MXPA04003352A

MXPA04003352A - Gonadotrofinas para foliculogenesis.

Info

Publication number: MXPA04003352A
Application number: MXPA04003352A
Authority: MX
Inventors: Loumaye Ernest
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-15
Publication date: 2004-07-08
Also published as: CN1608078A; CA2464368A1; EP1621549A2; UA87433C2; PL369606A1; EA200400574A1; DK1438336T3; IL161235A; HRP20040278B1; EP1438336A2; ATE329930T1; EA007030B1; CN1608078B; HRP20040278A2; RS32804A; KR100929971B1; PT1438336E; ES2261740T3; NO327966B1; WO2003035686A3

Abstract

La invencion proporciona una preparacion de la FSH que tiene un alto grado de sialilacion y que muestra un aumento en su eficacia.

Description

posiciones 13 y 30 en hCG = hGC . En la LH humana, se une u oligosacárido a la posición 30 de la subunidad-ß. La hCG "iene adicionalnente cuatro cadenas laterales de oligosacárido (unicnes-O) de uniones-serina presentes en la. porción terminal carboxilo (CTP = PTC) . Como en el caso de las gliccpr oteinas , las variaciones en la estructura de oligosacárido ocurren e las gonadotrof inas, resultando en un ordenamiento de isoformas que se encuentran dentro de la glándula pituitaria y en la circulación. Además, hay diferencias en el grado de la "cabeza" del carbohidrato terminal per el ácido siálico. Las isoformas pueden estar separadas en base a su carga, la que se determina en gran medida por el número y la distribución de los ol igosacáridos unicnes- sialiladas. Las formas altamente sialiladas van a tener un pl más ácido que el promedio y se denominan "ácidas". Las formas menos sialiladas tienen comparativamente pls más altos y se las denominan "básicas" . Como una consecuencia de sus diferencias estructurales, las isoformas de la gonadotrofina difieren en su capacidad para unir a los receptores de célula-objetivo. El grado de sialilación afecta su capacidad para sobrevivir en la circulación. En el caso de la FSH, varios grupos han demostrado que las isoformas muy ácidas/sialilaaas tienen vida media de plasma considerablemente más largas en los modelos animales, tales como en el ratón o la rata". Se ha demostrado que varía el perfil de la isoterma de la FSH endógena en los seres humanos. Las isoformas ácidas cor. vidas medias largas ir¡ vive y con potencia biológica i vítro rela ivamente baja están predominantemente en el suero ce los niños pre-púberes, en les pacientes hipogonadales y en las mujeres durante la fase folicular. En contraste, las isoformas menos sialiladas más básicas, con vida media in vivo más cortas y con actividad biológica in vitro relativamente alta, se encuentran durante la pubertad, en la terapia de GnRH y aproximadamente en el surgimiento del ciclo medio de la gonadotrofina en las mujeres2. Las isoformas de la FSH que poseen un contenido de ácido siálico más grande circulan por períodos más largos, debido a que los residuos del ácido siálico terminal "encabezan" los residuos de galactosa impidiendo, de esta manera una interacción con los receptores asialo-glicoproteínas hepáticos y la remoción de la circulación3. Las fracciones (glicano) oligosacáridas unidas a las proteínas son ramificadas y cada residuo de azúcar terminal es referido como una antena. El número Z del parámetro proporciona una medida de qué proporción de la antena de las fracciones de carbohidrato en la giieoproteína soporta residuos cargados tales como el ácido siálico. La FSH desialilada tiene el número Z de 0. La FSH totalmente sialilada tendría un número Z entre aproximadamente 23C a 280. La potencia de las preparaciones de la FSH se estima in vivo en el ensayo de Steelman-Pohley , que compara,. bajo las condiciones especificas, la capacidad de una preparación para incrementar la masa ovárica de las ratas inmaduras en comparación con una preparación internacional estándar /referencia , calibrada en las Unidades Internacionales (IU = UI) . Muchos grupos han investigado el rol de la glicosilación y la sialilación para influenciar en el perfil biológico de la FSH. D' Antonio y colaboradores evaluaron las proporciones de despeje metabólico {MCR = PDM) de las isoformas ácidas (pl < 4.8} y básicos (pl > 4.8) en las ratas hembras obtenidos mediante cromatoenfoque . Como era de esperarse, se descubrió que las isoformas básicas tenían un despeje más rápido que las isoformas ácidas (ti 2 = 0.4 h para los básicos, 0.9 h para les ácidos) . Cuando se compararon las formas ácidas y básicas (en una base masiva) en el ensayo Steelman-Pohley, se descubrió que la isoforma básica era considerablemente menos activa que la isoforma ácida (ED50 = 0.9 pg/rata para la básica, 0.3 pg/rata para la ácida) . Cuando se compararon las isoformas en una base UI, no existió diferencia entre las dos5.

Vitt y colaboradores llevaron a cabo un estudio ir. vitro en el cual cuatro preparaciones de la F3H humanas recombinantes de diferentes pls se compararon por su capacidad para causar incremento en la medida y producción de oestradiol (E2) en los folículos del ratón aislado. Se descubrió que la FSH básica (pl 5.C-5.6) conducían a un crecimiento mayor de los folículos, y que resultaban en la medida más grande del folículo, seguido por la FSH recombinante no fraccionado. Las preparaciones de las FSH medias (pl 4.5-5.0) y ácidas (3.6-4.6) estuvieron por detrás en la velocidad de crecimiento y en la medida máxima de los folículos. La FSH básica mostró inducir la secreción E2 más temprana y a una dosis más baja que las otras isoformas. Los folículos cultivados con la FSH ácida, sin tener en cuenta la concentración, secretaron concentraciones mesurables de E? solamente después de una incubación prolongada6. Timossi y colaboradores utilizaron cromatoenfoque para separar la FSH pituitaria humana en siete variantes de fracciones diferentes de glicosilación/acidez . Se probaron las fracciones por su capacidad para causar la sobre-regulación de la expresión de la aromatasa (necesaria para la producción de oestradiol) y activador piasminógeno tipo tejido (tPA = AtP) in vitro en las células granulosas de la rata. Se descubrió que la proporción de la bioactividad a la inmunorreactividad (B/I) disminuía mientras que el valor pH de elución de la isoforma declinaba. Los autores concluyeron que las isoformas básicas exhibieron una capacidad mayor para inducir la expresión de la aromatasa y del tPA mR As y las proteínas que las variantes ácidas'. _ . Zambrano y colaboradores fraccionaron la FSH pituitaria humana en 9 fracciones de diversos pl, utilizando cromatoenfoque, y probaron las isoformas ácidas y básicas utilizando tres inmunoensayos y dos ensayos in vitro: la producción de oestradiol mediante las células granulosas de la rata y la producción cRV.P por una línea de células fetal humana expresando el receptor de la FSH. La proporción de la actividad en los bioensayos a la inmunorreactividad (B/I) disminuyó tanto como disminuyó el pl de la isoforma para todos los bioensayos8. En un estudio posterior, Zambrano y colaboradores , compararon la afinidad de la unión de siete fracciones diferentes de las isoformas ácidas y básicas de la FSH pituitaria humana para un sistema receptor heteróloco (células granulosas de las ratas) y del sistema receptor homólogo (células HEK-293 humanas recombinantes expresando el receptor de la FSH humana). El receptor heterólogo mostró un incremento en unir la afinidad mientras el pl de la isoforma aumentaba, en tanto que el receptor homólogo no lo hacía. La producción cAMP en las células ???-293 también se incrementó mientras el pl de la isoforma se incrementaba9.

Los estudios han mostrado que las formas más acidas ae las FSH exhiben la bioactividad in vivo más alta (en base masiva) cuando se evalúan por las pruebas clásicas de aumento de peso de ovario1"'11. Timossi y colaboradores postularon que las formas básicas pueden ser más activas ir. vive pero que, debido a la vida medida más corta, no se puede observar el efecto en ganancia en el peso de los ovarios de las ratas. Silos examinaron el efecto de dos preparaciones en un sistema de respuesta rápido: sobre-regulación de la actividad TPA". Los autores concluyeron que la rhFSH que tiene un perfil de distribución de carga menos ácida exhibe una bioactividad in vítro más alta y velocidades de despeje de plasma e induce la actividad de la enzima tPA más rápidamente que una preparación de la FSH altamente ácida. Las gonadotrofinas juegan roles cruciales en el ciclo reproductivo y su uso es esencial para las técnicas reproductivas asistidas (ART), tal como la fertilización in vitro (IVF = FIV) , IVF en conjunto con la inyección del esperma intracitoplásmicc (IVF/EIC) y la transferencia embrional (ET) , tanto como para la inducción de la ovulación ;0I = 10) en los pacientes anovulatorios que se encuentra bajo tratamiento de fertilización in vivo tanto en forma natural o por medio de la inseminación intrauterina (IUI) . La ART se lleva normalmente a cabo utilizando la hiperestimulación ovárica controlada (COH = HOC) para aumentar el número de gametos femeninos1". Los regímenes estándar"'' para COH incluyen una fase de regulación descendente en las cuales las gonadotrofinas endógenas se suprimen mediante la administración de un agonista de la hormona de liberación de gonadotrofina (GnRH) , seguido por una fase estimulante en la cual el desarrollo folicular í foliculogénesis } se induce por la administración diaria de la FSH, usualmente a aproximadamente 150-225 Ul/día. Alternativamente, la estimulación se comienza luego de la menstruación espontánea o inducida, mientras se impide que ocurra un surgimiento de la LH en un mal momento, mediante la administración de un antagonista GnRH (normalmente comenzando alrededor del día sexto de la fase estimulante) . Cuando existen al menos 3 folículos >16 mm (uno de IB mm) , se suministra un bolo único de hCG ;5-lC,000 ül) para imitar el surgimiento de LH natural e inducir la ovulación. La recuperación de los oocitos se regula durante 36-38 horas luego de la inyección de hCG. La OI se lleva a cabo con la administración diaria de la FSH a una dosis de aproximadamente 75-150 Ul/día. Se puede utilizar una regulación descendente con los agonistas GnRH = HLGn, o con los antagonistas, aunque menos frecuentemente que en la indicación de ART . Se da hCG para imitar el surgimiento de LH antes de la fertilización ín vivo, que se logra tanto mediante la relación sexual regular como por la IUI.

