NO327966B1 - Farmasoytisk preparat omfattende rekombinant FSH, anvendelse av rekombinant FSH, samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinant FSH preparat. - Google Patents
Farmasoytisk preparat omfattende rekombinant FSH, anvendelse av rekombinant FSH, samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinant FSH preparat. Download PDFInfo
- Publication number
- NO327966B1 NO327966B1 NO20042061A NO20042061A NO327966B1 NO 327966 B1 NO327966 B1 NO 327966B1 NO 20042061 A NO20042061 A NO 20042061A NO 20042061 A NO20042061 A NO 20042061A NO 327966 B1 NO327966 B1 NO 327966B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fsh
- recombinant fsh
- recombinant
- preparation
- pharmaceutical preparation
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 26
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 claims description 22
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 13
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 claims description 12
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 claims description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 230000009027 insemination Effects 0.000 claims description 8
- 108010057005 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 7
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 7
- 102100029962 CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Human genes 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical group O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 claims description 5
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 5
- 102200046323 rs2066524 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 claims description 4
- ZUQUTHURQVDNKF-WZPXOXCRSA-N 1-[(3S,4R,5S,6R)-3-amino-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]ethanone Chemical compound C(C)(=O)C1(O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO ZUQUTHURQVDNKF-WZPXOXCRSA-N 0.000 claims description 3
- TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N CMP-N-acetyl neuraminic acid Natural products O1C(C(O)C(O)CO)C(NC(=O)C)C(O)CC1(C(O)=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 102220504498 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A_H83N_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 claims description 2
- 102220094761 rs876658808 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 245
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 245
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 245
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 49
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 49
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 19
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 13
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 13
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 12
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 12
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 12
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 12
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 10
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 10
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 10
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 10
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 8
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 7
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 7
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 7
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 6
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 6
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 6
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 6
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 6
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 6
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 5
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 4
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 4
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014654 Aromatase Human genes 0.000 description 2
- 108010078554 Aromatase Proteins 0.000 description 2
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710136188 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100029963 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N Fluoroform Chemical compound FC(F)F XPDWGBQVDMORPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000893054 Homo sapiens Follitropin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101001038874 Homo sapiens Glycoprotein hormones alpha chain Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CLRLHXKNIYJWAW-UHFFFAOYSA-N KDN Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1O CLRLHXKNIYJWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030928 Lactosylceramide alpha-2,3-sialyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical group CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical group OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010058823 Ovarian mass Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000652822 Rattus norvegicus CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 108010064886 beta-D-galactoside alpha 2-6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 239000002474 gonadorelin antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940121381 gonadotrophin releasing hormone (gnrh) antagonists Drugs 0.000 description 2
- 108010076477 haematoside synthetase Proteins 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 102220029329 rs398123484 Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 3-O-methyl-D-glucose Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 0.000 description 1
- CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-amine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1C=CN2 CNPURSDMOWDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101710183133 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031969 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710136075 CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100027098 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000034702 Multiple pregnancies Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010015197 N-acetyllactosaminide alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010081778 N-acylneuraminate cytidylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 description 1
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102220623841 Sulfotransferase 2B1_L99V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108010050144 Triptorelin Pamoate Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000001158 estrous effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- ZNOLGFHPUIJIMJ-UHFFFAOYSA-N fenitrothion Chemical compound COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C)=C1 ZNOLGFHPUIJIMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 210000004914 menses Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000011599 ovarian follicle development Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200079760 rs3824915 Human genes 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N triptorelin Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 VXKHXGOKWPXYNA-PGBVPBMZSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
Abstract
Oppfinnelsen tilveiebringer et FSH-preparat med en høy sialyseringsgrad og som viser økt virkeevne.
Description
Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen angår området gonadotropiner, og spesielt deres anvendelse i assistert befruktningsteknologier (ART), eggløsningsinduksjon (OI), intrauterin inseminering (IUI) og for behandling av ufruktbare mannlige pasienter.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Gonadotropinene er en gruppe heterodimere glykoproteiner som inkluderer follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH) og koriongonadotropin (CG). Disse hormonene regulerer gonadefunksjonen i menn og kvinner.
Hvert av disse hormonene er sammensatt av to ikke-kovalent bundede underenheter: en a-underenhet som er felles for FSH, LH og hCG og en (3-underenhet som er unik for hver av dem og som gir hvert hormon biologisk spesifisitet.
I alle gonadotropinene har hver underenhet asparaginbundede (N-bundede) oligosakkaridsidekjeder. I den felles a-underenheten til de humane hormonene er disse bundet ved posisjonene 52 og 78.1 både humant FSH og CG er to N-bundede oligosakkaridsidekjeder bundet til P-underenheten ved posisjonene 7 og 24 i FSH
og posisjon 13 og 30 i hCG. I humant LH er ett oligosakkarid bundet ved posisjon 30 i P-underenheten. hCG har i tillegg fire serinbundede (O-bundede) oligosakkaridsidekjeder til stede i karboksylendedelen (CTP).
Som for alle glykoproteiner finnes variasjoner i oligosakkaridstrukturen i gonadotropinene hvilket resulterer i en orden av isoformer som finnes innen hypofysekjertelen og i sirkulasjon. Videre er det forskjeller i graden av terminal karbohydrat-"kapping" av sialinsyre. Isoformene kan separeres på basis av deres ladning som i stor grad bestemmes av antallet og fordelingen av sialyserte N-bundede oligosakkarider. Svært sialyserte former er surere enn gjennomsnittelig pl og kalles "sure". Mindre sialyserte former har til sammenligning høyere pl og kalles "basiske".
Som en konsekvens av deres strukturelle forskjeller har gonadotropinisoformene forskjellig kapasitet hva gjelder å binde målcellereseptorer. Graden av sialysering påvirker deres evne til å overleve i sirkulasjon. I tilfelle av FSH har flere grupper vist at svært sure/sialyserte isoformer har betraktelig lengre plasmahalveringstid i dyremodeller, slik som i mus og rotte<1>.
Isoformprofilen til endogent FSH i mennesker er vist å variere. Sure isoformer med lang in vivo halveringstid og relativt lavt in vitro biologisk potensiale dominerer i serum til før-pubertetsbarn, hypogonodale pasienter og i kvinner gjennom follikkelfasen. I kontrast til dette er mindre sialyserte mer basiske isoformer, med kort in vivo halveringstid og relativt høy in vitro biologisk aktivitet funnet i puberteten, GnRH-terapi og rundt den midtre gonadotropinsyklusbølgen i kvinner . FSH-isoformene med et større syalinsyreinnhold sirkulerer i lengre tidsrom, fordi terminalsyalinsyrerester "kapper" galaktoserester, og forhindrer derved en interaksjon med hepatisk asialo-glykoproteinreseptorer og fjerning fra sirkulasjonen •a.
