KR20040045885A - 난포발생을 위한 성선자극호르몬 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고도의 시알릴화를 가지며, 증가된 효능을 나타내는 FSH 제제를 제공한다.

Description

난포발생을 위한 성선자극호르몬{GONADOTROPHINES FOR FOLLICULOGENESIS}
성선자극호르몬은 난포 촉진 호르몬(FSH), 황체화 호르몬(LH), 태반성 성선자극호르몬(CG)을 비롯한 헤테로이형 당단백질 군이다. 이들 호르몬은 남성과 여성에서 생식선 기능을 조절한다.
이들 호르몬 각각은 2개의 비-공유 결합된 아단위(subunits): FSH, LH, hCG에 공통된 α-아단위 및 독특하고 각 호르몬에 생물학적 특이성을 공여하는 β-아단위로 구성된다.
모든 성선자극호르몬에서, 각 아단위는 아스파리긴-연결된(N-연결된) 올리고당 측쇄를 보유한다. 인간 호르몬의 공통된 α-아단위에서, 이들은 52번과 78번 위치에 부착된다. 인간 FSH와 CG의 β-아단위에서, 2개의 N-연결된 올리고당 측쇄는 FSH의 경우에 7번과 24번, hCG의 경우에 13번과 30번에 부착된다. 인간 LH의 β-아단위에서, 1개의 올리고사카라이드는 30번 위치에 부착된다. hCG는 카르복실 말단부(CTP)에 존재하는 4개의 세린-연결된(0-연결된) 올리고사카라이드 측쇄를 추가로 보유한다.
당단백질에서처럼, 올리고사카라이드 구조에서 변화는 성선자극호르몬에서 발생하고, 뇌화수체와 순환계에서 발견되는 일련의 동형(isoform)을 결과한다. 게다가, 시알산에 의한 말단 탄수화물 "캡핑(capping)"의 정도에서 차이가 존재한다. 이들 동형은 시알산 N-연결된 올리고사카라이드의 개수와 분포에 의해 주로 결정되는 극성에 기초하여 분리될 수 있다. 고도로 시알릴화(Sialylation)된 형태는 평균 pI보다 좀더 산성을 보유하고 "산성"으로 칭한다. 시알릴화가 덜한 형태는 상대적으로 높은 pI를 보유하고 "염기성"으로 칭한다.
구조적 차이의 결과로, 성선자극호르몬 동형은 표적-세포 수용체에 결합하는 능력에서 서로 상이하다. 시알릴화 정도는 순환계에서 생존하는 이들의 능력에 영향을 준다. FSH의 경우에, 여러 여자들은 고도로 산성/시알릴화된 동형이 생쥐 및 쥐와 같은 동물 모델에서 상당히 긴 혈장 반감기를 갖는다는 것을 확인하였다(1).
인간에서 내인성 FSH의 동형 프로필은 가변적인 것으로 밝혀졌다. 긴 체내 반감기 및 상대적으로 낮은 시험관내 생물 효능을 갖는 산성 동형은 사춘기이전 아동, 성선기능저하증 환자, 난포기 여성의 혈청에서 우세하다. 대조적으로, 짧은 체내 반감기와 상대적으로 높은 시험관내 생물 활성을 보유하고 시알릴화가 덜한 염기성 동형은 사춘기, GnRH 요법, 여성에서 월경중기 성선자극호르몬 급증동안 발견된다2.
시알산을 좀더 많이 보유하는 FSH 동형은 좀더 오랜 기간 동안 순환하는데, 그 이유는 말단 시알산이 갈락토오스 잔기를 "캡"하고, 간 아시알로-당단백질 수용체와의 상호작용 및 순환계로부터 제거를 예방하기 때문이다3.
단백질에 부착된 올리고사카라이드(글리칸) 부분은 분지되고, 각 말단 당 잔기는 안테나(antenna)라고 한다. 파라미터 Z-번호는 시알산과 같은 당단백질-보유 극성 잔기에서 탄수화물 부분의 안테나 비율의 척도를 제공한다. 탈시알릴화된 FSH는 0의 Z-번호를 갖는다. 완전히 시알릴화된 FSH는 대략 230 내지 280의 Z-번호를 갖는다.
FSH 제제의 효능은 특정한 조건하에 미성숙 쥐의 난소 중량(ovarian mass)을 증가시키는 능력을 국제 표준/참고 제제에서와 비교하고 국제 단위(IU)로 조정하는 Steelman-Pohley 분석법으로 시험관내 평가한다.4
여러 연자들은 FSH의 생물학적 프로필에서 당화와 시알릴화의 역할을 조사하였다.
D'Antonio 등은 크로마토집속(chromatofocussing)으로 수득된 산성(pI < 4.8)과 염기성(pI > 4.8) rhFSH 동형의 대사 제거율(MCR)을 암컷 쥐에서 평가하였다. 예상한 바와 같이, 염기성 동형은 산성 동형보다 빨리 제거되는 것으로 밝혀졌다(염기성 동형의 경우 = 0.4 h, 산성 동형의 경우 = 0.9 h). 산성과 염기성 형태를 Steelman-Pohley 분석법에서 비교(질량 기준)할 때, 염기성 동형은 산성 동형보다 활성이 훨씬 덜한 것으로 밝혀졌다(염기성 동형의 경우에 ED50= 0.9 pg/rat, 산성 동형의 경우에 0.3 ㎍/rat). IU를 기초하여 비교하면 이들 동형에는 차이가 없었다.5
Vitt 등은 pI가 서로 상이한 4가지 재조합 인간 FSH 제제가 분리된 생쥐 난포에서 크기와 에스트라디올(E2) 생산의 증가를 유도하는 능력을 비교하는 시험관내 연구를 실시하였다. 염기성 FSH(pI 5.0-5.6)는 난포의 좀더 신속한 성장을 유도하고, 최대 난포 크기 및 미분획된(unfractionated) 재조합 FSH를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 중성(pI 4.5-5.0)과 산성(pI 3.6-4.6) FSH 제제는 난포의 성장률과 최대 크기에서 열등하였다. 염기성 FSH는 다른 동형보다 좀더 적은 용량에서 좀더 빨리 E2분비를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 농도에 상관없이, 산성 FSH와 함께 배양된 난포는 연장된 배양이후에만 측정 가능한 농도의 E2를 분리하였다6.
Timossi 등은 크로마토집속(chromatofocussing)을 이용하여 인간 뇌하수체 FSH를 상이한 당화/산도의 7가지 서로 다른 분획물(fraction)로 구분하였다. 이들 분획물은 쥐 과립막 세포에서 시험관내 아로마타제(에스트라디올의 생산에 필요)와 조직형 플라스미노겐 활성물질(tPA) 발현의 상향조절을 유도하는 능력을 검사하였다. 생물활성 vs, 면역반응성(B/I) 비율은 동형의 용리 pH 값이 하락함에 따라 감소하는 것으로 밝혀졌다. 이들 저자들은 염기성 동형이 아로마타제 및 tPA mRNA와 단백질의 발현을 유도하는 능력에서 산성 변이체보다 높은 능력을 보인다고 결론하였다.7
Zambrano 등은 코로마토집속을 이용하여 인간 뇌하수체 FSH를 상이한 pI의 9가지 분획물로 분획하고, 3가지 면역분석법과 2가지 시험관내 분석법: 쥐 과립막 세포에 의한 에스트라디올 생산 및 FSH 수용체를 발현하는 인간 태아 세포주에 의한 cAMP 생산으로 염기성과 산성 동형을 검사하였다. 생물분석에서 활성 vs. 면역반응성(B/I)의 비율은 모든 생물분석에서 동형의 pI가 하락함에 따라 감소하였다.8
추가 연구에서, Zambrano 등은 이질성 수용체 시스템(쥐 과립막 세포)과 동질성 수용체 시스템(인간 FHS를 발현하는 재조합 인간 HEK-293 세포)에서 인간 뇌하수체 산성과 염기성 FSH 동형의 7가지 서로 다른 분획물의 결합 친화성을 비교하였다. 이질성 수용체는 동형의 pI가 증가함에 따라 결합 친화성이 증가한 반면, 동질성 수용체는 그렇지 않았다. HEK-293 세포에서 cAMP 생산 역시 동형의 pI가 증가함에 따라 증가하였다.9
여러 연구에서 좀더 산성 형태의 FSH가 고전적인 난소 중량 증가 검사에 의한 평가에서 최대 체내 생물활성(중량 기초)을 보이는 것으로 밝혀졌다.10, 11Timossi 등은 염기성 형태가 체내에서 좀더 활발하긴 하지만, 상대적으로 짧은 반감기로 인하여 이런 효과가 쥐 난소의 중량 증가에서 관찰될 수 없다고 가정하였다. 이들은 신속-반응 시스템: tPA 활성의 상향조절에 대한 2가지 제제의 효과를 검사하였다.12이들 저자들은 산성이 덜한 극성 분포 프로필을 보유하는 rhFSH가 좀더 높은 시험관내 생물활성과 혈장 제거율을 보이고 고도 산성 FSH 제제보다 신속하게 tPA 효소 활성을 유도한다고 결론하였다.
성선자극호르몬은 생식 주기에서 결정적인 역할을 수행하고, 자연적으로 또는 자궁내 인공 수정(IUI)을 통하여 체내 수정을 받는 무배란성 환자에서 배란 유도(OI)를 비롯하여 보조 생식술(ART), 예를 들면 시험관내 수정(시험관내 수정)(IVF), 세포질내 정자 주입술(intracytoplasmic sperm injection)과 병용되는 IVF(IVF/ICSI), 수정란 이식(ET)에 필수적으로 사용된다.