Los regímenes típicos descritos anteriormente para ART e 01 requieren inyecciones diarias de gonadotrofinas durante un período prolongado, es decir para un promedio de 10 días, y hasta 21 días en algunos pacientes. El desarrolle. de las preparaciones de la FSH de mayor eficacia permitirían que la dosis diaria de la FSH disminuya, y/o permita un acortamiento del período de tratamiento íes decir pocas inyecciones) y/o permita que se den inyecciones menos frecuentemente. Esto provocaría regímenes de ART e 01 convenientes y más agradables para el paciente. Además, la ART que utiliza la fertilización in vitro puede acarrear posibles contratiempos. Por ejemplo, no todos los folículos van a producir un occito viable, no todos ios oocitos viables van a ser fertilizados en forma exitosa, y algunos embriones pueden no ser viables. Además, una vez que los embriones viables se seleccionan, la transferencia al útero y la implantación puede no ser exitosa. Para maximizar las chances de un nacimiento vivo, se desea por lo tanto estimular el crecimiento y la maduración de varios folículos, para asegurar la recolección de múltiples oocitos. En la indicación de 01, en contraposición, el objetivo es obtener no más ce tres y preferiblemente un folículo dominante (para evitar los embarazos múltiples) . Algunos pacientes que están bajo tratamiento de las ART e OI presentan un número reducido de folículos que crecen cuando se tratan con las preparaciones de la FSH convencionales. Este es un factor limitante del éxito, cuando se está bajo tratamiento ART, por el hecho que se limita el número de embriones disponibles para transferencia y/o. criopreservación . También puede ser un factor limitante del éxito en aquellos pacientes que están co tratamiento IUI, ya que la obtención de más de un folículo es importante. Los pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen a los pacientes que están aproximadamente er. los 33-35 años de edad, a los pacientes con la F5H de línea basal elevad, oestradiol de línea basal elevada o inhibir, b de línea basal reducida . En los machos, la espermatogénesis depende de la estimulación de las células Sertoli mediante la FSH. La deficiencia de la FSH trae como resultado la oligoespermia, y por lo tanto la infertilidad. El tratamiento de la infertilidad masculina con las preparaciones de la FSH convencionales requieren inyecciones de la FSH tres veces por semana por un lapso de hasta 18 meses. El desarrollo de las preparaciones de la FSH con una capacidad mejorada para estimular la foliculogénesis es una necesidad corriente. También existe una necesidad para nuevas preparaciones de la FSH para tratar pacientes con disminución a la respuesta de la FSH. También se desean preparaciones de la FSH de mejor eficacia, permitiendo protocolos de tratamientos más cortos y/c dosis acumulativas disminuidas y/o dosis menos frecuentes, para ART, 01 y para la infertilidad masculina. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención suministrar una preparación de gonadotrofina para utilizar en la inducción de la ovulación y en COH, particularmente en conjunto con la AR . En un primer aspecto, la invención proporciona una preparación de la FSH, en donde el número Z de la preparación está al menos en o aproximadamente 200. En un segundo aspecto de la invención proporciona una preparación de la FSH, en donde la preparación tenga un pl promedio debajo de, o aproximadamente 3.4. En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la FSH, en donde la FSH tiene un número Z que está al menos en, o aproximadamente 200. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un uso de la FSH en la estimulación de foliculogénesis , en donde la FSH tiene un número Z que está al menos en, o aproximadamente 200. En un quinto aspecto, la invención proporciona un uso de la FSH en la preparación de un medicamento para el uso en la estimulación de la foliculogénesis, en donde la FSH tiene ur. número Z que está al menos en, c aproximadamente 200. En un sexto aspecto, la invención proporciona un método para inducir la foliculogénesis en un paciente humana,. tal método comprende la administración de la F3H a un paciente en donde la FSH tiene un número Z que está al menos en, o aproximadamente 200. En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método para preparar una preparación de la FSH que tiene un número Z que está al menos en, o aproximadamente 200, tal método comprende una etapa seleccionada de: • reaccionar la FSH con un donante ácido siálico en la presencia de 2, 3-sialiltransferasa; • seleccionar un tipo de célula adecuada para la expresión de la FSH recombinante; • cultivar una célula, preferiblemente recombinante, que está expresando FSH de acuerdo con las condiciones que favorecen altos niveles de sialilación; y · aislamiento de las isoformas de la FSH que tiene un número de Z alto utilizando una técnica cromatográfica . En un octavo aspecto, la invención proporciona un uso de FSH para tratar la infertilidad masculina, en donde la FSH tiene un número Z que está ai menos en, o aproximadamente 200.

