 방법의 성공이 데스몬드 클론 15C9의 독특한 특성에 기인하는 것이 아니며, 이 클론에만 제한되는 것이 아님을 입증하기 위해, 본 발명자들은 항-CD20 몰리를 데스몬드 클론 9B2에 도입시켰다 (참조: 도 4의 레인 6, 도 5의 레인 1). 몰리 DNA의 제조 및 데스몬드 9B2로의 일렉트로포레이션을 항-CD20에 관한 이전 실시예에 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 본 발명자들은 이 실험으로부터 하나의 상동 삽입물을 수득하였다. 이 클론을, 이것이 평균 항-CD20 1.2pg/c/d을 생성시키는 120㎖ 스피너 플라스크로 증식시켰다. 이것은 본 발명자들이 데스몬드 15C9로 표적화시킨 몰리를 사용하여 관찰한 발현 수준 보다 상당히 낮은 발현이었다. 그러나, 이것은 데스몬드 클론에 대한 본 발명자들의 노던 분석을 기준으로 할때 예상된 결과였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 클론 9B2로부터의 mRNA 수준은 15C9로부터의 mRNA 수준 보다 현저하게 낮으며, 이는 이 클론의 부위가 15C9의 부위와 같이 전사 활성적이 아님을 나타낸다. 따라서, 이 실험에 의해, 시스템의 재현가능성이 입증될 뿐만 아니라 (아마도 임의의 마킹된 데스몬드 부위는 몰리에 의해 표적화할 수 있음), 데스몬드 15C9의 부위가 가장 전사 활성적이라는 노던 데이터가 확인된다.
상기 설명으로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시를 위해 기술되어 있다고 하더라도, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해 제한되지 않는다.

Claims (53)

  1. 시험관내에서 목적하는 DNA를 포유동물 세포의 게놈내의 표적 부위에 삽입시키는 방법으로서,
    (i) 시험관내에서 포유동물 세포를, 하기 서열을 함유하는 마커 플라스미드로 트랜스펙션시키거나 형질전환시키는 단계:
    (a) 포유동물 세포 게놈에 이종성이며 포유동물 세포 게놈에 삽입되면 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 영역을 포함하는 제 1 DNA 단편;
    (b) 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 제 2 DNA 단편; 및
    (c) 제 1 선별 마커 단백질과 상이하며 마커 플라스미드가 게놈에 삽입된 포유동물 세포를 선택할 수 있게 하는 제 2 선별 마커 단백질을 코드화하는 영역을 포함하는 제 3 DNA 단편;
    (ii) 시험관내에서 제 3 DNA 단편에 의해 코드화된 선별 마커 단백질의 발현을 스크리닝하므로써 마커 플라스미드가 게놈에 삽입된 세포를 선택하는 단계;
    (iii) 선택된 세포를, 세포의 게놈에 삽입시키려는 하나 이상의 DNA 및 추가로 (a) 상동 재조합을 위한 마커 플라스미드의 독특한 부위와 동일하거나 충분히 상동성이어서, 상동 재조합에 의해 마커 플라스미드 DNA와 재조합될 수 있는 영역을 포함하는 제 4 DNA 단편 및 (b) 마커 플라스미드에 존재하지 않는 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 나머지 엑손(들)을 포함하는 제 5 DNA 단편을 함유하는 표적 플라스미드로 트랜스펙션시키거나 형질전환시키는 단계로서,
    활성인 제 1 선별 마커 단백질은 표적 플라스미드에 함유된 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손이 마커 플라스미드에 함유된 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 나머지 엑손(들)과 함께 발현되는 경우에만 생성되는 단계; 및
    (iv) 시험관내에서 제 1 선별 마커 단백질의 발현을 스크리닝하므로써 상동 재조합을 위한 독특한 부위에 삽입된 표적 플라스미드를 함유하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 세포의 게놈에 삽입시키려는 하나 이상의 DNA가 목적하는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 목적하는 단백질이 포유동물 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 단백질이 면역글로불린임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈에 삽입시키려는 하나 이상의 DNA가 표적 플라스미드에 함유된 제 1 선별 마커의 엑손에 인접한 위치에 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질이, 네오마이신 인산전이효소, 히스티디놀 탈수소효소, 디히드로폴레이트 환원효소, 히그로마이신 인산전이효소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 아데노신 탈아미노효소, 글루타민 합성효소 및 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 마커 플라스미드 중의 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손이 네오마이신 인산전이효소 유전자의 일부분을 함유하고, 표적 플라스미드 중의 나머지 엑손(들)이 네오마이신 인산전이효소 유전자의 나머지 부분을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 벡터를 삽입시키기 전에, 마커 플라스미드의 제 3 DNA 단편에 함유된 제 2 선별 마커의 RNA 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질과 상이한 제 2 선별 마커 단백질이, 네오마이신 인산전이효소, 히스티디놀 탈수소효소, 디히드로폴레이트 환원효소, 히그로마이신 인산전이효소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 아데노신 탈아미노효소, 글루타민 합성효소 및 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 또는 표적 플라스미드가 제 1 및 제 2 선별 마커 단백질과 상이한 제 3의 우세한 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 제 3의 우세한 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA의 발현이 세포의 게놈에 삽입시키려는 DNA를 증폭시킴을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 골수종 세포, 어린 햄스터 신장 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포 및 NIH 3T3 세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 세포가 CHO 세포임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 플라스미드가 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 마커 플라스미드의 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역내에 삽입되는 희소(rare) 제한 엔도누클레아제 서열을 추가로 함유함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 300개 이상의 누클레오티드임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역의 크기가 300개 누클레오티드 내지 20kb임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역의 크기가 2 내지 10kb임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA가 3개 이상의 엑손으로 분절되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 박테리아 DNA, 곤충 DNA, 바이러스 DNA 또는 합성 DNA임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 기능성 유전자를 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  22. 목적하는 DNA를 포유동물 세포의 게놈내의 표적 부위에 삽입시키기 위한 키트로서, 적어도 (i) 마커 플라스미드와 (ii) 표적 플라스미드를 포함하며,
    마커 플라스미드는,
    (a) 포유동물 세포 게놈에 이종성이며 포유동물 세포 게놈에 삽입되면 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 DNA의 영역을 포함하는 제 1 DNA 단편;
    (b) 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 제 2 DNA 단편; 및