전형적으로, ART는 자성 배우체(female gamete) 개수를 증가시키는 과배란 유도(COH)로 실시한다(13). COH를 위한 표준 섭생(14)은 내인성 성선자극호르몬이 성선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) 촉진제의 투여에 의해 억제되는 하향-조절기(down-regulation phase) 및 난포 발생(난포발생)이 대략 150-225 IU/일 FSH의 매일 투여로 유도되는 이후의 촉진기(stimulatory phase)를 수반한다. 대안으로, 촉진은 GnRH-길항제의 투여(전형적으로, 촉진기의 대략 6일에 시작)로 LH 급증을 예방하면서, 자발적이거나 유도된 월경이후에 시작한다. 적어도 3개의 >16㎜(1개는 18㎜) 난포가 존재하는 경우에, hCG(5-10,000 IU)의 단일 거환으로 자연적인 LH 급증을 모방하고 배란을 유도한다. 난모세포는 hCG 주사후 36-38시에 회수한다.
전형적으로, OI는 대략 75-150 IU/일 용량으로 FSH의 매일 투여로 실시한다. ART보다는 빈도가 덜하긴 하지만, GnRH 항진제 또는 길항제로 하향-조절이 활용될 수 있다. hCG는 정상적인 성교 또는 IUI를 통하여 달성되는 체내 수정에 앞서, LH 급증을 모방하기 위하여 투여된다.
ART와 OI를 위한 앞서 밝힌 전형적인 섭생에는 장기간, 다시 말하면 평균 10일, 일부 환자에서 최대 21일동안 성선자극호르몬의 매일 주사가 요구된다. 효능이 증가된 FSH 제제를 개발하면, FSH의 일일 용량을 감소시키고, 치료 기간을 줄이며(즉, 좀 더 적은 주사), 좀더 낮은 빈도로 주사를 제공할 수 있다. 이는 ART와 OI 섭생을 좀더 간편하고 환자-친화적으로 만든다.
더 나아가, 시험관내 수정을 이용한 ART는 오류의 가능성을 내포한다. 가령, 모든 난포가 생존가능 난모세포를 생산하지는 않고, 모든 생존가능 난모세포가 성공적으로 수정되지는 않으며, 일부 배아는 생육하지 못한다. 게다가, 선별된 생존가능 배아가 자궁으로 이식 및 착상에 실패할 수도 있다. 출생 가능성을 극대화시키기 위하여, 여러 난포의 성장과 성숙을 촉진하여 다중 난모세포의 수집을 담보하는 것이 바람직하다.
대조적으로, OI의에서 목적은 3개 이하, 바람직하게는 1개의 우성 난포(dominant follicle)[다태 임신(multiple pregnancy)을 피하기 위하여]를 수득하는 것이다.
ART와 OI를 받는 일부 환자는 통상적 FSH 제제로 치료받는 경우에 성장가능 난포의 수가 줄어든다. 이런 현상은 ART를 받는 환자에서 성공을 제한하는 인자인데, 그 이유는 이식 및/또는 동결보존에 가용한 배아의 개수를 제한하기 때문이다. 이는 1개 이상의 난포를 수득하는 것이 중요한 IUI를 받는 환자에서도 성공을 제한하는 인자이다. 이런 유형을 반응을 보이는 환자에는 33-35세 이상의 환자, 기저 수준 FSH가 상승된 환자, 기저 수준 에스트라디올이 상승된 환자 또는 기저 수준인히빈 b가 상승된 환자 등이 포함된다.
남성에서, 정자형성(spermatogenesis)은 FSH에 의한 세르톨리 세포(sertoli cell)의 자극에 의존한다. FSH 결핍은 희소정자증(oligospermia) 및 불임을 유발한다. 통상적인 FSH 제제로 남성 불임의 치료에는 최대 18개월동안 주 3회 FSH 주사가 요구된다.
난포형성을 촉진하는 강화된 능력을 보유하는 FSH 제제의 개발이 필요하다. 또한, FSH에 감소된 반응을 보이는 환자를 치료하는 신규한 FSH 제제가 필요하다. 이에 더하여, ART, OI, 남성 불임을 위한 강화된 효능, 짧아진 치료 프로토콜, 감소된 누적 용량 및/또는 줄어든 투약 빈도의 FSH 제제가 바람직하다.
본 발명의 요약
본 발명의 목적은 특히 ART와 공동되는 배란 유도와 COH에 사용되는 성선자극호르몬 제제를 제공하는 것이다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 Z-번호가 적어도 200인 FSH 제제를 제시한다.
두 번째 관점에서, 본 발명은 평균 pI가 3.4 이하인 FSH 제제를 제시한다.
세 번째 관점에서, 본 발명은 Z-번호가 적어도 200인 FSH를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.
네 번째 관점에서, 본 발명은 난포형성의 자극에서 Z-번호가 적어도 200인 FSH의 용도를 제시한다.
다섯 번째 관점에서, 본 발명은 난포형성의 자극에 사용되는 약물의 제조에서 Z-번호가 적어도 200인 FSH의 용도를 제시한다.
여섯 번째 관점에서, 본 발명은 인간 환자에서 난포형성을 유도하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 Z-번호가 적어도 200인 FSH를 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
일곱 번째 관점에서, 본 발명은 Z번호가 적어도 200인 FSH 제제를 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래에서 선택되는 단계로 구성된다:
■2,3-시알릴트랜스퍼라제의 존재하에 FSH를 시알산 공여체와 반응시키고;
■재조합 FSH의 발현에 적합한 세포형을 선별하고;
■높은 수준의 시알릴화에 유리한 조건하에 FSH를 발현하는 세포, 바람직하게는 재조합 세포를 배양하고;
■크로마토그래피 기술을 이용하여 높은 Z-번호를 보유하는 FSH 동형을 분리한다.
여덟 번째 관점에서, 본 발명은 남성 불임의 치료에서 Z번호가 적어도 200인 FSH의 용도를 제시한다.
아홉 번째 관점에서, 본 발명은 남성 불임의 치료에 사용되는 약물의 제조에서 Z번호가 적어도 200인 FSH의 용도를 제시한다.
열 번째 관점에서, 본 발명은 인간 환자에서 남성 불임을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 Z-번호가 적어도 200인 FSH를 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
본 발명은 성선자극호르몬(gonadotrophin) 분야, 특히 보조 생식 기술(ART), 배란 유도(OI), 자궁내 인공수정(IUI), 불임 남성 환자에서 이들의 용도에 관한다.
도 1에서는 rFSH로부터 방출된 글리칸의 GlycoSep® C 칼럼을 통한 용리의크로마토그램을 도시한다; 중합체 코팅된 디비닐 벤젠 수지(5 m)로 채워지고, 아세토니트릴:물 20:80의 이동상을 포함하며, 5분에서 21분까지 분당 0.25%의 암모늄 아세테이트(500 mM)의 선형 구배 및 21분에서 61분까지 분당 0.525%의 암모늄 아세테이트(500 mM)의 선형 구배를 보유하는 칼럼 4.6 x 100 mm. X-축은 머무름 시간(minute)을 나타내고, Y-축은 신호 강도(mV)를 나타낸다.
도 2에서는 7일까지 산성과 염기성 FSH 동형을 복용한 환자에서 8일(Y-축)에 크기 범주당 난포 개수를 도시한다. 물결선은 산성 동형의 결과를 나타내고, 사선은 염기성 동형의 결과를 나타낸다.
도 3에서는 7일까지 산성과 염기성 FSH 동형을 복용한 환자에서 10일(Y-축)에 크기 범주당 난포 개수를 도시한다. 물결선은 산성 동형의 결과를 나타내고, 사선은 염기성 동형의 결과를 나타낸다.
도 4에서는 산성과 염기성 FSH 동형의 마지막 투여이후 환자에서 평균 FSH 혈청 수준을 도시한다. X-축은 첫 FSH 주사이후 시간(hour)을 나타내고, Y-축은 면역-반응성 IU/L에서 혈청 농도를 나타낸다. 사각형(■)은 산성 FSH 동형의 주사이후 혈청 농도를 나타낸다; 다이아몬드(◆)는 염기성 FSH 동형의 주사이후 혈청 농도를 나타낸다. 혈청 농도는 Daiichi Isotope Laboratory(Japan)로부터 공급된 키트를 이용하여 면역분석법, 예를 들면 방사선-면역분석법으로 측정하였다.
도 5에서는 성숙 인간 FSH 알파 아단위에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 6에서는 성숙 인간 FSH 알파 아단위에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
본 발명자들은 인간 환자에서 난포형성을 유도하는데 있어서 고도로 시알릴화된 FSH 동형이 시알릴화가 덜한 동형보다 좀더 높은 효능을 보인다는 놀라운 사실을 확인하였다. 본 발명에 따른 FSH 제제를 사용하면, 좀더 적은 누적 용량의 FSH를 사용하여 동일하거나 우월한 임상적 결과를 달성할 수 있다.
본 발명자들은 IU에 기초하여 동등 함량의 산성 FSH와 염기성 FSH로 환자를 치료하는 경우에, 통상적인 분석법에 의한 측정에서 산성 FSH 치료를 받은 환자에서 성장가능 난포의 개수가 현저하게 많다는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 중량에 기초하여 동일한 함량의 산성 FSH와 염기성 FSH로 환자를 치료하는 경우에 산성 FSH 치료를 받은 환자에서 난포의 개수가 실질적으로 높았다.