En un noveno aspecto, la invención proporciona un uso de la FSH en la preparación ce un medicamento para utilizar en el tratamiento de la infertilidad masculina, er. donde la FSH tiene un número Z que está al menos en, _o aproximadamente 200. En un décimo aspecto, la invención proporciona un método para tratar la infertilidad masculina en un paciente humano, método que comprende la administración de la FSH al paciente, en donde la FSH tiene un número Z que está al míenos en, o aproximadamente 200. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un cromatcgrama para elución por medio de una columna GlycoSep® de glicanos liberados de la rFSH; la columna 4.6 x 100 m , empacada con resina de divinilbenceno revestido de polímero (5 m) , con una fase móvil de acetonitrilo ; agua 20:80, con un gradiente linear de 0.25% por minuto de acetato de amonio (500 mM) desde 5 a 21 minutos, seguido per un gradiente linear de 0.525% por minuto de acetato de amonio (500 mM) desde 21 a 61 minutos. El eje X muestra el tiempo de retención en minutos, y el eje Y muestra la fuerza de señal en mV. La Figura 2 muestra el número de folículos por categoría de medida, un día 8 (en el eje Y) , en pacientes que reciben isoformas ácidas y básicas de la FSH hasta el día 7. Las líneas onduladas representan el resultado con las iscformas ácidas, las líneas oblicuas representan el resultado con las isoformas básicas. La Figura 3 muestra el número de folículos por categoría de medida, un día 10 (en el eje Y) , en pacientes. que reciben isoformas ácidas y básicas de la FSH hasta el día 7. Las líneas onduladas representan el resultado con las isoformas ácidas, las líneas oblicuas representan el resultado con las iscformas básicas. La Figura 4 muestra los niveles de suero de la FSH promedio en ios pacientes luego de la última dosis de las isoformas ácidas y básicas de la FSH. El eje X representa el tiempo en horas desde la primer inyección de la FSH, el eje Y representa la concentración de suero en el UI/L inmunorreactiva . Los cuadrados (I) muestran la concentración de suero luego de ^a inyección de las isoformas ácidas. Los diamantes (?) muestran la concentración de suero luego de la inyección de las isoformas de las FSH básicas. Las concentraciones del suero fueron medidas por inmunoensayo , por ejemplo, radioinmunoensayo , utilizando un equipo como el suministrado por el Daiichi Isotope Laboratory, Japón. La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos para la subunidad alfa de la FSH humana madura. La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos para la subunidad beta FSH humana madura.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han descubierto en forma sorprendente que las isotermas FSH altamente sialiladas tienen mayor eficacia para inducir la folicuiogénesis en les pacientes. humanos que las isoformas menos sialiladas. La utilización oe una preparación de la FSH de la invención permite el uso de una dosis acumulativa más baja de la FSH para lograr el mismo o mejor resultado clínico. Los inventores han descubierto que cuando se tratan los pacientes con iguales cantidades de la FSH ácida y la FSH básica en una base UI, como lo determina el ensayo convencional, el número de folículos crecientes en los pacientes tratados con la FSH ácida es significativamente mayor . Cuando se tratan los pacientes con iguales cantidades de la FSH ácida y la FSH básica, en base masiva, el número de folículos en los pacientes tratados con la FSH ácida es también sustancialmente mayor. Algunos pacientes presentan un número reducido de folículos crecientes cuando se tratan con las preparaciones de la FSH convencionales. Este es un factor limitante para el éxito cuando se trata con la ART . Los pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen a los pacientes entre aproximadamente 33-35 años, pacientes con la FSH de línea base elevada, con oestradiol de línea de base elevada o con inhibir, b de línea de base reoucida. La preparación de la FSH de acuerde con la invención puede inyectarse una vez diariamente, o cada dos días, para educir una mejor respuesta del ovario que con las preparaciones convencionales. Esto incrementa las chances de concebir en estos pacientes. Los inventores han descubierto, sorprendentemente, que las preparaciones de la FSH que tienen mayor eficacia, que permiten dosis menos frecuentes, pueden ser realizadas utilizando la FSH que tenga un número Z que esté ai menos en o aproximadamente 200, de preferencia al menos en, c aproximadamente 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 y 290, con un orden de preferencia que aumenta a medida que aumenta el número Z, ¡los números Z que caen entre estos valores están, por supuesto, dentro del alcance de la invención) . Para inducir la folí c logénesis , las preparaciones de la FSH convencionales se administran en forma general cada día, en una dosis de aproximadamente 75-600 Ul/día. En la mayoría de los pacientes, la misma dosis acumulativa de una preparación de la FSH convencional puede ser administrada cada dos días, mientras que se logra un resultado clínico similar al de las inyecciones diarias15. La expresión "dosis menos frecuente" significa aplicar las preparaciones de la FSH que se pueden administrar con menor frecuencia que cada dos días, mientras se logra el mismo resultado clínico, tanto en términos del volumen total folicular, como en las preparaciones convencionales administradas cada uno o dos cías. Los términos "ácida" y "básica" se utilizan ampliamente para referirse a las preparaciones de _a FSH que tienen grados variables de sialilación. Debido a que el ácido siálico es ácido, las moléculas más altamente sialiladas van a tener pls más bajos. Utilizando un enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque u otros métodos de separación, tales como la cromatografía de intercambio de iones, FPLC y H?LC"D, una mezcla de isoformas puede ser separada en fracciones que pueden ser señaladas como ácidas o básicas, de preferencia basadas en el número Z. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxiladas de nueve-carbonos. El miembros más común de la familia ae ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido- 3 , 5-didesoxi-D-gl i cer o - 0- galactononulopiranos- 1 -ónico, a menudo abreviado como Neu5Ac, NeuAc, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc es hidroxilado . Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN)17. También incluido están los ácidos siálico 9-sustituidos tal como un 9-0-Ci-C6-acil-Neu5Ac como 9-0-lactil-Nau5Ac o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluor-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para revisión de la familia de ácido siálico, ver, por ejemplo, Varki; Glycobiology ÍG1 icobiolcgía ) 2 1592; 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function (Ácidos Siálicos: Química, Metabolismo y Función), R. Schauer, Ed. ( Spinger-Verlag, Nueva York (1992)}. Las fracciones de carbohidrato (alternativamente! "glicano") se une a la base péptido vía un azúcar única, tanto con una unión-O- o -N unidas glicosidicas . Como la fracción de carbohidrato se vuelve elaborada, puede ocurrir la ramificación, con el resultado que la fracción de carbohidrato tiene uno, dos, tres, o cuatro (a veces más) residuos de azúcar terminales o "antenas". Tales fracciones de carbohidrato son referidas como mono-, di-, tri- o tetra-ramificadas. El parámetro del índice de antenas (AI) proporciona una medida del grado de ramificación en los residuos de carbohidrato, proporcionando también una medida de la medida 3-D de las fracciones de carbohidrato. Para determinar este parámetro, se trata una glicoproteína químicamente para liberar todos los residuos de carbohidrato, por ejemplo calentando con hidracina, o el carbohidrato puede ser dividido enzimáticamente , por ejemplo, con endoglicosidasa (glicanasa-N) 18. La mezcla de carbohidrato se aisla. Si se desea, la mezcla de carbohidrato se hace reaccionar con una etiqueta, tal como una etiqueta-radio, una etiqueta cromofora (es decir UV-activa vis) , una etiqueta fluorófora, una etiqueta inmunorreactiva , etc. La mezcla de carbohidrato etiquetada es luego desialilada, con la enzima de sialidass, para producir una mezcla de carbohidrato neutral etiquetaca, (alternativamente, las etapas de etiquetado y desialilación pueden ser invertidas en el orden) . La mezcla de carbohidrato etiquetado neutral es luego separada en sus componentes, utilizando un método cromatográfico que puede distinguirse entre las especies diferentes (mono-, di, tri- y tetra-ramificada) . La cromatografía (fase-normal- o inversa-) puede llevarse a cabo utilizando esencialmente un método, incluyendo, por ejemplo la cromatografía de capa gruesa o fina, o la cromatografía líquida de alta performance (HPLC). Alternativamente, la mezcla de carbohidrato neutra- aislada puede hacerse reaccionar con agentes para suministrar los componentes volátiles, y la mezcla puede ser sujeta a la cromatografía por gas (GC) . La visual, zaciór. va ser llevada a cabo con un método apropiado a la etiqueta y al método cromatográfico utilizado. Por ejemplo, si se utiliza un fluoróforo como etiqueta se utilizará un fluorímetro para la detección; si se utiliza un cro óforo como etiqueta se va a utilizar un espectrofotómetro UV-vis para la detección. Si no se utiliza etiqueta, puede usarse la espectrometría de masa para medir los picos y los tiempos de retención. Las asignaciones picos a las especies mono-, di-, tri- o tetra-ramificadas pueden ser realizadas utilizando la espectrometría de masa, o por comparación con los estándares conocidos. 2 O Se analiza luego un cromatograrr.a integrando los picos asociados con _as especies de carbohidrato di-, tri- y tetxa-ramificadas . El porcentaje del carbohidrato total representado por cada especies puede luego ser usado para. calcular Al de acuerdo con la siguiente ecuación: Al = 2 Pdi + 3 Ptri + 4 Ptetra en donde Al es un índice de antena, y Pdi, Ptr. y P-etta son el oorcentaje de carbohidrato total que está di-, tri- y tetra-rarr.ificado respectivamente. Las cantidades de trazos de otros componentes (por ejemplo mono-antena) pueden estar presentes pero no contribuyen en forma importante al valor Al. Un índice alto de antenabílidad indica que las fracciones de carbohidrato son altamente ramificadas, con muchas antenas. La FSH humana recombinante normalmente tiene un Al desde aproximadamente 220-280, o un promedio de aproximadamente 255. El número Z del parámetro proporciona una medida de cómo muchas de las antenas de las fracciones de carbohidrato en la glicoproteína soportan residuos cargados, tales como el ácido siálico. Para determinar el número Z, las fracciones de carbohidrato se liberan desde el péptido, como anteriormente, y se etiquetan, si se desea. La mezcla es luego separada mediante cromatografía de intercambio de iones, permitiendo la separación ce las especies en la base de la carga. La visualización de los picos eluidos puede ser por virtud de una etiqueta, como la mencionada anteriormente, o puede ser por algún otro método, tal como la espectrometría de masa. Un. cromatograma se analiza luego integrando los picos asociados con las especies de carbohidrato monc-, di- tri- y tetra-cargadas. El porcentaje del carbohidrato total representado para cada especie puede luego utilizarse para calcular el número Z de acuerdo con la siguiente ecuación: Z = P'mono + 2 P'dl + 3 P'tri + 4 P'tetra en donde Z es un número Z, y ?'m3no, F'^, P' -rl y P' tetra son el porcentaje del carbohidrato total que está mono-, di-, tri- y tetra-carcado respectivamente. Un número Z alto indica que un número grande de antenas soporta los residuos cargados, y que la glicoproteína va, por lo tanto a ser altamente cargada, y en el caso de los residuos de ácido siálico, será ácida. La FSH recombinante humana normalmente tiene valores de número Z en el intervalo de aproximadamente 150 a aproximadamente 19C o en el promedio aproximadamente 18 . Los inventores han sorprendentemente descubierto que las isofor as de la FSH que tienen los números Z más altos que, o aproximadamente 200, muestran eficacia incrementada en términos del número de los folículos, cuando se compara con una base UI con una "dosis equivalente" de isoformas de la FSH que tienen menos números Z que 200. Por "dosis equivalente" se requiere significar que cuando la. cantidad de la FSH de las isoformas diferentes se midan por el ensayo in vivo convencional comparando, de acuerdo con las condiciones específicas, su capacidad de incrementar la masa ovárica en las ratas, la dosis UI es la misma. Sn otras palabras, la dosis UI equivalente de diferentes isoformas, come se determina en las ratas, tienen d_ferente eficacia clínica cuando se administran a los seres humanos. Las preparaciones de la FSH que tiene un número de Z incrementado pueden ser aisladas de diferentes maneras. Por ejemplo, un lote de la FSH recombinante puede estar sometido al enfoque isoeléctrico, o cromatoenfoque come se describiera, por ejemplo, tanto por Moulders y colaboradores1''' , como por Zambrano y colaboradores^'"' , y por Timossi y colaboradores"1. Las fracciones que tienen varios pls pueden ser aisladas. Las preparaciones de la FSH preferidas de la invención pueden tener un promedio de pls de menos que, a o aproximadamente 3.4, de más preferencia menos que a o aproximadamente 3.3, particularmente de preferencia menos que, o aproximadamente 3.2 con un grado de preferencia que aumenta tanto como baja el promedio de pl . El número Z del parámetro, refleja el grado promedie de sialilación de una población de especies de la FSH. Es posible que una preparación de la FSH que tiene un número Z alto pueda aún tener una proporción substancial de especies básicas (menos sialiladas) . Tales especies básicas. pueden actuar como antagonistas en el receptor de la FSH, y son por lo tanto indeseables. La "diseminación" de las especies presentes puede estar determinada por el enfoque isoeléctrico o por cromatoenfoque . El análisis del número Z puede también dar una idea de la diseminación de las especies. Se prefiere que la preparación tenga menos que, o aproximadamente el 4% de las especies de carbohidrato neutrales (es decir, fracciones glicanos que no soportan cambio), y menos que o aproximadamente el 16% de especies mono-sialiladas , y de más preferencia que la preparación tenga menos que, o aproximadamente el 3%, 2% o 1% de especies neutrales que, a o aproximadamente el 15%, 12%, 10%, 8% o 5% de especies mono-sialiladas, con un grado de preferencia que aumenta a medida que los porcentajes decrecen. Dentro del alcance de la invención están las preparaciones de la FSH que tienen eficacia aumentada en la foliculogénesis , resultando en un grado aumentado de sialilación en uno o más sitios de glicosilación adicional en la proteina. Tales sitios pueden ser introducidos por substitución de los residuos en la base de la proteina de la FSH con residuos de serina, treonina, lisina o asparagina, utilizando, por ejemplo, mutagénesis . Un ejemplo de un método que se puede utilizar para generar tales formas mutantes de la FSH se suministra en el Ejemplo 7. Para la glicosilación in vivo, el sitio introducido debería ser tal como para formar un "sitio de glicosilación-N" de las siguientes secuencias: N-X' -S/T/C-X" , en donde X' es un residuo de aminoácidos excepto la prolina, X" que es cualquier residuo de aminoácidos que pueda o no pueda ser idéntico a X' y el cual de preferencia es diferente de la prolina, N es asparagina, y S/T/C representa un residuo que puede ser serina, treonina c cisteína, de preferencia serina o treonína, y de más preferencia treonina. Las isoformas ácidas (pl < 3.4) de tales moléculas de la ?SH caen dentro del alcance de la invención. Tales moléculas de la FSH modificadas, que soportan sitios de glicosilación adicional se describen, por ejemplo en WO 01/58493 (Maxygen) : Particularmente preferidas son las siguientes mutaciones: En la subunidad-ß: E4 , A70N, L73N, V7SN, G100N, Y103 , F19N/121T, L37N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T Y R97N/L99T; en la subunidad-a: E9N, F17T, F17N, R67N, V68T, E56N, H83N y F33N/R35T; en donde A es alanina, D es ácido aspártico, E es ácido glutámico, F es fenilalanina, G es glicina, H es histidina, I es isoleucina, L es leucina, N es asparagina, R es arginina, T es treonina, V es valína, Y es tirosina y la notación "E4N" representa un reemplazo de un ácido glutámico (E) en la posición 4 con una asparagina (N) . Par la numeración de secuencia, la secuencia de aminoácidos del a_fa de la FSH humana se numera de acuerdo con la secuencia madura mostrada en la Figura 5 o SEC ID NO : 1. La. secuencia de aminoácidos de la FSH humana beta se numera de acuerdo con la secuencia madura mostrada en la Figura 6 o la SEC ID NC:2. También dentro del alcance de la invención están las preparaciones de la FSH que tienen eficacia incrementada en foliculogénesis resultando en un aumento del grado de sialilación en uno o más sitios adicionales de glicosilación presentes en un péptido que está pendiente. Por un "péptido pendiente" se quiere significar cualquier péptido que incluye un sitio de glicosilación, y que puede estar unido a la terminal amino y/o carboxilo de la subunidad-ot y/o -ß de la FSH sin afectar en forma perniciosa la actividad de la FSH de la molécula resultante. Por ejemplo, la subunidad-ß de hCG es substancialmente más grande que aquella de las otras gonadotrofinas , debido a aproximadamente 34 aminoácidos adicionales en la terminal-C referida en la presente como la porción terminal carboxilo (CTP) . En la hCG urinaria, el CTP contiene cuatro oligosacáridos unidos o tipo mucin. Este CTP puede estar ligado a la subunidad-ß de la FSH, de preferencia en la terminal carboxilo de la subunidad-ß de la FSH, resultando en una molécula que tiene actividad FSH y que cieñe cuatro sitios adicionales de glicosilación . Las isoforrras ácidas (pl < 4.4) de cales moléculas FSH caen dentro del alcance de la invención. Tales moléculas escán descritas en WO 93/06844 (Washington University) y por Boirne y colaboradores2' . Otras moléculas de la FSH que tienen glicosilación modificada se descnoen en WO 90/09800 (Washington University) . Con la finalidad de esta descripción, las preparaciones de la FSH que tienen sitios adicionales de glicosilación van a ser denominados de la FSH5~y+. Cuando ios sitios de glicosilación adicionales se agregan, el número Z del parámetro puede no ser más utilizado para compararlo con las preparaciones de la FSH "normales" (es decir, aquellos que tienen cuatro sitios de glicosilación) ya que este parámetro se normaliza (es una suma de porcentajes). Cuando una preparación de la FSHgly+ está sujeta a un análisis de especie de glicano, el número Z~ del parámetro puede ser calculado, en una forma análoga al número Z. Las preparaciones de la FSHgly" de la invención tienen los números Z~ de más que o aproximadamente 200, de preferencia más que, o aproximadamente 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 con un grado de preferencia que aumenta mientras disminuye el numero Z+. Las preparaciones FSHgly* de la invención tienen perfiles pl significativamente más bajos que la FSH normal. Particularmente preferidas por el aumento de su eficacia son aquellas preparaciones de la FSH51y+ que tienen pls promedio de menos que o aproximadamente 4.4, más preferidas sor. aquellas que tienen pls promedio meros que, o aproximadamente 4.2, 4.0, 3.8, 3.6, 3.4, 3.3 y 3.2 con un grado de preferencia que aumenta mientras que disminuye el promedio de pi. En todas las modalidades de la invención se prefiere la FSH recombinante . Para tratar los pacientes humanes, se prefiere la FSH recombinante humana. Las preparaciones de la invención pueden estar aisladas de la FSH recombinante convencional, o pueden estar aisladas de las preparaciones de la FSHgly~. Es también un aspecto de la invención proporciona un método para enriquecer el contenido de ácido siálico utilizando un método que los inventores llaman "acentuación del sialil". Las preparaciones de la FSH recombinante ¡preferidas), o las preparaciones de la FSHgly+ recombinante (también preferidas) , o FSH urinarias, pueden estar sujetas a la acentuación del sialil, tratando con una enzima, tal como la glicosiltransferasa, en particular sialiltransferasa, en la presencia de un donante de ácido siálico, por ejemplo, ácido siálico-CM? como se describen en WO-98/31826 (Cytel Corporation) . Ejemplos de la sialiltransferasa recombinante, tanto como los métodos para producir sialiltransferasas recombinantes , se encuentran en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,541,083 (University of California: Amgenj . Al menos 15 sialiltransferasas de mamíferos diferentes se han documentado, y las cADNs de trece de estos han sidc clonadas. Estas cADNs pueden ser usados para la producción recombinante de las sialiltransferasas., que pueden luego ser utilizadas en los métodos de la invención . La sialiltransferasa que se utiliza tendrá la capacidad de transferir ácido siálico a la secuencia Galpl, 4GlcNAc, que son las penúltimas fracciones más comunes que subyacen al ácido siálico terminal en las gliccproteinas sialiladas. Un ejemplo de sialiltransferasa que se puede utilizar es la ST3GalIII, que es también referida como una (2, 3) -sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) . Esta enzima cataliza la transferencia del ácido siálico al Gal de Gal-p-1,3-glicosilNAc o Gal-p-1, 4-glicosilNAc glicosída"3. El ácido siálico se une a un residuo de galactosi__ (Gal) con la formación de una unión- entre los dos sacáridos. La unión de los sacáridos está entre la posición-2 de >JeuAc y la posición-3 de Gal. Esta enzima particular puede ser aislada del hígado de la rata24; se sabe que el cADN25 humano y las secuencias ADN genómicas20 de ADN facilitan la producción de esta enzima mediante la expresión recombinante. En una modalidad preferida, los métodos de sialilación utilizan un ST3GalIII (de preferencia de la rata) , ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, STGGalNAc I, o ST6GalNAc II, de más preferencia ST3Gal III, SToGal I, ST3Gal IV, ST6Gal II o ST3Gal V, más particularmente de preferencia ST3Gal III de _a rara . La cantidad de sialiltransferasa va a estar de preferencia en el intervalo de, o aproximadamente 50 mU por ng de la FSH o menos, de preferencia a o aproximadamente 5-25 mU por mg de la FSH. Bajo las condiciones preferidas, la concentración de sialiltransferasa va a estar en o aproximadamente 10-50 mU/ml y la concentración de la FSH va a estar en, o aproximadamente 2 mg/ml. Es también posible producir la FSH enriquecida en las isoformas ácidas transíectando una célula, recombinante o de otra manera, que esté expresando la FSH, con un gen que codifica una sialiltransferasa, cuyo gen es expresadle en la célula. El gen puede comprender las secuencias genómicas que codifican (es decir con intrones) , o puede comprender secuencias que codifican cAD . Alternativamente, si el genoma de la célula contiene secuencias endógenas que codifican la sialiltransferasa , un constructo que causa la expresión de la FSH puede estar insertado en el genoma de la célula. La expresión de la sialiltransferasa puede ser incrementada insertando las secuencias reguladoras no nativas, activas en la célula, en conexión operativa a las secuencias endógenas que codifican la sialiltransferasa . Es también posible insertar con un gen amplificable en conexión operativa a las secuencias que codifican la sialiltransferasa, como para causar la amplif icaciór. de las secuencias que codifican la sialiltransferasa genómica. Estas manipulaciones pueden ser llevadas a cabo utilizando la recombinación homologa, por ejemplo, como la descrita en EP C 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.). El grado de sialilación de una preparación de la FSH puede también ser incrementado seleccionando una célula para la expresión de la FSH recombinante que es conocido por favorecer la sialilación. Tales células incluyen las células pituitarias seleccionadas y las células del Ovario Hámster Chino que expresa niveles altos de sialiltransferasas . Una oreparación de la FSH preparada de tal célula puede oosteriormente estar sujeta a un método de aislamiento, como el mencionado en la presente, para .aislar las isoformas que tengan un alto grado de sialilación. El grado de sialilación de una preparación de la FSH puede también ser aumentado cultivando una célula que expresa FSH, preferiblemente FSH recombinante, de acuerdo con las condiciones que favorecen un nivel alto de sialilación. La sialilación puede ser favorecida suplementando el medio de cultivo con los inhibidores de las neuraminidasas y/o los precursores intracelulares directos para la síntesis de ácido siálico, tal como la actilmanosamina . Una preparación de la FSH preparada de acuerdo con las condiciones de cultivo puede posteriormente estar sujeta a un método de aislamiento, co o se mencionara en la presente, para aislar las isoformas que tengan un grade alto de sialilación. Si se utiliza la acentuación del siaiil, se sesea que antes de la sialilación enzimática, la preparación de la FSH tenga un Al alto, de manera que proporcione muchas antenas para la unión de los resicuos de ácido siálico. Preferiblemente la FSH debería tener un Al de más que, o aproximadamente 220, más preferiblemente debería tener un Ai de más que, o aproximadamente 240, y más particularmente preferido debería tener un Al mayor a aproximadamente 270. La FSH que tenga Ais más altos puede estar aislada, por ejemplo, utilizando la cromatografía de afinidad de Sefarosa derivada del concanavalin-A (Con-A) , eluyendo con un gradiente de metil-glucosa o por HPLC preparativa. El método de acentuación de la sialilación de la invención puede ser ventajosamente aplicado a las preparaciones de la FSH que han sido modificadas para introducir uno o más sitios de glicosilación acicionaies (preparación de la FSH,lY+¡ . Tales preparaciones de la FSHgly+ puede también ser separadas en aquellas fracciones que tienen Ais altos antes de acentuar el sialil. La invención incluye las preparaciones de la FSH realizadas para expresar la FSH en las células que no son capaces de sialilación, y que luego someten a la FSH a la acentuación del sialil. Por ejemplo, ls O 99/13C81 (Akzo Nobel N.V.) describe la expresión de la FSH tipo salvaje y las muteínas en la Dictyostelium eucario a uni-celular, particularmente las muteínas que tienen sitios de glicosilación adicional. La Dictyostelium no es capaz de siaiilar a los glicanos. La invención incluye las preparaciones de la FSH realizadas sometiendo las FSH de tipo salvaje o las muteínas expresadas es Dictyostelium para acentuar el sialil. Luego de la acentuación del sialil, las preparaciones de la FSH que tienen un grado deseado de sialilación pueden ser aisladas utilizando la cromatografía de intercambio de iones, el enfoque isoeléctrico, el cromatoenfoque o la cromatografía en Concanavalin-A (Con-A) . La FSH de la invención tiene un número Z de al menos, o aproximadamente 200, de preferencia al menos, o aproximadamente 210, particularmente preferido al menos, o aproximadamente 220, más particularmente ce preferencia al menos aproximadamente 230, 240, 250, 260 ó 270 con un grado de preferencia que aumenta a medida que aumenta el número Z. La FSH sialilada tiene un número Z de, o aproximadamente 230 a, o aproximadamente 280, dependiendo del índice de antenabilidad. Las preparaciones de la FSH muy preferidas de acuerdo con la invención tienen un número Z de aproximadamente 230 a aproximadamente 280.

