KR101636885B1 - 소 베타-카제인과 융합된 바이오 신약용 단백질 생산을 위한 넉-인 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료용 단백질의 대량 생산을 위하여, ⅰ) 5'-아암으로서, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 4,840 bp 크기의 단편; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 치료용 단백질(therapeutic protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 3'-아암으로서, 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는, 형질전환 소에서의 외래 단백질 생산용 넉-인(knock in) 벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 형질전환 소로부터 바이오 신약용 단백질을 포함하는 외래 단백질 생산을 위한 넉-인용 벡터 및 이를 이용한 외래 단백질 생산방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 소 베타-카제인과 융합된 외래 단백질 생산을 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용한 외래 단백질 생산방법에 관한 것이다.
유전자 적중(gene targeting) 방법은 상동유전자 재조합에 의하여 특정 염색체 위치에 변이된 유전자를 도입하는 기술로 넉-아웃(knock-out)과 넉-인(knock-in)으로 구별되며 일반적으로 넉-인을 하면 삽입된 외래 유전자는 발현되지만 외래 유전자가 도입된 특정 유전자는 넉-아웃되는 것으로 알려져 있다. 이러한 넉-아웃은 동물의 표현형에 영향을 줄 수 있어 특정 유전자를 넉-아웃시키지 않고 외래 유전자를 넉-인시켜 발현시킬 수 있는 시스템의 개발이 필요하며 일반적으로 가축에 있어서 유전자 적중은 체세포에 유전자 적중용 벡터(knock-out 또는 knock-in 벡터)를 도입하여 상동유전자 재조합이 일어난 세포를 선별한 다음 이들 세포를 이용하여 복제동물을 생산하는 방법으로 형질전환 동물을 생산하고 있으나 체세포에 있어서 상동유전자 재조합 효율은 생쥐의 줄기세포를 이용하는 것보다 매우 낮은 것으로 보고되고 있다. 또한 대가축인 젖소에 있어서 넉-인 방법에 의하여 바이오신약을 생산할 수 있는 형질전환 가축은 아직 보고된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 소 체세포의 내재적 유전자의 넉-아웃 없이도 외래 단백질을 생산할 수 있는 넉-인 벡터 및 상기 넉-인 벡터를 이용한 상기 외래 단백질의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5'-아암;
ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 치료용 단백질(therapeutic protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3'-아암으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는, 형질전환 소에서의 외래 단백질 생산용 넉-인(knock in) 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 넉-인 벡터로 형질감염된 소 체세포 중 베타-카제인을 암호화하는 게놈 DNA 상에 상기 넉-인 벡터에 포함되어 있는 유전자 컨스트럭트가 제대로 넉-인된 형질전환 소 체세포를 선별하는 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계;
상기 소 체세포의 핵을 소 난자의 핵과 치환하여, 핵치환 난자를 제조하는 소 난자 핵치환 단계;
상기 핵치환 난자를 발생시켜 형질전환 넉-인 소를 제조하는 형질전환 넉-인 소 제조단계; 및
상기 넉-인 소 중 암소를 사육하여 우유로부터 상기 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 형질전환 넉-인 소로부터 외래단백질의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암, ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 엔도스타틴(endostatin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암을 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계;
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계;
상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
상기 게놈 DNA를 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3'바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 단계;
상기 1차 PCR에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 단계; 및
상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별하는 단계를 포함하는, 상기 넉-인 벡터가 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역에 제 위치로 삽입됨으로써 소 베타-카제인 발현이 넉-아웃 되지 않고, 인간 엔도스타틴이 발현되는 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1센스 프라이머; 서열번호 19로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1안티센스 프라이머; 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2센스 프라이머; 및 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2안티센스 프라이머를 포함하는 소 베타-카제인의 발현이 넉-아웃되지 않고 소 베타-카제인 단백질과 인간 엔도스타틴 단백질이 융합된 형태로 발현되도록 형질전환된, 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법에 의해 선별된 베타-카제인 게놈 DNA로 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자가 넉-인되고, 상기 베타-카제인을 암호화하는 유전자는 넉-아웃이 되지 않은 넉-인 형질전환 소 체세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 소의 난자의 핵을 상기 형질전환 소 체세포의 핵으로 치환시켜 제조된 핵치환 난세포를 발생시켜 태어난 인간 엔도스타틴를 우유로 분비하는 형질전환 복제소가 제공된다. 상기 소는 홀스타인(holstein) 품종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암, ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 엔도스타틴(endostatin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암을 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계; 및
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계를 포함하는, 넉-인 형질전환 체세포의 제조방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 소 베타-카제인 단백질과 인간 엔도스타틴 단백질이 융합된 형태로 발현되어 유즙으로 분비될 수 있는 형질전환 소를 이용한 바이오신약용 단백질 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다
도 1은 소 베타-카제인 엑손 7을 이용한 넉-인 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 F2A 펩타이드 합성을 위한 DNA 염기서열과 아미노산 서열 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 베타-카제인을 인간 엔도스타틴 발현 넉-인 벡터에 클로닝하고 발현을 확인한 겔 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 베타-카제인 유전자의 엑손 7 부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위(A), T7 endonuclease 분석을 나타낸 겔 사진(B) 및 TALEN 2 클론의 서열 분석을 나타낸 그림이다(C).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 1차 3'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 유전체 DNA을 이용하여 2차 3'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 5'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 F2A 펩타이드 합성을 위한 DNA 염기서열과 아미노산 서열 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 소 베타-카제인을 인간 엔도스타틴 발현 넉-인 벡터에 클로닝하고 발현을 확인한 겔 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 소 베타-카제인 유전자의 엑손 7 부분을 절단할 수 있는 TALEN의 결합 부위(A), T7 endonuclease 분석을 나타낸 겔 사진(B) 및 TALEN 2 클론의 서열 분석을 나타낸 그림이다(C).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 1차 3'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 유전체 DNA을 이용하여 2차 3'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 넉-인 세포의 5'-아암을 PCR 동정한 겔 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "넉-아웃 또는 knock-out"은 특정 유전자 위치에 상동유전자 재조합에 의하여 변이된 유전자를 도입하여 특정 유전자의 발현이 일어나지 않도록 하는 것을 말한다.
본 문서에서 사용되는 "넉-인 또는 knock-in"은 특정 유전자의 위치에 발현 시키고자 하는 외래 유전자를 상동유전자 재조합에 의하여 도입하는 것으로 삽입된 외래 유전자는 특정 유전자의 프로모터(promoter)와 인핸서(enhancer)를 포함하는 유전자 발현조절 염기서열 전체를 이용하여 발현할 수 있다. 즉, 외래 유전자는 그 위치에 존재하는 특정 유전자의 발현 양만큼 발현될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "Transcription activator-like effector nucleases(TALENs)"는 인공핵산 분해효소이며 특정 DNA 결합단백질로 특정 DNA 염기배열을 인식할 수 있는 능력을 가지고 있어서 15 bp을 인식할 수 있는 TALEN DNA 결합 도메인과 Fold 뉴클라아제 절단 도메인으로 구성된 융합단백질을 고안하여 이를 체세포 또는 수정란에 도입하면 특정 DNA을 절단하는 능력이 있는 것으로 보고되고 있다. TALEN을 이용하여 보다 효율적으로 유전자 적중된 동물을 생산하고 있으나 대가축인 소에 있어서 젖소 β-casein 유전자의 특정 부위를 절단하여 상동유전자 재조합에 의하여 바이오신약 생산 특정 유전자를 도입한 결과는 보고되고 있지 않다.
