ES2261740T3 - Composiciones de fsh con alto grado de sialilacion y su uso para la preparacion de medicamentos. - Google Patents

Composiciones de fsh con alto grado de sialilacion y su uso para la preparacion de medicamentos.

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ES2261740T3 ES02774712T ES02774712T ES2261740T3 ES 2261740 T3 ES2261740 T3 ES 2261740T3 ES 02774712 T ES02774712 T ES 02774712T ES 02774712 T ES02774712 T ES 02774712T ES 2261740 T3 ES2261740 T3 ES 2261740T3
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    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende FSH recombinante, en la que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200, preferiblemente al menos 220, más preferiblemente al menos 240, muy preferiblemente al menos 260.

Description

Composiciones de FSH con alto grado de sialilación y su uso para la preparación de medicamentos.
Campo del invento
El invento se refiere al campo de las gonadotropinas y, particularmente, a su uso en tecnologías de reproducción asistida (ART; del inglés, assisted reproductive technologies), inducción de la ovulación (OI; del inglés, ovulation induction), inseminación intrauterina (IUI; del inglés, intrauterine insemination) y pacientes masculinos estériles.
Antecedentes del invento
Las gonadotropinas son un grupo de glicoproteínas heterodímeras que incluyen la hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, follicle stimulating hormone), la hormona luteinizante (LH; del inglés, luteinising hormone) y la gonadotropina coriónica (CG; del inglés, chorionic gonadotrophin). Estas hormonas regulan la función gonadal en el macho y la hembra.
Cada una de estas hormonas está compuesta por dos subunidades no covalentemente unidas: una subunidad \alpha, que es común a FSH, LH y hCG, y una subunidad \beta que es única para cada una de ellas y que confiere especificidad biológica a cada hormona.
En todas las gonadotropinas, cada subunidad tiene cadenas laterales oligosacáridas unidas a asparagina (N-unidas). En la subunidad \alpha común de las hormonas humanas, éstas están fijadas en las posiciones 52 y 78. Tanto en la FSH como en la CG humanas, dos cadenas laterales oligosacáridas N-unidas están fijadas a la subunidad \beta, en las posiciones 7 y 24 en la FSH y en las posiciones 13 y 30 en la hCG. En la LH humana, un oligosacárido está fijado en la posición 30 de la subunidad \beta. La hCG tiene además cuatro cadenas laterales oligosacáridas unidas a serina (O-unidas), presentes en la porción terminal carboxílica (CTP; del inglés, carboxyl terminal portion).
Como con todas las glicoproteínas, en las gonadotropinas se presentan variaciones en la estructura oligosacárida, lo que da lugar a un conjunto de isoformas que se hallan en la glándula hipofisaria y en circulación. Además, hay diferencias en el grado de "remate" del hidrato de carbono terminal por ácido siálico. Las isoformas pueden ser separadas basándose en su carga, la cual viene determinada en gran medida por el número y la distribución de oligosacáridos N-unidos sialilados. Las formas muy sialiladas tendrán un punto isoeléctrico (pI) más ácido que la media y son denominadas "ácidas". Las formas menos sialiladas tienen un pI comparativamente mayor y son denominadas "básicas".
Como consecuencia de sus diferencias estructurales, las isoformas gonadotropínicas difieren en su capacidad para unirse a receptores de células diana. El grado de sialilación afecta a su capacidad para sobrevivir en circulación. En el caso de la FSH, varios grupos han demostrado que isoformas muy ácidas/sialiladas tienen semividas plasmáticas considerablemente más largas en modelos animales, tales como el ratón y la rata^{1}.
Se ha mostrado que el perfil de isoformas de la FSH endógena varía en los seres humanos. Las isoformas ácidas con largas semividas in vivo y relativamente baja potencia biológica in vitro son predominantes en el suero de niños prepúberes, pacientes hipogonadales y en mujeres durante la fase folicular. Por contraste, las isoformas menos sialiladas, más básicas, con cortas semividas in vivo y relativamente elevada actividad biológica in vitro se encuentran durante la pubertad, en la terapia con hormona liberadora de gonadotropina (GnRH; del inglés, Gonadotropin-Releasing Hormone) y alrededor de la oleada gonadotropínica del ciclo medio en las mujeres^{2}.
Las isoformas de FSH que poseen un mayor contenido de ácido siálico circulan durante periodos de tiempo más prolongados porque los restos de ácido siálico terminales "taponan" los restos de galactosa, lo que evita una interacción con receptores asialo-glicoproteínicos hepáticos y su eliminación de la circulación^{3}.
Los grupos oligosacárido (glicanos) fijados a proteínas están ramificados, y a cada resto de azúcar terminal se hace referencia como "antena". El parámetro "número Z" proporciona una medida de qué proporción de las antenas de los grupos hidrato de carbono de una glicoproteína llevan restos cargados, tal como ácido siálico. La FSH desialilada tiene un número Z de 0. La FSH totalmente sialilada tendría un número Z de entre aproximadamente 230 y 280.
La potencia de las preparaciones de FSH se estima in vitro mediante el ensayo de Steelman-Pohley, que compara, bajo unas condiciones especificadas, la capacidad de una preparación para aumentar la masa ovárica de ratas inmaduras en comparación con una preparación de norma/referencia internacional, calibrada en unidades internacionales (IU; del inglés, International Units)^{4}.
Muchos grupos han investigado el papel de la glicosilación y la sialilación en cuanto a su influencia en el perfil biológico de la FSH.
D'Antonio et al. evaluaron en ratas hembra los índices de aclaramiento metabólico (MCR; del inglés, metabolic clearance rate) de isoformas ácidas (pI < 4,8) y básicas (pI > 4,8) de rhFSH, obtenidas mediante cromatoenfoque. Como se esperaba, se halló que las isoformas básicas tienen un aclaramiento más rápido que las isoformas ácidas (t_{1/2} = 0,4 h para las básicas, 0,9 h para las ácidas). Cuando se compararon (sobre una base másica) las formas ácida y básica en el ensayo de Steelman-Pohley, se halló que la isoforma básica era considerablemente menos activa que la isoforma ácida (ED_{50} = 0,9 \mug/rata para la básica, 0,3 \mug/rata para la ácida). Cuando se compararon las isoformas sobre una base de IU, no hubo diferencias entre las dos^{5}.
Vitt et al. llevaron a cabo un estudio in vitro en el que cuatro preparaciones de FSH humana recombinante de diferentes pI eran comparadas en cuanto a su capacidad para causar un aumento de tamaño y de producción de estradiol (E_{2}) en folículos aislados de ratón. Se halló que la FSH básica (pI de 5,0-5,6) conducía a un crecimiento más rápido de los folículos y daba lugar al tamaño máximo de folículo, seguida de la FSH recombinante no fraccionada. Las preparaciones de FSH medias (pI de 4,5-5,0) y ácidas (pI de 3,6-4,6) iban detrás tanto en velocidad de crecimiento como en tamaño máximo de los folículos. Se mostró que la FSH básica induce la secreción de E_{2} más pronto y con menor dosis que las otras isoformas. Folículos cultivados con FSH ácida, independientemente de la concentración, secretaban concentraciones mensurables de E_{2} sólo después de una incubación prolongada^{6}.
Timossi et al. usaron el cromatoenfoque para separar siete fracciones diferentes de FSH hipofisaria humana, de glicosilación/acidez variables. Las fracciones fueron analizadas en cuanto a su capacidad para causar una suprarregulación de la expresión de aromatasa (necesaria para la producción de estradiol) y del activador de tipo tisular del plasminógeno (tPA; del inglés, tissue-type plasminogen activator) in vitro en células granulosas de rata. Se halló que la relación de bioactividad a inmunorreactividad (B/I) disminuía conforme decaía el valor del pH de elución de la isoforma. Los autores concluyeron que las isoformas básicas presentaban una mayor capacidad que las variantes ácidas para inducir la expresión de mRNAs y proteínas tanto de aromatasa como de tPA^{7}.
Zambrano et al. fraccionaron FSH hipofisaria humana en 9 fracciones de pI variable usando cromatoenfoque y analizaron las isoformas ácidas y básicas usando tres inmunoensayos y dos ensayos in vitro: la producción de estradiol por células granulosas de rata y la producción de cAMP por una línea celular fetal humana que expresa el receptor de FSH. La relación de actividad en los bioensayos a inmunorreactividad (B/I) se reducía conforme disminuía el pI de la isoforma, para todos los bioensayos^{8}.
En otro estudio, Zambrano et al. compararon la afinidad ligante de siete diferentes fracciones de isoformas ácidas y básicas de FSH hipofisaria humana hacia un sistema receptor heterólogo (células granulosas de rata) y un sistema receptor homólogo (células HEK-293 humanas recombinantes que expresan el receptor humano de FSH). El receptor heterólogo mostraba un aumento de afinidad ligante conforme aumentaba el pI de la isoforma, mientras que el receptor homólogo no. La producción de cAMP en células HEK-293 también aumentaba conforme aumentaba el pI de la isoforma^{9}.