Las preparaciones de la FSH de la invención están preparadas para tener consistentemente un número Z de al menos o aproximadamente 2C0, o los números Z preferidos mencionados, anteriormente. La FSH de la invención puede estar aislado de una mezcla de isoformas utilizando una cantidad de métodos que serán conocidos por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, el enfoque isoeléctrico, el crornatoenfoque o la cromatografía de intercambio de iones pueden ser utilizados para separar las isoformas en la base de pl . Las diferentes fracciones pueden ser analizadas por el contenido de ácido siálico, y las fracciones deseadas ser seleccionadas para usarse. Un ejemplo de las condiciones adecuadas para la cromatografía de intercambio ce iones se da en los Ejemplos. Tales métodos ce separación pueden utilizarse para aislar la FSH de la invención de la rFSH producida convencionalmente, o la FSH urinaria (uFSH) , o puede utilizarse para aislar las isoformas deseaaas de la FSH tratada con sialiltransferasa u otras técnicas recombinantes mencionadas anteriormente. En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la FSH de acuerdo con la invención, (es decir, que tiene un número de Z de al menos que, o aproximadamente de 200, los valores preferidos para el número Z mínimo están listados más abajo) · Tales composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para estimular la foliculogénesis, por ejemplo, en conjunto con a inducción de la ovulación, o las técnicas reproductivas asistidas (ART) . Porque _a FSH de la invención es particulamence efectiva en inducir múltiples folículos para desarrollar _y madurar, es particularmente adecuada para utilizarla en la ART, en la cual se desea recolectar múltiples occitos. Alternativamente, teniendo mucho cuidado en la dosificación, la FSH de la invención puede utilizarse para inducir la mono-foliculogénesis para 01, paucifoliculogénesis (hasta aproximadamente tres folículos.) para 'JI, para la fertilización in vivo. La mono-foliculogénesis puede también ser alcanzada con una dosis reducida de la FSH, o con dosis menos frecuentes en comparación con las preparaciones de la FSH convencionales. Por ejemplo, en la preparación de la FSH en OI de la invención puede administrarse a 225-400 UI cada tres días, o dosis más bajas, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta del paciente puede seguirse por sonografía . La FSH de la invención va a ser normalmente formulada como una composición farmacéutica, que va a comprender adicionaimente un diluyente o un excipiente. Una persona experta en la técnica es conciente ae una variedad total de tales diluyentes o excipientes adecuados ¦ para formular una composición farmacéutica. La FSH de la invención es normalmente formulado cerno una dosis de unidad en forma de un sólido lis o para la disolución para formar una solución inyectable estéril para su uso intramuscular o subcutánea. El sólido usualmente resulta de la lio ilización. Los excipientes normales y IQS vehículos incluyen la sacarosa, la lactosa, el cloruro de sodio, los agentes de amortiguación como el fosfato de sodio monobásico y el fosfato de sodio dibásico. La solución puede estar preparada por dilución con agua para inyección inmediatamente antes de usarse. La FSH de la invención puede también ser formulada como una solución para inyectar, comprendiendo cualquiera de los excipientes y amortiguadores listados más arriba, y otros conocidos por una persona experta en la técnica. La FSH de la invención puede ser utilizada en un régimen de hiperestimulación evárica controlada (COH) . Los regímenes estándar"' para COH incluyen una fase de regulación descendente en la cual la hormona luteinizante endógena es regulada hacia abajo por la administración ce un agonista de la hormona de liberación de gonadotrofina (GnRH), seguido por una fase estimulante en la cual el desarrollo folicular ( foliculogénesis ) se induce por la administración diaria de la hormona estimulante del folículo (FSH), usualmente en o aproximadamente 75-60C Ul/día, preferiblemente en, o aproximadamente 150-225 Ul/día. Alternativamente, la estimulación se comienza en la FSH luego de la menstruación espontánea o inducida, seguido por ia administración del antagonista GnRH (normalmente comenzando alrededor del día seis de la fase estimulante) . Cuando existen ai menos 3 folículos > 16 mm (uno de 18 mm) , se suministra un bolo único de hCG (5-10,000 UI) para imitar el surgimiento ce LH natural e inducir la ovulación. La inyección de hC es administrada normalmente en cualquiera de los días 10 a 14, pero puede ser administrada posteriormente, dependiendo de cuando se consiguen los parámetros mencionados ante iormente. La recuperación de oocitos es medido durante 36-38 horas luego de la inyección de hCG. La FSH de la invención puede también ser utilizado para CI e IUI. Por ejemplo la estimulación de la FSH con una preparación de la invención se comienza luego de la menstruación espontánea o inducida, en una dosis diaria de 75-150 Ui . Cuando 1 ó 3 folículos han alcanzado un diámetro de al menos 16 mm, un bolo único de hCG se administró para inducir la ovulación. La inseminación se lleva a cabo in vivo, mediante la relación sexual regular o mediante la IUI. Debido a que la FSH de la invención ha aumentado la eficacia con respecto a las preparaciones de la FSH conocidas, los regímenes tales como aquellos descritos anteriormente pueden emplear dosis de UI más bajas de la FSH, y/o pueden ser modificados disminuyendo el período de estimulación de la FSH, mientras que logre la misma o mejor respuesta, en términos del número y de la viabilidad de los folículos. Por ejemplo, utilizando una preparación de la FSH de _a invención, la foliculogénesis adecuada puede ser lograda con o aproximadamente 50-150 UI FSH, preferiblemente en, o aproximadamente 50-100, de más preferencia en, o aproximadamente 50-75 "JI FSH. La dosis de _a FSH es, usualmente, de base diaria o semidiana. El período de la dosis puede estar en menos que en, o aproximadamente 14 días, de preferencia menos que en, o aproximadamente 12 días, más de preferencia menos que en, o aproximadamente 11 ó 10 días. Las preparaciones para OI de la FSH de la invención pueden administrarse en dosis desde 25-150 UI FSH/día, de preferencia, 50-125 UI FSH/día. Para el tratamiento de la infertilidad masculina, la preparación de la FSH de la invención puede administrarse en 3 x 150 a 300 UI /semana hasta que la espermatogénesis alcance niveles adecuados para la inseminación, tanto por la relación sexual regular o por las técnicas ART . Los inventores han descubierto posteriormente, que debido al aumento de la eficacia, las preparaciones de la FSH que tienen un número Z de al menos de, o aproximadamente 200 pueden administrarse menos frecuentemente que las preparaciones de la FSH que tienen un número Z menor que 200. (Para los fines de esta descripción, los términos FSH4'0'", FSH+2lL, FSH+22Ú, etc., van a utilizarse para representar las preparaciones de la FSH que tienen números Z en el intervalo de o aproximadamente 200-210, 211-220, 221-230, etc. Esto significa que los pacientes que requieren normalm.er.r.e , por ejemplo, 150 UI de la FSH convencional cada día para lograr la fcliculogénesis adecuada, pueden lograr el mismo resultado con, por ejemplo, 225 UI de la FSH+20Ü, cada tres dias o 300 UI de la FSH+,i00, cada cuatro días. Debido al aumento de la eficacia de la FSH+20°, en comparación con las preparaciones de la FSH convencionales, las dosis arriba establecidas pueden ser disminuidas en aquellos pacientes que muestran una buena respuesta. Con las preparaciones de la FSH de la invención que tienen números Z no menores que, o aproximadamente 230, puede ser posible suministrar inyecciones solamente cada cinco, seis o siete cías, dependiendo de la respuesta del paciente. La respuesta puede ser evaluada mediante sonografía y/o midiendo los niveles de estradiol del suero. Otros regímenes adecuados son como sigue a continuación: 100 UI FSH+2:0, cada dos días; 2C0 UI FSH":i:, cada tres días; 275 ó 300 UI FSH+210, cada cuatro oías; 80-100 UI FSH+22°, cada dos días; 180-200 UI FSH+22°, cada tres días; 260-300 UI FSH+22°, cada cuatro días; 75-100 UI FSH'230 , cada dos dias; 170-200 UI FSH+23C, cada tres días; y 250-300 UI FSH+230 , cada cuatro días; 275-400 UI FSH+250 , cada cinco días; 375-450 UI FSH+25C, cada seis días; 450-525 UI FSH+2 0, cada siete días.