    (c) 제 1 선별 마커 단백질과 상이하며 마커 플라스미드가 게놈에 삽입된 포유동물 세포를 선택할 수 있게 하는 제 2 선별 마커 단백질을 코드화하는 영역을 포함하는 제 3 DNA 단편을 함유하고,
    표적 플라스미드는, 세포의 게놈에 삽입시키고자 하는 하나 이상의 DNA를 포함하고, 추가로
    (a) 상동 재조합을 위한 마커 플라스미드의 독특한 부위와 동일하거나 충분히 상동성이어서, 상동 재조합에 의해 마커 플라스미드 DNA와 재조합될 수 있는 영역을 포함하는 제 4 DNA 단편; 및
    (b) 마커 플라스미드에 존재하지 않는 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 나머지 엑손(들)을 포함하는 제 5 DNA 단편을 함유하며, 마커 플라스미드 중의 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손과 표적 플라스미드 중의 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 나머지 엑손(들)이 함께 활성의 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는, 목적하는 DNA를 포유동물 세포의 게놈내의 표적 부위에 삽입시키기 위한 키트.
  23. 제 22항에 있어서, 세포의 게놈에 삽입시키려는 하나 이상의 DNA가 목적하는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 키트.
  24. 제 23항에 있어서, 목적하는 단백질이 포유동물 단백질임을 특징으로 하는 키트.
  25. 제 24항에 있어서, 단백질이 면역글로불린임을 특징으로 하는 키트.
  26. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 게놈에 삽입시키려는 하나 이상의 DNA가 표적 플라스미드에 함유된 제 1 선별 마커의 엑손에 인접한 위치에 삽입됨을 특징으로 하는 키트.
  27. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질이, 네오마이신 인산전이효소, 히스티디놀 탈수소효소, 디히드로폴레이트 환원효소, 히그로마이신 인산전이효소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 아데노신 탈아미노효소, 글루타민 합성효소 및 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트.
  28. 제 27항에 있어서, 마커 플라스미드 중의 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 유전자의 하나 이상의 엑손이 네오마이신 인산전이효소 유전자의 일부분을 함유하고, 표적 플라스미드 중의 나머지 엑손(들)이 네오마이신 인산전이효소 유전자의 나머지 부분을 함유함을 특징으로 하는 키트.
  29. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질과 상이한 제 2 선별 마커 단백질이, 네오마이신 인산전이효소, 히스티디놀 탈수소효소, 디히드로폴레이트 환원효소, 히그로마이신 인산전이효소, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 아데노신 탈아미노효소, 글루타민 합성효소 및 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 또는 표적 플라스미드가 제 1 및 제 2 선별 마커 단백질과 상이한 제 3의 우세한 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 키트.
  31. 제 30항에 있어서, 제 3의 우세한 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA의 발현이 세포의 게놈에 삽입시키려는 DNA를 증폭시킴을 특징으로 하는 키트.
  32. 삭제
  33. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 DNA을, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 골수종 세포, 어린 햄스터 신장 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포 및 NIH 3T3 세포로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물 세포의 게놈내의 표적 부위에 삽입시킴을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 33항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포임을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 플라스미드가 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 마커 플라스미드의 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역내에 삽입되는 희소(rare) 제한 엔도누클레아제 서열을 추가로 함유함을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 300개 이상의 누클레오티드임을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 36항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역의 크기가 300개 누클레오티드 내지 20kb임을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 36항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역의 크기가 2 내지 10kb임을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 선별 마커 단백질을 코드화하는 DNA가 3개 이상의 엑손으로 분절되어 있음을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 박테리아 DNA, 곤충 DNA, 바이러스 DNA 또는 합성 DNA임을 특징으로 하는 키트.
  41. 제 40항에 있어서, 상동 재조합을 위한 독특한 부위를 제공하는 제 1 DNA 단편 중의 DNA의 영역이 기능성 유전자를 함유하지 않음을 특징으로 하는 키트.
  42. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 플라스미드가 도 7에 도시된 "데스몬드(Desmond)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 플라스미드가 도 8에 도시된 "몰리(Molly)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 플라스미드가 도 10에 도시된 "만디(Mandy)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 플라스미드가 도 7에 도시된 "데스몬드(Desmond)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  46. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 플라스미드가 도 8에 도시된 "몰리(Molly)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  47. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 플라스미드가 도 10에 도시된 "만디(Mandy)" 플라스미드의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  48. 제 11항에 있어서, 제 3의 우세한 선별 마커 단백질이 디히드로폴레이트 환원효소임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 31항에 있어서, 제 3의 우세한 선별 마커 단백질이 디히드로폴레이트 환원효소임을 특징으로 하는 키트.
  50. 제 43항에 있어서, 표적 플라스미드가 항-CD20 항체 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 44항에 있어서, 표적 플라스미드가 항-CD23 항체 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 46항에 있어서, 표적 플라스미드가 항-CD20 항체 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 함유하지 않음을 특징으로 하는 키트.
  53. 제 47항에 있어서, 표적 플라스미드가 항-CD23 항체 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 함유하지 않음을 특징으로 하는 키트.
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