KR20230157727A - 넉-인된 세포에서 글루타티온-s-트랜스페라제 융합 치료용 단백질 생산 방법 - Google Patents
넉-인된 세포에서 글루타티온-s-트랜스페라제 융합 치료용 단백질 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 넉-인된 세포에서 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 생쥐 β-카제인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 넉-인 벡터를 생쥐 세포에 도입하여 형질전환하고, 생쥐 β-카제인 엑손 3의 위치에 정확하게 삽입하고, 내인성 프로모터에 의해 Glutathione-S-Transferase (GST) 융합 치료용 단백질을 생산할 수 있으며, 생산된 치료용 단백질은 정제 단계에서 정밀 프로테아제 (Prescission protease)에 의해 쉽게 분리될 수 있어서 세포로부터 효율적으로 치료용 단백질을 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 넉-인된 세포에서 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase) 융합 치료용 단백질 및 이를 생산하는 방법에 관한 것으로, 넉-인 벡터를 이용하여 넉-인 된 세포를 확보할 수 있으며, 넉-인된 세포를 이용하여 효율적으로 세포로부터 치료용 단백질을 생산할 수 있다.
대장균, 효모 또는 동물세포 등은 치료용 재조합 단백질을 생산하기 위하여 사용되고 있다. 특히 동물세포를 숙주로 하여 치료용 재조합 단백질을 생산하는 비중이 늘어나고 있다. 이러한 동물세포의 일 예로는 CHO (Chinese Hamster Ovary), BHK (Baby Hamster Kidney) 및 HEK (Human Embryo Kidney) 세포 등이 있다. 이러한 세포로부터 치료용 재조합 단백질 생산을 하기 위해서는 목적으로 하는 단백질 생산을 위한 유전자를 특정 프로모터에 의하여 발현이 조절될 수 있도록 재조합 유전자를 만들고, 이 재조합 유전자를 동물세포에 도입하여 목적으로 하는 단백질을 합성하도록하고 있다. 특히 이러한 재조합 유전자의 발현을 위해서 특정 프로모터를 사용하고 있으나 이들 재조합 유전자가 세포내로 도입되었을 때는 무작위로 염색체 내에 삽입되어 그 특정 프로모터에 의한 재조합 유전자의 발현이 낮은 경우도 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위해서 정확한 내인성 유전자 위치에 상동유전자 재조합으로 치료용 단백질 생산을 위한 외래 유전자를 삽입하는 유전자 적중법 (gene targeting)인 넉-인 방법이 이용될 수 있다. 이러한 넉-인된 세포는 내인성 유전자의 프로모터를 포함한 유전자 발현 조절 DNA 영역을 모두 이용하여 치료용 단백질 생산을 위한 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있어서 치료용 재조합 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 동물 세포 생체 반응기 (animal cell bioreactor)로써 여러 분야에서 활용될 수 있다.
넉-인을 위해서는 치료용 단백질 생산을 위한 유전자를 삽입하기 위한 내인성 유전자의 시작 코돈인 ATG 염기서열의 5'영역을 5'암으로, 3'영역을 3'암으로 이용하여 넉-인 벡터를 제작하여야 하며, 발현 시키고자 하는 외래 유전자의 시작 코돈 ATG 위치는 내인성 유전자의 ATG 위치와 일치 되어야 한다.
이러한 넉-인 벡터를 세포에 도입하여 넉-인된 세포를 확보하기 위해서 최근에 징크핑거 (ZFN, zinc figer nuclease), 탈렌 (TALEN, transcription activator-like effector nuclease) 및 CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)과 같은 유전자 가위를 사용함에 따라 유전자 적중에 의한 넉-인 효율이 증가되었다고 보고되고 있다.
또한, 치료용 단백질을 생산할 수 있는 넉-인 세포에서 보다 효율적으로 치료용 단백질 정제를 위해서 방법이 고안되어야 하며, 한 가지 예로서 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 단백질 시스템을 이용할 수 있으며, 특히 융합 단백질의 절단을 위해서 저온에서 작동하는 정밀 프로테아제 (Prescission protease)의 이용은 보다 효율적으로 치료용 단백질을 정제할 수 있다. 이러한 정밀 프로테아제를 이용한 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 단백질 시스템을 넉-인 세포에서 치료용 재조합 단백질 생산에 이용하면 보다 효율적으로 내인성 유전자 조절 시스템을 이용하여 치료용 재조합 단백질 발현 및 정제를 유도할 수 있다.
우유 단백질은 자연적으로 분비되기 때문에 유선 세포로부터 재조합 단백질을 생산하는 것이 가장 좋은 방법이라고 알려져 왔다. 젖소 우유의 80 %는 카제인 단백질, 20 %는 유청 (Whey) 단백질로 이루어져 있으며, 이 카제인 단백질 (27.3 g/L)의 37 % (9 내지 11 g/L)는 β-카제인으로 구성되어 비교적 많은 양이 우유에 포함되어 있다고 알려져 있다. 이러한 것은 β-카제인 유전자 위치가 치료용 재조합 단백질 생산을 위한 내인성 유전자로서 넉-인에 적합한 위치라고 할 수 있다.
hEPO는 인간 에리트로포이에틴 (Erythropoietin)이라고도 불리는 165개의 아미노산으로 구성된 30 kDa의 분자량의 당단백질이며, 재조합 에리트로포이에틴 단백질은 암치료 시 나타나는 빈혈 치료제 뿐만 아니라, 류마티스성 관절염, 후천성면역결핍증, 궤양성 대장염 및 겸상 적혈구 빈혈증에도 효과적으로 이용되고 있다.
하지만 치료용 재조합 단백질 생산을 위하여 생쥐 유선세포인 HC11 세포의 β-카제인 유전자 위치에 글루타티온-S-트랜스페라제 (GST) 융합 단백질 시스템을 이용하여 치료용 재조합 단백질 hEPO 생산을 위한 넉-인 세포의 확보와 치료용 재조합 단백질 생산에 대해서는 성공적인 연구 사례가 보고되지 않고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 글루타티온-S-트랜스페라제 (GST) 융합 단백질 시스템을 이용하여 치료용 재조합 단백질 hEPO 생산을 위한 넉-인 세포의 확보와 치료용 재조합 단백질 생산하고자 예의 노력한 결과, 베타-카제인 (β-casein) 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 넉-인 벡터를 크리스퍼 유전자 가위 (CRISPR/Cas9)와 함께 세포에 도입하여 β-casein을 정확하게 삽입 가능하며, 넉-인 형질 전환된 세포를 이용하여 글루타티온-S-트랜스페라제 (GST) 융합 단백질을 생산하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 넉-인 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase; GST) 융합 형질전환체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 넉-인 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase; GST) 융합 치료용 넉-인 (Knock-in) 벡터에 관한 것이다:
베타-카제인 (β-casein) 유전자의 프로모터 서열인 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열;
치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
베타-카제인 유전자의 터미네이터 서열인 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열.