일부 환자는 통상적인 FSH 제제로 치료할 때, 감소된 숫자의 성장 난포를 보였다. 이는 ART 성공의 제한 요인이다. 이런 유형을 반응을 보이는 환자에는 대략 33-35세 초과 환자, FSH 베이스-라인이 상승된 환자, 오에드트라디올(oestradiol) 베이스-라인이 상승된 환자 또는inhibin b베이스-라인이 상승된 환자를 포함한다. 본 발명에 따른 FSH 제제는 전통적인 제제에 비하여 보다 나은 난소 반응을 이끌어내기 위하여 하루에 한번, 또는 이틀에 한번 주사될 수 있다. 이것은 이들 환자들에 대한 임신 가능성을 증가시킨다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도, 우수한 효능을 가지며, 덜 빈번한 투여를 허용하는 FSH 제제는 Z-번호가 약 200 이상, 바람직하게는 적어도 또는 약 210, 220, 230,240, 250,260, 270,280 그리고 290인 FSH를 사용하여 제조될 수 있다는 것을발견하였다. 선호도의 순서는 Z-번호의 증가와 함께 증가한다. (이들 값들의 사이에 있는 Z-번호들 또한 물론 본 발명의 범위 내에 있다.). 난포 발생의 유도를 위하여, 전통적인 FSH 제제는 약 75-600IU/일의 용량으로 일반적으로 매일 투여된다. 다수의 환자에서, 전통적인 FSH 제제의 동일한 누적 용량이 매일 주사하는 것과 유사한 임상 결과를 얻으며 이틀에 한번 투여될 수 있다.15"덜 빈번한 투약"이라는 표현은, 전통적인 제제가 매일 또는 이틀에 한번 투여되므로 총 난포 부피에 대하여 동일한 임상 결과를 얻으면서 이틀에 한번보다 덜 자주 투여되는 FSH 제제를 적용하는 것을 의미한다.
"산성" 그리고 "염기성"이라는 용어는 다양한 시알릴화 정도를 갖는 FSH 제제를 칭하기 위하여 광범위하게 사용된다. 시알산이 산성이므로, 보다 고도로 시알릴화된 분자는 보다 낮은 pI를 가질 것이다. 전기적 등전점시험 (isoelectric focussing), 크로마토집속 또는 이온-교환 크로마토그래피, FPLC 그리고 HPLC16와 같은 다른 분리방법을 사용하여, 동형의 혼합물을 산성 또는 염기성으로 지정되는 분류로, 바람직하게는 Z-번호에 기초하여 분리할 수 있다.
"시알 산"이라는 용어는 9-탄소 카르복시화된 당의 집합체의 구성원을 칭한다. 가장 보편적인 시알산 집합체는 N-아세틸뉴라미닉 애시드이다. (2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉼로피라노스-1-오닉 애시드, 종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA으로 약칭). 이 집합체의 두 번째 구성원은 N-글리콜릴-뉴라미닉 애시드 (Neu5Gc 또는 NeuGc)이며, 여기서 NeuAc의 N-아세틸 그룹은 하이드록시화 된다. 세 번째 시알산 집합체 구성원은 2-케토-3-데옥시-노뉼로소닉 애시드 (KDN)이다.17또한 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac, 9-O-아세틸-Neu5Ac 또는 9-O-락틸-Neu5Ac같은 9-O-C1-C6-아실-Neu5Ac와 같은 9-치환된 시알산이 포함된다. 시알산 집합체를 재관찰 하기 위해서는 예를 들면, Varki; Glycobiology 21992; 25-40 ; sialic acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))를 참조하라.
탄수화물 (대체적으로는 "글리칸") 성분은 단일 당을 통하여, 또는 O-또는 N-연결된 글라이코시딕 본드로 펩티드 주사슬에 부착된다. 탄수화물 성분(moiety)이 정교하게 될수록, 분지가 생겨나고, 그 결과 탄수화물 성분은 하나, 둘, 셋 또는 넷의 (때때로 그 이상) 말단 당 잔기 또는 "안테나"를 갖는다. 그러한 탄수화물 성분은 모노-디-트리- 또는 테트라-분지된 이라고 칭한다. 파라미터 안테나 지수 (AI)는 탄수화물 잔기 내의 분지 정도의 측정을 제공하며, 또한 탄수화물 성분의 3-D 크기의 측정을 제공한다. 이 파라미터를 결정하기 위하여, 당단백질은 화학적으로 모든 탄수화물 잔기를 분해하도록 처리된다. 예를 들면 하이드라진과 가열하거나 또는 이 탄수화물은 예를 들면 엔도글리코시다아제(N-글리카나아제)18로 효소적으로 분해할 수 있다. 이 탄수화물 혼합물은 분리된다. 필요하다면, 이 탄수화물 혼합물은 방사선라벨, 발색단-라벨 (즉 UV-vis 활성), 형광물질 라벨, 면역반응 라벨, 등과 같은 라벨과 반응된다. 이 라벨된 탄수화물 혼합물은 그 후 시알리다아제 효소로 탈시알릴화되어 라벨된 중성 탄수화물 혼합물을 산출한다. (다른 방법으로는, 라벨화 그리고 탈시알릴화 단계는 역순으로 될 수 있다.). 이 라벨된 중성 탄수화물 혼합물은 그 후 다른 종들(모노-, 디-, 트리- 및 테트라-분지된)을 구별할 수 있는 크로마토그래피 방법을 사용하여 그것의 성분들로 분리된다. 크로마토그래피 (일반적인 또는 역-상)는 본질적으로 예를 들면 두꺼운 또는 박막층 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함하는 어떤 방법을 사용하여 수행된다. 다른 방법으로는, 분리된 중성 탄수화물 혼합물은 성분들에 휘발성을 부여하기 위하여 시약과 반응시키고, 그 혼합물을 가스 크로마토그래피 (GC)에 도입할 수 있다. 가시화(Visualisation)는 라벨 그리고 사용된 크로마토그래피 방법에 적합한 방법으로 수행될 것이다. 예를 들면, 만일 형광물질이 라벨로 사용된 경우, 탐지를 위하여 형광 강도 측정기가 사용될 것이다. ; 만일 발색단이 라벨로 사용된 경우, UV-vis 스펙트로메터가 탐지에 사용될 것이다. 라벨이 사용되지 않은 경우, 중량 분광계가 피크 및 보유 시간의 측정에 사용될 것이다. 모노-디-트리- 또는 테트라-분지된 종의 피크 지정은 중량 분광계를 사용하거나, 또는 알려진 표준과 비교함으로써 가능하다.
크로마토그램은 그 후 디-트리- 그리고 테트라-분지된 탄수화물 종과 관련된 피크를 통합함으로써 분석된다. 각 종에 의하여 나타난 총 탄수화물의 퍼센트는 다음 방정식에 따라 AI을 계산하는 데에 사용될 수 있다. :
AI = 2 P디+ 3 P트리+ 4 P테트라
여기서 AI 는 안테나 지수(antennaity index), P디그리고 P트리그리고 P테트라는 각각 디-, 트리-그리고 테트라-분지된 총 탄수화물의 퍼센트이다. 다른 성분의 미량(예. 모노-안테나의)도 나타날 수 있으나 AI 값에 현저히 공헌하지 않는다
높은 안테나 지수는 탄수화물 성분이 많은 안테나로 고도로 분지된 것을 나타낸다. 재조합 인간 FSH는 일반적으로 약 220-280, 또는 평균 약 255의 AI을 갖는다.
파라미터 Z-번호는 시알산과 같은 극성 잔기를 보유하는 당단백질 탄수화물 성문이 얼마나 많은 안테나를 갖는지에 대한 측정을 제공한다. Z-번호을 결정하기 위하여, 탄수화물 성분은 위와 같이 펩티드로부터 분리되며 필요한 경우 라벨 된다. 이 혼합물은 그 후 이온 교환 크로마토그래피로 전하에 기초하여 종으로 분리된다. 용리된 피크의 가시화는 라벨의 효능으로 또는 위와 같이 중량-분광계와 같은 다른 방법으로 이루어진다. 크로마토그램은 그 후 모노- 디-트리-그리고 테트라-대전된 탄수화물 종과 관련된 피크의 통합에 의하여 분석된다. 각 종에 의하여 나타난 총 탄수화물의 퍼센트는 다음 방정식에 따라 Z-번호를 계산하는 데 사용될 수 있다. :
Z = P'모노+ 2 P'디+ 3 P'트리+ 4 P'테트라
여기서 Z는 Z-번호, 그리고 P', P'디,P'트리그리고 P'테트라는 각각 모노-, 디-, 트리- 그리고 테트라-대전된 총탄수화물의 퍼센트이다.
높은 Z-번호는 극성 잔기를 보유하는 다수의 안테나를 나타내며, 이 당단백질은 그러므로 고도로 대전될 것이고, 그리고 시알산 잔기의 경우, 산성일 것이다.재조합 인간 FSH는 일반적으로 약 150 내지 약 190, 또는 평균적으로 약 184 범위 내의 Z-번호 값을 갖는다.
본 발명자들은 놀랍게도 IU를 기초로 한 200미만의 Z-번호를 갖는 FSH 동형의 "당량 투여량"에 비하여 약 200 또는 그보다 높은 Z-번호를 갖는 FSH 동형은 난포의 수에 대하여 효능을 증가시킨다는 것을 발견하였다. "당량 투여량"은 다른 동형의 FSH 용량이 전통적인 생체 조건에서의 분석법에 의하여 비교하여 측정되는 경우, 특정 조건 하에서, 쥐에서의 난소 중량을 증가시키는 그들의 능력, IU 용량이 동일한 것을 의미한다. 다른 말로, 쥐에서 결정된, 다른 동형의 당량 IU 용량은 인간에게 투여되는 경우 다른 임상적 효능을 가진다.
증가된 Z-번호를 갖는 FSH 제제는 다른 많은 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들면, 재조합 FSH의 배치는 예를 들면, Mulders et al.19, Zambrano et al.20, 그리고 Timossi etal.21중의 어느 것에 의하여, 전술한 바와 같이 전기적 등전점시험, 또는 크로마토집속에 도입될 수 있다. 다양한 pI를 갖는 분획이 분리될 것이다. 본 발명의 바람직한 FSH 제제는 약 3.4 또는 그 미만의 평균 pI을 갖는다. 보다 바람직하게는 약 3.3 또는 그 미만, 특히 바람직하게는 약 3.2 또는 그 미만. 평균 pI이 감소할수록 선호도는 증가한다.