본 문서에서 사용되는 "엔도스타틴(endostatin)"은 type XVⅢ collagen에서 유래된 20 kDa의 c-말단 단편으로서 암 주변 조직의 혈관 신생을 억제하여 혈액을 암 조직으로 공급하는 영양분과 산소 유입을 차단함으로써 항암작용을 나타내며 동물실험에서 부작용이 없는 것으로 알려지고 있다. 마우스에서 엔도스타틴은 20 mg/kg/day로 투여가 필요하며 오랜 기간 투여가 필요하므로 다량의 엔도스타틴의 생산에 필수적이다.
본 문서에서 사용되는 "넉-인 벡터(knock-in vector)"는 유전자 적중(gene targeting)에 사용되는 벡터로서, 특정 유전자를 넉-아웃(knockout)시키고 그 유전자의 위치에 정확하게 발현시키고자 하는 외래 유전자를 도입하는데 사용되는 벡터이다. 넉-인 벡터에 의하여 삽입된 외래 유전자는 삽입된 위치의 게놈 상에 위치한 유전자 발현조절 영역의 모든 부분을 이용할 수 있으므로, 원래 그 위치에 존재하는 유전자의 발현량 만큼 발현될 가능성이 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5'-아암;
ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 치료용 단백질(therapeutic protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3'-아암으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는, 형질전환 소에서의 외래 단백질 생산용 넉-인(knock in) 벡터가 제공된다.
상기 넉-인 벡터에 있어서, 상기 외래 단백질은 치료용 단백질일 수 있고, 상기 치료용 단백질은 인간 엔도스타틴(endostatin); 락토페린(lactoferrin); 인슐린; 인간 성장 호르몬(human growth hormone) 또는 소 성장 호르몬(bovine growth hormone)을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출인자(growth hormone-releasing factor); 부갑상선 호르몬(parathyroid honnone); 갑상선자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone); 여포자극 호르몬(follicle stimulating hormone); 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone); 인터페론 알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마; 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor); 호르몬 수용체 또는 성장인자를 위한 수용체; 인테그린(integrin) A 또는 D 단백질; 류머티스성 인자(rheumatoid factors); 골 유래 신경 영양인자(bone-derived neutrophic factor; BDNF)와 같은 신경 영양인자(neurotrophic factor); 뉴로트로핀(neurotrophin), NGF-베타와 같은 신경 성장인자(nerve growth factor); 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor); FGF 또는 bFGF와 같은 섬유아세 포 성장인자(fibroblast growth factor); 상피세포 성장인자(epidermal growth factor); TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장인자(transformation growth factor); 인슐린(Insulin) 또는 인슐린 유사 성장인자(IGF-1 및 IGF-2); 각질세포 성장인자(keratinocyte growth factor); 인슐린유사 성장인자-결합단백질(insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBP); CD-3 CD-4, CD-8, 또는 CD-19와 같은 CD 단백질; 에리트로포이에틴(erythropoietin); 골-유도 인자(bone-inducing factors); 항체독소(immunotoxins); 골형성 단백질 (bone morphogenetic protein; BMP); M-CSF, GM-CSF 또는 G-CSF 등과 같은 콜로니 자극인자(colony stimulating factor); 위 리파아제(gastric lipases), 췌장 리파아제(pancreatic lipases) 또는 담즙 리파아제(biliary lipases), 엘라스타아제 (elastases), 알파-1 항 트립신(α-1 anti-trypsin)과 같은 단백질 분해효소 저해제(protease inhibitors); 프로테아제; 옥시다아제; 파이타아제(phytases); 키티나아제(chitinases); 인베르타제(invertase); 셀룰라아제(cellulases); 자일라나제(xylanases); 콜라겐과 같은 구조 단백질; 락토페린과 같은 트랜스페린; 헤모글로빈 또는 인간 알부민과 같은 혈액 단백질; 혈액 보조인자(blood cofactors), 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 또는 인자 Ⅹ와 같은 혈액응고인자, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrands Factor)와 같은 용고인자; 단백질 C와 같은 항-응고인자 (anti-coagulation factors); 심방 나트륨 배출 인자(atrial natriuretic factor); 레닌(renin); 칼시토닌(calcitonin); 글루카곤(glucagon); 폐표면 활성제(pulmonary surfactant); 유로키나아제(urokinase) 또는 조직특이적 플라스미노겐 활성화제(tissue-specific plasminogen activator)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 트롬빈(thrombin); 트롬보포이에틴(thrombo- poietin); 조혈 성장인자(haematopoietic growth factor), 알파- 또는 베타-종양괴사인자(alpha- or beta-tumour necrosis factor); 엔케팔리나제(encephalinase); MIP-1(human macrophage inflammatory protein-1); 인간 혈청 알부민(hwnan serum albumin)과 같은 혈청 알부민; 릴랙신(relaxin); DNase; 사이토카인(cytokine); 케모카인(chemokines); IL-1 내지 IL-1O과 같은 인터류킨(interleukins); 항체, 항체 및 항원의 단편; 또는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase)와 같은 항산화제(antioxidant) 등일 수 있다.
상기 넉-인 벡터에 있어서, 상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있고 상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자의 3'-말단에 BGH(bovine growth hormone) polyA 신호가 추가로 연결될 수 있으며, 상기 BGH polyA 신호는 서열번호 5로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이때, BGH polyA는 본 발명의 일 실시예에 따른 넉-인 벡터에 포함된 치료용 단백질의 안정적인 발현을 위해서 추가될 수 있다. 또한 본 서열은 BGH polyA신호로 한정하지 않으며 SV40 polyA 신호 등도 이용될 수 있다.
상기 넉-인 벡터에 있어서, 양성 선별마커(positive selectable marker)와 음성 선별마커(negative selectable marker)를 각각 또는 함께 포함할 수 있다. 상기 양성 선별마커는 neo 유전자, puromycin 저항성 유전자 또는 zeocin 저항성 유전자일 수 있다.
상기 넉-인 벡터에 있어서, 상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자의 5'-말단에 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 푸린-F2A 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 넉-인 벡터로 형질감염된 소 체세포 중 베타-카제인을 암호화하는 게놈 DNA 상에 상기 넉-인 벡터에 포함되어 있는 유전자 컨스트럭트가 제대로 넉-인된 형질전환 소 체세포를 선별하는 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계;
상기 소 체세포의 핵을 소 난자의 핵과 치환하여, 핵치환 난자를 제조하는 소 난자 핵치환 단계;
상기 핵치환 난자를 발생시켜 형질전환 넉-인 소를 제조하는 형질전환 넉-인 소 제조단계; 및
상기 넉-인 소 중 암소를 사육하여 우유로부터 상기 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 형질전환 넉-인 소로부터 외래단백질의 생산방법이 제공된다.
상기 생산방법에 있어서, 상기 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계는
ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암, ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 엔도스타틴(endostatin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암을 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하고, 상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별한 후, 상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하여, 이를 주형으로 하여 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 반응을 수행한 후, 상기 1차 PCR 반응에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 반응 수행한 뒤, 상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별함으로써 수행될 수 있다.