본 명세서 상 “넉-인 (knock-in) 벡터”는 유전자 타겟팅 (gene targeting)용 벡터의 하나로서, 특정 유전자를 넉-아웃 (knock-out) 시키고 그 유전자의 위치에 정확하게 발현시키고자 하는 외래 유전자를 도입하는데 사용하는 벡터이다. 넉-인 벡터에 의하여 삽입된 외래 유전자는 삽입된 위치에 게놈 상에 위치한 유전자 발현조절 영역의 모든 부분을 이용할 수 있으므로, 원래 그 위치에 존재하는 유전자의 발현량 만큼 발현될 가능성이 있다.
본 발명에 있어서 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 3의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 엑손 2 및 3을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 5'-아암의 3'말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상 용어 “치료용 단백질 (therapeutic protein)”은 치료 활성을 가진 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질은 인간 에리트로포이에틴 (Erythropoietin), 인간 엔도스타틴(endostatin), 락토페린(lactoferrin), 인슐린, 인간 성장 호르몬(human growth hormone), 소 성장 호르몬(bovine growth hormone), 성장 호르몬 방출인자 (growth hormone-releasing factor), 부갑상선 호르몬 (parathyroid honnone), 갑상선자극 호르몬 (thyroid-stimulating hormone), 여포자극 호르몬 (follicle stimulating hormone), 황체 형성 호르몬 (luteinizing hormone), 인터페론 알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마, 혈관내피 성장인자 (vascular endothelial growth factor), 호르몬 수용체 또는 성장인자를 위한 수용체, 인테그린 (integrin) A 또는 D 단백질, 류머티스성 인자 (rheumatoid factors), 골 유래 신경 영양인자 (bone-derived neutrophic factor; BDNF)와 같은 신경 영양인자(neurotrophic factor), 뉴로트로핀 (neurotrophin), NGF-베타와 같은 신경 성장인자 (nerve growth factor), 혈소판-유래 성장인자 (platelet-derived growth factor), FGF 또는 bFGF와 같은 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor), TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장인자 (transformation growth factor), 인슐린 (Insulin) 또는 인슐린 유사 성장인자 (IGF-1 및 IGF-2), 각질세포 성장인자,(keratinocyte growth factor), 인슐린유사 성장인자-결합단백질 (insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBP), CD 단백질 (CD-3, CD-4, CD-8, 또는 CD-19), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 골-유도 인자 (bone-inducing factors), 항체독소 (immunotoxins), 골형성 단백질 (bone morphogenetic protein; BMP), 콜로니 자극인자(colony stimulating factor; M-CSF, GM-CSF, G-CSF); 위 리파아제 (gastric lipases), 췌장 리파아제 (pancreatic lipases), 담즙 리파아제 (biliary lipases), 엘라스타아제 (elastases), 알파-1 항 트립신 (α-1 anti-trypsin), 프로테아제, 옥시다아제, 파이타아제(phytases), 키티나아제(chitinases), 인베르타제(invertase), 셀룰라아제(cellulases), 자일라나제(xylanases), 구조 단백질 (콜라겐), 트랜스페린, 헤모글로빈, 인간 알부민과 같은 혈액 단백질, 혈액 보조인자 (blood cofactors), 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 또는 인자 Ⅹ와 같은 혈액응고인자, 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrands Factor), 단백질 C와 같은 항-응고인자 (anti-coagulation factors), 심방 나트륨 배출 인자 (atrial natriuretic factor), 레닌(renin), 칼시토닌 (calcitonin), 글루카곤 (glucagon), 폐표면 활성제 (pulmonary surfactant), 유로키나아제 (urokinase), 플라스미노겐 활성화제, 트롬빈(thrombin), 트롬보포이에틴 (thrombo- poietin), 조혈 성장인자 (haematopoietic growth factor), 알파- 또는 베타-종양괴사인자 (alpha- or beta-tumour necrosis factor), 엔케팔리나제 (encephalinase), MIP-1 (human macrophage inflammatory protein-1), 인간 혈청 알부민 (hwnan serum albumin), 릴랙신(relaxin), Dnase, 사이토카인 (cytokine), 케모카인 (chemokines), 인터류킨 (interleukins; IL-1 내지 IL-1O), 항체 및 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 Human EPO (Erythropoietin) 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 10의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 3'말단에 정밀 프로테아제 (Prescission protease) 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정밀 프로테아제 염기서열은 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 9의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 Human EPO 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 13의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단에 SV40 polyA 뉴클레오타이드 및 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone; BGH) polyA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 SV40 polyA 뉴클레오타이드 서열은 치료용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 SV40 polyA 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 19의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 선별마커로 항생제 내성 유전자 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 형광 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제 내성 유전자는 네오마이신 (neomycin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 암피실린 (ampicilling) 및 브레오마이신 (bleomycin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 내성인 유전자를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제 내성 유전자는 PGK-neo (Phosphoglycerate kinase-neo)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제 내성 유전자 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 19의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 단백질은 녹색형광단백질 (green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질 (yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질 (red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질 (orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질 (cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질 (blue fluorescent protein, BFP) 및 원적색형광단백질 (far-red fluorescent protein)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 16의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 6의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 엑손 4를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명에 있어서 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 예를 들어, pSP124S 벡터 골격인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에 있어서 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 목적 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “실질적인 동일성”은 각각의 염기서열과 임의의 다른 염기서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 염기서열이 각각의 염기서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase; GST) 융합 형질전환체 제조방법에 관한 것이다:
베타-카제인 (β-casein) 유전자의 프로모터 서열인 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열, 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열 및 베타-카제인 유전자의 터미네이터 서열인 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 형질전환 단계.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 넉-인 벡터와 CRISPR/Cas9 효소를 이용하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 CRISPR/Cas9 효소는 서열번호 23의 핵산 서열을 표적으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 3의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 엑손 2 및 3을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 5'-아암의 3'말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 Human EPO (Erythropoietin) 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 10의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 3'말단에 정밀 프로테아제 (Prescission protease) 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정밀 프로테아제 염기서열은 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 9의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 Human EPO 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 13의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단에 SV40 polyA 뉴클레오타이드 및 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone; BGH) polyA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 SV40 polyA 뉴클레오타이드 서열은 치료용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 SV40 polyA 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 19의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 선별마커로 항생제 내성 유전자 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 형광 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제 내성 유전자 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 19의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 16의 염기서열에 대하여 실질적으로 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 넉-인 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다:
베타-카제인 (β-casein) 유전자의 프로모터 서열인 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열;
치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
베타-카제인 유전자의 터미네이터 서열인 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열.
명세서의 복잡함을 피하기 위해 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 넉-인 벡터에 관한 내용은 생략하며, 상기 기재한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다:
베타-카제인 (β-casein) 유전자의 프로모터 서열인 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열;
치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
베타-카제인 유전자의 터미네이터 서열인 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 형질전환 단계; 및
형질전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 수득하는 배양 단계.