파라미터 Z-번호는 FSH 종의 집단의 평균 시알릴화 정도를 반영한다. FSH 제제가 여전히 실질적인 염기성 (덜 시알릴화된) 종의 비율을 갖는 높은 Z-번호를 갖는 것이 가능하다. 그러한 염기성 종은 FSH 수용체에서 길항제(ant작동제s)로서 작용할 것이며, 그러므로 바람직하지 않다. 존재하는 종의 "전개(spread)"은 전기적 등전점시험, 또는 크로마토집속에 의하여 측정된다. Z-번호 분석은 또한 종의 전개에 아이디어를 제공할 수 있다. 제제가 약 4% 또는 그 미만의 중성 탄수화물 종 (즉, 전하를 보유하지 않는 글리칸 성분), 그리고 약 16% 또는 그 미만의 모노-시알릴화된 종을 갖는 것이 바람직하다, 그리고 보다 바람직하게는 제제는 약 3%, 2% 또는 1 % 또는 그 미만의 중성 종 그리고 약 15%, 12%, 10%, 8% 또는 5% 또는 그 미만의 모노시알릴화된 종을 갖는 것이 바람직하다. 선호도는 퍼센트의 감소에 따라 증가한다.
단백질 상에 하나 또는 그 이상의 부가적인 글리코실화 부위에 대한 시알릴화 정도의 증가로부터 난포발생 결과에 대한 증가된 효능을 갖는 FSH 제제가 발명의 범위 내에 있다. 그러한 부위는 예를 들면, 돌연변이 형성을 사용하여 세린, 트레오닌, 리신 또는 아스파라긴 잔기로 FSH 단백질의 주사슬에서 잔기를 치환함으로써 도입될 수 있다. 그러한 FSH의 돌연변이 형태를 생성하는데 사용될 수 있는 방법의 일 예는 실시예 7에서 설명된다. 생체 조건에서의 당화(glycosylation)에 디하여, 도입되는 부위는, 다음의 서열의 "N-당화부위"를 형성하기 위한 것과 같은 것이어야 한다. : N-X'-S/T/C-X", 여기서 X'는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산 잔기이며, X"는 X'와 동일하거나 또는 동일하지 않는 어떤 아미노산 잔기도 가능하며 바람직하게는 프롤린이 아니며, N은 아스파라긴이고, S/T/C는 세린, 트레오닌 또는 시스테인, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌, 그리고 가장 바람직하게는 트레오닌일 수 있는 잔기를 나타낸다. 그러한 FSH 분자의 산성 동형(pI≤3.4)은 본 발명의범위 내에 있다. 부가적 당화부위를 보유하는 그러한 변형된 FSH 분자는, 예를 들면 WO 01/58493 (Maxygen)에 개시된다. 특히 바람직한 것은 다음의 돌연변이 이다. : 6-아단위에서 : E4N, A70N, L73N, V78N,G100N, Y103N, F19N/121T, L37N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T 그리고 R97N/L99T; α-아단위에서 : E9N,F17T, F17N, R67N, V68T, E56N, H83N, 그리고 F33N/R35T ; 여기서 A는 알라닌, D는 아스팔틱 애시드, E는 글루타믹 애시드, F는 페닐알라닌, G는 글리신, H는 히스티딘, I는 이소류신, L은 류신, N은 아스파라긴, R은 아르기닌, T는 트레오닌, V는 발린, Y는 티로신, 그리고 기호"E4N"는 위치 4에서 글루타믹 애시드(E)와 아스파라긴(N)의 교체를 나타낸다. 서열의 순번화에 대하여, 인간 FSH 알파의 아미노산 서열은 도 5 또는 SEQ ID NO:1에 도시된 성숙한 서열에 따라 순번화 된다. The 아미노산 서열 of 인간 FSH 베타의 아미노산 서열은도 6 또는 SEQ ID NO: 2에 도시된 성숙한 서열에 따라 순번화 된다.
부가 펩티드 상에 존재하는 하나 또는 그 이상의 당화 부위에서 증가된 시알릴화의 정도로부터 난포발생 결과에 대한 효능을 증가시키는 FSH 제제 또한 본 발명의 범위에 포함된다. "부가(appended) 펩티드"란 당화 부위를 포함하는 어떤 펩티드를 의미하며, 그리고 이것은 결과물인 분자의 FSH 활성에 대한 해로운 영향 없이 FSH의 α-및/또는 β-아단위의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 부착될 수 있다. 예를 들면, hCG의 β-아단위는, 여기서 카르복시 말단 부분(CTP)이라 칭하는 C-말단에 약 34개의 부가적 아미노산에 기인하여, 다른 성선자극호르몬의 그것에 비하여 실질적으로 더 크다. urinary hCG에서, CTP는 4개의 뮤신-유사-O-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 이 CTP는 FSH의 β-아단위에, 바람직하게는 aFSH의 β-아단위의 카르복시 말단에서 결찰되며, 결과물인 분자는 FSH 활성을 가지며 그리고 부가적인 4 부위의 당화를 갖는다. 그러한 FSH 분자의 산성 동형 (pI≤ 4.4)은 본 발명의 범위 내에 있다. 그러한 분자는 WO 93/06844 (Washington University)에서, 그리고 Boime et al22에 의하여 개시된다. 변형된 당화 부위를 갖는 다른 FSH 분자는 WO 90/09800 (Washington University)에서 개시된다.
이 설명의 목적을 위하여, 부가적인 당화 부위를 갖는 FSH 제제는 FSH91y+라고 표시된다. 부가적인 당화 부위가 첨가되는 경우, 파라미터Z-번호는 더 이상 "정상의"FSH 제제(즉. 네 당화 부위를 갖는 것들)와 비교하기 위하여 사용될 수 없다. 이 파라미터 정상화되기 때문이다. (퍼센트의 합). FSH91y+제제가 글리칸 종 분석에 도입되는 경우, 이 파라미터 Z+-번호가 Z-번호에 유사한 방식으로 계산될 것이다. 본 발명의 FSH91y+제제는 약 200 또는 그 이상, 바람직하게는 약 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 또는 그 이상의 Z+-번호를 갖는다. 선호도는 Z+-번호가 증가할수록 증가한다.
본 발명의 FSH91y+제제는 정상의 FSH 보다 현저하게 낮은 pI 프로필을 갖는다. 특히 바람직하게는 약 4.4 또는 그 미만의 평균 pI를 갖는 FSH91y+제제에서 그들의 효능이 증가된다. 보다 바람직하게는 약 4.2, 4.0, 3.8, 3.6, 3.4, 3.3 그리고3.2 또는 그 미만의 평균 pI을 갖는다. 선호도는 평균 pI의 감소에 따라 증가한다.
본 발명의 모든 실시예에서 재조합 FSH가 선호된다. 인간 환자의 치료를 우하여, 인간 재조합 FSH가 바람직하다. 본 발명의 제제는 전통적인 재조합 FSH로부터 분리될 수 있다. 또는 이들은 FSH91y+제제로부터 분리될 수 있다.
또한 본 발명의 한 측면은 본 발명자가 "시알릴 부양(boosting)"이라 칭하는 방법을 사용하여 시알산 함량을 풍부하게 하는 방법을 제공하는 것이다. 재조합 FSH (바람직한) 또는 재조합FSH91y+제제(또한 바람직한) 또는 urinary FSH가, 예를 들면WO98/31826 (Cytel Corporation)에 개시된 바와 같은 CMP-시알산과 같은 시알산 공여체의 존재 하에 글리코실 트랜스퍼라아제, 특히 시알릴트랜스퍼라아제와 같은 효소로 처리함에 의하여, 시알릴 부양에 도입될 수 있다. 재조합 시알릴트랜스퍼라아제 그리고 재조합 시알릴트랜스퍼라아제의 제조방법은, 예를 들면, 미국 특허 제5,541, 083호 (University of California ; Amgen)에서 찾을 수 있다. 적어도 15가지의 다른 포유류 시알릴트랜스퍼라아제가 언급되어 있으며, 그들의 13개의 cDNAs가 클론되어있다. 이들 cDNAs는 시알릴트랜스퍼라아제의 재조합 생성에 사용될 수 있으며, 이것은 그 후 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
사용되는 시알릴트랜스퍼라아제는 시알릴화된 당단백질 상의 말산 시알산의 기초를 이루는 가장 보편적인 끝에서 두 번째(penultimate) 성분인 서열 Galβ1, 4GlcNAc에 시알산을 이동시킬 수 있을 것이다. 사용될 수 있는 시알릴트랜스퍼라아제의 일 예는 ST3Gal III이며, 이것은 또한 (2, 3)-시알릴트랜스퍼라아제 (EC 2.4.99.6)라 칭한다. 이 효소는 Gal-β-1,3-글리코실NAc 또는Gal-β-1,4-글리코실NAc 글리코사이드의 Gal에 시알산의 이동을 촉매한다.23이 시알산은 갈락토실 (Gal) 잔기에 두 단당류 사이에 α-연결을 형성하며 연결된다. 단당류의 연결은 NeuAc의 2-위치 그리고 tGal의 3-위치 사이에 있다. 이 특정 효소는 쥐의 간으로부터 분리될 수 있다.24; 인간 cDNA25그리고 게놈26DNA 서열은 공지되어 있으며, 재조합 발현에 의한 이 효소의 제조를 촉진한다. 바람직한 실시예에서, 시알릴화 방법은 ST3Gal III (바람직하게는 쥐의), ST3GalIV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GaINAc I, 또는 ST6GalNAc II을 사용하며, 보다 바람직하게는 ST3Gal III, ST6Gal I, ST3Gal IV, ST6Gal II 또는 ST3Gal V을, 보다 특히 바람직하게는 주의 ST3Gal III를 사용한다.
시알릴트랜스퍼라아제의 용량은 바람직하게는 약 50 mU/mg FSH 또는 미만, 바람직하게는 또는 약 5-25 mU/mg FSH의 범위 내에 있다. 바람직한 조건 하에서, 시알릴트랜스퍼라아제의 농도는 약 10-50 mU/ml, 그리고 FSH 농도는 약 2mg/ml일 것이다.