Ciertos estudios han mostrado que las formas más ácidas de FSH presentan la mayor bioactividad in vivo (con respecto a una base másica) cuando ésta se evalúa mediante los clásicos ensayos de aumento de peso ovárico^{10,11}. Timossi et al. presentaron el postulado de que las formas básicas pueden ser más activas in vivo pero que, a causa de su semivida más corta, el efecto no puede ser observado como una ganancia de peso de los ovarios de rata. Examinaron el efecto de dos preparaciones sobre un sistema de respuesta rápida: la suprarregulación de la actividad de tPA^{12}. Los autores concluyeron que la rhFSH que tiene un perfil de distribución de cargas menos ácido presenta mayor bioactividad in vitro y mayores índices de aclaramiento plasmático e induce una actividad enzimática tPA más rápidamente que una preparación de FSH muy ácida.
Las gonadotropinas desempeñan papeles cruciales en el ciclo reproductivo, y su uso es esencial para las técnicas de reproducción asistida (ART), tales como fertilización in vitro (IVF; del inglés, in vitro fertilisation), IVF junto con inyección intracitoplásmica de esperma [IVF/ICSI (del inglés, IVF/intracytoplasmic sperm injection)] y transferencia de embriones (ET; del inglés, embryo transfer), así como para la inducción de ovulación (OI) en paciente con anovulación que son sometidos a fertilización in vivo de forma natural o por medio de inseminación intrauterina (IUI).
Las ART se llevan típicamente a cabo usando hiperestimulación ovárica controlada (COH; del inglés, controlled ovarian hyperstimulation) para aumentar el número de gametos femeninos^{13}. Los regímenes estándares^{14} para COH incluyen una fase de infrarregulación en que se suprimen las gonadotropinas endógenas mediante la administración de un agonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), seguida de una fase estimuladora en que se induce el desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante la administración diaria de FSH, normalmente en una cantidad de aproximadamente 150-225 IU/día. Alternativamente, se inicia la estimulación después de una menstruación espontánea o inducida mientras se evita la aparición de una oleada intempestiva de LH mediante la administración de un antagonista de GnRH (comenzando típicamente alrededor del día seis de la fase estimuladora). Cuando hay al menos 3 folículos > 16 mm (uno de 18 mm), se administra un bolo único de hCG (5-10.000 IU) para remedar la oleada natural de LH e inducir
la ovulación. Se calcula un tiempo de 36-38 horas después de la inyección de hCG para la recuperación de ovocitos.
La OI se lleva típicamente a cabo con la administración diaria de FSH en una dosis de aproximadamente 75-150 IU/día. Puede usarse una infrarregulación con agonistas o antagonistas de GnRH, aunque menos frecuentemente que en la indicación de ART. Se administra hCG para remedar la oleada de LH antes de la fertilización in vivo, la cual se alcanza por medio del contacto sexual regular o de una IUI.
Los regímenes típicos anteriormente descritos para ART y OI requieren inyecciones diarias de gonadotropinas a lo largo de un período prolongado, es decir, durante un período medio de 10 días, y hasta 21 días en algunos pacientes. El desarrollo de preparaciones de FSH de eficacia aumentada permitiría que la administración diaria de FSH fuera disminuida y/o permitiría un acortamiento del período de tratamiento (es decir, menos inyecciones) y/o permitiría que las inyecciones se administraran menos frecuentemente. Esto haría que los regímenes de ART y OI fueran más convenientes y cómodos para el paciente.
Además, las ART en que se usa fertilización in vitro están plagadas de posibles contratiempos. Por ejemplo, no todo folículo producirá un ovocito viable, no todo ovocito viable resultará exitosamente fertilizado, y puede que algunos embriones no sean viables. Más aún, una vez que se han seleccionado embriones viables, puede que la transferencia al útero y la implantación no sean exitosas. Por lo tanto, con objeto de maximizar las posibilidades de un nacimiento con vida, es deseable estimular el crecimiento y la maduración de varios folículos para asegurar la recogida de múltiples ovocitos.
Por contraste, en la indicación de OI, el objetivo es obtener no más de tres, y preferiblemente uno, folículos dominantes (para evitar embarazos múltiples).
Algunos pacientes sometidos a ART y OI presentan un número reducido de folículos en crecimiento cuando se tratan con preparaciones de FSH convencionales. Éste es un factor limitante para el éxito cuando se lleva a cabo una ART ya que limita el número de embriones disponibles para transferencia y/o crioconservación. Puede ser también un factor limitante para el éxito en pacientes sometidos a IUI, en la que es importante obtener más de un folículo. Los pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen pacientes con una edad superior a aproximadamente 33-35 años y pacientes con un valor de FSH de línea de base elevado, un valor de estradiol de línea de base elevado o un valor de inhibina b de línea de base reducido.
En el varón, la espermatogénesis depende de la estimulación de las células de Sertoli por la FSH. La deficiencia de FSH da lugar a oligospermia y, por lo tanto, a esterilidad. El tratamiento de la esterilidad masculina con preparaciones de FSH convencionales requiere inyecciones de FSH tres veces a la semana durante hasta 18 meses. El desarrollo de preparaciones de FSH con capacidad potenciada para estimular la foliculogénesis es una necesidad actual. También existe la necesidad de nuevas preparaciones de FSH para tratar a pacientes con una respuesta disminuida a la FSH. También son deseables preparaciones de FSH de eficacia potenciada que permitan protocolos de tratamiento más cortos y/o dosis acumulativas disminuidas y/o administraciones menos frecuentes, para las ART, la OI y la esterilidad masculina.
Sumario del invento
Un objeto del invento es proporcionar una preparación de gonadotropina para uso en la inducción de ovulación y la COH, particularmente en asociación con las ART.
En un primer aspecto, el invento proporciona una preparación de FSH recombinante en que el número Z de la preparación es al menos 200.
En un segundo aspecto, el invento proporciona una preparación de FSH recombinante en que la preparación tiene un pI medio inferior a 3,4.
En un tercer aspecto, el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende FSH recombinante, en la que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un cuarto aspecto, el invento proporciona el uso de FSH recombinante en la estimulación de la foliculogénesis, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un quinto aspecto, el invento proporciona el uso de FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en la estimulación de la foliculogénesis, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un sexto aspecto, el invento proporciona un método para inducir la foliculogénesis en un paciente humano, método que comprende administrar FSH recombinante al paciente, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un séptimo aspecto, el invento proporciona un método para preparar una preparación de FSH recombinante que tiene un número Z que es al menos 200, método que comprende una operación seleccionada entre:
\bullet
hacer reaccionar FSH con un agente donante de ácido siálico en presencia de 2,3-sialiltransferasa;
\bullet
seleccionar un tipo celular adecuado, para la expresión de FSH recombinante;
\bullet
cultivar una célula, preferiblemente recombinante, que esté expresando FSH, bajo unas condiciones que favorezcan niveles elevados de sialilación; y
\bullet
aislar isoformas de FSH que tengan un número Z elevado usando una técnica cromatográfica.
En un octavo aspecto, el invento proporciona el uso de FSH recombinante en el tratamiento de la esterilidad masculina, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un noveno aspecto, el invento proporciona el uso de FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de la esterilidad masculina, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
En un décimo aspecto, el invento proporciona un método para tratar la esterilidad masculina en un paciente humano, método que comprende administrar FSH recombinante al paciente, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un cromatograma relativo a la elución, a través de una columna GlycoSep® C, de glicanos liberados de rFSH: columna de 4,6 x 100 mm, rellena de resina de divinilbenceno revestida con polímero (5 \mum), con una fase móvil de acetonitrilo:agua (20:80), con un gradiente lineal de 0,25% por minuto de acetato amónico (500 mM) de 5 a 21 minutos, seguido de un gradiente lineal de 0,525% por minuto de acetato amónico (500 mM) de 21 a 61 minutos. El eje X muestra el tiempo de retención en minutos y el eje Y muestra la intensidad de señal en mV.
La Figura 2 muestra el número de folículos por categoría de tamaños, el día 8 (en el eje Y), en pacientes que han recibido isoformas ácidas y básicas de FSH hasta el día 7. Las líneas onduladas representan el resultado con isoformas ácidas y las líneas oblicuas representan el resultado con isoformas básicas.
La Figura 3 muestra el número de folículos por categoría de tamaños, el día 10 (en el eje Y), en pacientes que han recibido isoformas ácidas y básicas de FSH hasta el día 7. Las líneas onduladas representan el resultado con isoformas ácidas y las líneas oblicuas representan el resultado con isoformas básicas.
La Figura 4 muestra niveles séricos medios de FSH en pacientes después de la última dosis de isoformas ácidas y básicas de FSH. El eje X representa el tiempo en horas desde la primera inyección de FSH y el eje Y representa la concentración sérica en IU inmunorreactivas/l. Los cuadrados (\blacksquare) muestran la concentración sérica después de la inyección de isoformas ácidas; los rombos (\blacklozenge) muestran la concentración sérica después de la inyección de isoformas de FSH básicas. Las concentraciones séricas se midieron mediante un inmunoensayo, por ejemplo, un radioinmunoensayo, usando un sistema como el suministrado por Daiichi Isotope Laboratory, Japón.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa de FSH humana madura.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de FSH humana madura.
Descripción detallada del invento
Los inventores han hallado sorprendentemente que las isoformas de FSH recombinante muy sialiladas presentan una mayor eficacia a la hora de inducir foliculogénesis en pacientes humanos que las isoformas menos sialiladas. El uso de una preparación de FSH del invento permite el uso de dosis acumulativas menores de FSH para alcanzar un resultado clínico igual o mejor.
Los inventores han hallado que, cuando se tratan pacientes con cantidades iguales de FSH ácida y FSH básica, con respecto a una base de IU, según se determinan mediante el ensayo convencional, el número de folículos en crecimiento en los pacientes tratados con FSH ácida es significativamente mayor.