본 발명에 있어서 세포는 생쥐 유선세포인 HC11 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 넉-인 벡터와 크리스퍼 유전자가위 (CRISPR/Cas9)를 세포내에 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 인덕션 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인덕션 단계는 락토제닉 (Lactogenic) 호르몬을 통한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인덕션 단계는 락토제닉 호르몬 처리에 의한 내인성 프로모터의 발현 유도에 따른 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 넉-인된 세포에서 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 생쥐 β-카제인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 넉-인 벡터를 생쥐 세포에 도입하여 형질전환하고, 생쥐 β-카제인 엑손 3의 위치에 정확하게 삽입하고, 내인성 프로모터에 의해 Glutathione-S-Transferase (GST) 융합 치료용 단백질을 생산할 수 있으며, 생산된 치료용 단백질은 정제 단계에서 정밀 프로테아제 (Prescission protease)에 의해 쉽게 분리될 수 있어서 세포로부터 효율적으로 치료용 단백질을 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 벡터의 모식도 및 넉-인된 베타-카제인 (beta-casein) 유전자 사이트에서 외래 유전자 발현을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 최종적인 넉-인 백터의 모식도를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 sgRNA의 T7 엔도뉴클레아제 활성 검증 결과를 보여주는 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 벡터를 HC11 세포에 도입하고 확보된 단일 세포에서 PCR로 넉-인을 확인한 실험 결봐를 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO mRNA의 발현을 보여주는 R-PCR 및 real-time PCR 검증 결과를 보여주는 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO 단백질의 발현 결과를 보여주는 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO 단백질 발현을 ELISA로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 최종적인 넉-인 백터의 모식도를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 sgRNA의 T7 엔도뉴클레아제 활성 검증 결과를 보여주는 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 벡터를 HC11 세포에 도입하고 확보된 단일 세포에서 PCR로 넉-인을 확인한 실험 결봐를 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO mRNA의 발현을 보여주는 R-PCR 및 real-time PCR 검증 결과를 보여주는 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO 단백질의 발현 결과를 보여주는 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬 처리 후 GST-hEPO 단백질 발현을 ELISA로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 치료용 넉-인 벡터의 구축
본 발명의 일 실시예에 따라 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase; GST) 융합 치료용 단백질을 생산을 위한 넉-인 벡터를 구축하였다 (도 1 및 2). 구체적으로, pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_β-casein 3'arm 넉-인 벡터 확보하기 위해 각각의 클로닝을 수행하였다.
1-1. 마우스 β-casein 5'-아암의 클로닝
넉-인 벡터 구축을 위한 5'-아암 (arm)은 c57BL/6 마우스의 genome DNA를 주형으로 사용하고, NotI, XhoI 제한효소 site가 포함된 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 증폭하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 1 | β-casein 5 arm (NotI S) | GCGCGGCCGCGTAAGGCATACATACAACTGTTAATG | 36 |
| 2 | β-casein 5 arm (XhoI AS) | GCCTCGAGAGTAAATGTAGTCTTTTGTAAAAGG | 33 |
PCR은 Takara EX Taq polymerase (Takara, Shiga, Japan)을 이용하여 98 ℃ 10초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 2분 35 cycle의 조건에서 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.8 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였다. PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터(Promega Co., Winconsin, USA)에 ligation mix (Takara. Shiga, Japan)을 이용해 클로닝하였다. 확보한 플라스미드는 DNA 염기서열을 결정한 후 Genetyx-win (version 4.0)을 사용하여 염기서열을 확인한 결과, 5'-아암은 1,024 bp의 서열번호 3으로 확인되었다.
1-2. 마우스 β-casein 3'-아암의 클로닝
넉-인 벡터 구축을 위한 3'-아암 (arm)은 c57BL/6 마우스의 genome DNA를 주형으로 사용하고 SmaI, SalI 제한효소 site가 포함된 하기 표 2에 나타낸 서열번호 4 및 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 증폭하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 4 | β-casein 3 arm (SmaI S) | GCCCCGGGCTCATTGCCTAGGAACTATAGTACCAAC | 36 |
| 5 | β-casein 3 arm (SalI AS) | GCGTCGACATTCTTTATTGATTAATTAATAATCC | 34 |
PCR은 Takara EX Taq polymerase (Takara, Shiga, Japan)을 이용하여 98 ℃ 10초, 58 ℃ 30초, 72 ℃ 2분 35 cycle의 조건에서 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.8 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터 (Promega Co.)에 ligation mix (Takara. Shiga, Japan)을 이용해 클로닝 하여 pGEM T-easy_β casein 플라스미드를 확보하였으며, 3'-아암은 염기서열을 확인한 결과 1,015 bp의 서열번호 6으로 확인되었다.
1-3.
Glutathione S Transferase(GST)
유전자의 클로닝
GST 유전자는 pGEX-4T-3 plasmid DNA를 주형으로 사용하고 XhoI, BamHI 제한효소 site가 포함된 하기 표 3의 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 증폭하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 7 | GST (XhoI S) | GCCTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG |
32 |
| 8 | GST (BamHI AS) | GGGGATCCCAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGATCCGATTTTGGAGGATGGTC |
56 |
Solg Pfu DNA polymerase (Solgent)을 이용하여 95 ℃ 20초, 57 ℃ 40초, 72 ℃ 2분 33 cycle의 조건에서 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터 (Promega)에 클로닝 하기 위해 A tailing을 실시했다. Go Taq을 이용해 (Promega) 70 ℃ 15분 처리를 하였고 이후 pGEM T-easy 벡터에 ligation mix (Takara)을 이용해 클로닝 하여 pGEM T-easy_GST gene 플라스미드를 확보하였으며 염기서열을 확인한 결과, GST는 24 bp의 서열번호 9 (Prescission protease)를 포함하는 693 bp의 서열번호 10으로 확인되었다.
1-4. Human
EPO
유전자 클로닝
인간 간암세포주인 HepG2 세포의 RNA를 추출하여 HepG2 RNA를 주형으로 사용한 RT-PCR을 실시하여 HepG2 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. RT-PCR에는 superscript 2 (invitrogen, USA)을 이용하여 실시하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 사용하고 BamHI, EcoRV 제한효소 site가 포함 된 하기 표 4의 서열번호 11 및 12를 이용하여 PCR 증폭을 하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 11 | human EPO (BamHI S) |
GCGGATCCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCC | 36 |
| 12 | human EPO (EcoRV AS) |
GCGATATCCCATCAGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTCCCC | 38 |
98 ℃ 10초, 68 ℃ 30초, 72 ℃ 30초 33 cycle의 조건에서 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 서열번호 13의 Human EPO 유전자 (514 bp)를 확인하였으며, PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 ligation mix(Takara)을 이용해 클로닝 하여 pGEM T-easy_hEPO 플라스미드를 확보하였다.
1-5.
Enhanced green fluorescent protein (EGFP)
클로닝
EGFP marker로 쓰인 CMV-EGFP-polyA는 pBSK-tEndo-EGFP KI plasmid DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭하였다. PCR은 Takara EX Taq polymerase(Takara)을 이용하여 실시하였다. EcoRI, SmaI 제한효소 site가 포함된 하기 표 5의 서열번호 14 및 15를 이용하여 PCR 증폭을 하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 14 | EGFP (EcoRI S) |
GCGAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC | 32 |
| 15 | EGFP (SmaI AS) |
GCCCCGGGCATAGAGCCCACCGCATCCCCAG | 31 |
증폭된 PCR 산물은 0.8 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하였으며, PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터 (Promega)에 ligation mix (Takara)을 이용해 클로닝 하여 pGEM T-easy_CMV-EGFP-polyA 플라스미드를 확보하였으며, 그 염기서열은 1,583 bp의 서열번호 16으로 확인되었다.