또한 세포, 재조합형 또는 그렇지 않으면, FSH를 발현하는 것을 세포 내에서 발현 가능한 시알릴트랜스퍼라아제를 인코딩하는 유전자로 유전자 도입함에 의하여 산성 동형이 풍부한 FSH를 제조하는 것이 가능하다. 유전자는 게놈 코딩 서열 (즉 인트론과)을 포함할 것이며 또는 cDNA 코딩 서열을 포함할 것이다. 다른 방법으로는, 만일 이 세포의 게놈이 시알릴트랜스퍼라아제를 코딩하는 내생 서열을 포함하는 경우, 세포의 게놈으로 FSH의 발현을 야기하는 구조가 삽입될 것이다. 시알릴트랜스퍼라아제의 발현은 세포 내에서 활성인 비-고유 조절 서열의 삽입으로 시알릴트랜스퍼라아제를 인코딩하는 내생 서열에 작동 연결하여 증가될 것이다. 게놈 시알릴트랜스퍼라아제 인코딩 서열의 증폭을 야기하기 위하여 시알릴트랜스퍼라아제 인코딩 서열에 작동 연결되는 증폭 가능한 유전자를 삽입하는 것 또한 가능하다. 이들 조작은 예를 들면, EP 제 0 505 500호 (Applied Research Systems ARS Holding N. V.)에 개시된 바와 같이 상동 재조합을 사용하여 수행될 것이다.
FSH 제제의 시알릴화 정도는 또한 시알릴화에 친화적인 것으로 알려진 재조합 FSH의 발현을 위한 세포를 선별함에 의하여 증가된다. 그러한 세포는 시알릴트랜스퍼라아제을 고도로 발현하는 선별된 뇌하수체 세포 그리고 중국 햄스터 난소 세포를 포함한다. 그러한 세포에서 제조된 FSH 제제는 그 후 고도의 시알릴화를 갖는 동형을 분리하기 위하여 여기서 언급된 바와 같이 분리 방법에 도입될 것이다.
FSH 제제의 시알릴화의 정도는 또한 고도의 시알릴화에 친화적인 환경 하에서 FSH, 바람직하게는 재조합 FSH를 발현하는 세포를 배양함에 의하여 증가된다. 시알릴화는 뉴라미니다아제의 억제제 및/또는 아세틸만노스아민과 같은 시알산 합성을 위한 직접 세포내 전구체의 배양 배지의 보충에 의하여 촉진될 것이다. 그러한 배양 조건 하에서 제조된 FSH 제제는 그 후 고도의 시알릴화를 갖는 동형을 분리하기 위하여 여기에서 언급된 바와 같이 분리 방법에 도입된다.
만일 시알릴 부양이 사용되는 경우, 효소성 시알릴화 이전에, 시알산 잔기의 부착을 위한 많은 안테나를 공급하기 위하여 FSH 제제가 높은 AI을 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는 FSH는 약 220 또는 그 이상의 AI을 가져야 하며, 보다 바람직하게는 약 240또는 그 이상의 AI을 가져야 하고 , 그리고 보다 특히 바람직하게는 약 270 이상의 AI을 가져야 한다. 고도의 AI을 갖는 FSH는 예를 들면 콘카나발린-A (Con-A) 유도 세파로오스(세파로오스) 상에서 메틸-글루코오스의 농도 구배로 용리하는 흡착 크로마토그래피를 사용하여 또는 preparative HPLC에 의하여 분리될 수 있다. 본 발명의 시알릴화 부양 방법은 하나 또는 그 이상의 당화 부위를 도입하기 위하여 변형된 FSH 제제 (FSH91y+제제)에 유리하게 적용될 수 있다. 그러한 FSH91y+제제는 또한 시알릴 부양 전에 고도의 AI을 갖는 분획으로 분리될 수 있다.
본 발명은, 시알릴화가 불가능 한 세포에서 FSH가 발현되며, 그리고 이 FSH를 그 후 시알릴 부양에 도입함에 의하여 제조된 FSH 제제를 포함한다. 예를 들면, WO 99/13081 (Akzo Nobel N. V.)는 단일-세포성 진핵세포Dictyostelium에서, 특히 부가적 당화 부위를 갖는 뮤테인에서의, 야생형 FSH 그리고 뮤테인의 발현을 개시한다.Dictyostelium은 글리칸의 시알릴화를 할 수 없다. 본 발명은Dictyostelium에서 발현된 야생형 FSH 또는 뮤테인을 시알릴 부양에 도입함으로써 제조된 FSH 제제를 포함한다.
시알릴 부양 후, 필요한 시알릴화 정도를 갖는 FSH 제제는 이온 교환 크로마토그래피, 전기적 등전점시험, 크로마토집속, 또는 콘카나발린-A (Con-A)상의 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 FSH는 약 200 이상의 Z-번호를 갖는다, 보다 바람직하게는 적어도또는 약 210, 특히 바람직하게는 적어도 약 220, 보다 특히 바람직하게는 적어도 약 230,240, 250,260 또는 270의 Z-번호를 가지며, 선호도는 Z-번호가 증가함에 따라 증가된다. 완전히 시알릴화된 FSH는 안테나 지수에 따라 약 230 내지 또는 약 280의 Z-번호를 갖는다. 본 발명에 따른 매우 바람직한 FSH 제제는 약 230 내지 약 280의 Z-번호를 갖는다.
본 발명의 FSH 제제는 일관되게 약 200 이상의 Z-번호, 또는 전술한 바람직한 Z-번호를 갖도록 제조된다. 본 발명의 FSH는 당해 기술분야의 당업자에게 알려진 수 많은 방법을 사용하여 동형 혼합물로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 전기적 등전점시험, 크로마토집속 또는 이온-교환 크로마토그래피 방법은 pI에 기초하여 동형의 분리에 사용될 수 있다. 서로 다른 분획들에서 시알산 함량이 분석되며, 그리고 사용을 위하여 필요한 분획이 선별될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에 적절한 조건은 실시예에서 제공된다. 그러한 분리 방법은 전통적으로 제조된 rFSH 또는 urinary FSH(uFSH)로부터 본 발명의 FSH를 분리하는 데 사용될 수 있다, 또는 이것은 시알릴트랜스퍼라아제 또는 다른 전술한 재조합 기술로 처리된 FSH로부터 필요한 동형을 분리하는 데 사용될 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 FSH를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. (즉 약 200 이상의 Z-번호를 갖는, 최소 Z-번호의 바람직한 값은 위에 나열된 바와 같음). 그러한 제약학적 조성물은 예를 들면 배란 유도 또는 보조 생식 기술 (ART)과 함께 난포발생을 자극하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 FSH는 특히 다중의 난포가 발생하고 성숙하는 것을 유도하는 데 효과적이므로, 특히 다중난모세포의 수집이 필요한, ART의 용도에 적합하다.
다른 방법으로는, 투여량의 신중한 설계로, 본 발명의 FSH는 OI를 위한 모노-난포발생, 또는 IUI를 위한 pauci-난포발생 (약 3 난포까지의)을 유도하기 위하여, 생체 조건에서의 수정을 위하여 사용될 수 있다. 모노-난포발생 또한 전통적인 FSH 제제에 비하여 감소된 FSH 투여용량, 또는 덜 빈번한 투약으로 얻을 수 있다. 예를 들면, OI에서 본 발명의 FSH 제제는 환자의 반응에 따라 매 3일 다마 225-400 IU, 또는 보다 낮은 용량으로 투여된다. 환자의 반응은 초음파검사에 의하여 추적될 것이다.
본 발명의 FSH는 대체로 제약학적 조성물로 제제화될 것이며, 이것은 부가적으로 희석제 또는 첨가제를 포함할 것이다. 당해 기술분야의 당업자는 제약학적 조성물의 제제에 적합한 그러한 희석제 또는 첨가제의 전체의 다양성을 인식하고 있다.
본 발명의 FSH는 대체로 근육 내 또는 피하의 용도를 위한 멸균 주사 용액을 형성하기 위하여 쉽게 용해되는 고형의 단위 투여용량으로 제제화 된다. 고형은 일반적으로 동결건조(lyophilisation)로부터 초래된다. 전형적인 첨가제 그리고 담체에는 수크로오스, 락토오스, 염화 나트륨, 소듐 포스페이트 모노베이스 그리고 소듐 포스페이트 디베이스 같은 완충제가 포함된다. 이 용액은 주사 직전에 주사용 물로 희석되어 제조될 것이다.
본 발명의 FSH는 또한, 어떠한 첨가제 그리고 전술한 완충제, 그리고 당해 분야의 당업자에게 공지된 다른 물질을 포함하는 주사 용액으로서 제제화 된다.
본 발명의 FSH는 제어된 난소 과자극 (COH) 처방 계획에 사용될 수 있다. COH의 표준 처방 계획27은 하향-조절기(down-regulation phase)를 포함한다. 여기서 내생 황체화 호르몬(LH)은 분비 호르몬(GnRH) 작동제의 투여에 의하여 하향 도절된다. 그 후 자극기(stimulatory phase)가 뒤따르는데, 여기서 난포발생(난포의 development)이 난포자극호르몬의 일반적으로 약 75-600IU/일, 바람직하게는 약150-225IU/일 매일 투여에 의하여 유도된다. 다른 방법으로는, 자극은 자발적인 또는 유도된 월경 후 FSH로 시작된다. 그 후 GnRH-기제가 투여된다. (대체로 자극기의 6일 경에 시작). 적어도 3개의 난포 > 16 mm (하나는 18 mm)가 있는 경우, 한 알의 hCG (5-10,000IU)가 자연적인 LH 고조를 모방하고 배란을 유도하기 위하여 공급된다. hCG 주사는 전술한 파라미터가 달성되는 시기에 따라 대체로 10 내지 14일에 투여되나, 그 후에 투여되지는 않을 것이다. 난모세포의 회수는 hCG 주사 후 36-38 시간이 적기이다.