Cuando los pacientes se tratan con cantidades iguales de FSH ácida y FSH básica, con respecto a una base másica, el número de folículos en los pacientes tratados con FSH ácida es también sustancialmente mayor.
Algunos pacientes presentan un número reducido de folículos en crecimiento cuando son tratados con preparaciones de FSH convencionales. Esto es un factor limitante para el éxito cuando se lleva a cabo una ART. Los pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen pacientes con una edad superior a aproximadamente 33-35 años y pacientes con un valor de FSH de línea de base elevado, un valor de estradiol de línea de base elevado o un valor de inhibina b de línea de base reducido. La preparación de FSH recombinante de acuerdo con el invento puede ser inyectada una vez al día, o un día sí y otro no, para provocar una mejor respuesta ovárica que con las preparaciones convencionales. Esto aumenta las posibilidades de concepción de estos pacientes.
Los inventores también han hallado sorprendentemente que se pueden obtener preparaciones de FSH recombinante que tengan mayor eficacia, lo que permitiría administraciones menos frecuentes, usando una FSH recombinante que tenga un número Z que sea al menos 200, preferiblemente al menos 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 y 290, aumentando el orden de preferencia al aumentar el número Z (por supuesto, los números Z que caen entre estos valores están dentro del alcance del invento). Para inducir foliculogénesis, las preparaciones de FSH convencionales se administran generalmente cada día, con una dosificación de aproximadamente 75-600 IU/día. En la mayoría de los pacientes, puede administrarse la misma dosis acumulativa de una preparación de FSH convencional cada dos días, alcanzándose un resultado clínico similar al de las inyecciones diarias^{15}. La expresión "administraciones menos frecuentes" se quiere aplicar a preparaciones de FSH que pueden ser administradas menos frecuentemente que cada dos días, alcanzándose el mismo resultado clínico, en términos de volumen folicular total, que con las preparaciones convencionales administradas cada uno o dos días.
Los términos "ácida" y "básica" se usan mucho para referirse a preparaciones de FSH que tienen grados variables de sialilación. Puesto que el ácido siálico es ácido, las moléculas más sialiladas tendrán menores pI. Usando enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque u otros métodos de separación, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía rápida de proteínas en fase líquida (FPLC; del inglés, fast protein liquid chromatography) y cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography)^{16}, una mezcla de isoformas puede ser sometida a una separación de fracciones, fracciones que pueden ser denominadas ácidas o básicas basándose preferiblemente en el número Z.
La expresión "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico, a menudo abreviado Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc), en el que el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado). Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN)^{17}. También están incluidos ácidos siálicos 9-sustituidos tales como 9-O-acil-C_{1}-C_{6}-Neu5Ac, por ejemplo, 9-O-lactil-Neu5Ac y 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico véanse, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2 1.992, 25-40; y "Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function", compilado por R. Schauer [Springer-Verlag, New York, EE.UU. (1.992)].
Los grupos hidrato de carbono (alternativamente "glicano") están fijados a la cadena principal peptídica por medio de un solo azúcar, con un enlace glicosídico O-unido o N-unido. Puesto que el grupo hidrato de carbono se vuelve complicado, puede tener lugar ramificación, con el resultado de que el grupo hidrato de carbono tiene uno, dos, tres o cuatro (a veces más) restos de azúcar terminales o "antenas". A dichos grupos hidrato de carbono se hace referencia como mono-, di-, tri- o tetra-ramificados. El parámetro "índice de antenas" (AI; del inglés, antennarity index) proporciona una medida del grado de ramificación en los restos hidrato de carbono, proporcionando además una medida del tamaño tridimensional de los grupos hidrato de carbono. Para determinar este parámetro, se trata químicamente una glicoproteína para liberar todos los grupos hidrato de carbono, por ejemplo, mediante calentamiento con hidrazina, o se puede escindir enzimáticamente el hidrato de carbono con, por ejemplo, una endoglicosidasa (N-glicanasa)^{18}. La mezcla de hidratos de carbono es aislada. Si se desea, la mezcla de hidratos de carbono es hecha reaccionar con un marcador, tal como un marcador radiactivo, un marcador cromóforo (es decir, activo en el espectro UV-visible), un marcador fluoróforo, un marcador inmunorreactivo, etc. La mezcla de hidratos de carbono marcados es luego desialilada con la enzima sialidasa para obtener una mezcla de hidratos de carbono neutros marcados (alternativamente, puede invertirse el orden de las operaciones de marcación y desialilación). Luego se separan los componentes de la mezcla de hidratos de carbono neutros marcados, usando un método cromatográfico que permite distinguir las diferentes especies (mono-, di-, tri- y tetra-ramificadas). La cromatografía (fase normal o inversa) puede ser llevada a cabo usando esencialmente cualquier método, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en capa gruesa o delgada y cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC). Alternativamente, la mezcla de hidratos de carbono neutros aislada puede ser hecha reaccionar con un agente que vuelva volátiles a los componentes, y luego ser sometida a cromatografía en fase gaseosa (GC; del inglés, gas chromatography). La visualización será llevada a cabo con un método apropiado para el marcador y el método cromatográfico usado. Por ejemplo, si se usa un agente fluoróforo como marcador, se usará un fluorímetro para la detección; si se usa un agente cromóforo como marcador, se usará un espectrofotómetro UV-visible para la detección. Si no se usa marcador alguno, puede usarse la espectrometría de masas para medir los picos y los tiempos de retención. Las asignaciones de picos a las especies mono-, di-, tri- y tetra-ramificadas pueden realizarse usando la espectrometría de masas o mediante comparación con patrones conocidos.
Luego se analiza el cromatograma integrando los picos asociados con las especies mono-, di-, tri- y tetra-ramificadas de hidratos de carbono. El porcentaje representado por cada especie con relación al total de hidratos de carbono puede ser luego utilizado para calcular AI de acuerdo con la ecuación siguiente:
AI = 2 P_{di} + 3 P_{tri} + 4 P_{tetra}
en la que AI es el índice de antenas, y P_{di}, P_{tri} y P_{tetra} son, respectivamente, los porcentajes de hidratos de carbono, con respecto al total, que están di-, tri- y tetra-ramificados. Pueden estar presentes cantidades insignificantes de otros componentes (por ejemplo, de una sola antena), pero no contribuyen significativamente al valor AI.
Un índice de antenas elevado indica que los grupos hidrato de carbono están muy ramificados, con muchas antenas. La FSH humana recombinante tiene típicamente un AI de aproximadamente 220-280 o, por término medio, aproximadamente 255.
El parámetro número Z proporciona una medida de cuántas antenas de los grupos hidrato de carbono de una glicoproteína llevan restos cargados, tal como ácido siálico. Para determinar el número Z, los grupos hidratos de carbono son liberados del péptido, del modo anterior, y, si se desea, son marcados. La mezcla es luego sometida a separación por cromatografía de intercambio iónico, lo que permite la separación de especies basándose en la carga. La visualización de los picos eluidos puede ser en virtud de un marcador, como se mencionó anteriormente, o puede ser mediante algún otro método, tal como espectrometría de masas. Luego se analiza el cromatograma integrando los picos asociados con las especies de hidrato de carbono di-, tri- y tetra-cargadas. El porcentaje representado por cada especie con respecto al total de hidratos de carbono puede ser luego utilizado para calcular el número Z, de acuerdo con la ecuación siguiente:
Z = P'_{mono} + 2 P'_{di} + 3 P'_{tri} + 4 P'_{tetra}
en la que Z es el número Z, y P'_{mono}, P'_{di}, P'_{tri} y P'_{tetra} son, respectivamente, los porcentajes de hidratos de carbono, con respecto al total, que están mono-, di-, tri- y tetra-cargados.
Un número Z elevado indica que un gran número de antenas llevan restos cargados y que, por lo tanto, la glicoproteína estará muy cargada y, en el caso de restos de ácido siálico, será ácida. La FSH humana recombinante tiene típicamente valores de número Z en el intervalo de aproximadamente 150 a aproximadamente 190 o, por término medio, de aproximadamente 184.
Los inventores han hallado sorprendentemente que las isoformas de FSH recombinante que tienen números Z superiores a 200 muestran una eficacia aumentada, en términos de número de folículos, cuando se comparan, con respecto a una base de IU, con una "dosis equivalente" de isoformas de FSH que tienen números Z inferiores a 200. Por "dosis equivalente" se quiere significar que cuando se mide la cantidad de diferentes isoformas de FSH mediante el ensayo in vivo convencional comparando, bajo condiciones especificadas, su capacidad para aumentar la masa ovárica en ratas, la dosis en IU es la misma. En otras palabras, dosis equivalentes de isoformas diferentes, en IU, según se determinan en ratas, tienen diferente eficacia clínica cuando se administran a seres humanos.
Las preparaciones de FSH que tienen números Z aumentados pueden ser aisladas mediante diversas maneras. Por ejemplo, una partida de FSH recombinante puede ser sometida a enfoque isoeléctrico o cromatoenfoque del modo descrito, por ejemplo, por cualquiera de Mulders et al.^{19}, Zambrano et al.^{20} y Timossi et al.^{21}. Las fracciones que tienen diferentes pI pueden ser aisladas. Las preparaciones de FSH recombinante preferidas del invento tienen pI medios inferiores a 3,4, más preferiblemente inferiores a 3,3, particularmente preferiblemente inferiores a 3,2, aumentando el grado de preferencia conforme disminuye el pI medio.