1-6. SV40 polyA signal 클로닝
SV40 polyA는 pBKS/polyA plasmid DNA를 주형으로 하여 PCR 증폭하였다. PCR은 Takara EX Taq polymerase (Takara)을 이용하여 실시하였다. EcoRI, SmaI 제한효소 site가 포함된 하기 표 6의 서열번호 17 및 18을 이용하여 PCR 증폭을 하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 17 | SV40 polyA (EcoRV S) | GCGATATCACTTGTTTATTGCAGCTTATAATG | 32 |
| 18 | SV40 polyA (EcoRI AS) | GCGAATTCAGACATGATAAGATACATTG | 28 |
98 ℃ 10초, 62 ℃ 30초, 72 ℃ 30초 36 cycle 조건에서 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.8 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 141 bp의 서열번호 19의 SV40 polyA (소 성장 호르몬 polyA 폴리뉴클레오티드)를 증폭하였고, 증폭한 PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터 (Promega)에 ligation mix (Takara)을 이용해 클로닝 하여 pGEM T-easy_SV40 polyA 플라스미드를 확보하였다.
1-7. pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST 플라스미드 제조
전체 염기서열을 확인한 pGEM T-easy_β casein 5'arm 및 pGEM T-easy_GST를 이용하여 다음과 같은 순서로 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST 플라스미드를 제조하였다. 먼저 전제 염기 서열을 확인한 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST 플라스미드를 이용하여 NotI과 XhoI으로 절단하여 첫 번째 삽입체를 제작하고, pGEM T.easy_GST 플라스미드를 이용하여 XhoI과 BamHI으로 절단하여 두 번째 삽입체를 제작하였다. 이 삽입체들을 pBSK(-)/NotI-BamHI 벡터에 ligation mix (Takara)을 이용하여 3 fragment ligation으로 클로닝 하여 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST 플라스미드를 확보하였다.
1-8. pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO 플라스미드 제조
클로닝한 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST 플라스미드를 이용하여 BamHI과 EcoRV로 절단하여 벡터를 제작하였다. 그 다음, 동정된 pGEM T-easy_hEPO 플라스미드를 이용하여 BamH과 EcoRV로 절단하여 삽입체를 제작해 벡터에 ligation mix (Takara)을 이용하여 ligation 후 클로닝 하여 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO 플라스미드를 확보하였다.
1-9. pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA 플라스미드 제조
클로닝 한 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO 플라스미드를 이용하여 NotI, EcoRV로 절단하여 첫 번째 삽입체를 제작하고, 동정된 pGEM T-easy_SV40polyA 플라스미드를 이용하여 EcoRV과 EcoRI으로 절단하여 두 번째 삽입체를 제작하였다. pBSK/NotI-EcoRI 벡터에 ligation mix(Takara)을 이용하여 3 fragment ligation으로 클로닝 하여 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA 플라스미드를 확보하였다.
1-10. pBSK(-)_EGFP_β-casein 3'arm 플라스미드 제조
동정된 pGEM T-easy_CMV-EGFP-polyA 플라스미드를 이용하여 EcoRI, SmaI으로 절단하여 첫 번째 삽입체를 제작하고 pGEM T.easy_β-casein 3'arm 플라스미드를 이용하여 SmaI과 SalI으로 절단하여 두 번째 삽입체를 제작해 pBSK(-)/EcoRI-SalI 벡터에 ligation mix(Takara)을 이용하여 3 fragment ligation으로 클로닝 하여 pBSK(-)_EGFP_β-casein 3'arm 플라스미드를 확보하였다.
1-11. pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_β-casein 3'arm 최종 벡터 제작
상기 동정된 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA 플라스미드를 이용하여 EcoRI, SalI으로 절단하여 벡터를 제작하고 pBSK(-)_EGFP_β-casein 3'arm 플라스미드를 이용하여 EcoRI과 salI으로 절단하여 삽입체를 제작하여 ligation 후 클로닝 하여 최종 벡터인 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_β-casein 3'arm을 확보하였다.
실시예 2. pBSK(-)_mβC5‘_GST_hEPO_1 kb mβC3’ knock-in 벡터 I 제작
본 발명에서 최종적으로 사용한 넉-인 벡터는 실시예 1에서 확보한 pBSK(-)_β-casein 5'arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_β-casein 3'arm 넉-인 벡터를 사용하여 실시예 2 및 3에서 3'-arm과 선별마커를 수정하여 최종적으로 완성하였다.
실시예 2에서 제작한 pBSK(-)_mβC5’ arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_mβC 1 kb 3’arm knock-in 벡터 I은 3'arm이 약 1 kb이며 3'arm 시작 부위가 E3 target sgRNA의 절단 부위와 서열이 일치하도록 제작하였다.
먼저 넉-인 벡터 I의 3'arm은 C57BL/6의 genome DNA를 주형으로 사용하고 SmaI과 SalI 제한효소가 포함된 하기 표 7의 서열번호 20 및 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 증폭하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 20 | mouse β-casein Exon3 3’arm (SmaI S) |
gccccgggCTGAGGTAAGAGTTTATATTGAGAC | 33 |
| 21 | mouse β-casein Exon3 3’arm (SalI AS) |
gcgtccagAAGTTATATTAGCAGGTTATTAATAT | 34 |
Go taq (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 94 ℃ 30초, 58 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 min에서 33 cycle 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 1 kb의 산물은 0.8 % 아가로스 젤에서 전기영동을 통해 확인하고 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 정제한 후 pGEMⓡ-T Easy 벡터 (Promega)에 ligation하여 pGEMⓡ-T Easy_β-casein 3’ arm E3 플라스미드를 확보하였다. 확보한 plasmid는 T7과 SP6 primer를 이용하여 Solgent (Solgent, Daejon, South Korea)에 DNA sequencing을 의뢰한 후 Genetyx-win(version4.0)을 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 확인된 T-easy_β-casein 3’arm E3 플라스미드는 SmaI과 SalI 제한효소를 이용하여 절단한 후 1 kb_mβC3’arm E3를 확보하였다. 그리고 확보한 DNA를 pBSK(-)_mβC5’ arm_GST_hEPO_SV40polyA_ EGFP_1.8 kb mβC3’ arm 플라스미드의 SmaI-SalI site로 삽입하여 pBSK(-)_mβC5’arm_GST_hEPO_SV40polyA_EGFP_mβC3’arm E3 plasmid (knock-in 벡터I)을 확보하였다.
실시예 3. pBSK(-)_mβC5’_GST_hEPO_PGK_Neo_mβC3’ 넉-인 벡터 제작
PGK-neo 유전자를 포함하고 있는 pBSK(-)_mβC5’ arm_GST_hEPO_SV40polyA_PGK_Neo_mβC3’ arm knock-in 벡터를 제작하기 위해서 실시예 2에서 확보한 pBSK(-)_mβC5‘_GST_hEPO_1 kb mβC3’ 넉-인 벡터 I을 수정하여 최종적인 벡터를 완성하였다.