본 발명의 FSH는 또한 OI 그리고 IUI에 사용될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 제제로의 FSH 자극은 자발적인 또는 유도된 월경 이후에 75-150 IU의 일일 용량으로 시작된다. 1개 또는 3개의 난포가 적어도 16 mm의 직경에 도달한 경우, hCG 한 알이 배란 유도를 위하여 투여된다. 정액 주입은 생체 조건에서 통상의 관계 또는 IUI에 의하여 수행된다. 본 발명의 FSH는 공지된 FSH 제제에 비하여 증가된 효능을 가지므로, 전술한 것과 같은 처방 계획은 보다 낮은 IU 용량의 FSH를 사용할 것이며, 그리고/또는 난포의 숫자 그리고 생존력의 측면에서 동일한 또는 보다 나은 반응을 얻으면서 FSH 자극 주기를 감소시킴에 의하여 변형될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 FSH 제제를 사용하여, 적절한 난포발생이 약 50-150 IU FSH로, 바람직하게는 약 50-100, 보다 바람직하게는 약 50-75 IU FSH로 도달될 것이다. FSH의 투약은 대개 매일 또는 반나절에 기초한다. 투약 주기는 약 14 일 또는 그 미만, 바람직하게는 약 12일 또는 그 미만, 보다 바람직하게는 미만의 약 11 또는 10일 또는 그 미만이다.
OI에서, 본 발명의 FSH 제제는 25-150IU FSH/일, 바람직하게는, 50-125IU FSH/일의 투여용량으로 투여될 것이다.
남성 불임의 치료에서, 본 발명의 FSH 제제는 정자생성(spermatogenesis)이 통상의 관계 또는 ART 기술을 통한 정액 주입을 위하여 적절한 수준에 도달할 때 까지 3 X 150 내지 300IU/주로 투여될 수 있다.
본 발명자는 나아가, 이 증가된 효능으로 인하여, 약 200 이상의 Z-번호를 갖는 FSH 제제는 미만의 200의 Z-번호를 갖는 FSH 제제보다 낮은 빈도로 투여될 수 있다는 것을 발견하였다. (이것을 설명하기 위하여, FSH+200, FSH+210, FSH+220, 등이 약 200-210, 211-220, 221-230, 등의 범위의 Z-번호를 갖는 FSH 제제를 나타내기 위하여 사용될 것이다.) 이것은
이것은 일반적으로, 예를 들면 적절한 난포발생에 도달하기 위하여 매일 150 IU의 전통적인 FSH를 요구하는 환자에서 동일한 결과를, 예를 들면, 225 IU의 FSH+200으로 3일에 한 번, 또는 300 IU의 FSH+200으로 4일에 한번으로 동일한 결과를얻을 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 FSH+200의 전통적인 FSH 제제에 비하여 증가된 효능으로 인하여, 우수한 반응을 보이는 환자에서는 위에서 인용한 용량은 감소될 수 있을 것이다. 본 발명의 약 230이상의 Z-번호를 갖는 FSH 제제로, 환자의 반응에 따라, 오직 매 5일, 6일 또는 7일 마다 주사를 공급하는 것이 가능할 것이다. 반응은 초음파, 그리고/또는 혈청 에스트라디올 수준에 의하여 추적될 것이다. 다른 적절한 처방 계획은 다음과 같다. : 100 IU FSH+210이틀에 한번; 200 IU FSH+210사흘에 한번; 275 또는 300 IU FSH+210나흘에 한번; 80-100 IU FSH+220이틀에 한번; 180-200 IU FSH+220사흘에 한번; 260-300 IU FSH+220 나흘에 한번; 75-100 IU FSH+230이틀에 한번, 170-200 IU FSH+230사흘에 한번; 그리고 250-300 IU FSH+230나흘에 한번; 275-400 IU FSH+2505일에 한번; 375-450 IU FSH+2506일에 한번; 450-525 IU FSH+2507일에 한번.
"증가된 효능"이라는 용어는, 여기서 예를 들면, 쥐에서의 난소 중량 증가의 전통적인 분석법으로 결정되는, 200 미만의 Z-번호를 가지는 FSH의 등가용량 (IU/IU)으로 처치된 하나 또는 그 이상의 환자에서 난포의 숫자 그리고/또는 생존력과 비교한 경우, 개체에서 난포의 숫자 그리고/또는 생존력의 어떠한 측정 가능한 증가 또는 개선을 포함하는 난포발생에 대한 효능과 관련하여 사용된다. 바람직하게는 이 개선 또는 증가는 통계학적으로, 바람직하게는 < 0.05의확률값(probability value)으로 현저할 것이다. 결과들의 통계학적인 현저성을 결정하는 방법은 잘 알려져 있으며, 당해 기술분야에 보고되어 있고 어떠한 적절한 방법도 사용될 수 있다.
본 발명은 이하에서, 비-제한적인 실시예에 의하여 상세히 설명된다.
실시예 1: Z-번호의 결정
글리칸 맵핑(mapping)으로 당단백질의 Z-번호를 결정한다.
글리칸 성분은 Oxford GlycoSciences GlycoPrep®1000 완전히 자동화된 장치 또는 동등물을 사용하여, 100℃에서 5시간 동안 하이드라진으로, 재조합 인간 FSH로 부터 분리하였다.
이 글리칸 종은 코팅된 유리 비드 칼럼을 사용하여 반응하지 않은 하이드라진 그리고 아미노산 하이드라자이드로부터 분리되었다. 글리칸 종들은 소듐 아세테이트 시약으로 용리되었다.
이 글리칸 종은 무수 초산으로 아세틸화 되었다. 여분은 시약은 혼상식(mixed-bed)이온교환 칼럼을 사용하여 제거되었다. 환원되지 않은 글리칸 종은 묽은 아세테이트 완충용액에 수집된다.
글리칸 종은 0.5 m 필터 (Oxford GlycoSciences) 상에 수집되었고 그리고 동결건조되었다. 건조된 글리칸종은 산성 조건 하에서 65℃ 120분 동안 형광물질을 갖는 환원제와 반응시켜 라벨되었다. (예를 들면, 2-아미노벤즈아마이드 또는 2-AB).
라벨된 글리칸 종은 글리칸 종을 보유하는 친수성 흡착 막을 사용하여 여분의 시약으로부터 분리되었다. 이 글리칸 종은 물에 회수되었고 크로마토그래피로 분리할 때까지 동결 저장되었다.
라벨된 글리칸 종은 이온-교환 크로마토그래피로 분리되었다. 크로마토그래피 절차는 다음과 같이 수행된다. :
■칼럼은 중합체 코팅된 디비닐 벤젠 수지 (5 m)로 채운 GlycoSep®C 칼럼, 4.6 x 100 mm
■이동상은 0.4 ml/분의 속도를 갖는다. :
이동상 A: 아세토니트릴 (크로마토그래피 등급)
이동상 B: 암모늄 아세테이트 500 mM, pH 4.5
이동상 C: 초순수(Ultrapure water)
■탐지는 Xexcitation330 nm 그리고 Xemission420 nm 로 설정된 형광분석기로 한다. ;
■용리는 아래의 용리 조건하에서 한다. :
초기 조건: 20 % 시기 A, 80% 시기 C.
선형 구배 시기 B (0.25 % 분당) 5 내지 21 분, 20% 시기 A 일정.
선형 구배 시기 B (0.525 % 분당) 21 내지 61분, 20% 시기 A 일정.
■칼럼은 30±2 ℃의 온도로 유지된다.
글리칸 종은 중성, 모노-, 디-, 트리- 그리고 테트라 시알릴화 종으로부터 그들의 전하에 따라 용리된다. 전형적인 크로마토그램은 도 1에 도시된다.
얻은 크로마토그램에서, 피크는 보유 시간의 범위에 따라 그룹 되며, 이것은 표 1에 나열된 시알릴화 정도에 대응된다.
rFSH로부터 분리된 글리칸의 보유 시간 그리고 전하 번호
보유 시간(분) 글리칸 종 전하 번호
2 내지 4 중성 0
15 내지 21 모노시알화된 P모노
21 내지 35 디시알릴화된 P디
35 내지 45 트리시알릴화된 P트리
45 내지 52 테트라시알릴화된 P테트라
각 글리칸 그룹에 대한 결과는 다른 글리칸 그룹(중성, 모노-, 디-, 트리- 그리고 테트라-)의 총 면적의 퍼센트로서 나타내었다. 그리고 Z-번호는 다른 종들의 비율로부터 계산되었다.(P글리칸):
Z = P'모노+ 2 P'디+ 3 P'트리+ 4 P테트라
실시예 2
안테나 지수(antennarity index) (AI)의 결정
실시예 1에서 설명된 바와 같이, 글리칸은 펩티드 주사슬로부터 하이드라지노라이시스(hydrazinolysis)에 의하여 분리되고, 그리고 나서 2-아미노벤즈아마이드 (2-AB)를 사용하여 형광 라벨되었다.
이 2-AB 라벨된 글리칸은 pH 5.5 20 mM 염화칼슘을 함유, 250 mM 암모늄 아세테이트에서 37℃에서 18시간 동안 시알리다아제 (Vibrio cholera)로 효소적으로 탈시알릴화되었다. 대략 0.05 U 시알리다아제가 100 ㎍의 rhFSH의 시작 용량으로부터의 글리칸에 사용된다.
이 탈시알릴화된 글리칸은 진공 하에서 건조되었으며 그리고 예비적 역상 HPLC에 의하여 이하의 조건에서 분리되기 전에 -20℃에서 저장되었다.:
■칼럼은 GlycoSep®R 칼럼이었다. ;
■이동상의 속도는0.7ml/분 이었다.
용출액 A : 암모늄 아세테이트 50 mM, pH 6.0 ;
용출액 B: 8% 아세토니트릴을 함유하는 암모늄 아세테이트 50mM, pH 6.0
■탐지는 λexcitation= 330 nm; λemission= 420 nm으로 설정된 형광분석이로 하였다.