Oligosakkarid (glykan)-enheter bundet til proteiner er forgrenet og hver terminal sukkerrest refereres til som en antenne. Parameteren Z-nummer tilveiebringer et mål på hvilken andel av antennen til karbohydratenhetene i et glykoprotein som bærer ladede rester, slik som sialinsyre. Desialysert FSH har et Z-nummer på 0. Fullstendig sialysert FSH ville ha et Z-nummer mellom omtrent 230-280.
Kraften til FSH-preparater er beregnet in vitro i Steelman-Pohley-analysen som sammenligner, under spesifiserte betingelser, et preparats evne til å øke ovariemasse i umodne rotter sammenlignet med en internasjonal standard/referansepreparat kalibrert i internasjonale enheter (IU)<4.>
Mange grupper har undersøkt glykosyleringen og sialyseringens rolle i påvirkningen av den biologiske profilen til FSH.
EP-A-388233 beskriver fremstilling av rekombinant FSH. Det foreslås også en metode for å indusere eggløsning ved først å administrere et rekombinant FSH med en relativ lang halveringstid i plasma, for deretter, før eggløsningen er fullendt, å administrere et rekombinant FSH med en kortere halveringstid i plasma.
WO0158493 angår mutante FSH-proteiner med ytterligere glykosyleringsseter, deriblant en mutant form av FSH som inneholder to N-bundede glykosyleringsseter ved den N-terminale enden av a-underenheten.
WO 9831826 beskriver generelt en metode for in vitro sialylering av rekombinante glykoproteiner.
D'Antonio et al. vurderte de metabolske "clearance"-hastighetene (MCR) i hunnrotter for sure (pl < 4,8) og basiske (pl > 4,8) rhFSH-isoformer oppnådd gjennom kromatofokusering. Som forventet ble det funnet at de basiske isoformene har en raskere clearance enn de sure isoformene (ti/2 = 0,4 t for basiske, 0,9 timer for sure). Når de sure og basiske formene ble sammenlignet (på basis av masse) i Steelman-Pohley-analysen ble det funnet at den basiske isoformen var betraktelig mindre aktiv enn den sure formen (ED50 = 0,9 jig/rotte for den basiske, 0,3 (ig/rotte for den sure). Når isoformene ble sammenlignet på en IU-basis var det ingen forskjell mellom de to<5>.
Vitt et al. utførte en in vitro-studie hvori fire rekombinante humane FSH-preparater med forskjellig pl ble sammenlignet for deres evne til å forårsake økning i størrelse og østradiol (E2)-produksjon i isolerte musefollikler. Basisk FSH (pl 5,0-5,6) ble funnet å medføre en hurtigere follikkelvekst og resulterte i den største maksimale follikkelstørrelsen, etterfulgt av ufraksjonert rekombinant FSH. Middels (pl 4,5-5,0) og sure (pl 3,6-4,6)-FSH-preparater var bak både hva gjelder veksthastighet og maksimum follikkelstørrelse. Basisk FSH ble vist å indusere E2-sekresjon tidligere og ved en lavere dose enn de andre isoformene. Follikler dyrket med sur FSH, uavhengig av konsentrasjon, utskilte målbare konsentrasjoner av E2 kun etter lengre inkubering<6>.
Timossi et al. anvendte kromatofokusering for å separere humant hypofyse-FSH i syv forskjellige fraksjoner av varierende glykosylering/surhet. Fraksjonene ble testet for deres evne til å forårsake oppregulering av ekspresjon av aromatase (nødvendig for østradiolproduksjon), og vevstype plasminogenaktivator (tPA) in vitro i rottegranulosaceller. Forholdet mellom bioaktivitet og immunreaktivitet (B/I) ble funnet å synke ettersom elueringen av pH-verdien til isoformene sank. Forfatterne konkluderte med at basiske isoformer har en større evne til å indusere ekspresjon av både aromatase og tPA mRNA og proteiner enn de sure variantene<7>.
Zambrano et al. fraksjonerte humane hypofyse-FSH i 9 fraksjoner med varierende pl, ved å anvende kromatofokusering og testet de sure og basiske isoformene ved å anvende tre immunanalyser og to in vitro-analyser: østradiolproduksjon via rottegranulosaceller og cAMP-produksjon gjennom en human føtal cellelinje som uttrykker FSH-reseptoren. Forholdet mellom aktivitet i bioanalysene og immunreaktivitet (B/I) sank ettersom isoformenes pl sank for alle bioanalysene<8>.
I en ytterligere studie sammenlignet Zambrano et al. bindingsaffiniteten til syv forskjellige fraksjoner av sure og basiske isoformer av humant hypofyse-FSH for et heterologt reseptorsystem (rottegranulosaceller) og et homologt reseptorsystem (rekombinant human HEK-293-celler som uttrykker den humane FSH-reseptoren). Den heterologe reseptoren viste en økning i bindingsaffinitet ettersom pl til isoformene økte mens den homologe reseptoren ikke viste slik økning i bindingsaffiniteten. cAMP-produksjonen i HEK-293-celler økte også ettersom isoformenes pl økte<9>.
Studier har vist at de surere formene av FSH har den høyeste in vivo-bioaktiviteten (på basis av masse) når de vurderes gjennom de klassiske
eggstokkvektforsterkningstestene<10>'<11>. Timossi et al. postulerte at de basiske formene kan være mer aktive in vivo, men på grunn av den kortere halveringstiden kan ikke denne effekten observeres i vektøkning i rotteovarier. De undersøkte virkningene av to preparater i et hurtigresponssystem: oppregulering av tPA-aktivitet . Forfatterne konkluderte at rhFSH med en mindre sur ladningsfordelingsprofil har høyere in vitro bioaktivitet og plasma-clearance-hastigheter og induserer tPA-enzymaktivitet raskere enn et svært surt FSH-preparat.
Gonadotropinene spiller en viktig rolle i reproduksjonssyklusen, og deres anvendelse er essensiell for assisterte befruktningsteknikker (ART), slik som in vitro-befruktning (IVF), IVF sammen med intracytoplasmatisk sperminjeksjon (IVF/ICSI) og embryooverføring (ET), så vel som eggløsningsinduksjon (OI) i en ikke-ovulerende pasient som gjennomgår in vivo-befruktning enten naturlig eller gjennom intrauterin inseminering (IUI).
ART utføres vanligvis ved anvendelse av kontrollert eggstokkhyperstimulering (COH) for å øke antallet hunnkjønnceller<13>. Standardregmer<14> for COH inkluderer en nedreguleringsfase hvori endogene gonadotropiner undertrykkes ved administrering av en gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH)-agonist etterfulgt av en stimuleringsfase hvori follikkelutvikling (follikulogenese) induseres ved daglig administrering av FSH, vanligvis ved omtrent 150-225 IU/dag. Alternativ stimulering startes etter spontan eller indusert menstruasjon mens inntreden av en uheldig LH-bølge forhindres ved administrering av en GnRH-antagonist (vanligvis startet rundt dag 6 i den stimulerende fasen). Når det er i det minste tre follikler > 16 mm (én på 18 mm) gis en enkel stor dose hCG (5-10000 IU) for å minimalisere den naturlige LH-bølgen og indusere eggløsning. Oocyttoppnåelse innstilles til 36-38 timer etter hCG-injeksjon.