상기 생산방법에 있어서, 상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합이 유도될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암, ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 엔도스타틴(endostatin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암을 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계;
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계;
상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
상기 게놈 DNA를 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 단계;
상기 1차 PCR에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 단계; 및
상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별하는 단계를 포함하는, 상기 넉-인 벡터가 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역에 제 위치로 삽입됨으로써 소 베타-카제인 발현이 넉-아웃 되지 않고, 인간 엔도스타틴이 발현되는 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법이 제공된다.
상기 선별방법에 있어서, 상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합이 유도될 수 있다.
상기 방법에 사용되는 넉-인 벡터는 생산하고자 하는 외래 단백질의 생산 및분비가 베타-카제인과 같은 효율로 일어날 수 있도록 고안된 것으로, 5'-아암(arm)이 4.8 kb로 구성되어 상동 유전자 재조합이 더욱 잘 일어날 수 있도록 고안되어 있으며, 3'-아암은 약 1.8 kb로서 상동 유전자 재조합이 일어난 세포를 PCR로 동정하는데 적절한 길이를 갖도록 고안되었다.
상기 넉-인 벡터는 소 베타-카제인이 소포체와 골지체를 거쳐 분비되는 경로를 따라 정상적으로 분비될 수 있도록, 소 베타-카제인 엑손 7의 말단까지 포함하는 것을 특징으로 갖는다. 소 베타-카제인 엑손 2 에서부터 엑손 7를 포함하고 푸린-F2A 펩타이드의 암호화 핵산서열, 및 외래 단백질을 암호화하는 핵산서열을 이용하여 mRNA가 합성되고, 이렇게 합성된 mRNA로부터 단백질의 합성은 엑손 2에 있는 ATG 위치로부터 시작되며, 푸린-F2A의 아미노산 서열과 외래 단백질의 아미노산 서열이 연결된 상태로 합성된다. 또한, 단백질 합성 후, 푸린-F2A 서열의 앞쪽은 푸린 단백질 분해효소에 의하여 절단되며 F2A 쪽은 단백질 합성시 리보솜에서 자가절단(self cleavage)되어 치료용 단백질이 분리되기 때문에, 상기 벡터에 삽입되어 있는 외래 단백질은 소 베타-카제인 mRNA만큼 합성되고 소포체-골지체를 거치는 단백질 분비 경로를 따르기 때문에 기존 방법보다 보다 효율적으로 베타-카제인 신호서열을 이용하여 치료용 단백질을 유선에서 분비되도록 할 수 있다, 그러나, 이러한 방법에 의해 형질전환에 성공한 형질전환체 중 실제 제 위치(소 베타-카제인 유전자의 엑손 7)에 외래 단백질이 발현될 수 있도록 삽입된 넉-인 형질전환체의 비율은 매우 낮았다. 따라서, 외래 단백질을 암호화하는 유전자가 제대로 삽입된 넉-인 형질전환체를 선별하는 것은 무엇보다도 중요하다.
이에 본 발명자들은 제대로 된 넉-인 형질전환체를 선별하기 위해 예의 노력한 결과 서열번호 18로 기재되는 제1센스 프라이머 및 서열번호 19로 기재되는 제1안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행할 경우, 넉-인이 일어난 형질전환체에서는 2.27 kb 크기의 밴드를 확인할 수 있었고, 제대로 넉-인이 일어나지 않은 형질전환체에서는 이러한 밴드를 확인할 수 없었다. 다만, 2.27 kb 크기의 밴드가 나타난 양성 콜로니 중 서열번호 20로 기재되는 제2센스 프라이머 및 서열번호 21로 기재되는 제2안티센스 프라이머로 게놈 DNA를 증폭한 결과 일부 콜로니에서는 6.0 kb의 예상되는 밴드가 나타나지 않아, 넉-인 유전자카세트의 3'-말단 인접 핵산서열만을 대상으로 한 PCR만으로는 정확한 넉-인 여부의 확인이 쉽지 않음을 알 수 있었다.
이에, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1센스 프라이머; 서열번호 19로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1안티센스 프라이머; 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2센스 프라이머; 및 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2안티센스 프라이머를 포함하는 소 베타-카제인의 발현이 넉-아웃되지 않고 소 베타-카제인 단백질과 인간 엔도스타틴 단백질이 융합된 형태로 발현되도록 형질전환된, 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별용 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법에 의해 선별된 베타-카제인 게놈 DNA로 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자가 넉-인되고, 상기 베타-카제인을 암호화하는 유전자는 넉-아웃이 되지 않은 넉-인 형질전환 소 체세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 소의 난자의 핵을 상기 형질전환 소 체세포의 핵으로 치환시켜 제조된 핵치환 난세포를 발생시켜 태어난 인간 엔도스타틴를 우유로 분비하는 형질전환 복제소가 제공된다. 상기 소는 홀스타인(holstein) 품종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암, ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역과 프레임에 맞게 연결된 엔도스타틴(endostatin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 24), 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 ⅲ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암을 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계; 및
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계를 포함하는, 넉-인 형질전환 체세포의 제조방법이 제공된다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합이 유도될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양 한 형태로 구현될 수 있는 것으로 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전 하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예1: 인간 엔도스타틴 생산을 위한 넉-인(knock-in) 벡터의 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 인간 엔도스타틴(Endostatin) 생산을 위한 넉-인(knock-in) 벡터를 제조하기 위하여, 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 4,840 bp의 5' 말단 단편(서열번호 1)을 넉-인 벡터의 5'-아암(arm)으로 포함하며, 3'-아암(1813 bp)으로서, 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 8 및 9을 포함하는 플라스미드를 클로닝하였다.
또한, 상기 넉-인 벡터를 이용하여 생산될 인간 엔도스타틴를 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 포함하는 플라스미드와 상기 유전자의 안정적인 발현을 위하여, 상기 유전자의 5'-부분에 연결되어 젖소 베타-카제인 아미노산과 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 단백질을 연결하고 절단할 수 있는 기능을 수행하는 푸린-F2A 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)를 포함하는 플라스미드 및 3'-부분에 연결되어 안정적인 발현 및 핵에서 세포질로의 이행을 위해서 필요한 BGH polyA 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5)를 포함하는 플라스미드를 클로닝하였다.
또한, 추가적으로 양성 선별마커로 마우스 포스포글리세레이트 키나제-I 프로모터(mouse phosphoglycerate kinase-I promoter)에 의해 발현되는 neo 유전자를 상기 BGH polyA의 3'-말단에 위치하도록 클로닝하였다(도 1).
1-1: pGEM-bβC 5E2-E7 플라스미드의 클로닝
넉-인 벡터 구축을 위한 5'-아암(4,840bp)은 기존에 확보되어 있는 T-easy-βCE2E8 플라스미드를 주형으로 이용하고 βCE2 S NotI 센스 프라이머(서열번호 6) 및 βCE7 AS SalI 안티센스 프라이머(서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 상기 PCR은 TAKARA LA Taq polymerase을 이용하여 94℃ 30초, 66℃ 30초 및 72℃ 5분 30초의 조건으로 33 사이클로 수행되었고 증폭된 반응산물은 T-easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다.
1-2: pGEM-bβC 3E8-E9 플라스미드의 클로닝
넉-인 벡터 구축을 위한 3'-아암(1.8 kb)은 기존에 확보되어 있는 T-easy-βCE3-#6 플라스미드를 주형으로 이용하고 βC 3'-아암 SalI S 센스 프라이머(서열번호 8) 및 βC 3'-아암 XhoI AS 안티센스 프라이머(서열번호 9)를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR은 SolgTM pfu DNA polymerase를 이용하여 95℃ 20초, 64℃ 40초 및 72℃ 4분으로 35 사이클 조건에서 실시하였다. 증폭된 반응산물은 T-easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다.