먼저 Neo 넉-인 벡터 확보를 위한 Neo 유전자는 PGK-neo 플라스미드를 이용한 PCR을 통하여 확보하였다. PCR은 EcoRI과 SmaI 제한효소가 포함된 하기 표 8의 서열번호 22 및 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 증폭하였다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 | bp |
| 22 | PGK_Neo(EcoRI S) | gaattcTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC | 30 |
| 23 | PGK_Neo(SmaI AS) | cccgggCCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG | 30 |
실시예 4. sgRNA 제작 및 활성 평가
4-1. sgRNA 디자인
생쥐 β-casein을 target으로 하는 sgRNA 디자인은 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 확인한 생쥐 β-casein 유전자의 염기서열 (x13484.1)과 RGEN Tools program (http://www.rgenome.net/cas-designer/)을 구매하여 sgRNA를 디자인하였다. 본 발명에서 사용된 sgRNA target 서열은 서열번호 24 및 PAM sequence는 서열번호 25로 하기 표 9에 나타내었다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 24 | sgRNA target | TACATTTACTGTATCCTCTG | 20 |
| 25 | PAM sequence | AGG | 3 |
4-2. T7 엔도뉴클레아제 어세이를 통한 CRISPR/Cas9 system의 인-비보 활성검증
In vivo 활성 검증에 이용할 sgRNA 발현 벡터는 sgRNA target 부위의 oligo와 Guide-itTM CRISPR/Cas9 System Green (Takara)를 사용하여 다음과 같이 제작하였다.
pGuide-it-ZsGreen1_E3 sgRNA 발현 벡터를 확보하기 위하여 한 쌍의 oligo를 형성한 후 선형화 된 pGuide-it-ZsGreen1 벡터에 sgRNA 타겟 부위의 oligo를 클로닝하는 과정은 Takara의 프로토콜에 따라 진행하였다. HC11 세포에서 sgRNA의 활성을 검증하기 위하여 생쥐 β-casein의 Exon 3을 타겟으로 하는 pGuide-it-ZsGreen1_E3 sgRNA 발현 벡터 7.5 μg을 세포 내에 도입하고 T7E1 assay를 아래와 같이 수행하였다. T7E1 assay에 이용할 sgRNA target 부위를 포함하는 DNA substrate는 genome DNA를 이용한 PCR을 통하여 확보하였다. PCR은 Exon 3을 포함하는 하기 표 10의 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머 서열을 KOD FX Neo (Toyobo)를 이용해 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 26 | Mouse β-casein Exon 3 (T7 Tndel S) |
GGCCATGCTATGAGTAGAGTCATAGGC | 27 |
| 27 | Mouse β-casein Exon 3 (T7 Indel AS) |
GTACTATAGTTCCTAGGCAATGAGTGTC | 28 |
PCR은 프라이머 조합에 따라 98 ℃ 10초, 64 ℃ 또는 66 ℃ 30초, 68 ℃ 30초에서 31 cycles 실시하였고 PCR 산물은 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. T7E1 assay를 위하여 세포 내에 target 위치에 따라 각각 처리한 sgRNA target DNA를 이용하여 위에 기술한 바와 같이 수행하였다. T7E1 assay의 결과는 2 % agarose gel에서 전기영동을 통해 절단된 DNA 단편을 확인하여 검증하였다 (도 3).
실시예 5. HC11 세포에 넉-인 벡터의 도입 및 세포선별
5-1. HC11 세포 배양
생쥐 유선세포인 HC11 세포는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI, HyClone, Logan, USA), 10 % fetal 소 serum (FBS, Atlas, FT.Collins, CO), 1% penicillin/streptomycin (HyClone), 0.01% gentamycin (Sigma, Missouri, US), 0.01% EGF (Gibco, Thermo Fisher, USA), 0.05% Insulin (Sigma)을 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터 (incubator)에서 배양하였다. 또한 생쥐 β-casein 유전자를 조절하기 위하여 락토제닉 (Lactogenic) 호르몬을 통한 인덕션 (induction)은 다음과 같이 수행하였다.
우선, 락토제닉 호르몬 (Lactogenic hormone) 처리를 위하여 넉-인이 확인 된 단일 세포를 6 cm dish (SPL)에 5.5 x 105 세포로 시딩 한 후 위에 기술된 HC11 세포와 동일한 조건으로 배양하였다. 그 후 100 %로 confluence 한 세포를 이틀 동안 배양한 후 배양액을 제거하여 남아 있는 혈청을 PBS로 2 번 세척하였고 다음과 같이 락토제닉 호르몬을 처리하였다. 인덕션 유도를 위한 배양액은 RPMI1640 (HyClone), 10 % FBS (HyClone), 1 % penicillin/streptomycin (HyClone), 0.01% gentamycin (Sigma), 0.05 % Insulin (Sigma), 500 μg/mL prolactin (Sigma), 10 mg/ml Dexamethasone (Sigma)을 사용하였고, 세포를 72 시간 동안 배양하였다. 또한 배양액으로부터 단백질을 회수할 경우에는 FBS를 제외한 배양액에 락토제닉 호르몬을 첨가하여 인덕션을 유도하였다.
5-2. HC11 세포에 넉-인 벡터의 도입 및 넉-인 세포 선별
넉-인 벡터가 도입된 단일 세포주를 확보하기 위하여 HC11 세포를 6 well plate (SPL)에 2.75 x 105 cells/well로 씨딩 (Seeding)하였고, 넉-인 벡터 (3 μg), pGuide_it_ZsGreen1_E3 sgRNA 발현 벡터 (1.5 μg), pRC/CMV_mDmc1 벡터 (1.5 μg), pRC/CMV_mRad51 벡터 (1.5 μg)를 도입하였다. Plasmid DNA가 도입된 세포는 EDTA-PBS를 이용하여 1회 세척한 후 0.25 % trypsin-EDTA를 처리하였다. 세포를 배양액으로 현탁하고 48 well plate의 각 well당 약 500 세포가 되도록 분주하였다. 48 well plate에 분주하여 24시간 후에 300 μg/ml의 G418 (Gibco-BRL, Waltham, USA)로 10-12일간 선별하였다. 선별된 콜로니 (colony)는 0.25% trypsin-EDTA 처리에 의해 24 well로 계대 배양하였으며 3 내지 4일 후 세포가 80 % 정도 confluence 하게 되면 6 well plate로 계대 배양하여 아래 기술한 바와 같이 세포를 회수하고 genome DNA를 분리하여 PCR 주형으로 이용하였다.
5-3. PCR에 의한 넉-인 세포의 분석
세포로부터 genome DNA를 정제하기 위하여 세포를 EDTA-PBS로 1회 세척하였고 0.25% trypsin-EDTA를 처리하였다. 그 후 세포를 배양액으로 현탁하였고 4 ℃에서 1,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 회수한 세포를 PBS로 세척하였다. 회수한 세포는 G-DEXTM IIc genomic DNA extraction kit(for cell/tissue)(iNtRON)를 이용해 genome DNA를 정제하여 PCR에 이용하였다.