El parámetro número Z refleja el grado medio de sialilación de una población de especies de FSH. Es posible que una preparación de FSH que tenga un número Z elevado pueda aún tener una proporción sustancial de especies básicas (menos sialiladas). Dichas especies básicas pueden actuar como antagonistas en el receptor de FSH y, por lo tanto, son indeseables. La "cobertura" de las especies presentes puede ser determinada por enfoque isoeléctrico o cromatoenfoque. El análisis del número Z puede proporcionar también una idea de la cobertura de especies. Se prefiere que la preparación tenga menos de aproximadamente 4% de especies de hidrato de carbono neutras (es decir, grupos glicano que no llevan carga) y menos de aproximadamente 16% de especies monosialiladas, y se prefiere más que la preparación tenga menos de aproximadamente 3%, 2% o 1% de especies neutras y menos de aproximadamente 15%, 12%, 10%, 8% o 5% de especies monosialiladas, aumentando el grado de preferencia al disminuir los porcentajes.
Dentro del alcance del invento hay preparaciones de FSH recombinante que tienen una eficacia aumentada sobre la foliculogénesis como resultado de un grado aumentado de sialilación en uno o más sitios de glicosilación adicionales de la proteína. Dichos sitios pueden ser introducidos mediante la sustitución de restos de la cadena principal proteica de FSH por restos de serina, treonina, lisina o asparagina usando, por ejemplo, mutagénesis. En el Ejemplo 7 se presenta un ejemplo de un método que puede ser utilizado para generar dichas formas mutantes de FSH. Para glicosilación in vivo, el sitio introducido debe ser tal que se forme un "sitio de N-glicosilación" con la secuencia siguiente: N-X'-S/T/C-X", en la que X' es un resto de aminoácido salvo prolina, X" es cualquier resto de aminoácido, que puede ser idéntico a X' o no y que es preferiblemente diferente de prolina, N es asparagina, y S/T/C representa un resto que puede ser serina, treonina o cisteína, preferiblemente serina o treonina, y muy preferiblemente treonina. Las isoformas ácidas (pI \leq 3,4) de dichas moléculas de FSH caen dentro del alcance del invento. En, por ejemplo, el documento WO 01/58493 (Maxygen) se describen dichas moléculas de FSH modificadas que llevan sitios de glicosilación adicionales. Se prefieren particularmente las mutaciones siguientes:
En la subunidad \beta: E4N, A70N, L73N, V78N, G100N, Y103N, F19N/I21T, L37N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T y R97N/L99T; y
En la sububnidad \alpha: E9N, F17T, F17N, R67N, V68T, E56N, H83N Y F33N/R35T,
en las que A es alanina, D es ácido aspártico, E es ácido glutámico, F es fenilalanina, G es glicocola, H es histidina, I es isoleucina, L es leucina, N es asparagina, R es arginina, T es treonina, V es valina, Y es tirosina, y la anotación "E4N" representa la sustitución de un ácido glutámico (E) de la posición 4 por una asparagina (N). Para la numeración de secuencias, la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa de FSH humana es numerada de acuerdo con la secuencia madura mostrada en la Figura 5 o la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de FSH humana es numerada de acuerdo con la secuencia madura mostrada en la Figura 6 o la SEQ ID NO: 2.
Dentro del alcance del invento también están preparaciones de FSH recombinante que tienen una eficacia aumentada sobre la foliculogénesis como resultado de un grado aumentado de sialilación en uno o más sitios de glicosilación adicionales presentes en un péptido adjunto. Por "péptido adjunto" se quiere significar cualquier péptido que incluye un sitio de glicosilación, y que puede estar fijado al extremo amínico y/o carboxílico de la subunidad \alpha y/o \beta de FSH sin afectar deletéreamente a la actividad FSH de la molécula resultante. Por ejemplo, la subunidad \beta de hCG es sustancialmente mayor que la de las demás gonadotropinas a causa de aproximadamente 34 aminoácidos adicionales en el extremo C, a los que aquí se hace referencia como porción terminal carboxílica (CTP). En la hCG urinaria, la CTP contiene cuatro oligosacáridos O-unidos de tipo mucina. Esta CTP puede estar ligada a la subunidad \beta de FSH, preferiblemente al extremo carboxílico de la subunidad \beta de FSH, lo que daría lugar a una molécula que tendría actividad FSH y tendría cuatro sitios adicionales de glicosilación. Las isoformas ácidas (pI \leq 4,4) de dichas moléculas de FSH caen dentro del alcance del invento. Dichas moléculas son descritas en el documento WO 93/06844 (Washington University) y por Boime et al.^{22}. En el documento WO 90/09800 (Washington University) se describen otras moléculas de FSH que tienen sitios de glicosilación modificados.
Para los fines de esta descripción, las preparaciones de FSH que tienen sitios de glicosilación adicionales serán denominadas FSH^{gli+}. Cuando se añaden sitios de glicosilación adicionales, el parámetro número Z ya no puede ser usado para comparar con preparaciones de FSH "normales" (es decir, aquéllas que tienen cuatro sitios de glicosilación) ya que este parámetro está normalizado (es una suma de porcentajes). Cuando una preparación de FSH^{gli+} es sometida a un análisis de especies de glicano, puede calcularse el parámetro "número Z^{+}" de una manera análoga a la usada para el número Z. Las preparaciones de FSH^{gli+} del invento tienen números Z^{+} superiores a 200, preferiblemente superiores a, 210, 220, 230, 240, 250, 260 y 270, aumentando el grado de preferencia conforme aumenta el número Z^{+}.
Las preparaciones de FSH^{gli+} del invento tienen perfiles de pI significativamente menores que la FSH normal. En cuanto a su eficacia aumentada, son particularmente preferidas las preparaciones de FSH^{gli+} que tienen pI medios inferiores a 4,4 y son más preferidas las que tienen pI medios inferiores a 4,2, 4,0, 3,8, 3,6, 3,4, 3,3 y 3,2, aumentando el grado de preferencia al disminuir el pI medio.
En todas las realizaciones del invento se usa FSH recombinante. Para el tratamiento de pacientes humanos, se prefiere FSH recombinante humana. Las preparaciones del invento pueden ser aisladas de FSH recombinante convencional o pueden ser aisladas de preparaciones de FSH^{gli+}.
Un aspecto del invento es también proporcionar un método para enriquecer el contenido de ácido siálico usando un método que los inventores llaman "refuerzo sialílico". Las preparaciones de FSH recombinante o FSH^{gli+} recombinante pueden ser sometidas a refuerzo sialílico por tratamiento con una enzima, tal como una glicosil transferasa, en particular sialiltransferasa, en presencia de un agente dador de ácido siálico, por ejemplo, CMP-ácido siálico, como se describe en el Documento WO 98/31826 (Cytel Corporation). En, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.541.083 (Universidad de California; Amgen) se encuentran ejemplos de sialiltransferasas recombinantes así como métodos para producir sialiltransferasas recombinantes. Se han documentado al menos 15 sialiltransferasas de mamífero diferentes y se han clonado los cDNAs de trece de éstas. Estos cDNAs pueden ser usados para la producción recombinante de sialiltransferasas, las cuales pueden ser luego usadas en los métodos del invento.
La sialiltransferasa que se usa será capaz de transferir ácido siálico a la secuencia Gal\beta1, 4GlcNAc, que son los penúltimos grupos más comunes que están debajo del ácido siálico terminal de las glicoproteínas sialiladas. Un ejemplo de una sialiltransferasa que puede utilizarse es ST3Gal III, a la que también se hace referencia como una (2,3)-sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico al Gal de un glicosido Gal-\beta-1,3-glicosilNAc o Gal-\beta-1,4-glicosilNAc^{23}. El ácido siálico está unido a un resto galactosilo (Gal) con la formación de un enlace \alpha entre los dos sacáridos. La unión de los sacáridos es entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Esta particular enzima puede ser aislada de hígado de rata^{24}; se conocen las secuencias de cDNA^{25} y DNA genómico^{26} humanas, lo que facilita la producción de esta enzima por expresión recombinante. En una realización preferida, en los métodos de sialilación se usa una ST3Gal III (preferiblemente de rata), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I o ST6GalNAc II, más preferiblemente ST3Gal III, ST6Gal I, ST3Gal IV, ST6Gal II o ST3Gal V, y, más particularmente, preferiblemente ST3Gal III de rata.
La cantidad de sialiltransferasa estará preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 50 mU por mg de FSH o menos, preferiblemente de aproximadamente 5-25 mU por mg de FSH. Bajo condiciones preferidas, la concentración de sialiltransferasa será aproximadamente 10-50 mU/ml y la concentración de FSH será aproximadamente 2 mg/ml.
También es posible producir FSH enriquecida en isoformas ácidas al transfectar una célula, recombinante o no, que esté expresando FSH, con un gen que codifica una sialiltransferasa, gen que es expresable en la célula. El gen puede comprender secuencias de codificación genómicas (es decir, con intrones) o puede comprender secuencias de codificación de cDNA. Alternativamente, si el genoma de la célula contiene secuencias endógenas que codifican sialiltransferasa, puede insertarse en el genoma de la célula una construcción que cause la expresión de FSH. Se puede aumentar la expresión de sialiltransferasa al insertar secuencias reguladoras no nativas, activas en la célula, en conexión operativa con las secuencias endógenas que codifican sialiltransferasa. También es posible insertar un gen multiplicable en conexión operativa con las secuencias que codifican sialiltransferasa, con objeto de causar la multiplicación de las secuencias genómicas que codifican sialiltransferasa. Estas manipulaciones pueden ser llevadas a cabo utilizando recombinación homóloga, como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.505.500 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.).