El término "aumento de la eficacia" como se utiliza en la presente en relación con un efecto en la foliculogénesis incluye cualquier mejora mesurable, o incremento en el número y/o la viabilidad ae los folículos en un individuo, por ejemplo, cuando se compara con el número y/o la viabilidad de los folículos en une o más pacientes tratados con dosis equivalentes (UI/UI), como lo determina el ensayo convencional del incremento del peso del ovario en las ratas, de la FSH que tiene un número Z menor a 200. De preferencia, la mejora o el incremento va a ser estadísticamente importante, de preferencia con un valer de probabilidad de <0.05. Los métodos para determinar la importancia estadística de los resultados son bien conocidos y están documentados en la técnica, pudiéndose utilizar cualquier método apropiado. La invención será ilustrada con los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS Ejemplo 1 Determinación del número Z ?1 mapeo de glicano permite la determinación del número Z de una glicoproteína . Las fracciones de glicano fueren liberadas de la FSH humana recombinante, utilizando un instrumento totalmente automatizado Oxford GiycoSciences GlycoPrep® 1000 o su 4 O equivalente, con hidracina a 1C0°C durante 5 horas. Las especies de glicano se separaron ae la hidracina no reaccionada y las hidrazidas de aminoácido utilizando una columna de perlas de vidrio revestida. Las especies de glicano se eluyeron con reactivo de acetato de sodio. Las especies de glicano fueron acetiladas con anhídrido acético. Los reactivos en exceso se removieron, utilizando una columna de intercambio de iones de cama mezclada. Cualquier especie de glicano no reducida se recolectó en una solución de amortiguación de acetato diluido. Las especies de glicano se recolectaron en un filtro de 0.5 m (Oxford GlycoSciences ) y se liofilizaron. Las especies de glicano seco fueron etiquetadas reaccionando con un reductor que tiene un fluoróforo (por ejemplo, 2-aminobenzamida o 2-AB) bajo condiciones acidas, durante 120 minutos a 65°C. Las especies de glicano etiquetadas se separaron de los reactivos en exceso utilizando una membrana de absorción hidrofíiica que retiene las especies de glicano. Las especies de glicano se recubrieron en agua y se almacenaron congeladas hasta la separación cromatográfica . Las especies de glicano etiquetadas se separaron por cromatografía de intercambio de aniones. El procedimiento cromatográfico se llevó a cabo como a continuación se describe: La columna es una columna GlyccSep®, 4.6 x 100 mm, empaquetada con resina de diviniíbenceno revestido de polímero (5 m) la fase móvil tiene una velocidad de flujo de 0 ml/min: Fase móvil A Acetonitrilo (grado cromatográfico) Fase móvil B Acerato de amonio 500 nM, pH 4.5 Fase móvil C Agua ultrapura • La detección es con un juego de fluorímetro a ?wexcitacior. : 330 nm ^emisi6r. ' ¿0 nm,* • La elución es baje las siguientes condiciones de elución : Condiciones iniciales: 20 % fase A, 80 % fase C Gradiente lineal fase B (0.25 % por minuto) desde 5 a 21 min, 20% fase A constante. Gradiente lineal fase B (0.525 % por minuto) desde 21 a 61 min, 20% fase A constante. • La columna se mantiene a una temperatura de 30+2 °C. Las especies de glicano eluyen de acuerdo con su carga para las especies neutrales, mono-, di-, tri- y tetra-sialiladas. Un crcmatograma típico se muestra en la Figura 1. En el cromatograma obtenido, los picos fueron agrupados de acuerdo con el intervalo de tiempos as retención que corresponden a los grados de sialilación listados en la Tabla 1.