OI utføres vanligvis med daglig administrering av FSH ved en dose på omtrent 75-150 IU/dag. Nedregulering med GnRH-agonister eller -antagonister kan anvendes selv om dette er mindre vanlig enn i ART-indikasjonen. hCG gis for å minimalisere LH-bølgen forut for in vivo-befruktning og som oppnås enten gjennom regulært samleie eller IUI.
De vanlige regimene beskrevet ovenfor for ART og OI krever daglige injeksjoner av gonadotropiner over et lengre tidsrom, dvs. et gjennomsnitt på 10 dager, og opptil 21 dager i enkelte pasienter. Utviklingen av FSH-preparater med økt virkning ville tillate reduksjon av de daglige dosene FSH, og/eller tillate en kortere behandlingsperiode (dvs. færre injeksjoner), og/eller tillate at injeksjoner gis sjeldnere. Dette ville gjøre ART- og OI-regimene mer egnet og pasientvennlige.
Videre er ART ved anvendelse av in vitro-befruktning fulgt av mulige mislykkede forsøk. F.eks. vil ikke hver follikkel produsere en levedyktig oocytt, hver levedyktig oocytt vil ikke vellykket bli befruktet og noen embryo er ikke levedyktige. Med én gang levedyktige embryo velges, kan videre overføring til livmoren og implantering ikke lykkes. For å maksimalisere sjansene for en vellykket fødsel er det derfor ønskelig å stimulere veksten og modningen av flere follikler for å sikre samlingen av flere oocytter.
I kontrast til dette er formålet ved OI-indikasjonen å oppnå ikke mer enn tre og fortrinnsvis én dominant follikkel (for å unngå flere graviditeter).
Enkelte pasienter som gjennomgår. ART og OI har et redusert antall voksende follikler når de behandles med konvensjonelle FSH-preparater. Dette er en begrensende faktor for suksess når man gjennomgår ART, idet det begrenser antallet embryo tilgjengelig for overføring og/eller kryopreservering. Det kan også være en begrensende faktor for suksess i pasienter som gjennomgår IUI, når det å oppnå mer enn én follikkel er viktig. Pasienter med denne typen respons inkluderer pasienter over omtrent 33-35 år, pasienter med forhøyet basislinje FSH, forhøyet basislinje østradiol eller redusert basislinje av inhibin b.
I mannen er spermatogenesen avhengig av stimulering av Sertoli-celler med FSH. FSH-mangel resulterer i oligospermia, og følgelig infertilitet. Behandlingen av mannlig infertilitet med konvensjonelle FSH-preparater krever FSH-injeksjoner tre ganger i uken i opptil 18 måneder.
Utviklingen av FSH-preparater med økt evne til å stimulere follikulogenese er et pågående behov. Det er også et eksisterende behov for nye FSH-preparater for å behandle pasienter med en redusert FSH-respons. FSH-preparater med økt virkning, som tillater kortere behandlingsprotokoller og/eller reduserte kumulative doser og/eller mindre hyppige doser for ART, OI og mannlig infertilitet er også ønskelig.
Sammendrag av oppfinnelsen
Det er et formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et gonadotropinpreparat for anvendelse i eggløsningsinduksjon og COH, spesielt i sammenheng med ART.
I et første aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter rekombinant FSH, hvori Z-nummeret til det rekombinante FSH i det minste er 220, fortrinnsvis i det minste 240, mer foretrukket i det minste 260, for anvendelse i human medisin.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som omfatter rekombinant FSH i følge oppfinnelsen, der det rekombinante FSH har et Z-nummeret som er i det minste 220, samt en antenneindeks AI på fra 220- 280.
I et tredje aspekt tilveiebringer oppfinnelsen i følge oppfinnelsen et preparat der det rekombinante FSH uttrykkes i eggstokkceller fra kinesiske hamstre.
I et fjerde aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse av rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for human follikellogenese, der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
I ytterligere et femte aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse som nevnt over der FSH administreres daglig eller semidaglig ved en dose på 50-75 IU i løpet av mindre enn 14 dager.
I følge et sjette aspekt tilveiebringes en anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for å kontrollere hyperstimulering av humane eggstokker, der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
I et ytterligere syvende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for eggløsningsinduksjon eller intrauterin inseminasjon, der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
I et åttende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for behandling av infertilitet hos menn der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
I et niende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse som nevnt over der 150 til 300 IU FSH administreres 3 ganger per uke inntil spermatogenesen når adekvate nivåer for inseminasjon.
I et tiende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en anvendelse som nevnt over der rekombinante FSH her et Z-nummer som er i det minste 240, fortrinnsvis i det minste 260.
I et ellevte aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat eller anvendelse der FSH har en gjennomsnittlig pl på mindre enn 3,4, mer foretrukket mindre enn 3,3, enda mer foretrukket mindre enn 3,2.
I et tolvte aspekt tilveiebringer oppfinnelsen videre et farmasøytisk preparat eller anvendelse der FSH har en økt sialyleringsgrad ved ett eller flere glykosyleringsseter til stede i et peptid festet til FSH-proteinet.
I et trettende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen videre et farmasøytisk preparat eller anvendelse der det festede peptidet er den karboksyterminale delen av underenheten til hCG.
I et fjortende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat eller anvendelse der FSH har en eller flere mutasjoner som introduserer en eller flere ytterligere glykosyleringsseter i FSH-proteinet og som øker sialyleringsgraden.
I enda et femtende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat eller der mutasjonene er utvalgt fra en eller flere av A70N, V78M, G100N, D41, N/A43T i P-underenheten til FSH og/eller en eller flere av F17T, E56N, H83N i a-underenheten til FSH.
I et sekstende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen videre en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant FSH preparat med et Z-nummer som er i det minste 220 for anvendelse i human medisin, der fremgangsmåten omfatter trinnene å reagere FSH med en sialinsyredonor i nærværet av 2,3-sialyltransferase.
I et ytterligere syttende aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant FSH preparat der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 240, fortrinnsvis i det minste 260.
I et attende aspekt tilveiebringers en fremgangsmåte som nevnt over der sialinsyredonoren er CMP-sialinsyre.
I et nittende aspekt tilveiebringes en fremgangsmåte som nevnt over der nevnte sialyltransferase er ST3Gal III fra rotte.
I et tyvende aspekt tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant FSH preparat der det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220 for anvendelse i human medisin, der fremgangsmåten omfatter et trinn for isoelektrisk fokusering, kromatofokusering eller ionebyttekromatografi.
I et tjueførste aspekt tilveiebringers videre en fremgangsmåte som nevnt over der fremgangsmåten omfatter å tilføre kulturmediet hvori det rekombinante FSH uttrykkes med neuraminidaseinhibitorer og/eller direkte intracellulære forløpere for sialinsyresyntese, slik som acetylmannosamin.