El grado de sialilación de una preparación de FSH puede ser también aumentado seleccionando una célula para expresión de FSH recombinante de la que se sabe que favorece la sialilación. Dichas células incluyen células hipofisarias y células de ovario de hámster chino seleccionadas que expresan niveles elevados de sialiltransferasas. Una preparación de FSH preparada en dicha célula puede ser adicionalmente sometida a un método de aislamiento, como el aquí mencionado, con objeto de aislar las isoformas que tienen un grado elevado de sialilación.
El grado de sialilación de una preparación de FSH puede ser también aumentado cultivando una célula que está expresando FSH, preferiblemente FSH recombinante, bajo unas condiciones que favorezcan un nivel elevado de sialilación. La sialilación puede ser favorecida al complementar los medios de cultivo con inhibidores de neuraminidasa y/o con precursores intracelulares directos para la síntesis de ácido siálico, tal como acetilmanosamina. Una preparación de FSH preparada bajo dichas condiciones de cultivo puede ser adicionalmente sometida a un método de aislamiento, como el aquí mencionado, con objeto de aislar las isoformas que tienen un grado elevado de sialilación.
Si se usa el refuerzo sialílico, es deseable que, antes de la sialilación enzimática, la preparación de FSH tenga un AI elevado con objeto de proporcionar muchas antenas para la fijación de restos de ácido siálico. Preferiblemente, la FSH debería tener un AI superior a 220, más preferiblemente debería tener un AI superior a 240 y, más particularmente, debería tener preferiblemente un AI superior a 270. Las FSH que tienen mayores AI pueden ser aisladas usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad sobre Sepharose derivatizada con concanavalina A (Con-A), realizándose la elución con un gradiente de metil-glucosa, o mediante HPLC preparativa.
El método de refuerzo de la sialilación del invento puede ser ventajosamente aplicado a preparaciones de FSH que hayan sido modificadas para introducir uno o más sitios adicionales de glicosilación (preparaciones de FSH^{gli+}). De dichas preparaciones de FSH^{gli+} pueden separarse también aquellas fracciones que tengan AI elevados antes del refuerzo sialílico.
El invento incluye preparaciones de FSH recombinante obtenidas al hacer que se exprese FSH en células que no son capaces de sialilación y someter luego la FSH a refuerzo sialílico. Por ejemplo, en el Documento WO 99/13081 (Akzo Nobel N.V.) se describe la expresión de FSH de tipo silvestre y muteínas en el eucarionte unicelular Dictyostelium, particularmente muteínas que tienen sitios de glicosilación adicionales. Dictyostelium no es capaz de sialilar glicanos. El invento incluye preparaciones de FSH recombinante obtenidas al someter FSH de tipo silvestre o muteínas expresadas en Dictyostelium a refuerzo sialílico.
Después del refuerzo sialílico, las preparaciones de FSH recombinante que tienen el deseado grado de sialilación pueden ser aisladas usando cromatografía de intercambio iónico, enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque, o cromatografía sobre concanavalina A (Con-A).
La FSH recombinante del invento tiene un número Z de al menos 200, más preferiblemente al menos 210, particularmente preferiblemente al menos 220, más particularmente preferiblemente al menos 230, 240, 250, 260 ó 270, aumentando el grado de preferencia al aumentar el número Z. La FSH totalmente sialilada tiene un número Z de 230 a 280 dependiendo del índice de antenas. Las preparaciones de FSH muy preferidas de acuerdo con el invento tiene un número Z de 230 a 280.
Las preparaciones de FSH recombinante del invento son preparadas para que tengan consistentemente un número Z de al menos 200, o los números Z preferidos anteriormente mencionados. La FSH del invento puede ser aislada de una mezcla de isoformas usando diversos métodos que serán conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo puede utilizarse enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque o cromatografía de intercambio iónico para separar las isoformas basándose en el pI. Las diferentes fracciones pueden ser analizadas en cuanto al contenido de ácido siálico, y las fracciones deseadas pueden ser seleccionadas para su uso. En los Ejemplos se da un ejemplo de condiciones adecuadas para cromatografía de intercambio iónico. Dichos métodos de separación pueden ser utilizados para aislar la FSH del invento a partir de rFSH convencionalmente producida, o pueden ser utilizados para aislar isoformas deseadas a partir de FSH tratada con sialiltransferasa o las otras técnicas recombinantes anteriormente mencionadas.
En un aspecto, el invento proporciona una composición farmacéutica que comprende una FSH recombinante de acuerdo con el invento (es decir, que tiene un número Z de al menos 200; los valores preferidos para el número Z mínimo son como se indicaron anteriormente). Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas para estimular la foliculogénesis, por ejemplo, junto con inducción de la ovulación o técnicas de reproducción asistida (ART). Puesto que la FSH del invento es particularmente eficaz a la hora de inducir el desarrollo y la maduración de múltiples folículos, es particularmente adecuada para uso en ART, en las que se desea recoger múltiples
ovocitos.
Alternativamente, con un cuidadoso ajuste de la dosis, puede usarse la FSH recombinante del invento para inducir una monofoliculogénesis para OI o una paucifoliculogénesis (hasta aproximadamente tres folículos) para IUI, para fertilización in vivo. La monofoliculogénesis puede ser también alcanzada con una dosis reducida de FSH o con administraciones menos frecuentes en comparación con las preparaciones de FSH convencionales. Por ejemplo, en OI, puede administrarse una preparación de FSH recombinante del invento en una cantidad de 225-400 IU cada tres días, o en dosis menores, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta del paciente puede ser seguida por sonografía.
La FSH recombinante del invento será típicamente formulada como una composición farmacéutica, la cual comprenderá además un agente diluyente o excipiente. Una persona experta en la técnica está al corriente de la gran variedad de tales agentes diluyentes o excipientes adecuados para formular una composición farmacéutica.
La FSH recombinante del invento es típicamente formulada como una dosificación unitaria en forma de un sólido listo para disolución, para formar una disolución inyectable estéril para uso intramuscular o subcutáneo. El sólido procede normalmente de una liofilización. Los excipientes y vehículos típicos incluyen sacarosa, lactosa, cloruro sódico y agentes tampón tales como fosfato monobásico de sodio y fosfato dibásico de sodio. La disolución puede ser preparada al diluir con agua para inyección inmediatamente antes del uso.
La FSH recombinante del invento puede ser también formulada como una disolución para inyección, que comprende cualesquiera de los excipientes y tampones anteriormente indicados y otros conocidos por los expertos en la técnica.
La FSH recombinante del invento puede ser usada en un régimen de hiperestimulación ovárica controlada (COH). Los regímenes estándares^{27} para COH incluyen una fase de infrarregulación en la que se infrarregula la hormona luteinizante (LH) endógena mediante la administración de un agonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), seguida de una fase estimuladora en la que se induce un desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante la administración diaria de hormona estimulante del folículo (FSH), normalmente en una cantidad de aproximadamente 75-600 IU/día, preferiblemente de aproximadamente 150-225 IU/día. Alternativamente, se inicia la estimulación con FSH después de una menstruación espontánea o inducida, lo que va seguido de la administración de un antagonista de GnRH (comenzando típicamente cerca del día seis de la fase estimuladora). Cuando hay al menos 3 folículos > 16 mm (uno de 18 mm), se administra un único bolo de hCG (5-10,000 IU) para remedar la oleada natural de LH e inducir la ovulación. La inyección de hCG es típicamente administrada cualquiera de los días 10 a 14, pero puede ser administrada más tarde, dependiendo de cuándo se cumplen los parámetros anteriores. Se calcula un tiempo de 36-38 horas después de la inyección de hCG para la recuperación de ovocitos.
La FSH recombinante del invento puede ser también utilizada para OI e IUI. Por ejemplo, la estimulación de FSH con una preparación del invento se inicia después de una menstruación espontánea o inducida, con una dosis diaria de 75-150 IU. Cuando 1 ó 3 folículos han alcanzado un diámetro de al menos 16 mm, se administra un bolo único de hCG para inducir la ovulación. La inseminación se lleva a cabo in vivo por contacto sexual regular o IUI.
Puesto que la FSH recombinante del invento tiene una eficacia aumentada con respecto a las preparaciones de FSH conocidas, pueden emplearse dosis menores de FSH (en IU) en regímenes tales como los anteriormente descritos y/o pueden modificarse estos disminuyendo el período de estimulación con FSH, alcanzándose una respuesta igual o mejor en términos de número y viabilidad de folículos. Por ejemplo, usando una preparación de FSH del invento, puede alcanzarse una foliculogénesis adecuada con aproximadamente 50-150 IU de FSH, preferiblemente aproximadamente 50-100, más preferiblemente aproximadamente 50-75 IU de FSH. La dosificación de FSH se realiza normalmente con respecto a una base diaria o semidiaria. El período de administración puede ser inferior a aproximadamente 14 días, preferiblemente inferior a aproximadamente 12 días, más preferiblemente inferior a aproximadamente 11 ó 10 días.
Para OI, las preparaciones de FSH recombinante del invento pueden ser administradas en dosis de 25-150 IU de FSH/día, preferiblemente de 50-125 IU de FSH/día.