Tabla 1 : Tiempos de retención y números de carga para los glicanos liberados de la rFSH Tiempo de retención (min.) Especies de glicano Número de carga 2 a 4 Neutral 0 15 a 21 Monosialilados Pmono 21 a 35 Disialilados Pdi 35 a 45 Trisialilados Pth 45 a 52 Tetrasialilados Ptetra Los resultados de cada grupo glicano se expresaron como el porcentaje del área total de ios diferentes grupos de glicano (neutral, mono-, di-, tri- y tetra-) y n número Z se calcula de las proporciones de las diferentes especies ( Pglicano ) ¦ Z = P'mono + 2 P'di + 3 P' trx + 4 P' tetra Ejemplo 2 Determinación del Índice de antenabilidad (AI) Los glicanos fueren liberados de la base del péDtido por hidrazinolisis , y luego fueren etiquetados fluorescentemente utilizando 2-amir.obenzamida (2-A3! , como se encuentra detallado en el Ejemplo 1. Los glicanos etiquetados 2-AB fueron desialilados enzimáticamente con sialidasa {Vibrio cholerae) en 250 mM de acetato de amonio, pH 5.5 conteniendo 20 mM de cloruro de calcio durante 18 horas a 37°C. Aproximadamente 0.05 U stalidasa se utilizaren para los glicanos desde una cantidad de inicio de 100 ug de rhFSH. Los glicanos desialilados se secaron al vacio y se almacenaron a -20 °C antes de la separación por la HPLC preparativa de fase inversa, de acuerdo con las siguientes condiciones : • La columna fue una columna GlvcoSep® R; • La fase móvil tuvo una proporción de flujo de 0.7 ml/min. Sluyente A: acetato de amonio 50 mE, pH 6.0; Eluyente B: acetato de amonio 50 mM, pH 6.0 conteniendo 8% de acetonitrile ; • La detección fue con un juego de fluorinetro a .e,;Cltaci0r, = 330 nm; ?6?113?6? = 420 nm. ¦ La temperatura de la columna: 30°C. Antes de la aplicación a la columna, las muestras secas se reconstituyeron con Eluyente A !200 µ? de esta solución se aplicó. Se utilizo el siguiente gradiente: t = 0 (min) 55% de A; 45% de B t = 15 min ) 55% de A; 45% de B t = 70 (min) 0% de A; 100% de B t = 75 (min) 0% de A; 100% de B t = 76 (min) 55% de A; 45% de B Los picos se asignaron a di-, tri- y tetra-antenabilidad, utilizando espectrometría de masas por Tiempo de Vuelo de Ionización por Desorción con láser ae Matriz Asistido (MALDI-TOF MS ) . Los resultados se expresan como porcentajes relativos de P de di-antenabilidad, tri-antenabilicad _y tetra-antenabiiidad siendo 100% la suma de todos los glicanos. Se calculó luego el AI utilizando la siguiente ecuación : AI = 2 Pdi + 3 Ptri + 4 Ptetra en donde AI es el índice de antenabilidad, y ?di, Ptn y Pretra son el porcentaje del carbohidrato total que es di-, tri- y tetra-ramificado respectivamente . Ejemplo 3 Separación de la FSH en fracciones basado en el grado de sialilación Se separó la FSH recombinante en fracciones básicas y ácidas utilizando la cromatografía de intercambio de aniones en DEAE-Sefarosa FF. • La columna utilizada fue 0 1.6 x 20 cm (XK P armacia o su equivalente) para la purificación a escala de laboratorio (aproximadamente 60 mg proteína a granel), y 0 3.4 x 40 cm (Vantage Amicon o su equivalente) para purificación de escala más grande, empacado con resina DEAE -Sefarosa FF; • La fase móvil tuvo una velocidad de 150-250 cm/hcras El amortiguador de equilibrio 1: Tris-HCl 2 M pH 7.0±0.1 El amortiguador de equilibrio 2: Tris-HCl 25 raM pH. 7.010.1, conductividad 2. loil .5 mS/cm; El amortiguador de elución 1: Tris 25 mM pH 7.010.1, NaCl 35 mM, conductividad 5.81C.4 mS/crr. (Este amortiguador eluye las isoformas más básicas . ) ; El amortiguador de elución 2: Tris 25 mM pH 7.C±0.i, NaCl 150 mM, conductividad 18.3+0.5 mS/cm (Este amortiguador eluye las isoformas más acidas . ) Solución de regeneración: NaCH 0.5M, NaCl 1M Solución de almacenamiento: NaOH 10 mM • Se mantuvo la columna en 23±3°C o 5+3°C. Se preparó la FSH para cargar en la columna como sigue a continuación: La masa de rhFSH congelada se derritió a 5±3°C. Luego del completo derretimiento, la solución (3-4 mg de la rhFSH, como se estimara por la densidad óptica a 276.4 nm, por mi de resina) se diluyó con Tris-HCl 2M pH 7.C±0.1 en la siguiente proporción: 1 parte de amortiguador y 79 partes de rhFSH a granel. La concentración final de Tris-HCl fue 25 mM. El pH se ajustó a 7.0r0.1 con HC1 1M.