■칼럼 온도: 30℃.
칼럼에 적용하기 전에, 건조된 샘플은 용출액 A (200-㎕)로 재구성되었다. : 50㎕ of this solution was applied. 다음의 농도구배가 사용되었다. :
t = 0 (분) 55% A;45% B
t = 15 (분) 55% A;45% B
t = 70 (분) 0% A;100% B
t = 75 (분) 0% A;100% B
t = 76 (분) 55% A;45% B
피크들은 전자분사 중량 분광계 (ESMS) 그리고 MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption lonisation Time-Of- Flight spectormetry)를 사용하여 디-트리- 그리고 테트라-안테나로 지정되었다.
결과들은 모든 글리칸의 합을 100%로 하여 디-안테나;트리-안테나 그리고 테트라-안테나의 상대 퍼센트 P로 표현된다. AI은 그 후 다음의 방정식을 사용하여 계산된다. :
AI = 2P디+ 3P트리+ 4P테트라
여기서 AI는 안테나 지수, 그리고 P디, P트리그리고 P테트라는 각각 디-, 트리- 그리고 테트라-분지된 총 탄수화물의 퍼센트이다.
실시예 3
시알릴화 정도에 기초하여 FSH를 분획으로 선별
재조합 FSH는 음이온 DEAE-세파로오스 FF상의 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 산성 그리고 염기성 분획으로 분리되었다.
■칼럼은 DEAE-세파로오스 FF 수지로 채워진, 실험실 수준의 정제(대략 60 mg 벌크 단백질)를 위하여 직경 1.6 x 20 cm (XK Pharmacia 또는 동등물), 그리고 대규모 정제를 위하여 직경 3.4 x 40 cm (Vantadge Amicon 또는 동등물)을 사용하였다. ;
■이동상의 속도는 150-250 cm/시간이었다.
평형 완충액 1:2M 트리스-HCl pH 7.0±0.1 ;
평형 완충액 2: 25 mM 트리스-HCl pH 7.0±0.1, 전도도 2.15±1.5 mS/cm
용리 완충액 1: 25mM 트리스 pH 7.0±0.1, 35 mM NaCl, 전도도 5.80±0.44 mS/cm (이 완충액은 보다 염기성 동형을 용리한다.) ;
용리 완충액 2: 25mM 트리스 pH 7.0±0.1, 150mM NaCl, 전도도 18.30±0.5 mS/cm (이 완충액은 보다 산성 동형을 용리한다.) ;
억압용액(Regeneration solution): 0.5M NaOH,1M NaCl
저장용액(Storage solution): 10 mM NaOH
■칼럼은 23±3℃ 또는 5±3℃ 로 유지되었다.
FSH는 다음과 같이 칼럼에 로딩을 위하여 제조된다. :
동결된 rhFSH 벌크는 53℃에서 해동되었다. 해동 완결 후, 이 용액(광학적 밀도 276.4 nm에서 측정된, ml 수지 당, 3-4 mg의 rhFSH, )은 2M 트리스-HCl pH 7.0±0.1로 다음 비율로 희석되었다. : 완충액 1 part 그리고 rhFSH 벌크 79 parts. 트리스-HCl의 최종 농도는 25 mM이었다. pH는 7.0±0.1으로 HCl 1M로 조절되었다.
칼럼은 3 BV (bed volume)의 NaOH 0.5 M 그 후 6 BV의 물로 플러싱(플러시ing)하여 되었다. 평형은 4-5 BV의 평형 완충액 1로, pH가 대략 7로 측정될 때까지 플러싱하여 수행되었다. 플러싱은 그 후 7-8 BV의 평형 완충액 2로 계속되었다.
위와 같이 준비된 rhFSH가 칼럼에 로드되었다. 로딩 완결 후 칼럼은 3 BV의 평형 완충액 1로 플러시되었다.
용리 완충액 1로의 용리가 그 후 시작되었으며 그리고 흡광도 값 (276.4 nm)이 상승하기 시작할 때 염기성 분획의 수집이 시작되어, 그리고 20±1 BV(bed volumes)동안 계속되었다. 용출액은 그 후 용리 완충액 2로 바뀌었고 흡광도 값이 (276.4 nm) 증가하기 시작하자마자 산성분획의 수집이 시작되었으며, 3±1 BV(bed volumes)동안 계속되었다.
분획은 그 후 농축하기 위하여 염기성 분획을 위한 YM3 막 그리고 산성 분획을 위한 YM10이 구비된 울트라여과 세포 형 8400 (Amicon 또는 동등물)으로 울트라 여과에 도입되었다. 모든 작업은 53℃에서 수행되었다.
실시예 4
FSH 동형 비교 임상 연구
두 실험적 rhFSH 배치의 지원자에 대한 상대효능이 평가되었다.
두 FSH 제제가 rhFSH를 두 분획으로 실시예 3에서 전술한 바와 같이 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 분리함으로써 생성되었다. 배치 A는 "산성"으로 생각되었으며, 그리고 220의 Z-번호를 가졌다. (즉, 실시예 3의 산성 분획), 반면 배치 B는 "염기성"으로 생각되었고 160의 Z-번호를 가졌다.(즉, 실시예 3의 염기성 분획).
쥐에서의 난소 중량 증가의 전통적인 분석법을 사용하여, 배치 A 그리고 배치 B 각각의 앰풀은 대략 150 IU FSH로 충전되었다.
두 배치의 특성은 표 2에 도시된다. 바이랑은 IU로 충전되었으므로, 염기성 배치 B의 앰풀 내의 실제 FSH 용량은 산성 배치 A의 그것의 약 250%였다는 것을 유의해야 한다. (약 24㎍ 대 약 9㎍).
임상 연구에 사용된 FSH 배치의 특성
배치 A"산성" 배치 B"염기성"
앰풀당 FSH 함량 8.7 ㎍/앰풀 23.8 ㎍/앰풀
특이적 생리활성 19,753 IU/mg 7,386 IU/mg
Z-번호 220 160
안테나 지수 (AI) 274 237
특이적 생리활성은 IU 활성을 단백질의 중량으로 나누어서 계산한다.
환자 그룹은 32명의 폐경기 전의 여성 지원자였다. 환자들은 데카펩틸 (0.1 mg)을 매일 주사하여 뇌하수체 하향-조절(pituitary down-regulation)되었다. 14일 후, 초음파 검사가 수행되었으며 그리고 낭포(cysts)의 부재 하에서 rFSH (150IU/일)의 배치 A 또는 배치 B중 하나로 자극이 시작되었다. 난포의 성장은 매일 초음파 그리고 혈청 E2 농도로 평가되었다.
FSH 자극 동안, 난포는 발생되며 그리고 직경이 성장할 것이다. 각 환자의 난포가 측정되었으며 자극 8일 그리고 10일에 카운트되었다. 그리고 0-10 mm, 11-15 mm 그리고 16-25 mm의 크기 범주 내에 있는 수의 난포가 주목되었다. 도 2에서는, 산성 그리고 염기성 동형으로 처치된 8일의 각 범주에 속하는 환자 당 평균 난포의 수가 도시된다. 도 3에서는, 10일에서의 동일한 구성이 도시된다.
연구의 결과는 나타내었다.
염기성 그룹에서 난포의 크기는 시간에 따라 규칙적으로 증가되었으나, 산성 그룹은 첫 번째에 비하여 약간 지연된 두 번째의 난포의 일단을 발생시키는 것을 나타내었다. 이것은 결과적으로 대략 염기성 그룹의 두 배의 강한 난포 형성의 증가이다. 이 두 번째의 일단은 8일 내지 10일에 크기가 증가하였다. 결과적으로 "산성" FSH로 처치된 환자 그룹은, 10일에 평균적으로 11 mm보다 큰 총 18개의 난포가 있었으며, 반면 "염기성" 동형으로 처치된 그룹은, 10일에 11 mm보다 큰 난포의 평균 개수는 오직 11개뿐이었다.
"산성" 그룹에서 10일의 평균 총 난포 개수는 28이었으며, 반면 "염기성"그룹은 19이었다.
환자 당 평균 총 난포의 부피 (TFV)는 초음파를 사용하여 측정되었다. "산성" FSH를 공급받은 그룹의 TFV는 30%였으며, "염기성" FSH를 공급받은 그룹의 그것보다 높았다.
환자의 FSH 혈청 수준은 방사선면역분석법으로 측정되었으며, 주사된 단백질 중량으로부터 예측된 바와 같이 염기성 그룹에서 높았다. ; 그러나 산성 형태의 대사에 대한 지속성과 나란하게, 250%의 투여 차이에 비하여, 차이는 오직 약 30%였다. (도 4 참조)
실시예 5
안테나 지수(AI)에 기초하여 분획으로 FSH 선별
보통보다 높은 안테나 지수를 갖는 FSH 제제는 콘카나발린 A (Con-A) 유도 세파로오스로 친화성크로마토그래피 또는 HPLC를 사용하여 분리할 수 있다.
실시예 6
시알릴트랜스퍼라아제로 "시알릴 부양(Sialyl boosting)"
재조합 인간 FSH ("시작 물질"; 10 mg)를 완충액 (0.1 M HEPES, pH 7.5)에 4.3mg/ml의 농도로 용해하였다. 이 용액에 재조합 쥐 시알릴트랜스퍼라아제(ST3Gal III)를 100mU/ml의 농도로, 그리고 시알산 공여체로서 20mM 농도의 사이티딘-5'-모노포스페이트-N-아세틸 뉴라미닉 애시드 (CMP-NeuAc)을 가하였다. 다른 방법으로는, 시알산 공여체는 20 mM NeuAc 그리고 2 mM CMP를 CMP-시알산 합성효소의 존재 하에서 사용하므로써 즉석에서 생성할 수 있다. 이 반응은 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 되었다. 시알신이 풍부한 분획은 실시예 3에서 설명된 방법을 사용하여 분리되었다.