Endelig i et tjueandre aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en der det rekombinante FSH uttrykkes i eggstokkceller fra kinesiske hamstre.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 viser et kromatogram for eluering gjennom en GlycoSep -C-kolonne av glykaner frigjort fra rFSH; kolonne 4,6 x 100 mm, pakket med polymer belagt med divinylbenzenresin (5 m), med en mobilfase av acetonitril:vann 20:80, med en lineær gradient på 0,25 % pr. min. ammoniumacetat (500 mM) fra 5-21 min., etterfulgt av en lineær gradient på 0,525 % pr. min. ammoniumacetat (500 mM) fra 21-61 min. X-aksen viser retensjonstiden i minutter og Y-aksen viser signalstyrke i mV. Fig. 2 viser antallet follikler pr. størrelseskategori ved dag 8 (på Y-aksen), i pasienter som mottok sure og basiske isoformer av FSH inntil dag 7. Bølgelinjer representerer resultatet med sure isoformer, skrålinjer representerer resultatet med basiske isoformer. Fig. 3 viser antallet follikler pr. størrelseskategori ved dag 10 (på Y-aksen) i pasienter som mottok sure og basiske FSH-isoformer inntil dag 7. Bølgelinjer representerer resultatet med sure isoformer, skrålinjer representerer resultatet med basiske isoformer. Fig. 4 viser gjennomsnittelig FSH-serumnivåer i pasienter etter den siste dosen sure og basiske FSH-isoformer. X-aksen representerer tid i timer siden første FSH-
injeksjon, Y-aksen representerer serumkonsentrasjon i immunreaktive IU/L. Firkanter (■) viser serumkonsentrasjon etter injeksjon av sure isoformer; diamanter (♦) viser serumkonsentrasjon er etter injeksjon av basiske FSH-isoformer. Serumkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av immunanalyse, f.eks. radioimmunanalyse ved anvendelse av et kit markedsført av Daiichi Isotope Laboratory, Japan.
Fig. 5 viser aminosyresekvensen til modent humant FSH-alfa-underenhet.
Fig. 6 viser aminosyresekvensen til den modne humane FSH-beta-underenheten.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Oppfinnerne har overraskende funnet at svært sialyserte FSH-isoformer har en større effekt i induseringen av follikulogenesen i humane pasienter enn mindre sialyserte isoformer. Anvendelsen av et FSH-preparat ifølge oppfinnelsen tillater anvendelsen av lavere kumulative doser FSH for å oppnå den samme eller bedre klinisk resultat.
Oppfinnerne har funnet at når pasienter behandles med like mengder sur FSH og basisk FSH, på en IU-basis, som bestemt ved hjelp av den konvensjonelle analysen er antallet voksende follikler i pasienter behandlet med sur FSH signifikant større.
Når pasienter behandles med like mengder sur FSH og basisk FSH, på basis av masse, er antallet follikler i pasienter behandlet med sur FSH også vesentlig større.
Enkelte pasienter har et redusert antall voksende follikler når de behandles med konvensjonelle FSH-preparater. Dette er en begrensende faktor for suksess ved gjennomføring av ART. Pasienter med denne typen respons inkluderer pasienter over omtrent 33-35 års alderen, pasienter med forhøyet FSH-basislinje, forhøyet østradiolbasislinje eller redusert inhibin b-basislinje. Preparatet av FSH ifølge oppfinnelsen kan injiseres én gang om dagen eller hver annen dag for å frembringe en bedre eggstokkrespons enn med konvensjonelle preparater. Dette øker sjansene for unnfangelse for disse pasientene.
Oppfinnerne har også overraskende funnet at FSH-preparater med større virkning, som tillater sjeldnere dosering, kan fremstilles ved å anvende FSH med et Z-nummer som er i det minste ved eller omtrent 200, fortrinnsvis i det minste ved eller omtrent 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 og 290 hvor preferanserekkefølgen øker med økende Z-nummer (Z-nummer som faller mellom disse verdiene er selvfølgelig også innenfor rammen av oppfinnelsen). For å indusere follikulogenese administreres konvensjonelle FSH-preparater vanligvis hver dag, ved en dosering på omtrent 75-600 IU/dag. I de fleste pasienter kan den samme kumulative dosen av et konvensjonelt FSH-preparat administreres annenhver dag, og oppnå et lignende klinisk resultat som daglige injeksjoner<15>. Uttrykket "sjeldnere dosering" er ment å gjelde FSH-preparater som kan administreres sjeldnere enn annenhver dag, og oppnå de samme kliniske resultatene, i betydningen av totalt follikkelvolum, som konvensjonelle preparater administrert hver dag eller annenhver dag.
Uttrykket "sure" og "basiske" anvendes bredt og viser til FSH-preparater med varierende sialyseringsgrad. Fordi sialinsyre er surt vil mer sialyserte molekyler ha lavere pl. Ved anvendelse av isoelektrisk fokusering, kromatofokusering eller andre separeringsmetoder, slik som ionebyttekromatografi, FPLC og HPLC<16> kan en blanding av isoformer separeres til fraksjoner som kan angis som sure eller basiske, fortrinnsvis basert på Z-antall.
Uttrykket "sialinsyre" henviser til et medlem av en familie på ni karbonkarboksylerte sukre. Det mest vanlige medlemmet av sialinsyrefamilien er N-acetylneuraminsyre (2-keto-5-acetamid-3,5-dideoksy-D-glysero-D-galaktononulopyranos-l-onsyre, ofte forkortet Neu5Ac, NeuAc eller NANA). Et annet medlem av familien er N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc eller NeuGc), hvori N-acetylgruppen i NeuAc er hydroksylert. Et tredje sialinsyrefamiliemedlem er 2-keto-3-deoksy-nonulosonsyre (KDN)<17>. 9-substituert sialinsyre slik som en 9-O-Ci-C6-acyl-Neu5Ac slik som 9-0-laktyl-Neu5Ac eller 9-0-acetyl-Neu5Ac, 9-deoksy-9-fluor-Neu5Ac og 9-azid-9-deoksy-Neu5Ac er også inkludert. For en oversikt over sialinsyrefamilien, se f.eks. Varki; Glycobiology 2 1992; 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, red. (Springer-Verlag, New York
(1992)).