1-3: pGEM-Furin-F2A 플라스미드의 클로닝
Knock-in 벡터 제조 시 bovine β-casein 유전자의 엑손 7 뒤쪽에 연결되는 엔도스타틴 유전자의 연결에 필요한 푸린-F2A 서열은 기존에 확보되어 있는 T-easy F2A 플라스미드를 주형으로 이용하고 Furin-2A XhoI S 센스 프라이머(서열번호 10) 및 Furin-2A Kpni S 안티센스 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 Enzynomics nTaq-Tenuto Taq polymerase을 이용하여 94℃ 30초, 64℃ 30초 및 72℃ 1분으로 30 사이클 조건에서 실시하였다. 증폭된 95 bp의 반응산물은 T-easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다(도 2).
1-4: pGEM-BGHp XhoI-EcoRI 플라스미드의 클로닝
넉-인 벡터 구축에 이용할 Bovine growth hormone Poly A(BGH polyA)는 pRC/CMV 플라스미드를 주형으로 이용하고 BGH polyA S 센스 프라이머(서열번호 12) 및 BGH polyA EcoRl 안티센스 프라이머(서열번호 13)를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 Fermentas Pfu DNA polymerase을 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 1분으로 33 사이클 조건에서 실시하였다. 증폭된 230 bp의 반응산물은 T-easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다.
1-5: 엔도스타틴(endostatin) 유전자의 클로닝
엔도스타틴 유전자는 기존에 확보되어 있는 T-easy-Endostain 플라스미드를 주형으로 이용하고 hEndo S KpnI 센스 프라이머(서열번호 14) 및 hEndo AS SalI 안티센스 프라이머(서열번호 15)를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 Fermentas Pfu Taq polymerase를 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 30초 및 72℃ 1분으로 33 사이클 조건에서 실시하였다. 증폭된 560 bp의 반응산물은 T-easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다(도 3).
1-6: PGK-neo 유전자 확보
양성 선별 마커로 이용할 PGK-neo 유전자는 기존에 확보되어 있는pBSK(-)/pKJ2-neo(EcoRI-HindⅢ) 플라스미드를 이용하였다.
1-7: Transcription Activator-Like Effector Nucleases(TALENs) 확보
젖소 β-casein 유전자 엑손 7 위치를 절단할 수 있는 TALEN은 툴젠(Toolgen, 대한민국)으로부터 합성하였으며, 각 TALEN에 대해서는 체세포와 MAC-T 세포에서 활성을 측정하였다. TALEN은 좌측 결합부위가 TGTACCAGGAGCCTGTACTC(서열번호 22)이며, 우측 결합부위는 TACAATAATAGGGAAGGGTC(서열번호 23) 인식할 수 있도록 합성하였다(도 4A).
실시예 2: Knock-in 벡터의 서브 클로닝
본 발명의 일 실시예에 따른 Knock-in 벡터는 상기 동정된 유전자들을 이용하여 하기와 같은 순서에 의하여 제조하였다. 먼저 전체 염기서열을 확인한 T-easy-bβC E2E7 5'-아암 플라스미드로부터 NotI - SalI으로 절단하여 삽입체(insert)를 제작하고 pBSK-/NotI-SalI 벡터에 클로닝하였다. pBSK-/T-easy-βCE2E7 5'-아암 플라스미드를 SalI - Kpnl으로 절단하여 벡터를 제작하고 T-easy/Furin-2A plasmid를 XhoI ?? KpnI으로 절단하여 삽입체를 제작한 후 연결하였다. 그 후, T-easy/hEndostatin 플라스미드를 KpnI - SalI으로 잘라서 첫 번째 삽입체를 제작하고 T-easy/BGH polyA 플라스미드를 XhoI - EcoRI으로 잘라서 두번째 삽입체를 제작하였으며 KpnI - EcoRI으로 잘라 제작한 pBSK-/KpnI-EcoRI 벡터에 3'-단편 결찰(1igation)로 클로닝 하였다.
pBSK-/bovine β-Casein 5'-F2A 플라스미드는 NotI - KpnⅠ으로 잘라 첫번째 삽입체를 제작하고, pBSK-/hEndostatin_BGHpolyA 플라스미드를 KpnI - EcoRI으로 잘라서 두번째 삽입체를 제작하였다. 그 후, NotI - KpnI으로 잘라 제작한 pBSK-/NotI-KpnI 벡터에 3'-단편 결찰로 클로닝하였다. pBSK-/PGKneo plasmid를 SalI - XhoI으로 잘라서 벡터를 제작하고 T-easy/ bβC 3'-아암 플라스미드를 SalI - XhoI으로 잘라서 삽입체를 제작한 다음 벡터에 결찰시켰다. pBSK-/bβC3'-아암_PGKneo 플라스미드를 NotI - EcoRI으로 잘라서 벡터를 제작한 후 pBSK-/bovine β-Casein 5'-아암_F2A_Endostatin_BGHpolyA 플라스미드를 NotI - EcoRI으로 잘라서 제작한 삽입체를 삽입하여 클로닝하였다.
최종적으로, pBSK-/bβCE2E7 5'-아암_F2A_Endotatin_BGHpolyA_PGK-neo_bβC 3'-아암 플라스미드를 NotI - XhoI으로 잘라서 삽입체를 제작한 후, NotI - XhoI으로 잘라서 제작한 pMCDT-A/NotI - XhoI 벡터에 결찰시켜 Knock-in 벡터를 완성하였다.
실시예 3: TALEN의 활성 측정
젖소 유선 세포인 MAC-T 세포에서 TALEN 활성을 측정하기 위하여 MAC-T 세포를 성장 배양액(DMEM, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 5 μg/ml insulin, 1 μg/ml hydrocortisone)에서 배양하였다. MAC-T 세포에 TALEN의 형질주입(transfection)은 6 cm dish에 2x105 세포를 파종하고 1일 후 각 left, right TALEN DNA 6 ㎍과 DharmaFECT 시약으로 수행하였다.
TALEN 2는 S2 센스 프라이머(서열번호 16) 및 AS2 안티센스 프라이머(서열번호 17)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 SolgTM X-Pfu polymerase을 이용하여 94℃ 30초, 62℃ 40초 및 72℃ 1분으로 33 사이클 조건에서 수행하였다. 증폭된 반응산물은 T-easy 벡터에 결찰시킨 후 염기서열을 결정하고 TALEN 절단부위의 삽입 및 결실을 확인 하였다.