5‘-arm screening PCR은 먼저 HC11 세포에서 상동유전자재조합 (HR) 조절에 의한 넉-인 벡터의 넉-인 효율은 1차와 2차 PCR로 확인하였다. 넉-인 효율 확인을 위하여 넉-인 벡터가 도입된 세포로부터 분리한 Genome DNA는 PCR을 위한 DNA 주형으로 사용되었다. 먼저 넉-인 효율의 검증을 위하여 5‘-arm screening PCR은 넉-인 벡터의 5‘-arm 외부에 있는 mβC5 CV S5 primer와 GST 유전자 위치에서 하기 표 11에 나타낸 서열번호 28 및 서열번호 29인 mβC3 GST AS9 프라이머를 제작하여 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 28 | Mouse β-casein 5'arm (mβC5 Cv S5) |
ATAAGAACTGCAGTGGGATTCTTC | 24 |
| 29 | Mouse β-casein 5'arm (mβC3 GST AS9) |
AGCATTGAAATCTCTGCACGCTC | 23 |
PCR은 SolgTM 2X Multiplex (Solgent)를 사용하여 95 ℃ 20초, 62 ℃ 40초, 72 ℃ 2분에서 25 cycles 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 1,739 bp의 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 확인하였다 (도 4). 또한 PCR을 통해 넉-인 여부를 확인한 세포는 동결 보존하였다.
2차 PCR은 1차 PCR 산물을 1/50로 희석한 것을 주형으로 이용하였고 하기 표12에 나타낸 바와 같이 서열번호 30 및 서열번호 31의 프라이머를 이용하여 nested PCR을 실시하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 30 | Mouse β-casein 5'arm (mβC5 CV S6) |
GTCTACCAATTCACTCTAGAAGTG | 25 |
| 31 | Mouse β-casein 5'arm (mβC3 GST AS7) |
ACGTATGATGGCCATAGACTGTG | 23 |
Nested PCR은 KOD FX Neo (Toyobo)를 사용하여 95 ℃ 20초, 62 ℃ 40초, 72 ℃ 2분에서 25 cycles 시행하였고, PCR 분석결과는 0.8 % 아가로스 겔에서 전기영동 하여 1388 bp PCR 산물을 확인 하였다. 또한 정량 비교를 위하여 각 DNA는 생쥐 β-casein 유전자의 Exon 7 영역으로 표준화 (normalization) 하였다. 또한 넉-인 벡터가 도입된 단일 세포주를 확보하기 위하여 선별된 세포의 넉-인 여부는 콜로니로부터 분리한 genome DNA를 이용한 PCR을 통해 확인하였다. PCR은 5’-arm screening 1차 PCR 분석과 동일한 primer 쌍을 사용하였고 SolgTM 2X Multiplex (Solgent)를 이용하여 95 ℃ 20초, 62 ℃ 40초, 72 ℃ 2분에서 33 cycles 실시하였다.
5’-arm screening PCR 분석을 통해 positive band가 확인된 단일 세포주는 동일한 genome DNA를 주형으로 사용하여 3‘ -arm screening PCR을 수행하였다. 3’ -arm screening PCR은 하기 표 13과 같이 Neo 유전자에 위치한 서열번호 32 (Neo 3-4 sense primer) 및 3’-arm 외부에 있는 서열번호 33 (mβC3’ arm AS1 primer)를 제작하여 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 32 | Mouse β-casein 3'arm (Neo 3-4 S) |
CGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCA | 30 |
| 33 | Mouse β-casein 3'arm (mβC3'(outside (밖)) arm) |
GTTTACCTCATTGATATGTTCAACAGATTC | 30 |
PCR은 SolgTM 2X Multiplex (Solgent)를 사용하여 95 ℃ 20초, 62 ℃ 40초, 72 ℃ 2분에서 33 cycle 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 1461 bp의 산물은 0.8 % 아가로스 겔에서 전기 영동하여 확인하였다.
Screening PCR을 통해 넉-인이 확인된 단일 세포주는 homo와 hetero knock-in 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 targeted와 non-targeted PCR을 수행하였다. PCR은 하기 표 14의 서열번호 34 (mβC5 CV S5 primer) 및 서열번호 35 (mβC3’arm AS2 primer)을 이용하였고,KOD Fx Neo (Toyobo)를 사용하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 34 | Targeted and non-targeted (mβC5 CV S5) | ATAAGAACTGCAGTGGGATTCTTC | 24 |
| 35 | Targeted and non-targeted (mβC5'arm (inner(안)) AS2) | TGCAAGCCAGCCTAGCTACTATA | 23 |
94 ℃ 15초, 74℃ 5분 5 cycles, 94 ℃ 15초, 72 ℃ 5분 5 cycles, 94 ℃ 15초, 70 ℃ 5분 5 cycles, 94 ℃ 15초, 68 ℃ 5분 20 cycles, 68 ℃ 7분 조건에서 수행하였다. PCR 분석 결과는 0.8 % 아가로스 겔에서 전기 영동하여 targeted size는 4,620 bp, non-targeted size는 1,943 bp의 PCR 산물을 확인하였다.
실시예 6. 넉-인 세포로부터 치료용 단백질 유전자의 발현 검증
6-1.RT-PCR과 real-time PCR에 의한 mRNA 발현 분석
HC11 세포로부터 total RNA를 분리하기 위해 EDTA-PBS를 이용하여 세포를 1회 세척하였고, 0.25 % trypsin-EDTA를 처리하였다. 그 다음 세포를 배양액으로 현탁하였고, 1,000 rpm에서 5분동안 4 ℃에서 원심분리하여 PBS로 세척하였다. 회수한 세포는 Rneasy mini kit (QIAgen)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA 합성은 3 ug의 total RNA를 주형으로 이용하였고 제조사의 프로토콜에 따라 하기 표 15의 서열번호 36, 37 (random primer) 및 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 36 | GST-hEPO fro RT-PCR (GST RT PCR S1) |
TTAGCAAGCTACCTGAAATGCTG | 23 |
| 37 | GST-hEPO fro RT-PCR (hEPO RT PCR AS1) |
AAGGCCACTGACGGCTTTATCC | 22 |
세포에서 해당 유전자의 발현을 확인하기 위하여 기술된 바와 동일하게 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)은 하기 표 15의 서열번호 38 및 서열번호 39을 이용하여 KOD Fx neo(Toyobo) 또는 SolgTM 2X Multiplex(Solgent)를 사용하여 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 38 | GST_hEPO for real-time PCR (mβC GST qPCR S1) | GAGTCTCCAAAGTGAAGGAGGCTATGG | 27 |
| 39 | GST_hEPO for real-time PCR (mβC hEPO qPCR AS1) |
GGTTCTCAACAGACCAATTAAATCATAGT | 29 |
PCR은 98 ℃ 10초, 64 ℃ 30초, 68 ℃ 1분 30초에서 28 cycles 또는 95 ℃ 20초, 64 ℃ 40초, 72 ℃ 1분에서 33 cycles 실시하였다. RT-PCR 결과는 2% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다.