Karbohydrat (alternativt "glykan")-enheter er bundet til peptidryggraden via et enkelt sukker, enten med en O- eller N-bundet glykosidbinding. Ettersom karbohydratenheten elaboreres forekommer forgrening, med det resultat at karbohydratenheten har 1, 2, 3 eller 4 (noen ganger flere) endesukkerrester eller "antenner". Slike karbohydratenheter henvises til som mono-, di-, tri- eller tetraforgrenet. Parameteren antenneindeks (AI) tilveiebringer et mål for forgreningsgrad i karbohydratrester, og gir også et mål for 3-D-størrelsen til karbohydratenhetene. For å bestemme denne parameteren behandles et glykoprotein kjemisk for å frigjøre alle karbohydratrester, f.eks. ved å varme med hydrazin, eller karbohydratet kløyves enzymatisk, f.eks. med endoglykosidase (N-glykanase)<18>. Karbohydratblandingen isoleres. Om ønskelig omsettes karbohydratblåndingen med et merke, slik som et radiomerke, et kromoformerke (dvs. UV-vis aktivt), et fluoroformerke, et immunreaktivt merke osv. Den merkede karbohydratblandingen desialyseres deretter, med enzymet sialidase, hvilket gir en merket nøytral karbohydratblanding (alternativt kan merketrinnene og desialyseringstrinnet utføres i omvendt rekkefølge). Den merkede nøytrale karbohydratblandingen separeres deretter til dets komponenter ved anvendelse av en kromatografisk fremgangsmåte som kan skilne mellom de ulike typene (mono-, di-, tri- og tetraforgrenet). Kromatografi (normal eller revers fase) kan utføres ved anvendelse av hvilken som helst fremgangsmåte, inkludert f.eks. tykk- eller tynnsjikt kromatografi, eller høytrykks væskekromatografi (HPLC). Alternativt kan den isolerte nøytrale karbohydratblandingen omsettes med et middel for å gjøre komponentene flyktige, og blandingen kan utsettes for gasskromatografi (GC). Visualisering kan oppnås med en fremgangsmåte passende for merket og den anvendte kromatografiske fremgangsmåten. F.eks. vil fluorimeter anvendes for deteksjon dersom et fluorofor anvendes som merke; dersom et kromofor anvendes som merke vil et UV-vis-spektrofotometer anvendes for deteksjon. Dersom det ikke anvendes noe merke vil massespektrometri anvendes for å måle topper og retensjonstider. Toppangivelser for mono-, di-, tri- eller tetraforgrenede typer kan utføres ved anvendelse av massespektrometri eller ved å sammenligne med kjente standarder.
Et kromatogram analyseres deretter ved å integrere toppene assosiert med di-, tri-, og tetraforgrenede karbohydrattyper. Prosenten av totalt karbohydrat tilstede av hver type kan deretter anvendes for å beregne AI i henhold til en følgende ligning:
hvori AI er antenneindeks og Pdi, Ptri og Ptetra er prosent av totalt krabohydrat som er henholdsvis di-, tri- og tetraforgrenet. Spormengder av andre komponenter (f.eks. monoantenner) kan være tilstede, men bidrar ikke signifikant til AI-verdien.
En høy antenneindeks indikerer at karbohydratenheten er svært forgrenet, med mange antenner. Rekombinant humant FSH har vanligvis en AI på fra omtrent 220-280, eller et gjennomsnitt omkring 255.
Parameteren Z-antall tilveiebringer et mål for hvor mange antenner av karbohydratenhetene i et glykoprotein som bærer ladede rester, slik som sialinsyre. For å bestemme Z-antallet frigjøres karbohydratenhetene fra peptidet, som ovenfor, og merkes om ønskelig. Blandingen separeres deretter ved hjelp av ionebyttekromatografi, og tillater separering av typer på basis av ladning. Visualisering av de eluerte toppene kan gjøres ved hjelp av et merke, som nevnt ovenfor, eller kan gjøres ved hjelp av noen andre fremgangsmåter, slik som massespektrometri. Et kromatogram analyseres deretter ved å integrere toppene assosiert med mono-, di-, tri- og tetraledede karbohydrattyper. Prosenten av totalt karbohydrat til stede i hver type kan deretter anvendes for å beregne Z-antallet i henhold til den følgende ligning:
hvori Z er Z-nummeret, og P'm0no, P'<n, P'tri og P\etra er prosent totalt karbohydrat som er henholdsvis mono- di-, tri- og tetraladet.
Et høyt Z-nummer indikerer at et større antall antenner bærer ladede rester og at glykoproteinet derfor vil være svært ladet, og i tilfelle av sialinsyrerester, surt. Rekombinant humant FSH har vanligvis Z-nummerverdier i området omtrent 150 til omtrent 190, eller et gjennomsnitt på omtrent 184.
Oppfinnerne har overraskende funnet at FSH-isoformer som har Z-nummere som er høyere enn ved eller omtrent 200 viser økt virkning i betydningen av antall follikler sammenlignet på en IU-basis med en "ekvivalent dose" FSH-isoformer med Z-antall mindre enn 200. Med "ekvivalent dose" menes at når FSH-mengden til forskjellige isoformer måles ved hjelp av den konvensjonelle in vivo-analysen ved sammenligning, under spesifiserte betingelser av deres evne til å øke eggstokkmasse i rotter er IU-dosen den samme. Med andre ord har ekvivalente IU-doser til forskjellig isoformer, som bestemt i rotter, forskjellig klinisk virkning når de administreres til mennesker.
FSH-preparater med økt Z-nummer kan isoleres ved hjelp av et antall fremgangsmåter. F.eks. kan en prøve rekombinant FSH utsettes for isoelektrisk fokusering eller kromatofokusering som beskrevet, f.eks., av Mulders et al.<19>, Zambrano et al.<20>, og Timossi et al.<21>. Fraksjoner med ulike pl kan isoleres. Foretrukne FSH-preparater ifølge oppfinnelsen har gjennomsnittelig pl som er mindre enn ved eller omtrent 3,4, mer foretrukket mindre eller ved omtrent 3,3, spesielt foretrukket mindre enn ved eller omtrent 3,2 med preferansegrad økende ettersom gjennomsnittelig pl synker.
Parameteren Z-nummer reflekterer gjennomsnittet av sialyseringsgrad av en populasjon av FSH-typer. Det er mulig at et FSH-preparat med et høyt Z-nummer fortsatt kan ha en vesentlig andel basiske (mindre sialyserte) typer. Slike basiske typer kan virke som antagonister på FSH-reseptoren og er derfor uønsket. "Spredningen" av typer som er til stede kan bestemmes ved hjelp av isoelektrisk fokusering eller kromatofokusering. Z-nummeranalysen kan også gi en idé om spredningen av typer. Det er foretrukket at preparatet har mindre enn ved eller omtrent 4 % nøytrale karbohydrattyper (dvs. glykanenheter som ikke er ladet), og mindre enn ved eller omtrent 16 % monosialyserte typer, og mer foretrukket at preparatet er mindre enn ved eller omtrent 3 %, 2 % eller 1 % nøytrale typer og mindre enn ved eller omtrent 15 %, 12 %, 10 %, 8 % eller 5 % monosialyserte typer, hvor preferansegraden øker med synkende prosenter.