T7 endonuclease에 의한 활성 측정은 먼저 상기 PCR 반응산물을 겔 추출키트(QIAgen, USA)로 처리한 후 450 ng의 DNA을 이용하여 실시하였다. 먼저 DNA 단편을 PCR 머신을 이용하여 95℃에서 10분 처리한 다음 85℃ 1 분, 75℃ 1분, 65℃ 1분, 55℃ 1분, 45℃ 1분, 35℃ 1분 및 25℃ 1분 처리하였다. 상기 처리된 DNA에 T7 endonuclease(NEB) 1 ㎕(2 또는 4 unit)을 넣고 37℃에서 15분 처리한 후 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 indels 현상을 확인하였다(도 4B 및 C). 상기 프라이머를 포함한 본 발명에 사용된 모든 프라이머를 하기 표 1에 표시하였다.
| 플라스미드 | 핵산 서열 | 서열번호 |
| pGEM-bβC 5E2-E7 플라스미드 |
βCE2 S NotI 센스 프라이머:gcg gcc gcG AAT TGA GAG CCA TGA AGG TC | 6 |
| βCE7 AS SalI 안티센스 프라이머:gtc gac AAT AAT AGG GAA GGG TCC CCG GAC | 7 | |
| pGEM-bβC 3E8-E9 플라스미드 |
βC 3'-아암 SalI S 센스 프라이머:GTC GAC CTA AAT TTA CTA ACT GTG CTG TTT AAC TTC | 8 |
| βC 3'-아암 XhoI AS 안티센스 프라이머:CTC GAG TAT TCA ATT TTA ATT TTC CAC AGC TCT | 9 | |
| pGEM-푸린-F2A 플라스미드 |
Furin-2A XhoI S 센스 프라이머:CTC GAG AGA AAA AGA AGG gct cct gtc aaa caa ac | 10 |
| Furin-2A Kpni S 안티센스 프라이머:GGT ACC tgg acc tgg att | 11 | |
| pGEM-BGHp XhoI-EcoRI 플라스미드 | BGH polyA S 센스 프라이머:ctc gag CGA CTG TGC CTT CTA GTT | 12 |
| BGH polyA EcoRl 안티센스 프라이머:gaa ttC CAT AGA GCC CAC CGC AT | 13 | |
| 엔도스타틴 클로닝 | hEndo S KpnI 센스 프라이머:GGT ACC cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc | 14 |
| hEndo AS SalI 안티센스 프라이머:GTC GAC cta ctt gga ggc agt cat gaa gct gtt ctc | 15 | |
| TALEN 2 | S2 센스 프라이머:GAG TCT CCA AAG TGA AGG AGG CTA TGG | 16 |
| AS1 안티센스 프라이머:CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC ATT CAT | 17 | |
| Positive colonies by 1st PCR | Neo 3-2 센스 프라이머:TGC TTG CCG AAT ATC ATG GTG GAA AAT | 18 |
| Endo CV_3R 안티센스 프라이머:ACC ACA CTG TAG AGC TGT GAT TCA GAT ACC | 19 | |
| Positive colonies by genome PCR | cEndo 5'-Sc S2 센스 프라이머:GAT CTT GGT TCC CTG ATG AAG GAT CAA ACC | 20 |
| Neo 5'-2 AS 안티센스 프라이머:TGC TAA AGC GCA TGC TCC AGA CTG CCT TGG | 21 | |
| TALEN 좌측 결합부위 | 5'-TGTACCAGGAGCCTGTACTC-3' | 22 |
| TALEN 우측 결합부위 | 5'-TACAATAATAGGGAAGGGTC-3' | 23 |
실시예 4: 세포의 배양과 넉-인 벡터의 도입
젖소 체세포에 넉-인 벡터의 도입은 전기천공법(electroporation)을 이용하여 하기와 같이 실시하였다. 90% 정도 confluence하게 배양한 젖소 섬유아세포를 EDTA-PBS로 1회 세척한 후 0.25% Trypsin-EDTA를 처리하였다. 상기 세포를 배양액으로 현탁한 다음 800 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였고 다시 F1O 배양액(Gibco-BRL, USA)으로 현탁한 다음 원심분리 후 세척하였으며 상기 회수된 세포는 1.25×107 세포/ml이 되도록 현탁한 다음 전기천공법에 이용하였다.
넉-인 벡터의 도입에 있어서는 NotI으로 절단하여 직선화된 넉-인 벡터 5 μg과 TALEN left 2.5 μg 및 TALEN right 2.5 μg을 100 μl F1O 배지에 융해한 후 세포 현탁액 400 μl( 5 × 106 세포)와 혼합한 다음 4 mm gap 큐벳에 세포 및 벡터 혼합액을 넣었다. 상기 큐벳(cuvette)을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001)에 장착한 다음 450V, 4 pulses, 1 ms 또는 2 ms 조건에서 전기충격을 실시하였다. 전기충격 후 큐벳을 얼음 위에 10분 간 방치한 후 배양액으로 현탁하고 48 웰 플레이트의 각 웰당 1000-4000 세포가 들어가도록 분주하여 배양하였다. 벡터를 세포에 도입한 다음 48시간 후 500 ㎍/ml의 G418(Sigma, USA)로 10-12일간 선별하였다. 특히 본 선별 과정 중에는 5, 10, 또는 15% FBS, 1 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 1X 비필수아미노산(non-essential amino acid), 1X β -mercaptoethanol, 100 unit/ml 페닐실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 배지로 이용하였다. 선별된 콜로니(colony)는 트립신(trypsin) 처리에 의하여 24 웰로 계대 배양하였으며 3 내지 4일 후 세포가 배양용기 바닥에서 포화상태가 되면 12 웰로 계대배양하였으며 동일한 방법에 의하여 6 웰, 60 mm dish, 100 mm dish 순으로 계대 배양하여 동결 보존하였다.
실시예 5: 소 체세포 형질전환체의 넉-인 확인
소의 귀로부터 채취한 섬유아세포와 같은 일반 소 체세포로의 형질전환시 통상적으로 인간 엔도스타틴이 발현되지 않기 때문에 상기 실시예에서 사용한 프라이머쌍으로는 제대로 넉-인이 일어났는지 여부를 확인하기 곤란하므로 본 발명자들은 소의 체세포에서 제대로 넉-인이 일어났는지 확인하기 위하여, 넉-인된 세포의 PCR 동정을 하기와 같이 수행하였다.
먼저, PCR에 의한 1 단계 동정은 G418에 내성을 가지는 콜로니(colony)를 선별한 다음, 24 웰에서 12 웰로 계대할 때 1/5의 세포를 취하여 PCR을 수행하였다. 1/5의 세포 현탁액을 10,000 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리를 수행한 후 상층액을 버리고 3차 멸균수 40 ㎕를 첨가하여 섞어준 후 10분 동안 lO0℃에서 처리하였다. 상기 100℃ 처리된 세포에 Proteinase K(10 mg/ml) 1 ㎕를 첨가하여 55℃에서 130분간 처리한 다음 다시 10분 동안 100℃에서 처리하였다. PCR 반응에는 전체 세포추출액 중 20 μl를 이용하였고 Neo 3-2 센스 프라이머(서열번호 18) 및 3'-아암 상동영역 밖에 위치한 Endo CV_3R 안티센스 프라이머(서열번호 19)를 이용하였다. PCR은 20 μl의 세포 현탁액을 이용하여 Takara Ex Taq으로 실시하였으며 PCR 조건은 94℃ 30초, 58℃ 30초 및 72℃ 3분에서 35 사이클로 수행하였다. PCR 반응산물의 확인은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 약 2.27 kb의 밴드를 확인하였다(도 5). 상기 1 단계에서 동정된 콜로니는 계대배양하여 배양된 세포에서 G-DEXTM IIc ForCell/tissue Genomic DNAe xtraction kit(Intron)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였고 게놈 DNA 100 ng을 이용하여 2 단계 PCR을 상기와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 제대로 넉-인이 일어난 형질전환체에서는 2.27 kb 크기의 밴드를 확인하였다(도 6).