G418 선별을 통해 선별된 단일 세포에서 락토제닉 호르몬을 통해 인덕션을 유도하였을 때 사람 EPO 유전자의 상대적인 mRNA 발현 수준 확인하기 위하여 Quantitative real-time PCR을 수행하였다. RT-qPCR은 10 μl의 TOPrealTM qPCR 2X PreMix (Enzynomics, Daejeon, Korea), 20 ng cDNA, 하기 표 17에 서열번호 40 및 41으로 나타낸 10 pmole의 primer 쌍을 이용하여 총 20 μl volume으로 수행하였다.
| 서열번호 | 서열 | 서열 | bp |
| 40 | m.Rplp0 for real-time PCR (S) | cgacctggaa gtccaacta | 19 |
| 41 | m.Rplp0 for real-time PCR (AS) | ATCTGCTGCATCTGCTTG | 18 |
넉-인 단일 세포에 락토제닉 호르몬을 처리하여 GST-hEPO mRNA의 발현을 확인한 결과, 넉-인 된 세포는 GST-hEPO mRNA의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
6-2. 웨스턴 블랏에 의한 단백질 발현 분석
넉-인 벡터가 도입된 단일 세포로부터 GST-hEPO 단백질 발현을 확인하기 위하여 세포를 회수하여 35 μl의 PRO-PREPTM protein extraction solution(iNtRON)를 첨가하여 얼음 위에서 5분 간격으로 20분 동안 볼텍싱 (vortexing) 하였다. 그 다음, 세포를 4 ℃ 13,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 1.5 ml tube에 옮겨 단백질을 추출하였다. 락토제닉 호르몬을 통해 인덕션을 유도한 단일 세포의 배양액으로부터 단백질을 추출할 경우에는 배양액을 회수하여 15 ml tube에 옮겨 1,000 rpm에 5분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리한 후 상층액은 새로운 15 ml tube에 옮기고 1.5 ml tube에 1 ml씩 분주하였다. 분주한 1 ml의 배양액은 250 μl의 100% Trichloroactic Acid (TCA)를 첨가하여 얼음 위에서 10분 동안 반응하였다. 이후 배양액은 13,000 rpm, 4 ℃에서 20분 동안 원심 분리 한 후 상층액을 제거하였고, 200 μl의 100 % acetone을 첨가한 후 13,000 rpm 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 TCA를 제거하였다. 100 % acetone을 처리하여 단백질에 남아있는 TCA를 제거하는 과정은 3 반복하였고 tube의 뚜껑을 열어 95 ℃에서 5분 동안 반응하여 acetone을 증발시켜주었다. Acetone이 증발된 tube에 30 μl의 Alkaline SDS-PAGE sample buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 세포와 배양액으로부터 추출한 50 μg의 단백질 추출물은 60 mA에서 1.5 시간 동안 12 % SDS-PAGE gel에서 전기영동 하였으며, polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 80V, Tris-glycine buffer에서 2 시간동안 트랜스퍼 하였다. 단백질이 트랜스퍼 된 멤브레인은 5% skim milk가 함유된 TBS-T (Tris-buffered salin with 0.1% Tween 20)에 실온에서 2시간 30분 동안 blocking을 한 후, 1차 항체 반응을 위하여 mouse monoclonal anti-EPO (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)는 5% skim milk가 함유된 TBS-T에 1:1000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 16시간동안 반응하였다. 2차 항체 반응을 위하여 1차 항체와 16시간 동안 반응시킨 membrane은 TBS-T로 3번 세척한 후 2차 항체는 m-IgGk BP-HRP (sc516102)를 5 % skim milk가 함유된 TBS-T에 1:2000으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 단백질 발현 확인을 위하여 membrane은 TBST로 세 번 세척한 후, EPO 단백질을 EZ-Western Lumi Pico kit(Dogen, Seoul, Korea)를 이용하여 detection하였다. 동일한 단백질 양을 전기 영동하였는지 확인하기 위하여 β-actin 항체 (Santa Cruz, sc-47778)를 이용하였다 (도 6).
6-3. ELISA에 의한 분비 단백질 발현 분석
사람 EPO 단백질의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 분석은 사람 EPO ELISA kit (abcam, Cambridge, England)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 진행하였다. 75 ul의 샘플 diluent에 25 ul의 샘플을 섞어 희석하여 주었고, 희석한 sample 100 ul를 분석에 이용하였다. SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader(Biotek, Winooski, USA)를 이용하여 450 nm의 파장에서 항원에 결합하는 발색 효소의 활성을 측정하여 사람 EPO의 존재 여부와 양을 측정하였다 (도 7).
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Methods for producing Glutathione-S-Transferase fusion
therapeutic protein in knock-in cell
<130> PN220069
<160> 41
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-casein 5 arm (NotI S)
<400> 1
gcgcggccgc gtaaggcata catacaactg ttaatg 36
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-casein 5 arm (XhoI AS)
<400> 2
gcctcgagag taaatgtagt cttttgtaaa agg 33
<210> 3
<211> 1024
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'-arm
<400> 3
gcggccgcgt aaggcataca tacaactgtt aatgaaagag agttaacaca aaagactgaa 60
gagagttgtg agctgaagac cacggtggct gcagctgaag tctgagtgta gtgtttagta 120
atagtattta agggccagag tagatcttga cttgttaact gactaatctg ttactaattc 180
ttcacttcat tcacaggact tgacagccat gaaggtcttc atcctcgcct gccttgtggc 240
ccttgctctt gcaagagagg tgtgtaaaga agatatagag aaaagtctgc ttagctacac 300
acagtagcag cagtgagctc ttaatgtata gtcaacagag agtttggaat ctgtttattt 360
aatcactgct tctttgagaa tcacagtgtc tcaaagttcc tgtagggtct ccaagctgga 420
acaaatgctt actgtattac agtatcacaa cttctctaac aacaacaaaa ccaaaaccaa 480
aaataagaaa tgaaacaagg caatagaaat gcatcgagta aaaatgactt tgcaaaagta 540
gactcacatg tgcagcacat gtgcagcttg ggtatctcat tgtgatgatc aagtgcaggc 600
atctctttag gtgagcaggt gacgtcttac tgtgcctctc caaagaaata atcagaggag 660
gaaacataac caagaattgt ggccatgcta tgagtagagt cataggcata ataaaaaaaa 720
aagtgtttag tagaaattaa agtaactttt gccactcatc aaacattatg tacacttaga 780
aaataaaata atatagtaat ttatataata tagtaatgta ccaaaacaaa tttgttaaaa 840
gatcaaagag agtgtaaata taagttttca agactatgaa agccatatat ctttttttat 900
tttctgaaag aggtaaaaga catgaaagcc aaatggaaag tatgtttagt aacaaagtag 960
atatagtaac taatgtattt tgtctgtttg tttcctttta caaaagacta catttactct 1020
cgag 1024
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-casein 3 arm (SmaI S)
<400> 4
gccccgggct cattgcctag gaactatagt accaac 36
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-casein 3 arm (SalI AS)
<400> 5
gcgtcgacat tctttattga ttaattaata atcc 34
<210> 6
<211> 1015
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'-arm
<400> 6
cccgggctga ggtaagagtt tatattgaga caaatttccc actctaaaat tactacattt 60
ttaatgatct tgaagtccta attggatata taatctaaca tatatatgta tgtatttttg 120
tttacagact gatagtattt ccagtgaggt aaggcaattg tctctcagag gcagtaaatg 180
tcatctttct tttgagctaa atcatgttac tcagactcta atatatccct tacatgatat 240
taggggcagg aaagtatctg gatagcttct tgttctaatc gccatttgtt tcttatttga 300
aatgtcatca ccacctcttc aacctctctt tattttagaa gctcacaatc ttattcactg 360
ccatgagctc tccctaatct gacctggatt attaatattc actgtgtgcc ttttgacact 420
cattgcctag gaactatagt accaactaaa gactactaga aatgacatgc ctattctata 480
gtagctaggc tggcttgcag aaggacatat ttggttatta aagttgtcat ttacataaat 540
aagaatcaac aggatacaat gaaatcttaa atttacctga gagtatcaca tgaaatactt 600
accatctctt taccatgaaa tacttatcat gtgtctatta ttttctcgtc acaatgctgc 660
aaatacctca gaggaagtat tcatttctca tggcttattt gaagcctagc atagtagcaa 720
gcaaactcat agtgactact gtaatatatt gccattagtc tgtattttcc attatgtttg 780
tgtgttttga tttaagaatg gaatttaaag ttcacctgta gacagagaaa gaattagcat 840
tgtttagatg tctctttgta tactctgctc actaatttct ttttctctct ggactgcact 900
cacttttctt gtaaacagta ggcttataca atgtgtttta aataatttaa atgtaagttt 960
catcaaatgt cccattatat attatattaa taacctgcta atataacttg tcgac 1015
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST (XhoI S)
<400> 7
gcctcgagat gtcccctata ctaggttatt gg 32
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST (BamHI AS)
<400> 8
ggggatccca ggggcccctg gaacagaact tccagatccg attttggagg atggtc 56
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prescission protease
<400> 9
ctggaagttc tgttccaggg gccc 24
<210> 10
<211> 693
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Glutathione-S-Transferase(GST)
<400> 10
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tcc 693
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human EPO (BamHI S)
<400> 11
gcggatccgc cccaccacgc ctcatctgtg acagcc 36
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human EPO (EcoRV AS)