Se preparó la columna enjuagando ccn 3 volúmenes de cama (3V) de NaOH C.5 M seguido por 6 BV de agua. El equilibrio se llevó a cabo enjuagando con 4-5 BV de Amortiguador de Equilibrio 1, se midió hasta un pH de aproximadamente 7. El enjuague luego continuó ccn 7-8 BV de Amortiguador de Equilibrio 2. Una muestra de la rhFSH, se preparó como anteriormente para cargar en la columna. Luego que se completó, la columna se enjuagó con 3 BV de Amortiguador de Equilibrio 1. Se comenzó la elución con el Amortiguador de Elución 1 y la recolección de la fracción básica comenzó cuando el valor de absorción (276.4 nm) se comenzó a elevar, y fue continuado durante 20±1 volúmenes de cama. El eluyente se cambió luego a Amortiguador de Elución 2, y la recolección de la fracción ácida se comenzó tan pronto como el valor de absorción (276.4 nm) comenzó a elevarse, y se continuó durante 3+1 volúmenes de cama. Las fracciones se sometieron a ultraf iltración para concentrarlas con un tipo de célula de ultrafiltración 8400 (Amicon o su equivalente) equipada con una membrana de YM3 para la fracción básica y con una YM10 para la fracción ácida. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 5+3°C. Ejemplo 4 Estudio clínico comparativo de las isoformas FSH Fue evaluada la eficacia comparativa de dos lotes experimentales de la rhFSK sobre voluntarios. Se generaron dos preparaciones de la FSH mediante la división de la rhFSH en dos fracciones, utilizando la. cromatografía de intercambio de iones, tal como fue descrito más arriba, en el Ejemplo 3. El lote A fue estimado como "ácido", y tuvo un número Z de 220 (es decir la fracción ácida del Ejemplo 3), mientras que el Lote B fue eslimado como "básico" y tuvo un número Z de 160 (es decir, la fracción básica del Ejemplo 3) . Utilizando el ensayo convencional del aumento de peso en los ovarios del Lote B oara que contenga:, aproximadamente 150 UI de la FSH cada una. Las características de los dos lotes se presentan en la Tabla 2. Debería notarse que, puesto que las ampollas fueron llenadas mediante UI , la cantidad real de la FSH en las ampollas del Lote B básico fue de aproximadamente 250% que la del Lote A ácido (aproximadamente 24 g Vs aproximadamente 9 pg) . Tabla 2: Características de los Lotes de la FSH usados en los estudios clínicos Lote A "ácido" Lote B "básico" Contenido de la FSH por 8.7 pg/ampolla 23.8 pg/ampolla ampolla Bioactividad específica 19,753 lU/mg 7,386 lU/mg Número Z 220 160 índice de Antenabilidad (Al) 274 237 43 La bioactividad específica se calcula mediante la división de la actividad en UI por el peso de la prcteína. El grupo de paciente fue de 32 mujeres voluntarias pre-mencpáusicas . Las pacientes fueron sometidas a regulación de pituitaria descendente mediante inyecciones diarias de decapepril (0.1 mg) . Después de 14 días, se realizó un examen sonográfico y ante la ausencia de quistes, se comenzó la estimulación con rFSH (150 Ul/día) tanto del Lote A como del Lote B. Se evaluó el crecimiento folicular mediante sonografía y concentraciones de suero E- en una base diaria. Durante la estimulación de la FSH, los folículos se desarrollaron y crecieron en su diámetro. Los folículos de cada paciente se midieron y se contaron a los 8 y 10 días de la estimulación, y se tomó nota del número y de la medida de los folículos que estaban dentro de las categorías de 0-10 mm, 11-15 rrai y 16-25 mm. En la Figura 2, se muestra el número promedio de los folículos por paciente que cayeron dentro de cada categoría para aquellos pacientes tratados con isoformas ácidas y básicas, en el día 8. En la Figura 3, se nuestra el mismo esquema para el día 10. Los resultados del estudie muestran que mientras en el grupo básico la medida de los folículos con el tiempo progresaba regularmente, en el grupo ácido dio origen a una segunda cohorte de folículos, ligeramente retrasados con respecto al primero, con un consiguiente fuerte incremento en la formulación de los folículos, duplicando aproximadamente aquellos del grupo básico. Esta segunda cohorte se incrementó en tamaño desde el día 8 al día 10. El resultado es aquel en que el grupo de pacientes tratados con la FSH "ácida", en el día 10, estaban con un promedio total de 18 folículos más grandes que 11 rrvm, mientras que en el grupo tratado con isoformas "básicas", el número promedio de folículos más grandes que 11 rara en el día 10 fue solamente 11 folículos. El número total de folículos en el día 10 en el grupo "ácido" fue de 28, mientras en el grupo "básico" fue de 19. El volumen folicular total promedio (TFV) por paciente fue determinado utilizando sonografía. El TFV en el grupo que recibía la FHS "ácida" fue el 30% más alto que en el grupo que recibía la FSH "básica". Los niveles de suero de la FSH en los pacientes medidos por radioinmunoensayo fueron más altos en el grupo básico como se esperaba de la masa de proteína inyectada; sin embargo, la diferencia fue de solamente el 30% (ver Figura 4), comparándolo con la diferencia de administración de 250%, en línea con una más alta resistencia metabólica de las formas ácidas. Ejemplo 5 Separación de la FSH en fracciones basado en el índice de Antenabilidad (AI) Las preparaciones de la FSH que tienen índices de antenabilidad más altos que los normales pueden ser aisladas utilizando HPLC o cromatografía de afinidad con Sefarosa derivada ae Concanavalin A (Con-A) . Ejemplo 6 "Acentuación de sialil" con la sialiltransferasa Se disolvió la FSH humana recombinante ("material de inicio": 1C mg) en el amortiguador (HEPES 0.1 M, pH 7.5) a una concentración de 4.3 mg/ml. Se agregó a esta solución sialiltransferasa de rata recombinante (ST3GalIII) a una concentración de 100 m'J/nl, y ácido de citidina-5'-monofosfato-N-acetilneuramínico (CMP-NauAc) como donante de ácido siálico a una concentración de 20 mM. Alternativamente, el donante de ácido siálico puede ser generado ín sítu utilizando NauAc 20 mM y CMP 2 mM en la presencia de sintetasa de ácido siálico-CMF. La reacción se incubó a 37°C durante 24 horas. Las fracciones enriquecidas en ácido siálico se aislaron utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 3. La acentuación del sialil puede ser 11 a cabo utilizando material de inicio consistente en la FSH que tiene un índice de antenabilidad aumentada, preparada de acuerdo con el Ejemplo 5. Alternativamente, la acentuación del sialil puede llevarse a cabo con un material de inicio de la FSH que tenga un número Z elevado, en comparación con la FSH recombinante convencional. Tal material de inicio puede estar aislado utilizando las técnicas del Ejemplo 3. Ejemplo 7 Generación de mu antes de la FSH Los cADNs de las subur.idades a- y ß- de la FSH humana se subclonaron en el vector pDONR ( Invitrogen ) . Se utilizó el equipo QuikChange™ Site-Directed utagenesis (Stratagene) para introducir los sitios de glicosilación unidcs-N en las subunidades a- y ß- de la FSH. El sistema QuikChange™ utiliza dos cebadores o^igonucleótidos sintéticos conteniendo las mutaciones deseadas. Los siguientes pares de oligonucleótidos se utilizaron para introducir los sitios de glicosilación unidos-N: CC TTG TAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC y GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG C-TA TGT ATA CAA GG para V78N, GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C y GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC para A70 , GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA y TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC para D41 /A43T, TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC y GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA para G100N, G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG y CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C para E56 N, y CAG GAA AAC CCA ACC TTC TCC CAG CC y GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG para F17T. Las secuencias de ADN de los cADNs murantes se confirmaron utilizando el Equipo ABI PRISM BigDye™ Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle seguido por análisis con el Analizador Genético ABI PRISM 310. El vector de expresión de mamífero pCI (Promega) se convirtió en un vector de destino GATEWAY utilizando el Sistema de Conversión de Vector GATEWAY (Invitrogen) . Los mutantes a- y ß- junto con las subunidades de tipo salvaje fueron clonadas e el vector de expresión pCI utilizando el Gateway-" Cloning Technology (Invitrogen) . El vector de expresión pCI contiene el promotor /mej orador temprano-inmediato de citomegalovirus para regular la expresión del gen insertado, un intrón de corriente ascendente del gen para promover la expresión y la corriente descendente de señal de pcliadenilación tardía 40 del virus de simio del gen insertado para terminar la transcripción. Los mutantes E56N y F17T alfa en pCI se co-transfectaron con la FSK tipo salvaje P en pCI mientras que los mutantes A70N, G100N, V78N y D41N/A43T ß en pCI se co-transfectaron con la subunidad-a de tipo salvaje en pCI. Como un control, la sub nidad-ß de tipo salvaje de la FSH en pCI y la subunidad-oc en pCI se co-transíectaron . Los plásmidos fueron transitoriamente transfectados en células HEK293 (ATTC, CRL-10852) utilizando el método de fosfato de calcio (por ejemplo, como el descrito en WO 96/07750.) . Alternativamente el plásmido pCI conteniendo tanto la subunidad-ß tipo salvaje o el mutante V78N ß se co-transfectaron con la subunidad-a tipo salvaje en pCI. Los plásmidos fueron también transitoriamente o establemente transfectados en las células CHO. Un día después de la transfección se cambió el medio a DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) conteniendo 1 ug/ml de insulina ( Invitrogen,. 18140-020), G.3 ng/ml de selenito de scdic {Sigma, S5261) y 12.2 ng/ml de citrato férrico (Sigrr.a, F3388) . Un días después del cambio en el medio, el medio condicionado se recolectó y se centrifugó durante 5 minutos a aproximadamente 800 x g a 4°C para quitar cualquier resto celular. El sobrenadante fue quitado y centrifugado a 16,000 x g en un Biofuge fresco (Heraeus Instruments) durante 5 minutos y luego el medio fue clarificado por filtración por medio de un filtro de 0.45 µp? Acrodisc (Gelman Sciences, 4184). Se agregó al extracto celular clarificado Tris 1 M, pH 7.4 para una concentración final de Tris 50 mM y Tween2C para una concentración final de 0.1% de Tween20. Los mutantes de la FSH se purificaron del extracto celular utilizando la cromatografía de inmunoafinidad, en Sefarosa derivada con anticuerpos monoclonales anti-FSH inmovilizados utilizando divinilsulfcna (Inmuno-resina anti-FSH-McAb-DVS-Sefarosa) . Tales resinas pueden ser producidas por los métodos conocidos por el practicante experto, por ejemplo, como se describe en WO 88/10270. Se equilibró la resina en amortiguador de equilibrio, consistente de amortiguador Tris-HCl 0.1 , NaCl 0.3M a pH = 7.5, a 4°C. La columna se cargó con una cantidad de UI FSH (por radioinmunoensayo RIA) correspondiente al 80-90¾ del total de la capacidad de unión de la FSH total de la columna. las proteínas no retenidas se eluyercn con amortiguador de equilibrio (como se mencionara anteriormente) hasta que OD de eluato estuvo más bajo que 0.02. El mutante absorbido de la FSH fue eluido de la inmuno-resina con solución de amonio 1 a 4°C. Se combinaron los eluatos correspondientes a aproximadamente 4 veces el volumen de la inmuno-resina, el pH se ajustó a 9.0 mediante el agregado del ácido acético glacial a 4°C, tan pronto como fuera posible luego de la recolección, y la solución se ultrafiltró en un aparaio Amicon (membrana de ataje 10,000 Da) y se concentró a un pequeño volumen. La solución de la FSH mutante concentrado se sometió a una etapa de HPLC de fase inversa, utilizando un cromatógrafc líquido Waters Prep LC 500A equipado con un detector UV y un generador de gradiente preparatorio. Antes de la aplicación a la columna, el pH de la solución se ajustó a aproximadamente 5.6. La solución se cargó en una columna de fase invertida Cíe (cartuchos Prepak 500 Cu. Waters) que fueron previamente equilibrados con amortiguador de acetato de amonio 0.05 M, pH = 5.6 a temperatura ambiente. La velocidad del flujo fue de 100 mi/min., y el eluato se monitoreó a 280 nm.