Para el tratamiento de la esterilidad masculina, puede administrarse una preparación de FSH recombinante del invento en cantidades de 3 x 150 a 300 IU/semana hasta que la espermatogénesis alcance los niveles adecuados para la inseminación, sea por medio de contacto sexual regular o mediante técnicas ART.
Los inventores han hallado además que, a causa de su eficacia aumentada, las preparaciones de FSH recombinante que tienen un número Z de al menos 200 pueden administrarse menos frecuentemente que las preparaciones de FSH que tienen un número Z inferior a 200 (para los fines de esta descripción, se usarán los términos FSH^{+200}, FSH^{+210}, FSH^{+220}, etc. para representar preparaciones de FSH que tienen números Z en el intervalo de 200-210, 211-220, 221-230, etc.). Esto significa que pacientes que normalmente requerirían cada día, por ejemplo, 150 IU de FSH convencional para alcanzar una foliculogénesis adecuada, pueden alcanzar el mismo resultado con, por ejemplo, 225 IU de FSH^{+200} cada tres días o 300 IU de FSH^{+200} cada cuatro días. A causa de la eficacia aumentada de FSH^{+200} en comparación con las preparaciones de FSH convencionales, las dosis anteriormente citadas pueden ser disminuidas en aquellos pacientes que muestren una buena respuesta. Con preparaciones de FSH recombinante del invento que tienen números Z no inferiores a 230, puede ser posible administrar inyecciones sólo cada cinco, seis o siete días, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta puede ser evaluada por sonografía y/o midiendo los niveles séricos de estradiol. Otros regímenes adecuados son los siguientes: 100 IU de FSH^{+210} cada dos días, 200 IU de FSH^{+210} cada tres días, 275 ó 300 IU de FSH^{+210} cada cuatro, 80-100 IU de FSH^{+220} cada dos días, 180-200 IU de FSH^{+220} cada tres días, 260-300 IU de FSH^{+220} cada cuatro días, 75-100 IU de FSH^{+230} cada dos días, 170-200 IU de FSH^{+230} cada tres días, 250-300 IU de FSH^{+230} cada cuatro días, 275-400 IU de FSH^{+250} cada cinco días, 375-450 IU de FSH^{+250} cada seis días, y 450-525 IU de FSH^{+250} cada siete días.
La expresión "eficacia aumentada", como se usa aquí en relación con un efecto sobre la foliculogénesis, incluye cualquier mejora o aumento mensurable en el número y/o la viabilidad de los folículos en un individuo, por ejemplo, cuando se compara con el número y/o la viabilidad de los folículos en uno o más pacientes tratados con una dosis equivalente (IU/IU), según se determina en el ensayo convencional del aumento de peso ovárico en ratas, de FSH que tiene un número Z inferior a 200. Preferiblemente, la mejora o aumento será aquél estadísticamente significativo, preferiblemente con un valor de probabilidad de < 0,05. Los métodos para determinar la significación estadística de resultados son bien conocidos y están documentados en la técnica, y puede usarse cualquier método apropiado.
El invento será ilustrado con los siguientes Ejemplos no restrictivos.
Ejemplos Ejemplo 1 Determinación del número Z
El mapeo de glicanos permite la determinación del número Z de una glicoproteína.
Se liberaron los grupos glicano de FSH humana recombinante, usando un instrumento GlycoPrep® 1000 totalmente automatizado de Oxford GlycoSciences u otro equivalente, con hidrazina a 100ºC durante 5 horas.
Las especies de glicano fueron separadas de la hidrazina sin reaccionar y las hidrazidas de aminoácido usando una columna de glóbulos de vidrio revestido. Las especies de glicano fueron eluidas con un reactivo de acetato sódico.
Las especies de glicano fueron acetiladas con anhídrido acético. Los reactivos en exceso fueron eliminados usando una columna de intercambio iónico y lecho mixto. Toda especie de glicano no reducida es recogida en una disolución diluida de tampón de acetato.
Las especies de glicano fueron recogidas en un filtro de 0,5 \mum (Oxford GlycoSciences) y fueron liofilizadas. Las especies de glicano secadas fueron marcadas al hacerlas reaccionar con un agente reductor que tenía un grupo fluoróforo (por ejemplo, 2-aminobenzamida o 2-AB), bajo condiciones ácidas durante 120 minutos a 65ºC.
Las especies de glicano marcadas fueron separadas de los reactivos en exceso usando una membrana hidrófila de adsorción que retiene las especies de glicano. Las especies de glicano fueron recuperadas en agua y fueron guardadas congeladas hasta la separación cromatográfica.
Las especies de glicano marcadas fueron separadas por cromatografía de intercambio aniónico. El procedimiento cromatográfico se lleva a cabo del modo siguiente:
\bullet
La columna es una columna GlycoSep® C, de 4,6 x 100 mm, rellena de resina de divinilbenceno revestida con polímero (5 \mum).
\bullet
El caudal de la fase móvil es 0,4 ml/minuto;
Fase móvil A: acetonitrilo (calidad cromatográfica);
Fase móvil B: acetato amónico 500 mM, pH de 4,5;
Fase móvil C: agua ultrapura.
\bullet
La detección es con un fluorímetro ajustado así: \lambda_{excitación} = 330 nm, \lambda_{emisión} = 420 nm.
\bullet
La elución es bajo las siguientes condiciones de elución:
Condiciones iniciales: 20% de fase A, 80% de fase C;
Gradiente lineal de fase B (0,25% por min) de 5 a 21 min, 20% de fase A constante;
Gradiente lineal de fase B (0,525% por min) de 21 a 61 min, 20% de fase A constante;
\bullet
La columna es mantenida a una temperatura de 30 \pm 2ºC.
Las especies de glicano resultan eluidas de acuerdo con su carga de especies neutras, mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. En la Figura 1 se muestra un cromatograma típico.
En el cromatograma obtenido, los picos fueron agrupados de acuerdo con los intervalos de tiempos de retención que corresponden a los grados de sialilación indicados en la Tabla 1.
TABLA 1
Tiempos de retención y números de cargas para glicanos liberados de rFSH
Tiempos de retención (min) Especies de glicano Número de cargas
2 a 4 Neutras 0
15 a 21 Monosialiladas P_{mono}
21 a 35 Disialiladas P_{di}
35 a 45 Trisialiladas P_{tri}
45 a 52 Tetrasialiladas P_{tetra}
Los resultados para cada grupo de glicanos se expresaron como el porcentaje del área total de los diferentes grupos de glicanos (neutros, mono-, di-, tri- y tetra-), y se calcula un número Z a partir de las proporciones de las diferentes especies (P_{glicano}):
Z = P'_{mono} + 2 P'_{di} + 3 P'_{tri} + 4 P'_{tetra}
Ejemplo 2 Determinación del índice de antenas (AI)
Los glicanos fueron liberados de la cadena principal peptídica por hidrazinolisis y fueron luego marcados fluorescentemente utilizando 2-aminobenzamida (2-AB), como se detalló en el Ejemplo 1.
Los glicanos marcados con 2-AB fueron desialilados enzimáticamente con sialidasa (Vibrio cholerae) en acetato amónico 250 mM, pH de 5,5, que contenía cloruro cálcico 20 mM, durante 18 horas a 37ºC. Se usan aproximadamente 0,05 U de sialidasa para glicanos procedentes de una cantidad inicial de 100 \mug de rhFSH.
Los glicanos desialilados fueron secados bajo vacío y fueron guardados a -20ºC antes de la separación por HPLC preparativa en fase inversa, bajo las condiciones siguientes:
\bullet
La columna era una columna GlycoSep® R;
\bullet
El caudal de la fase móvil era 0,7 ml/minuto;
Eluyente A: acetato amónico 50 mM, pH de 6,0;
Eluyente B: acetato amónico 50 mM, pH de 6,0, que contenía acetonitrilo al 8%;
\bullet
La detección fue con un fluorímetro ajustado así: \lambda_{excitación} = 330 nm, \lambda_{emisión} = 420 nm.
\bullet
Temperatura de la columna: 30ºC.
Antes de su aplicación a la columna, las muestras secadas fueron reconstituidas con Eluyente A (200 \mul): se aplicaron 50 \mul de esta disolución.
Se usó el gradiente siguiente:
t = 0 (min):
A al 55%, B al 45%
t = 15 (min):
A al 55%, B al 45%
t = 70 (min):
A al 0%, B al 100%
t = 75 (min):
A al 0%, B al 100%
t = 76 (min):
A al 55%, B al 45%.
Los picos son asignados a di-, tri- y tetra-antenas usando espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESMS; del inglés, electrospray mass spectrometry) y espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser asistida por matriz y analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS; del inglés, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry).
Los resultados se expresan como porcentajes relativos P de di-antenas, tri-antenas y tetra-antenas, siendo 100% la suma de todos los glicanos. Luego se calcula el AI usando la ecuación siguiente:
AI = 2 P_{di} + 3 P_{tri} + 4 P_{tetra}
en la que AI es el índice de antenas, y P_{di}, P_{tri} y P_{tetra} son, respectivamente, los porcentajes de hidratos de carbono, con relación al total, que están di-, tri- y tetra-ramificados.
Ejemplo 3 Separación de fracciones de FSH basándose en el grado de sialilación
Se separaron fracciones ácidas y básicas de FSH recombinante usando cromatografía de intercambio aniónico sobre DEAE-Sepharose FF.