<400> 12
gcgatatccc atcagtcccc tgtcctgcag gcctcccc 38
<210> 13
<211> 514
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human EPO
<400> 13
gggatccgcc ccaccacgcc tcatctgtga cagccgagtc ctggagaggt acctcttgga 60
ggccaaggag gccgagaata tcacgacggg ctgtgctgaa cactgcagct tgaatgagaa 120
tatcactgtc ccagacacca aagttaattt ctatgcctgg aagaggatgg aggtcgggca 180
gcaggccgta gaagtctggc agggcctggc cctgctgtcg gaagctgtcc tgcggggcca 240
ggccctgttg gtcaactctt cccagccgtg ggagcccctg cagctgcatg tggataaagc 300
cgtcagtggc cttcgcagcc tcaccactct gcttcgggct ctgggagccc agaaggaagc 360
catctcccct ccagatgcgg cctcagctgc tccactccga acaatcactg ctgacacttt 420
ccgcaaactc ttccgagtct actccaattt cctccgggga aagctgaagc tgtacacagg 480
ggaggcctgc aggacagggg actgatggga tatc 514
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP (EcoRI S)
<400> 14
gcgaattcta gttattaata gtaatcaatt ac 32
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP (SmaI AS)
<400> 15
gccccgggca tagagcccac cgcatcccca g 31
<210> 16
<211> 1583
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV-EGFP-polyA
<400> 16
gaattctagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420
acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600
gcgctaccgg actcagatcc atcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 660
gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 720
ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 780
ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 840
gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 900
aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 960
ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 1020
tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 1080
tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 1140
acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 1200
acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 1260
accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 1320
ctctcggcat ggacgagctg tacaagtggg cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1380
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1440
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1500
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1560
atgcggtggg ctctatgccc ggg 1583
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyA (EcoRV S)
<400> 17
gcgatatcac ttgtttattg cagcttataa tg 32
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyA (EcoRI AS)
<400> 18
gcgaattcag acatgataag atacattg 28
<210> 19
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyA
<400> 19
gatatcactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 60
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 120
tatcttatca tgtctgaatt c 141
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse B-casein Exon3 3'arm (SmaI S)
<400> 20
gccccgggct gaggtaagag tttatattga gac 33
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse B-casein Exon3 3'arm (SalI AS)
<400> 21
gcgtccagaa gttatattag caggttatta atat 34
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGK_Neo(EcoRI S)
<400> 22
gaattctacc gggtagggga ggcgcttttc 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PGK_Neo(SmaI AS)
<400> 23
cccgggcctc agaagaactc gtcaagaagg 30
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA target
<400> 24
tacatttact gtatcctctg 20
<210> 25
<211> 3
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAM sequence
<400> 25
agg 3
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein Exon 3 (T7 Tndel S)
<400> 26
ggccatgcta tgagtagagt cataggc 27
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein Exon 3 (T7 Indel AS)
<400> 27
gtactatagt tcctaggcaa tgagtgtc 28
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein 5'arm (mBC5 CV S5)
<400> 28
ataagaactg cagtgggatt cttc 24
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein 5'arm (mBC3 GST AS9)
<400> 29
agcattgaaa tctctgcacg ctc 23
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein 5'arm (mBC5 CV S6)
<400> 30
gtctaccaat tcactctaga agtg 24
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein 5'arm (mBC3 GST AS7)
<400> 31
acgtatgatg gccatagact gtg 23
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B--casein 3'arm (Neo 3-4 S)
<400> 32
cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse B-casein 3'arm (mBC3'(outside) arm)
<400> 33
gtttacctca ttgatatgtt caacagattc 30
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Targeted and non-targeted (mBC5 CV S5)
<400> 34
ataagaactg cagtgggatt cttc 24
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Targeted and non-targeted (mBC3'arm (inner) AS2)
<400> 35
tgcaagccag cctagctact ata 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST-hEPO fro RT-PCR (GST RT PCR S1)
<400> 36
ttagcaagct acctgaaatg ctg 23
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST-hEPO fro RT-PCR (hEPO RT PCR AS1)
<400> 37
aaggccactg acggctttat cc 22
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST_hEPO for real-time PCR (mBC GST qPCR S1)
<400> 38
gagtctccaa agtgaaggag gctatgg 27
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GST_hEPO for real-time PCR (mBC hEPO qPCR AS1)
<400> 39
ggttctcaac agaccaatta aatcatagt 29
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> m.Rplp0 for real-time PCR (S)
<400> 40
cgacctggaa gtccaacta 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> m.Rplp0 for real-time PCR (AS)
<400> 41
atctgctgca tctgcttg 18
Claims (12)
- 다음을 포함하는 글루타티온-S-트랜스페라제 (Glutathione-S-Transferase; GST) 융합 치료용 넉-인 (Knock-in) 벡터:
베타-카제인 (β-casein) 유전자의 프로모터 서열인 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열;
치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
베타-카제인 유전자의 터미네이터 서열인 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열. - 제1항에 있어서, 상기 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 엑손 2 및 3을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 Human EPO (Erythropoietin) 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 넉-인 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 글루타티온-S-트랜스페라제 코딩 뉴클레오타이드 서열은 3'말단에 서열번호 9의 정밀 프로테아제 (Prescission protease) 염기서열을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 Human EPO 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 치료용 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단에 SV40 polyA 뉴클레오타이드 및 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone; BGH) polyA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 선별마커로 항생제 내성 유전자 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 형광 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 3'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 5'-아암 (arm) 코딩 뉴클레오타이드 서열은 엑손 4를 포함하는 것인, 넉-인 벡터.
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| KR1020220057290A KR20230157727A (ko) | 2022-05-10 | 2022-05-10 | 넉-인된 세포에서 글루타티온-s-트랜스페라제 융합 치료용 단백질 생산 방법 |
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