또한, 정확한 넉-인을 확인하기 위하여 본 발명에서는 하기와 같이 5'-아암 PCR을 실시하였다. 먼저, 1차 3'-PCR에서 양성으로 확인된 세포로부터 제조한 게놈 DNA(10 ng)을 주형으로 이용하고 FX Neo 폴리머라아제를 이용하여 5' 상동영역 밖에 위치하는 cEndo 5'-Sc S2 프라이머(서열번호 20)와 Neo 5'-2 AS 프라이머(서열번호 21)를 이용하여 98℃ 10초, 74℃ 3분에서 5 사이클, 98℃ 10초, 72℃ 3분에서 5 사이클, 98℃ 10초, 70℃ 3분에서 5 사이클, 98℃ 10초, 68℃ 3분에서 20 사이클 의 조건으로 PCR을 수행하였다.
그 결과, PCR 반응산물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 약 6.0 kb의 밴드를 확인하였다(도 7). 또한, 본 발명의 일 실시예 따라 제조된 넉-인 벡터를 소 체세포에 도입하고 넉-인된 세포를 동정한 효율을 나타낸 표를 하기 표 2에 표시하였다.
| 벡터 | TALEN 사용여부 | 형질감염 세포수 | G418R 저항성 콜로니수 | PCR로 분석된 G418R 저항성 콜로니수 | 1차 PCR로 확인된 양성 콜로니수 | 2차 게놈 DNA PCR로 확인된 양성 콜로니수 | 비고 |
| cEndo |
- | 5×106 | 145/597 | 97/145 | 2 | 0 | |
| + | 5×106 | 127/624 | 65/127 | 6 | 3 | C4-24,26,33 |
상기 표 2에서 나타난 바와 같이, TALEN 시스템을 사용하지 않은 경우 오히려 G418R 저항성 콜로니의 수는 더 많았으나, 이 중 엔도스타틴 발현카세트가 제대로 젖소 게놈 내의 베타-카제인 유전자 내로 정확하게 넉-인된 것은 하나도 없었던 반면, 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 7번 엑손에 특이적인 TALEN 시스템을 이용한 경우, 최종 PCR을 통해 양성으로 확인된 콜로니 세 개가 선별됨으로써, 정확한 넉-인 체세포주를 확립할 수 있었다. 아울러, 본 발명자들은 1차 PCR 결과 TALEN 불사용 넉-인 유도시 1차 PCR에서 양성이었던 클론이 2차 PCR에서 음성으로 나온 점을 고려할 때, 삽입 유전자 카세트의 5'-아암 뿐만 아니라, 3'-아암에 대한 분석을 수행해야 보다 정확한 넉-인 여부를 확인할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 정확한 넉-인 여부를 확인하기 위해 2 단계의 PCR을 수행하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Method for producing bio-pharmaceutical protein fused to bovine
beta-casein
<130> PD14-1474
<160> 24
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 4840
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 1
gcggccgcga attgagagcc atgaaggtcc tcatccttgc ctgcctggtg gctctggccc 60
ttgcaagaga ggtaagtaca gaaaaaatgt tgaaataaat aagactagta ctatctgcct 120
atgtgtagaa aatcgcatta ccaacattgt aaatgtataa ataatgcaca atctcagatt 180
ttttttgaat gctaagaaag tcatttacgt tcatccacta tctcagtagt atcctatggg 240
accacaagtc tgagtctagt gctttctata gtattgtacc atctgtacca tcaatcccta 300
aagaaaaaag aaaataaacc aataagcaac agactaacaa gaaggaacac agataagaac 360
aaaaagtgag taatattgca taaatacaat tgcatgcata tacaatctag ataaatatat 420
cttattccag tgatgaaata tttgtatccc ttactgtaga gtgctaggtt tagctgtgtc 480
tattcaacac aggatgatac tccagaggat ggtatatcag acaacaataa taaatatgtt 540
cataattata ataaaaagtg ttcagtaaaa attaaaataa ctccctttct gttacccata 600
aaaactcttc attaaagtaa aacaaaaata tactaatgaa agttactaaa tttaaaagac 660
tctcaaaaga catataacat ttttattttt cagatttgtg aaatagatag ctctgaataa 720
agcaagtaaa aattaggtag gaaaaatatt taataatgag ttgactgtgg gaactaaagt 780
gttttttttt ctctttagct ggaagaactc aatgtacctg gtgaggtaag atatttttat 840
acaaagaaaa aaattaattt aactgtaaaa tagtaacagt ctctaatgat ctggcagaag 900
actcagctaa ttgtcaattt ttatttttcc tttatagatt gtggaaagcc tttcaagcag 960
tgaggtaaga tagtgttcat tcagaggcaa tttcccaaat ttagagcaat aaaatgctgt 1020
attatctttt tgtgttacat taatggcaac ccactccagt attcttgcct ggaaaatccc 1080
atagaggagg agcctggtag gctgcagtcc acggggtcgc taagagtcgg acaggactga 1140
gcgacttccc tttcactttt cactttcatg ccttggagaa ggaaatggca acccactcca 1200
gttttcttgc cgggagaatc ccagggacgg gggagcctgg tgggctgccg tctatggggt 1260
cgcacagagt tggacacgac tgaagcgact tagcagtagc agcagcagga cagttaaggt 1320
ttctctaata gctcagttgg taaagaatct ggctgcagtg caggagaccc tggttcgatt 1380
cctcaagatc tgcaggagaa gggataggct acccattcca gtgttcttta agccaatgtg 1440
gctatgtact gacgggtaac tattgtcaat ttccactcta tatatttaaa ggaataaatg 1500
tgtagaaggt ttaatattct agtaatttct aaatgggttt gttatttgaa attgtgtcat 1560
tgtgccctgc tttttttcct taatgaactg tacagtcctc ttttctgtct tgaactttct 1620
atgttaacct ccttccatgc tttggcattt attgagcact ttctgtttca gactttgact 1680
aggaactgca gtacaaacta gaaagagggg tgccctttgt aaagtgtgag cagacatgca 1740
aatggacata ttttattatt atacaagcaa tccagtacac aagaggcagt gagaatgagt 1800
gtagtcctaa atctgcctgg tggaatgagg tagataataa ccctatgcca ctctttctgg 1860
ctctgtcatc agctgttggt taaatagtgc atcaatatac tttgtctctt cacaaaggtc 1920
aaaagatgct gctgctgctg ctaagtccct tcagtcatgt ctgactctgt gcgacctcat 1980
agatggcagc ctgccaggct cccccatccc tgggattctc caggcaagaa tactggagtg 2040
ggttgccatt tcctattcca atgcataaaa gtgaaaagtg aaagtgaagt cgctcagtcg 2100
tgtccgactc ctagtgaccc cgtggactgc agcctaccag gctcctccat ccatgggatt 2160
ttccaggcaa gagtactgga gtgggttgcc attgccatct ccaaagatcc ttataggagg 2220
gtatgtattt cttataattc attagaagcc taaacataac cagggaacta agaatgatta 2280
acaagttcat gcgtggttat tattatatat tttcaatgac tattattctt ttagaaccag 2340
atgaaaatat tagagatcat ttgttgtcct aaggagagaa caggatgatt gagagacatg 2400
tatgcatgca aagttgcttc agccctttcc aactctgtat gaccctatgg actgtaacct 2460
gccaggttcc tctgtctatg ggattctcca ggcaagaata caggagtggg ttgtcatctc 2520
ctccagggcc taggaattga cctgcatctc ttacgtctcc tgcattggca ggcaggttct 2580
ttaccactag caccacctgg gaagcccgat tagtatctgt taaatgcctc tttgagtact 2640
atgctctcta atcctctttt tcttgattgc atcatctttc tttttataca acagccttat 2700
tcagaagagt ggaacataaa cgttcagcca taaaataatg atattatcaa atgagctgtc 2760
catattaatc tattaaattt cttcattttc tgatttatgt tgacaaataa gaattttttt 2820
taaagctaga cctgatttta tttttatttt tccaaaggaa tctattacac gcatcaataa 2880
ggtaaaaccc tcatatttaa atgtacattt tttttaattt catgtttgat ttttataaac 2940
agcatttctt tatgtatttt tttttaacca gaaaattgag aagtttcaga gtgaggaaca 3000
gcagcaaaca gaggtaattt gttcactatg agtatatttt gagaagtatt atgaaacata 3060
acacataaaa agatttataa taattatgtt cagtctaaga atggtaatat aaatgtcagt 3120
gcaagaaata aaaactttga caaaatgaaa atattttaaa aatataaaca cattttaaaa 3180
cacataatca aatttcacag tatagaataa atagctaaga ataattattg atgtattcat 3240
tttactaatg gtatacctgg ttttaataac tgcatattag taggaacatt tccagactag 3300
ggactgtgat ccccttattc taatgatgga tatgctgatg aaagacagta gggtgacagt 3360