Los mutantes de la FSH se eluyeror. por un gradiente de isopropanol hasta el 50% de la fase móvil. Las fracciones se controlaron por cromatografía de fase de cas analítica !GPC; y radioinmunoensayo (RIA) . Se quinó el solvente por. destilación bajo vacio a menos de 40°C, y se congeló la solución y se licfilizó. Las preparaciones de la FSH mutantes expresadas en las células de CHO estuvieron sujetas a cromatografía de intercambio de iones, como se encuentra descrito en el Ejemplo 3, para aislar las fracciones que tenían números Z+-mayores que 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, y más altos . Las preparaciones de la FSH mutante expresadas en células CHO o HEK293 se sometieron a acentuación de sialil, como se encuentra descrito en el Ejemplo 6. Luego de la acentuación de sialil, el mutante de la FSH se sometió a cromatografía de intercambio de iones, de acuerdo con el Ejemplo 3, para aislar las fracciones que tenían números Z+-mayores que 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, y más altos.

Referencias : " Wide, L; The regulation of metabolic of human FSH in mice by variation of the molecular structure of the hormone; Acta Endocrir.ologica 112 1986; 336-344; ' Chappel ez al.; Endocr. Rev. 4 1983; 179-211; Padmanabhan et al.; J. Clin. Endocrinol. Met. 67 1988; 465-473; ide et al.; J. Clin. Endocrinol. Met. 70 1990; 271-276; Anobile et al. Glycoform composition of serum gonadctropíns through the normal menstrual cycle and in the post-menopausal state; Mol. Rumian Reproduct. 4 1998; 631-639 3 orell et al.; J. Bioi. Chem. 246 1971; 1461-1467; Ashwell et al.; Annu. Rev. 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Chem. 271 1996; 931-938 27 por ejemplo, una técnica convencional se describe en EP 0 170 502 (Serono Laboratories, Inc. ) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta clare de la presente descripción de la invención. - 1 - LISTADO DE SECUENCIAS <120> Hormonas de estimulación del folículo <13C> <160> 2 <170> Patente en versión 3.0 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro De Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser - 2 - <21C> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn He Thr De Ala De Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys lie Ser De Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys lie Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110

Claims

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REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una preparación de la FSH, caracterizada porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 200. 2. La preparación de la FSH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 210.
3. La preparación de la FSH de conformidao con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 220.
4. La preparación de la FSH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 230.
5. La preparación de la FSH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 240.
6. La preparación de la FSH de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 250.
7. La preparación de la FSH de conforrr.idad con la reivindicación 1, caracterizado porque el número Z de la preparación es al menos, o aproximadamente 260. 60
8. Una conposición farmacéutica que comprende la FSH, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 200.
9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 210.
10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 220.
11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 230.
12. La composición farmacéutica de conformidad co la reivindicación 8, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 240.
13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la F3H tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 250.
14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 260.
15. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para utilizarse en la hiperestimulación del ovario controlado.
16. Un uso de una preparación de la FSH en 61 folicu_ogénesis , en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 200.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, _c aproximadamente 210.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 220.
19. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en dcnde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 230.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 240.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la FSH tiene un número Z que es al rr.enos, o aproximadamente 250.
22. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 260.
23. Un uso de la FSH en la preparación de un medicamento para utilizarse en la foliculogénesis , en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 200.
24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, 62 en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 210.
25. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la FSH tiene un número -Z que es al menos, _o. aproximadamente 220.
26. El uso de conformidad con la rei indicación 23, en donde la FSH tiene un número Z que es ai menos, o aproximadamente 230.
27. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 240.
28. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 250.
29. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 260.
30. Un método para preparar una preparación de la FSH que tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 200, el método está caracterizado porque comprende la etapa de hacer reaccionar la FSH con un donante de ácido siálico en la presencia de 2 , 3-sialiltransferasa .
31. El méiodo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 210. 63
32. El método de conformidad con la reivindicación 3C, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 220.
33. El método de conformidad con la reivindicación. 30, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 230.
34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 240.
35. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 250.
36. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la FSH tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 260.
37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, caracterizado porque el donante de ácido siálico es un ácido siálico-CKP.
38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, caracterizado porque la sialiltransferasa es de una rata ST3Gal III.
39. Un método para preparar una preparación de la FSH que tiene un número Z que es al menos, o aproximadamente 200, el método está caracterizado porque comprende una etapa de la cromatografía de intercambio de iones.