시알릴 부양은 또한 실시예 5에 따라 제조된 증진된 안테나 지수를 갖는 FSH로 구성된 시작 물질을 사용하여 수행될 수 있다.
다른 방법으로는, 시알릴 부양은 이미 전통적인 재조합 FSH에 배하여 증가된 Z-번호를 갖는 FSH 시작 물질로 수행될 수 있다. 그러한 시작 물질은 실시예 3의 방법을 사용하여 분리될 수 있다.
실시예 7
FSH 변이체의 생성
인간 FSH의 α-그리고 β-아단위의 cDNA가 pDONR 벡터(Invitrogen)에 서브클론 되었다. QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)가 FSH의 α-그리고 β-아단위로 N-연결된 당화 부위를 도입하기 위하여 사용되었다. 이 QuikChangeTM시스템은 필요한 돌연변이체(s)를 보유하는 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한다. 아래의 올리고뉴클레오타이드의 쌍은 N-연결된 당화 부위를 도입하기 위하여 사용되었다: V78N의 경우에 CC TTG TAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC 및 GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG; A70N의 경우에 GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C 및 GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC; D41N/A43T의 경우에 GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA 및 TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC; G1OON의 경우에 TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC 및 GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA; E56N의 경우에 G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG 및 CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C; F17T의 경우에 CAG GAA AAC CCA ACC TTC TCC CAG CC 및 GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG. 돌연변이 cDNA의 DNA 서열은 ABI PRISM BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit로 확정되었으며 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer로 분석되었다.
pCI 표유류 발현 벡터 (Promega)는 GATEWAY Vector Conversion System(Invitrogen)을 사용하여 GATEWAY destination vector로 전환되었다. α-그리고 β-돌연변이체는 야생형 아단위와 함께 pCi 발현 벡터로 GatewayTM클로닝 기술(Invitrogen)을 사용하여 서브클론 되었다. pCI 발현 벡터는 삽입된 유전자의 발현을 조절하기 위하여 인간 cytomegalovirus immediate-early enhancer/promoter를, 발현을 증진하기 위하여 유전자 상위 인트론을, 그리고 전사를 종결하기 위하여 삽입된 유전자로부터 하위에 simian virus40 late polyadenylation 신호를 보유한다. pCI의 E56N 그리고 F17T 알파 돌연변이체는 pCI의 야생형 FSH β로 공동-형질도입(co-transfection)된 반면, pCI의 A70N, G100N, V78N 그리고 D41 N/A43T β-돌연변이체는 pCI의 야생형 α-아단위로 공동-형질도입(co-transfection)되었다. 대조군으로서, pCI의 FSH의 야생형 β-아단위 그리고 pCI의 α-아단위가 공동-형질도입(co-transfection)되었다. 플라스미드는 칼슘 포스페이트 방법 (예를 들면, WO 96/07750에 개시된)을 사용하여 일시적으로 HEK293 세포 (ATTC, CRL-10852)에 형질도입 되었다. 다른 방법으로는, 야생형 β-아단위 또는 V78N β-돌연변이체를 보유하는 pCI 플라스미드는 pCI의 야생형 α-아단위로 공동-형질도입(co-transfection)되었다. 이 플라스미드는 또한 일시적으로 또는 안정적으로 CHO 세포에 형질도입될 수 있다. 형질 도입 하루 후에, 배지는 1㎍/ml의 인슐린(Invitrogen, 18140-020), 6.8 ng/ml의 소듐 셀레나이트(Sigma, S5261) 그리고 12.2ng/ml의 페릭 사이트레이트(Sigma, F3388)를 보유하는 DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033)으로 변경되었다. 배지 변경 하루 후에, 조절된 배지는 수집되어 4℃에서 800 x g로 약 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다.
상청액을 분리하고 Biofuge fresco (Heraeus Instruments)에서 16,000 x g로 5분간 원심분리한 다음 배지는 0.45㎛ Acrodisc 필터(Gelman Sciences, 4184)를 통하여 더 정화한다. 세포 추출물을 더 정화하기 위하여, 1 M 트리스, pH 7.4를 최종 농도 50 mM 트리스로, 그리고 트윈20을 최종 농도 of 0.1% 트윈20으로 첨가하였다.
FSH 돌연변이체는 디비닐 술폰 (면역수지 항-FSH-McAb-DVS-세파로오스)를 사용하여 고정된 항-FSH 모노클로날 항체로 변형된 세파로오스 상에서 면역-친화성크로마토그래피를 사용하여 세포 추출물로부터 정제하였다. 그러한 수지는 당업자에게 알려진 방법, 예를 들면 WO88/10270에 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
이 수지는 0.1 M 트리스-HCl, 0.3M NaCl 완충액으로 구성된 평형화 완충용액으로 평형되었다. pH=7.5, 4℃. 칼럼은 칼럼의 총 FSH 결합 용량의 80-90%에 대응되는 양의 IU FSH(방사선면역분석법, RIA에 의하여)로 로드된다.
비-유지된 단백질은 평형화 완충액 (위와 같이)으로 용출액의 OD280가 0.02보다 낮아질 때까지 용리되었다.
흡착된 돌연변이체 FSH는 면역수지로부터 1 M 암모니아 용액, 4℃으로 용리되었다. 면역 수지 부피의 약 4배에 대응되는 용출액은 풀링되었으며, pH는 빙초산, 4℃을 가하여 9.0으로 수집하자 마자 조절하였다. 그리고 이 용액은 Amicon 장치 (막 차단 10,000 Da)으로 울트라 여과되고 소량으로 농축되었다.
농축된 돌연변이체 FSH 용액은 UV 탐지기 그리고 예비 농도구배 생성기가 구비된 Waters Prep LC 500A 액체 크로마토그래프를 사용하여 역상 HPLC단계에 도입되었다. 칼럼에 적용하기 전에, 용액의 pH는 약 5.6으로 조정되었다. 이 용액은 실온에서 pH=5.6 0.05 M 암모늄 아세테이트 완충액으로 미리 평형화된 C18역상 칼럼 (Prepak 500C18cartridges Waters)에 로드 되었다. 유속은 100 ml/분 그리고 용출액은 280 nm에서 관측되었다.
이동상의 50%까지의 이소프로판올의 농도구배에 의하여 돌연변이체 FSH가 용리되었다. 분획은 분석용 가스 크로마토그래피(GPC) 그리고 방사선 면역분석법(RIA)에 의하여 분석되었다. 유기 용매는 40℃미만에서 진공 하에서 증류하여 제거되었으며, 이 용액은 동결 건조되었다.
CHO 세포에서 발현된 돌연변이체 FSH 제제는 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 초과, 그리고 그 이상의 Z+-번호를 갖는 분획을 분리하기 위하여 실시예 3에서 설명된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 도입되었다.
CHO 또는 HEK293 세포에서 발현된 돌연변이체 FSH 제제는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 시알릴 부양에 도입되었다. 시알릴 부양 후, 돌연변이체 FSH는 실시예 3에 따라 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250을 초과하는, 그리고 그 이상의 Z+-번호를 갖는 분획을 분리하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피에 도입되었다.
참고문헌:

Claims (39)

  1. Z-번호가 약 200 이상인 FSH 제제.
  2. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 210 이상인 FSH제제.
  3. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 220 이상인 FSH제제.
  4. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 230 이상인 FSH제제.
  5. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 240 이상인 FSH제제.
  6. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 250 이상인 FSH제제.
  7. 제 1항에 있어서, Z-번호가 약 260 이상인 FSH제제.
  8. 약 200 이상의 Z-번호를 갖는 FSH를 포함하는 제약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, FSH가 약 210 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, FSH가 약 220 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  11. 제 8항에 있어서, FSH가 약 230 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  12. 제 8항에 있어서, FSH가 약 240 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  13. 제 8항에 있어서, FSH가 약 250 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  14. 제 8항에 있어서, FSH가 약 260 이상의 Z-번호를 갖는 제약학적 조성물.
  15. 제 8항 내지 제 14항에 있어서, 난소 과자극(hyperstimulation)의 조절에 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. FSH가 약 200 이상의 Z-번호를 갖는, 난포형성에 사용되는 FSH 제제의 용도.
  17. 제 16항에 있어서, FSH가 약 210 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  18. 제 16항에 있어서, FSH가 약 220 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  19. 제 16항에 있어서, FSH가 약 230 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  20. 제 16항에 있어서, FSH가 약 240 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  21. 제 16항에 있어서, FSH가 약 250 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  22. 제 16항에 있어서, FSH가 약 260 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  23. FSH가 약 200 이상의 Z-번호를 갖는 난포형성에 사용되는 약물 제제에서의 FSH의 용도.
  24. 제 23항에 있어서, FSH가 약 210 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  25. 제 23항에 있어서, FSH가 약 220 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  26. 제 23항에 있어서, FSH가 약 230 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  27. 제 23항에 있어서, FSH가 약 240 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  28. 제 23항에 있어서, FSH가 약 250 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  29. 제 23항에 있어서, FSH가 약 260 이상의 Z-번호를 갖는 용도.
  30. 2,3-시알릴트랜스퍼라아제의 존재 하에 시알산 공여체와 FSH를 반응하는 단계를 포함하는, 약 200 이상인 Z-번호를 갖는 FSH 제제의 제조방법.
  31. 제 30항에 있어서, FSH가 약 210 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, FSH가 약 220 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  33. 제 30항에 있어서, FSH가 약 230 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  34. 제 30항에 있어서, FSH가 약 240 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  35. 제 30항에 있어서, FSH가 약 250 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  36. 제 30항에 있어서, FSH가 약 260 이상의 Z-번호를 갖는 방법.
  37. 제 30항 내지 36항에 있어서, 시알산 공여체는 CMP-시알산인 방법.
  38. 제 30항 내지 37항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제는 주 ST3Gal III 인 방법.
  39. 이온-교환 크로마토그래피의 단계를 포함하며, 약 200 이상의 Z-번호를 갖는 FSH 제제의 제조방법.
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