\bullet
La columna usada tenía unas dimensiones de 1,6 x 20 cm (XK Pharmacia o equivalente) para una purificación a escala de laboratorio (aproximadamente 60 mg de carga proteica) y 3,4 x 40 cm (Vantadge Amicron o equivalente) para purificaciones a mayor escala, y estaba rellena de resina DEAE-Sepharose FF;
\bullet
El caudal de la fase móvil era 150-250 cm/hora;
Tampón 1 de Equilibrio: Tris-HCl 2 M, pH de 7,0 \pm 0,1;
Tampón 2 de Equilibrio: Tris-HCl 25 mM, pH de 7,0 \pm 0,1, conductividad de 2,15 \pm 1,5 mS/cm;
Tampón 1 de Elución: Tris 25 mM, pH de 7,0 \pm 0,1, NaCl 35 mM, conductividad de 5,8 \pm 0,4 mS/cm (este tampón permite eluir las isoformas más básicas)
Tampón 2 de Elución: Tris 25 mM, pH de 7,0 \pm 0,1, NaCl 150 mM, conductividad de 18,3 \pm 0,5 mS/cm (este tampón permite eluir las isoformas más ácidas)
Disolución de regeneración: NaOH 0,5 M, NaCl 1 M;
Disolución de almacenamiento: NaOH 10 mM;
\bullet
La columna fue mantenida a 23 \pm 3ºC o 5 \pm 3ºC.
Se preparó la FSH para carga en la columna del modo siguiente:
La masa de rhFSH congelada fue descongelada a 5 \pm 3ºC. Una vez completada la descongelación, la disolución [3-4 mg de rhFSH, según se estima por densidad óptica (DO) a 276,4 nm, por ml de resina] fue diluida con Tris-HCl 2 M, pH de 7,0 \pm 0,1, en la relación siguiente: 1 parte de tampón y 79 partes de masa de rhFSH. La concentración final de Tris-HCl era 25 mM. El pH se ajustó a 7,0 \pm 0,1 con HCl 1 M.
Se preparó la columna haciendo pasar 3 volúmenes de lecho (BV; del inglés, bed volume) de NaOH 0,5 M, seguidos de 6 BV de agua. Se alcanzó el equilibrio al hacer pasar 4-5 BV de Tampón 1 de Equilibrio, hasta que se midió un pH de aproximadamente 7. Luego se continuó haciendo pasar 7-8 BV de Tampón 2 de Equilibrio.
Se cargó una muestra de rhFSH, preparada del modo anterior, en la columna. Una vez completada la carga, se hicieron pasar 3 BV de Tampón 1 de Equilibrio por la columna.
Luego se inició la elución con Tampón 1 de Elución y se empezó la recogida de la fracción básica cuando el valor de absorbancia (276,4 nm) comenzó a aumentar, recogida que se continuó durante 20 \pm 1 volúmenes de lecho. Luego se cambió el eluyente por Tampón 2 de Elución y se empezó la recogida de la fracción ácida tan pronto como el valor de absorbancia (276,4 nm) comenzó a aumentar, recogida que se continuó durante 3 \pm 1 volúmenes de lecho.
Luego se sometieron las fracciones a ultrafiltración, con objeto de concentrarlas, con un equipo de ultrafiltración para células tipo 8400 (Amicon o equivalente) provisto de una membrana YM3 para la fracción básica y de una YM10 para la fracción ácida. Todas las operaciones se llevaron a cabo a 5 \pm 3ºC.
Ejemplo 4 Estudio clínico para comparar isoformas de FSH
Se evaluó comparativamente la eficacia de dos partidas experimentales de rhFSH sobre voluntarios.
Se generaron dos preparaciones de FSH al dividir la rhFSH en dos fracciones usando cromatografía de intercambio iónico, como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. La partida A fue considerada "ácida" y tenía un número Z de 220 (es decir, la fracción ácida del Ejemplo 3), mientras que la partida B fue considerada "básica" y tenía un número Z de 160 (es decir, la fracción básica del Ejemplo 3).
Utilizando el ensayo convencional del aumento de peso ovárico en ratas, se cargaron partida A y partida B en ampollas de modo que cada una de éstas contuviera aproximadamente 150 IU de FSH.
En la Tabla 2 se presentan las características de las dos partidas. Ha de advertirse que, puesto que los viales estaban cargados con IU, la cantidad real de FSH en las ampollas de la partida B básica era aproximadamente el 250% de la cantidad de FSH en la partida A ácida (aproximadamente 24 \mug frente a aproximadamente 9 \mug).
TABLA 2
Características de las partidas de FSH usadas en el estudio clínico
Partida A "ácida" Partida B "básica"
Contenido de FSH por ampolla 8,7 \mug/ampolla 23,8 \mug/ampolla
Bioactividad específica 19.753 IU/mg 7.386 IU/mg
Número Z 220 160
Índice de antenas (AI) 274 237
La bioactividad específica se calcula dividiendo la actividad en IU por el peso de proteína.
El grupo de pacientes era 32 voluntarias premenopáusicas. Las pacientes fueron sometidas a infrarregulación hipofisaria mediante inyecciones diarias de Decapeptyl (0,1 mg). Después de 14 días, se llevó a cabo un examen sonográfico y, en ausencia de quistes, se inició una estimulación con la Partida A o la Partida B de rFSH (150 IU/día). Se evaluó diariamente el crecimiento folicular por sonografía y las concentraciones séricas de E_{2}.
Durante la estimulación con FSH, se desarrollarán folículos y crecerá su diámetro. Se midieron y contaron los folículos de cada paciente los días 8 y 10 de estimulación y se anotó el número de folículos cuyo tamaño caía en las categorías 0-10 mm, 11-15 mm y 16-25 mm. En la Figura 2 se muestra el número medio de folículos por paciente que caen en cada categoría, para grupos de pacientes tratados con isoformas ácidas y básicas, el día 8. En la Figura 3 se muestra el mismo gráfico para el día 10.
Los resultados del estudio mostraron que, aunque el tamaño folicular progresaba regularmente con el tiempo en el grupo básico, el grupo ácido daba lugar a una segunda cohorte de folículos, ligeramente retrasada con respecto a la primera, con un consiguiente aumento acusado en la formación de folículos, que casi duplicaba a la del grupo básico. El tamaño de esta segunda cohorte aumentaba del día 8 al 10. El resultado es que, en el grupo de pacientes tratados con FSH "ácida", el día 10 había por término medio un total de 18 folículos con un tamaño superior a 11 mm, mientras que, en el grupo tratado con isoforma "básica", el número medio de folículos con un tamaño superior a 11 mm era sólo 11 el día 10.
El número total medio de folículos el día 10 es 28 en el grupo "ácido", mientras que es 19 en el grupo "básico".
Se determinó el volumen folicular total (TFV; del inglés, total follicular volume) medio por paciente usando sonografía. El TFV era 30% mayor en el grupo que había recibido FSH "ácida" que en el grupo que había recibido FSH "básica".
Los niveles séricos de FSH de los pacientes, medidos mediante un radioinmunoensayo, eran mayores en el grupo básico, como se esperaba según la masa proteica inyectada; sin embargo, la diferencia era sólo aproximadamente 30% (véase la Figura 4) para una diferencia de administración de 250%, lo que está de acuerdo con la mayor resistencia metabólica de las formas ácidas.
Ejemplo 5 Separación de fracciones de FSH basándose en el índice de antenas (AI)
Las preparaciones de FSH que tienen índices de antenas mayores que los normales pueden ser aisladas utilizando HPLC o cromatografía de afinidad con Sepharose derivatizada con concanavalina A (Con-A).
Ejemplo 6 "Refuerzo sialílico" con sialil-transferasa
Se disolvió FSH humana recombinante ("material de partida"; 10 mg) en tampón (HEPES 0,1 M, pH de 7,5) en una concentración de 4,3 mg/ml. A esta disolución se añadió sialil-transferasa recombinante de rata (ST3Gal III) a una concentración de 100 mU/ml y ácido citidina-5'-monofosfato-N-acetil-neuramínico (CMP-NeuAc), como agente dador de ácido siálico, en una concentración de 20 mM. Alternativamente, el agente dador de ácido siálico puede ser generado in situ utilizando NeuAc 20 mM y CMP 2 mM en presencia de CMP-ácido siálico sintetasa. La mezcla de reacción fue incubada a 37ºC durante 24 horas. Las fracciones enriquecidas en ácido siálico fueron aisladas usando las técnicas descritas en el Ejemplo 3.
El refuerzo sialílico puede ser llevado también a cabo usando un material de partida que consiste en una FSH que tiene un índice de antenas potenciado, preparada de acuerdo con el Ejemplo 5.
Alternativamente, el refuerzo sialílico puede ser llevado a cabo con un material de partida de FSH que ya tiene un número Z elevado en comparación con la FSH recombinante convencional. Dicho material de partida puede ser aislado usando las técnicas del Ejemplo 3.