gtggcactaa tcctcatctg atcatttatc agctgtataa ccttggctcc atgtttctct 3420
gtacatcatt ttcttcacct gtaaattgag aatattcata attacccaga gttgatgaac 3480
tgacacacaa tgaatattca gtggttttat attatatttg atagctttta tactcacatt 3540
tatggatgtg tggagttcta aaaagtattt ccattgccca gatgagagaa gtgaggtaca 3600
ggacaattga gtatgcaaat gtgtgaccac accacatagt tattaaatag cagaacttgc 3660
ttaaaaacaa ggatttgcgg acaatgtaaa attctttcat tatattactc ttgtggtaac 3720
atatttatct aattatgata tttaagcttt cgtgttttat aattgaagtt tgattgtttg 3780
gcacttaggc caaattctaa atcaaaatga atttacaact tgatgccttt gaagactcaa 3840
gattaccacc ttctatcaag agaagtagtg ctagaagttg gtccattgtt aaggaactcc 3900
ttgaaattaa aaaaacacat attaagactt agttttcatt aaaacaaaca aaaataaacc 3960
tcggagtaac ttttaaagtc tttttaaaat ggatctttct ttgttatatg aaaccagttt 4020
ggactattat ccaaagtatg tagctaccac tctgcaggca actcaggaag aggtggaata 4080
agtgttgaaa tctccaaacc ctgatttcac ttgactctct gatttcacct gtgaagaaag 4140
tgggttaatg agaaatcctt cagtgagcat tttactcatt agtcttcata tgaccccaat 4200
ttcttaacca aaccaaatgg aagattttct ttctctctct tcactgaatt atgttttaaa 4260
aagaggagga taattcacca tgaataacaa ttataactgg attatggact caaagatttg 4320
ttttccttct ttccaggatg aactccagga taaaatccac ccctttgccc agacacagtc 4380
tctagtctat cccttccctg ggcccatccc taacagcctc ccacaaaaca tccctcctct 4440
tactcaaacc cctgtggtgg tgccgccttt ccttcagcct gaagtaatgg gagtctccaa 4500
agtgaaggag gctatggctc ctaagcacaa agaaatgccc ttccctaaat atccagttga 4560
gccctttact gaaagccaga gcctgactct cactgatgtt gaaaatctgc accttcctct 4620
gcctctgctc cagtcttgga tgcaccagcc tcaccagcct cttcctccaa ctgtcatgtt 4680
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<211> 1813
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<213> Bos taurus
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<213> Artificial Sequence
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<223> Furin-F2A plasmid
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ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 180
gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 240
aattc 245
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> betaCE2 S NotI sense primer
<400> 6
gcggccgcga attgagagcc atgaaggtc 29
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> betaCE7 AS SalI antisense primer
<400> 7
gtcgacaata atagggaagg gtccccggac 30
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> betaC 3-arm SalI S sense primer
<400> 8
gtcgacctaa atttactaac tgtgctgttt aacttc 36
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> betaC 3-arm XhoI AS antisense primer
<400> 9
ctcgagtatt caattttaat tttccacagc tct 33
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Furin-2A XhoI S sense primer
<400> 10
ctcgagagaa aaagaagggc tcctgtcaaa caaac 35
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Furin-2A Kpni S antisense primer
<400> 11
ggtacctgga cctggatt 18
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH polyA S sense primer
<400> 12
ctcgagcgac tgtgccttct agtt 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH polyA EcoRl antisense primer
<400> 13
gaattccata gagcccaccg cat 23
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hEndo S KpnI sense primer
<400> 14
ggtacccaca gccaccgcga cttccagccg gtgctc 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hEndo AS SalI antisense primer
<400> 15
gtcgacctac ttggaggcag tcatgaagct gttctc 36
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S2 sense primer
<400> 16
gagtctccaa agtgaaggag gctatgg 27
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS1 antisense primer
<400> 17
ctcagctatg cttattttgg aaccattcat 30
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neo 3-2 sense primer
<400> 18
tgcttgccga atatcatggt ggaaaat 27
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Endo CV_3R antisense primer
<400> 19
accacactgt agagctgtga ttcagatacc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cEndo 5'-Sc S2 sense primer
<400> 20
gatcttggtt ccctgatgaa ggatcaaacc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Neo 5'-2 AS antisense primer
<400> 21
tgctaaagcg catgctccag actgccttgg 30
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TALEN left binding site
<400> 22
tgtaccagga gcctgtactc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TALEN right binding site
<400> 23
tacaataata gggaagggtc 20
<210> 24
<211> 1323
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta casein-F2A-endostatin
<400> 24
atgaaggtcc tcatccttgc ctgcctggtg gctctggccc ttgcaagaga gctggaagaa 60
ctcaatgtac ctggtgagat tgtggaaagc ctttcaagca gtgaggaatc tattacacgc 120
atcaataaga aaattgagaa gtttcagagt gaggaacagc agcaaacaga ggatgaactc 180
caggataaaa tccacccctt tgcccagaca cagtctctag tctatccctt ccctgggccc 240
atccctaaca gcctcccaca aaacatccct cctcttactc aaacccctgt ggtggtgccg 300
cctttccttc agcctgaagt aatgggagtc tccaaagtga aggaggctat ggctcctaag 360
caaaaagaaa tgcccttccc taaatatcca gttgagccct ttactgaaag ccagagcctg 420
actctcactg atgttgaaaa tctgcacctt cctctgcctc tgctccagtc ttggatgcac 480
cagcctcacc agcctcttcc tccaactgtc atgtttcctc ctcagtccgt gctgtccctt 540
tctcagtcca aagtcctgcc tgttccccag aaagcagtgc cctatcccca gagagatatg 600
cccattcagg cctttctgct gtaccaggag cctgtactcg gtcctgtccg gggacccttc 660
cctattattg tcgagagaaa aagaagggct cctgtcaaac aaactcttaa ctttgattta 720
ctcaaactgg ctggggatgt agaaagcaat ccaggtccag gtacccacag ccaccgcgac 780
ttccagccgg tgctccacct ggttgcgctc aacagccccc tgtcaggcgg catgcggggc 840
atccgcgggg ccgacttcca gtgcttccag caggcgcggg ccgtggggct ggcgggcacc 900
ttccgcgcct tcctgtcctc gcgcctgcag gacctgtaca gcatcgtgcg ccgtgccgac 960
cgcgcagccg tgcccatcgt caacctcaag gacgagctgc tgtttcccag ctgggaggct 1020