FSH-preparater i følge oppfinnelsen har økt virkning i follikulogenesen som et resultat av en økt sialyseringsgrad ved én eller flere ytterligere glykosyleringsseter på proteinet. Slike seter kan introduseres ved substitusjon av rester i FSH-proteinryggraden med serin, treonin, lysin eller asparaginrester, ved anvendelse av f.eks. mutagenese. Et eksempel på en fremgangsmåte som kan anvendes for å generere slike mutantformer av FSH er gitt i eksempel 7. For in vivo-glykosylering bør det introduserte setet være slik at det danner et "N-glykosyleringssete", med den følgende sekvensen: N-X'-S/T/C-X", hvor X' er en hvilken som helst aminosyrerest bortsett fra prolin, X" er en hvilken som helst aminosyrerest som kan eller ikke trenger å være identisk med X' og som fortrinnsvis er forskjellig fra prolin, N er asparagin og S/T/C representerer en rest som kan være serin, treonin eller cystein, fortrinnsvis serin eller treonin, og mer foretrukket treonin. Sure isoformer (pl < 3,4) av slike FSH-molekyler faller innenfor rammen av oppfinnelsen. Slike modifiserte FSH-molekyler som bærer ytterligere glykosyleringsseter er beskrevet f.eks. i den tidligere omtalte WO 01/58493 (Maxygen). Spesielt foretrukket er de følgende mutasjoner: I p<->subenheten: E4N, A70N, L73N, V78N, G100N, Y103N, F19N/121T, L27N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T og R97N/L99T; I a-underenheten: E9N, F17T, F17N, R67N, V68t, E56N, H83N og F33N/R35T; hvori A er alanin, D er aspartinsyre, E er glutaminsyre, F er fenylalanin, G er glysin, H er histidin, I er isoleucin, L er leucin, N er asparagin, R er arginin, T er treonin, V er valin, Y er tyrosin og anmerkningen "E4N" representerer en erstatning av en glutaminsyre (E) ved posisjon 4 med en asparagin (N). For sekvensnummerering er aminosyresekvensen til humant FSH-alfa i henhold til den modne sekvensen vist i fig. 5 eller SEKV. ID nr. 1. Aminosyresekvensen til humant FSH-beta er nummerert i henhold til den modne sekvensen vist i fig. 9 eller SEKV. ID nr. 2.
FSH-preparatene i følge oppfinnelsen har økt virkning i follikulogenesen som et resultat av økt syaliseringsgrad ved én eller flere ytterligere glykosyleringsseter til stede på et vedheftet peptid. Med "vedheftet peptid" menes ethvert peptid som inkluderer et glykosyleringssete, og som kan være bundet til amino- og/eller karboksylenden til a- og/eller p-subenheten til FSH uten å negativt påvirke FSH-aktiviteten til det resulterende molekylet. F.eks. er p-subenheten til hCG vesentlig større enn den til andre gonadotropiner som følge av tilnærmet 34 ytterligere aminosyrer ved C-terminalen henvist til heri som karboksyterminaldelen (CTP). I urin-hCG inneholder CTP fire mucinlignende O-bundede oligosakkarider. Denne CTP kan ligeres til P-subenheten til FSH, fortrinnsvis ved den karboksylterminale enden av P-subenheten til FSH og resulterer i et molekyl med FSH-aktivitet og som har ytterligere fire glykosyleringsseter. Sure isoformer (pl < 4,4) av slike FSH-molekyler faller innenfor rammen av oppfinnelsen. Slike molekyler er beskrevet i WO 93/06844 (Washington University) og av Boime et al.<22>. Andre FSH-molekyler med modifiserte glykosyleringsseter er beskrevet i WO 90/09800 (Washington University).
For formålet ved denne beskrivelsen angis FSH-preparater med ytterligere glykosyleringsseter som FSH<ely+>. Når ytterligere glykosyleringsseter er tilført kan parameteren Z-nummer ikke lenger anvendes for å sammenligne med "normale" FSH-preparater (dvs. de som har fire glykosyleringsseter), ettersom denne parameteren er normalisert (det er en sum av prosenter). Når et FSHelyH -preparat utsettes for en glykantypeanalyse kan parameteren Z<+->nummer beregnes på en måte som ligner på Z-nummer. FSH<8>'<y+->preparater ifølge oppfinnelsen har Z<+->nummere på mer enn ved eller omtrent 200, fortrinnsvis mer enn ved eller omtrent 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, hvor preferansegraden øker ettersom Z<+->nummeret øker.
FSH<gly+->preparater ifølge oppfinnelsen har signifikant lavere pl-profiler enn normalt FSH. Spesielt foretrukket for deres økte virkning er de FSH<ely+->preparatene med gjennomsnittelige pl på mindre enn omtrent 4,4, mer foretrukket de med gjennomsnittelig pl mindre enn ved eller omtrent 4,2, 4,0, 3,8, 3,6, 3,4, 3,3 og 3,2, hvor preferansegraden øker med lavere gjennomsnittelig pl.
Alle utførelsesformene av oppfinnelsen omfatter rekombinant FSH. For behandling av humane pasienter foretrekkes humant rekombinant FSH. Preparater ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra konvensjonelt rekombinant FSH eller de kan isoleres fra FSH<gly+->preparater.
Det er også et aspekt ved oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å berike sialinsyreinnholdet ved anvendelse av en fremgangsmåte som oppfinnerne kaller "sialylforsterkning". Rekombinant FSH (foretrukket) eller rekombinant FSH<ely+->preparater (også foretrukket) eller urin-FSH kan utsettes for sialylforsterkning ved behandling med et enzym slik som en glykosyltransferase, spesielt sialyltransferase, i nærvær av en sialinsyredonor, f.eks. CMP-sialinsyre som beskrevet i WO 98/31826 (Cytel Corporation). Eksempler på rekombinant sialyltransferaser, så vel som fremgangsmåter for å fremstille rekombinant sialyltransferaser, finnes i f.eks. US patent nr. 5 541 083 (University of California; Amgen). I det minste 15 forskjellige pattedyrsialyltransferaser er blitt dokumentert og cDNA for 13 av disse er blitt klonet. Disse cDNA kan anvendes for rekombinant fremstilling av sialyltransferaser, som deretter kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Sialyltransferasen som anvendes vil være i stand til å overføre sialinsyre til sekvensen Galpl, 4GlcNAc, som er de mest vanlige nest siste enhetene som ligger bak den endelige sialinsyre på sialyserte glykoproteiner. Et eksempel på en sialyltransferase som kan anvendes er ST3Gal III, som også henvises til som en (2,3)-sialyltransferase (EC 2.4.99.6). Dette enzymet katalyserer overføringen av sialinsyre til Gal i en Gal-P-l,3-glykosylNAc- eller Gal-P-subenheten-p-1,4-glykosylNAc-glykosid . Sialinsyren er bundet til en galakotsylrest (Gal) med dannelsen av en a-binding mellom de to sakkaridene. Bindingen av sakkaridene er mellom 2-posisjonen til NeuAc og 3-posisjonen til Gal. Dette spesifikke enzymet kan isoleres fra rottelever<24>; den humane cDNA<25> og genomiske<26> DNA-sekvensen er kjent, hvilket letter fremstillingen av dette enzymet gjennom rekombinant ekspresjon. I en foretrukket utførelsesform anvender sialyseringsmetodene en ST3Gal III (fortrinnsvis fra rotte), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I eller St6GalNAc II, mer foretrukket ST3Gal III, ST6Gal I, ST3Gal IV, ST6Gal II eller ST3Gal V, enda mer foretrukket fortrinnsvis ST3Gal III fra rotte.