Ejemplo 7 Generación de mutantes de FSH
Los cDNAs de las subunidades \alpha y \beta de FSH humana fueron subclonados en el vector pDONR (Invitrogen). Se utilizó el sistema QuikChange™ (Stratagene) de mutagénesis dirigida al sitio, para introducir sitios de glicosilación N-unidos en las subunidades \alpha y \beta de FSH. En el sistema QuikChange™ se usan dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos que contienen la(s) mutación(es) deseada(s). Se usaron los siguientes pares de oligonucleótidos para introducir los sitios de glicosilación N-unidos: CC TTG TAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC y GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG para V78N, GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C y GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC para A70N, GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA y TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC para D41N/A43T, TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC y GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA para G100N, G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG y CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C para E56N, y CAG GAA AAC CCA ACC TTC TCC CAG CC Y GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG para F17T. Se confirmaron las secuencias de DNA de los cDNAs mutantes usando el sistema ABI PRISM BigDye™ Terminator v3.0 Ready para secuenciación por ciclos de reacción, seguido de un análisis con el analizador genético ABI PRISM 310.
El vector de expresión pCI de mamífero (Promega) fue convertido en un vector de destino GATEWAY usando el sistema GATEWAY para conversión de vectores (Invitrogen). Los mutantes \alpha y \beta, junto con las subunidades de tipo silvestre, fueron subclonados en el vector de expresión pCI usando la tecnología de clonación Gateway™ (Invitrogen). El vector de expresión pCI contiene el potenciador/promotor inmediato-precoz del citomegalovirus humano para regular la expresión del gen insertado, un intrón cadena arriba del gen para promover la expresión, y la señal de poliadenilación tardía del virus 40 de simios, cadena abajo del gen insertado, para terminar la transcripción. Los mutantes alfa E56N y F17T, en pCI, fueron cotransfectados con FSH \beta de tipo silvestre en PCI, mientras que los mutantes \beta A70N, G100N, V78N y D41N/A43T, en PCI, fueron cotransfectados con la subunidad \alpha de tipo silvestre en PCI. Como testigos, se cotransfectaron la subunidad \beta de tipo silvestre de FSH en PCI y la subunidad \alpha en PCI. Se transfectaron transitoriamente células HEK293 (ATTC, CRL-10852) con los plásmidos usando el método del fosfato cálcico (por ejemplo, del modo descrito en el Documento WO 96/07750). Alternativamente, el plásmido pCI que contiene la subunidad \beta de tipo silvestre o el mutante \beta V78N fue cotransfectado con la subunidad \alpha de tipo silvestre en pCI. También pueden transfectarse transitoria o establemente células CHO con los plásmidos. Un día después de la transfección, el medio fue cambiado a DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) que contenía 1 \mug/ml de insulina (Invitrogen, 18140-020), 6,8 ng/ml de selenito sódico (Sigma, S5261) y 12,2 ng/ml de citrato férrico (Sigma, F3388). Un día después del cambio de medio, el medio acondicionado fue recogido y fue centrifugado durante 5 min a aproximadamente 800 x g, a 4\betaC, para eliminar todo fragmento celular. El sobrenadante fue separado y fue centrifugado a 16.000 x g en una centrífuga Biofuge Fresco (Heraeus Instruments) durante 5 minutos, y el medio fue luego adicionalmente clarificado por filtración a través de un filtro Acrodisc de 0,45 \mum (Gelman Sciences, 4184). Al extracto celular clarificado se añadió Tris 1 M, pH de 7,4, para
una concentración final de Tris de 50 mM, y se añadió Tween20 para una concentración final de Tween 20 de 0,1%.
Los mutantes de FSH fueron purificados del extracto celular utilizando cromatografía de inmunoafinidad sobre Sepharose derivatizada con anticuerpos monoclonales anti-FSH inmovilizados utilizando divinilsulfona (Inmunoresina de anticuerpo monoclonal anti-FSH-DVS-Sepharose). Dichas resinas pueden ser producidas mediante métodos conocidos por el técnico experto, como se describe, por ejemplo, en el Documento WO 88/10270.
La resina fue equilibrada en un tampón de equilibrio que consistía en un tampón de Tris-HCl 0,1 M y NaCl 0,3 M, pH = 7,5, a 4ºC. Se cargó en la columna una cantidad de IU de FSH (por radioinmunoensayo, RIA) correspondiente al 80-90% de la capacidad ligante total de FSH de la columna.
Las proteínas no retenidas fueron eluidas con tampón de equilibrio (como el anterior) hasta que la DO_{280} del producto de elución fue inferior a 0,02.
La FSH mutante absorbida fue eluida de la inmunoresina con una disolución 1 M de amoniaco a 4ºC.Se reunieron los productos de elución correspondientes a aproximadamente cuatro veces el volumen de la inmunoresina, se ajustó el pH a 9,0 mediante la adición de ácido acético glacial a 4ºC, lo más pronto posible después de la recogida, y se ultrafiltró la disolución en un aparato Amicon (corte de membrana de 10.000 Da) y se concentró hasta un volumen pequeño.
La disolución concentrada de FSH mutante fue luego sometida a una operación de HPLC en fase inversa usando un cromatógrafo Waters Prep LC 500A para fases líquidas provisto de un detector UV y un generador de gradientes preparativos. Antes de la aplicación a la columna, se ajustó el pH de la disolución a aproximadamente 5,6. Se cargó la disolución en una columna de fase inversa C_{18} (cartuchos de Prepak 500 C_{18}, Waters) que había sido previamente equilibrada con tampón de acetato amónico 0,05 M, pH = 5,6, a temperatura ambiental. El caudal fue 100 ml/minuto y el producto de elución fue observado a 280 nm.
La FSH mutante fue eluida mediante un gradiente de isopropanol de hasta el 50% de la fase móvil. Las fracciones fueron controladas mediante cromatografía en fase gaseosa (GPC; del inglés, gas phase chromatography) analítica y radioinmunoensayo (RIA). El disolvente orgánico fue eliminado por destilación bajo vacío a menos de 40ºC y la disolución fue congelada y liofilizada.
Las preparaciones de FSH mutante expresadas en células CHO fueron sometidas a cromatografía de intercambio iónico, del modo descrito en el Ejemplo 3, con objeto de aislar fracciones que tuvieran números Z^{+} superiores a 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 y mayores.
Las preparaciones de FSH mutante expresadas en células CHO o HEK293 fueron sometidas a refuerzo sialílico, del modo descrito en el Ejemplo 6. Después del refuerzo sialílico, la FSH mutante fue sometida a cromatografía de intercambio iónico, de acuerdo con el Ejemplo 3, para aislar fracciones que tuvieran números Z^{+} superiores a 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 y mayores.
Referencias
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^{27} Se describe una técnica convencional en, por ejemplo, el Documento EP 0.170.502 (Serono Laboratories, Inc.).
<120> Hormonas estimulantes del folículo
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 111
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
2

Claims (23)

1. Una composición farmacéutica que comprende FSH recombinante, en la que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200, preferiblemente al menos 220, más preferiblemente al menos 240, muy preferiblemente al menos 260.
2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en medicina.
3. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la FSH recombinante tiene un índice de antenas AI de 220-280.
4. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la FSH recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino.
5. Un uso de FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en foliculogénesis, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
6. Un uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la FSH se administra sobre una base diaria o semidiaria en una dosis de 50-75 IU durante menos de 14 días.
7. Un uso de una FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en hiperestimulación ovárica controlada, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
8. Un uso de una FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en inducción de la ovulación o inseminación intrauterina, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
9. Un uso de una FSH recombinante en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de la esterilidad masculina, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 200.
10. Un uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la FSH se administra en 3 cantidades de 150 a 300 IU por semana hasta que la espermatogénesis alcanza los niveles adecuados para una inseminación.
11. Un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 220, preferiblemente al menos 240, más preferiblemente al menos 260.
12. Una composición farmacéutica o un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la FSH tiene un pI medio inferior a 3,4, más preferiblemente inferior a 3,3, particularmente preferiblemente inferior a 3,2.
13. Una composición farmacéutica o un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la FSH tiene un grado aumentado de sialilación en uno o más sitios de glicosilación adicionales presentes en un péptido adjunto a la proteína de FSH.
14. Una composición farmacéutica o un uso de acuerdo con la reivindicación 13, en que el péptido adjunto es la porción terminal carboxílica de la subunidad \beta de hCG.
15. Una composición farmacéutica o un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la FSH tiene una o más mutaciones que introducen uno o más sitios de glicosilación adicionales en la proteína de FSH y aumentan el grado de sialilación.
16. Una composición farmacéutica o un uso de acuerdo con la reivindicación 15, en que las mutaciones son seleccionadas entre una o más de A70N, V78N, G100N y D41N/A43T en la subunidad \beta de FSH y/o una o más de F17T, E56N y H83N en la subunidad \alpha de FSH.
17. Un método para preparar una preparación de FSH recombinante que tenga un número Z que sea al menos 200, método que comprende la operación de hacer reaccionar FSH con un agente dador de ácido siálico en presencia de 2,3-sialiltransferasa.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la FSH recombinante tiene un número Z que es al menos 220, preferiblemente al menos 240, más preferiblemente al menos 260.
19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18, en el que el agente dador de ácido siálico es CMP-ácido siálico.
20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la sialiltransferasa es ST3Gal III de rata.
21. Un método para preparar una preparación de FSH recombinante que tenga un número Z que sea al menos 200, método que comprende una operación de enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque o cromatografía de intercambio iónico.
22. Un método para preparar una preparación de FSH recombinante que tenga un número Z que sea al menos 200, método que comprende complementar el medio de cultivo en que se expresa la FSH recombinante, con inhibidores de neuraminidasa y/o con precursores intracelulares directos para la síntesis de ácido siálico, tal como acetilmanosamina.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en el que la FSH recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino.
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