ctgttctcag gctctgaggg tccgctgaag cccggggcac gcatcttctc ctttgacggc 1080
aaggacgtcc tgaggcaccc cacctggccc cagaagagcg tgtggcatgg ctcggacccc 1140
aacgggcgca ggctgaccga gagctactgt gagacgtggc ggacggaggc tccctcggcc 1200
acgggccagg cctcctcgct gctggggggc aggctcctgg ggcagagtgc cgcgagctgc 1260
catcacgcct acatcgtgct ctgcattgag aacagcttca tgactgcctc caagtaggtc 1320
gac 1323
Claims (19)
- ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5'-아암;
ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 7과 프레임에 맞게 연결된 F2A 및치료용 단백질(therapeutic protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
ⅲ) 양성 선별마커; 및
ⅳ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3'-아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는, 형질전환 소에서의 외래 단백질 생산용 넉-인(knock in) 벡터. - 제1항에 있어서,
상기 치료용 단백질은 인간 엔도스타틴(endostatin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), G-CSF(granulocyte colony stimulating factor), 혈액응고인자(blood coagulation factor) 또는 인간 성장 호르몬(human growth hormone)인, 넉-인 벡터. - 제2항에 있어서,
상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 넉-인 벡터. - 제3항에 있어서,
상기 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자의 3'-말단에 BGH(bovine growth hormone) polyA 신호가 추가로 연결된, 넉-인 벡터. - 제4항에 있어서,
상기 BGH polyA 신호는 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인, 넉-인 벡터. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 양성 선별마커는 neo 유전자, puromycin 저항성 유전자 또는 Zeocin 저항성 유전자인, 넉-인 벡터. - 삭제
- 제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 넉-인 벡터로 형질감염된 소 체세포 중 베타-카제인을 암호화하는 게놈 DNA 상에 상기 넉-인 벡터에 포함되어 있는 유전자 컨스트럭트가 제대로 넉-인된 형질전환 소 체세포를 선별하는 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계;
상기 소 체세포의 핵을 소 난자의 핵과 치환하여, 핵치환 난자를 제조하는 소 난자 핵치환 단계;
상기 핵치환 난자를 발생시켜 형질전환 넉-인 소를 제조하는 형질전환 넉-인 소 제조단계; 및
상기 넉-인 소 중 암소를 사육하여 우유로부터 상기 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 형질전환 넉-인 소로부터 외래단백질의 생산방법. - 제9항에 있어서,
상기 넉-인 형질전환 소 체세포 선별단계는
ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호 24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하고, 상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별한 후, 상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하여, 이를 주형으로 하여 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 반응을 수행한 후, 상기 1차 PCR 반응에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 반응 수행한 뒤, 상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별함으로써 수행되는, 생산방법. - 제10항에 있어서,
상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 생산방법. - ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계;
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계;
상기 형질전환 체세포로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
상기 게놈 DNA를 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1센스 프라이머 및 상기 3'-말단 단편의 3' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제1안티센스 프라이머로 증폭하는 1차 PCR 단계;
상기 1차 PCR에서 양성으로 나온 클론의 게놈 DNA를 다시 상기 5'-말단 단편의 5' 바깥쪽의 게놈 DNA에 특이적인 제2센스 프라이머 및 상기 항생제 내성 단백질 암호화 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2안티센스 프라이머로 증폭하는 2차 PCR 단계; 및
상기 증폭된 PCR 산물의 유무 및 크기를 판별하는 단계를 포함하는, 상기 넉-인 벡터가 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역에 제 위치로 삽입됨으로써 소 베타-카제인 발현이 넉-아웃 되지 않고, 인간 엔도스타틴이 발현되는 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별방법. - 제12항에 있어서,
상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 선별방법. - 제12항에 있어서,
상기 제1센스 프라이머는 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되고, 상기 제1안티센스 프라이머는 서열번호 19으로 기재되는 핵산서열로 구성되며, 상기 제2센스 프라이머는 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되고, 상기 제2안티센스 프라이머는 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는, 선별방법. - 서열번호 18로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1센스 프라이머; 서열번호 19로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1안티센스 프라이머; 서열번호 20로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2센스 프라이머; 및 서열번호 21로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2안티센스 프라이머를 포함하는 소 베타-카제인의 발현이 넉-아웃되지 않고 소 베타-카제인 단백질과 인간 엔도스타틴 단백질이 융합된 형태로 발현되도록 형질전환된, 넉-인 형질전환 소 체세포의 선별용 키트.
- 제12항의 선별방법에 의해 선별된 베타-카제인 게놈 DNA로 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자가 넉-인되고, 상기 베타-카제인을 암호화하는 유전자는 넉-아웃이 되지 않은 넉-인 형질전환 소 체세포.
- 소의 난자의 핵을 제16항의 형질전환 소 체세포의 핵으로 치환시켜 제조된 핵치환 난세포를 발생시켜 태어난, 인간 엔도스타틴를 우유로 분비하는 형질전환 복제소.
- ⅰ) 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 2, 3, 4, 5, 6 및 7을 포함하는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 5' 아암; ⅱ) 상기 베타-카제인 암호화 영역의 엑손7과 프레임에 맞게 연결된 서열번호 24로 기재되는 핵산서열로 구성되는 F2A 및 엔도스타틴(endostatin)으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항생제 내성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 ⅲ) 상기 소 게놈 DNA의 베타-카제인 암호화 영역의 엑손 8 및 엑손 9를 포함하는 단편으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 3' 아암;으로 구성되는 유전자컨스트럭트를 포함하는 넉-인(knock in) 벡터를 소 체세포에 형질감염하는 단계; 및
상기 형질감염된 소 체세포 중 상기 항생제에 대한 내성을 갖는 클론들을 선별하는 형질전환 체세포 선별단계를 포함하는, 넉-인 형질전환 체세포의 제조방법. - 제18항에 있어서,
상기 형질감염시 젖소 베타-카제인 게놈 DNA의 엑손 7 위치의 서열번호 22의 암호화가닥(coding strand) 부위에 결합하는 TALEN 및 서열번호 23의 상보가닥(complementary strand) 부위에 결합하는 TALEN을 사용하여 상동 재조합을 유도하는, 제조방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190042152A (ko) | 2017-10-16 | 2019-04-24 | 전남대학교산학협력단 | 소 락토페린 발현을 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉-인 방법 |
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|---|---|---|---|---|
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-
2014
- 2014-08-06 KR KR1020140101328A patent/KR101636885B1/ko active IP Right Grant
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| KR20190042152A (ko) | 2017-10-16 | 2019-04-24 | 전남대학교산학협력단 | 소 락토페린 발현을 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉-인 방법 |
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