Mengden sialyltransferase er fortrinnsvis i området fra ved eller omtrent 50 mU pr. mg FSH eller mindre, fortrinnsvis ved eller omtrent 5-25 mU pr. mg FSH. Under foretrukne betingelser er konsenstrasjonen av sialyltransferase ved eller omtrent 10-50 mU/ml, og FSH-konsentrasjonen er ved eller omtrent 2 mg/ml.
Det er også mulig å fremstille FSH beriket med sure isoformer ved å transfektere en celle, rekombinant eller på annen måte, som uttrykker FSH med et gen som koder for en sialyltransferase, hvor genet kan uttrykkes i cellen. Genet kan omfatte genomisk kodende sekvenser (dvs. med introner) eller det kan omfatte cDNA kodende sekvenser. Alternativt, dersom cellens genom inneholder endogene sekvenser kodende for sialyltransferase, kan et konstrukt som medfører ekspresjon av FSH settes inn i genomet til cellen. Ekspresjonen av sialyltransferase kan økes ved å sette inn ikke-negative regulatoriske sekvenser, aktive i cellen, operabelt bundet til den endogene sekvensen kodende for sialyltransferasen. Det er også mulig å sette inn et amplifiserbart gen operabelt bundet til sekvensen som koder for sialyltransferase for slik å forårsake amplifisering av den genomisk sialyltransferasekodende sekvensen. Disse manupulasjonene kan utføres ved anvendelse av homolog rekombinasjon, f.eks. som beskrevet i EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.).
Sialyseringsgraden til et FSH-preparat kan også økes gjennom utvelgelse av en celle for ekspresjon av rekombinant FSH som er kjent for å favorisere sialysering. Slike celler inkluderer utvalgte hypofyseceller og eggstokkceller fra kinesisk hamster som uttrykker høye nivåer av sialyltransferaser. Et FSH-preparat fremstilt i en slik celle kan ytterligere utsettes for en isoleringsmetode, som nevnt heri, for å isolere isoformer med høy sialyseringsgrad.
Sialyseringsgraden til et FSH-preparat kan også økes ved å dyrke en celle som uttrykker FSH, fortrinnsvis rekombinant FSH, under betingelser som favoriserer et høyt sialyseringsnivå. Sialysering kan favoriseres ved å tilføre kulturmediet inhibitorer av nevroamidase og/eller direkte intracellulære forløpere for sialinsyresyntese, slik som acetylmannosamin. Et FSH-preparat fremstilt under slike dyrkningsbetingelser kan ytterligere utsettes for en isoleringsmetode som nevnt heri, for å isolere isoformer med høy grad av sialysering.
Dersom sialylforsterkning anvendes er det ønskelig at FSH-preparatet har en høy AI, for slik å tilveiebringe mange antenner for binding av sialinsyrerester forut for den enzymatiske sialyseringen. Fortrinnsvis bør FSH ha en AI på mer enn eller ved omtrent 220, mer foretrukket bør den ha en AI på mer enn eller omtrent 240, og enda mer foretrukket bør det ha en AI på mer enn eller omtrent 270. FSH med høyere AI kan isoleres, f.eks. ved anvendelse av affinitetskromatografi på Concanavalin-A (Con-A)-derivatisert sefarose, å eluere med en metylglukosegradient, eller ved hjelp av preparativ HPLC.
Sialyseringsforsterkningsmetoden ifølge oppfinnelsen kan være fordelaktig å anvende på FSH-preparater som har blitt modifisert for å introdusere én eller flere ytterligere glykosyleringsseter (FSH<B>'<y+->preparater). Slike FSH<gly+->preparater kan også separeres i fraksjoner med høy AI forut for sialylforsterkning.
Oppfinnelsen inkluderer FSH-preparater fremstilt ved å uttrykke FSH i celler som ikke er i stand til å sialysere og deretter utsette FSH for sialylforsterkning. F.eks. beskriver WO 99/13081 (Akzo Nobel N.V.) ekspresjonen av villtype FSH og muteiner i den unicellulære eukaryote Dictyostelium, spesielt muteiner med ytterligere glykosyleringsseter. Dictyostelium er ikke i stand til å sialysere glykaner. Oppfinnelsen inkluderer FSH-preparater fremstilt ved å utsette villtype FSH eller muteiner uttrykt i Dictyostelium for sialylforsterkning.
Etter sialylforsterkning kan FSH-preparater med ønsket sialyseringsgrad isoleres ved anvendelse av ionebyttekromatografi, isoelektrisk fokusering, kromatofokusering eller kromatografi på Concanavalin-A (Con-A).
FSH ifølge oppfinnelsen har et Z-nummer på i det minste 220, fortrinnsvis 240, mer foretrukket i det minste 260, hvor preferansegraden øker med økende Z-nummer-Fullstendig sialysert FSH har et Z-nummer på ved eller omtrent 230 til ved eller omtrent 280 avhengig av antenneindeksen. Svært foretrukne FSH-preparater ifølge oppfinnelsen har et Z-nummer på ved eller omtrent 230 eller ved eller omtrent 280.
FSH-preparatene ifølge oppfinnelsen fremstilles slik at de konsekvent har et Z-nummer på i det minste 220, eller de foretrukne Z-nummerne nevnt ovenfor. FSH ifølge oppfinnelsen kan isoleres fra en blanding av isoformer ved anvendelse av et antall fremgangsmåter som er velkjent for fagmannen på området. F.eks. kan isoelektrisk fokusering, kromatofokusering eller ionebyttekromatografi anvendes for å separere isoformene på absis av pl. De forskjellige fraksjonene kan analyseres for sialinsyreinnhold og de ønskede fraksjonene velges for anvendelse. Et eksempel på egnede betingelser for ionebyttekromatografi er gitt i eksemplene. Slike separeringsmetoder kan anvendes for å isolere FSH ifølge oppfinnelsen fra konvensjonelt fremstilte rFSH eller urin-FSH (uFSH), eller de kan anvendes for å isolere ønskede isoformer fra FSH behandlet med sialyltransferase eller de andre rekombinante teknikkene nevnt ovenfor.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et farmasøytisk preparat omfattende FSH i henhold til oppfinnelsen (dvs. med et Z-nummer på i det minste 220, fortrinnsvis minimumsverdiene for Z-nummer som angitt ovenfor). Slike farmasøytiske preparater kan anvendes for å stimulere follikulogenese, f.eks. i sammenheng med eggløsningsinduksjon eller assistert befruktningsteknikker (ART). Fordi FSH ifølge oppfinnelsen er spesielt virksomt i induseringen av multippel follikkelutvikling og modning er det spesielt egnet for anvendelse i ART hvor det er ønskelig å samle flere oocytter.
Alternativt, med forsiktig avpasning av dosen, kan FSH ifølge oppfinnelsen anvendes for å indusere monofollikulogenese for OI eller pausifollikulogenese (opptil omtrent 3 follikler) for IUM, for in vivo-fertilisering. Monofollikulogenese kan også oppnås med en redusert FSH-dose eller mindre hyppigere dosering sammenlignet med konvensjonelle FSH-preparater. I OI kan f.eks. et FSH-preparat ifølge oppfinnelsen administreres ved 225-400 1U hver tredje dag, eller lavere doser, avhengig av pasientresponsen. Pasientresponsen kan følges sonografisk.
FSH ifølge oppfinnelsen vil vanligvis formuleres som et farmasøytisk preparat som ytterligere vil omfatte et fortynningsmiddel eller eksipient. En fagmann på området vil være klar over mangfoldet av slike fortynningsmidler eller eksipienter som er egnet for formulering av et farmasøytisk preparat.
FSH ifølge oppfinnelsen formuleres vanligvis som en enhetsdose i form av et faststoff klart for oppløsning for å danne en steril injiserbar løsning for intramuskulær eller subkutan anvendelse. Det faste stoffet er ofte et resultat av lyofilisering. Typiske eksipienter og bærere inkluderer sukrose, laktose, natriumklorid, bufringsmidler slik som natriumfosfatmonobasiske og natriumfosfatdibasiske midler. Løsningen kan fremstilles ved å fortynne med vann for injeksjon umiddelbart forut for anvendelse.
FSH ifølge oppfinnelsen kan også formuleres som en løsning for injeksjon, omfattende hvilke som helst av eksipientene og bufferne angitt ovenfor og andre kjent for fagmannen på området.
FSH ifølge oppfinnelsen kan anvendes i et kontrollert
ovariehyperstimuleringsregime (COH). Standard regimer<27> for COH inkluderer en nedreguleringsfase hvori endogent luteiniserende hormon (LH) nedreguleres ved
administrering av en gonadotropinfrigjørende hormonagonist (GnRH) etterfulgt av en stimuleringsfase hvori follikkelutvikling (follikkulogenese) induseres ved daglig administrering av follikkelstimulerende hormon (FSH), vanligvis ved eller omtrent 75-600 IU/dag, fortrinnsvis ved eller omtrent 150-225 IU/dag. Alternativ stimulering startes med FSH etter spontan eller indusert menstruasjon etterfulgt av administrering av en GnRH-antagonist (vanligvis startet rundt dag seks av stimuleringsfasen). Når det er i det minste tre follikler større enn 16 mm (én på 18 mm) gis en enkelt stor dose hCG (5-10000 IU) for å etterligne den naturlige LH-bølgen og indusere eggløsning. hCG-injeksjon administreres vanligvis ved hvilken
som helst av dagene 10-14, men kan administreres senere avhengig av når de ovenfor angitte parameterne nås. Oocyttgjenvinning innstilles til 36-38 timer etter hCG-inj eksj onen.
FSH ifølge oppfinnelsen kan også anvendes for OI og IUI. F.eks. kan FSH-stimulering med et preparat ifølge oppfinnelsen starte etter spontan eller indusert menstruasjon, ved en daglig dose på 75-150 IU. Når én eller tre follikler er nådd en diameter på i det minste 16 mm administreres én enkelt stor dose hCG for å indusere eggløsning. Inseminering utføres in vivo, gjennom regulært samleie eller
IUI.
Fordi FSH ifølge oppfinnelsen har en økt virkning i forhold til kjente FSH-preparater kan regimer som beskrevet ovenfor anvende lavere IU-doser av FSH, og/eller kan modifiseres ved å redusere FSH-stimuleringsperioden samtidig som tilsvarende eller bedre respons oppnås med hensyn til antall og levedyktige follikler. Ved anvendelse av et FSH-preparat ifølge oppfinnelsen kan f.eks. adekvat follikulogenese oppnås ved eller omtrent 50-150 IU FSH, fortrinnsvis ved eller omtrent 50-100, mer foretrukket ved eller omtrent 50-75 IU FSH. FSH-dosering er vanligvis på en daglig basis eller annenhver dag. Doseringsperioden kan være mindre enn eller ved omtrent 14 dager, fortrinnsvis mindre enn ved eller omtrent 12 dager, mer foretrukket mindre enn ved eller omtrent 11 eller 10 dager.
For OI kan FSH-preparatene ifølge oppfinnelsen administreres ved doser fra 25-150 IU FSH/dag, fortrinnsvis 50-125 IU FSH/dag.
For behandlingen av mannlig infertilitet kan et FSH-preparat ifølge oppfinnelsen administreres ved 3 x 150-300 IU/uker inntil spermatogenesen når adekvate nivåer for inseminering, enten gjennom regulært samleie eller ART-teknikk.
Oppfinnerne har ytterligere funnet at som følge av økt virkning kan FSH-preparater med et Z-nummer på i det minste 220 administreres mindre hyppig enn FSH-preparater med et lavere Z-nummer. (For formål med denne beskrivelsen vil uttrykkene FSH<+200>, FSH<+>210, FSH<+22>° osv. anvendes for å representere FSH-preparater med Z-numre i området fra ved eller omtrent 200-210, 211-220, 221-230 osv.).
På grunn av den økte virkningen av FSH<+220> sammenlignet med konvensjonelle FSH-preparater kan de ovenfor angitte doseringene reduseres i de pasientene som viser en god respons. Med FSH-preparatene ifølge oppfinnelsen med Z-numre som ikke er mindre enn ved eller omtrent 230 er det mulig å gi injeksjoner kun hver femte, sjette eller syvende dag avhengig av responsen til pasienten. Responsen kan vurderes sonografisk og/eller ved å måle serumøstradiolnivåer. Andre egnede regimer er som følger: 80-100 IU FSH+220 hver annen dag; 180-200 IU FSH<+220> hver tredje dag; 260-300 IU FSH<+220> hver fjerde dag; 75-100 IU FSH+230 hver annen dag, 170-200 IU FSH<+230> hver tredje dag; og 250-300 IU FSH+230 hver fjerde dag; 275-400 IU FSH<+250> hver femte dag; 375-450 IU FSH+250 hver sjette dag; 450-525 IU FSH<+25>° hver syvende dag.
Uttrykket "økt virkning" som anvendt heri i sammenheng med en virkning på follikulogenesen inkluderer enhver målbar forbedring eller økning i antallet og/eller levedyktigheten til follikler i et individ, f.eks. sammenlignet med antallet og/eller levedyktigheten til follikler i én eller flere pasienter behandlet med en ekvivalent dose (IU/IU) som bestemt i de konvensjonelle analysene for ovarievektøkning i rotter til FSH med et Z-nummer som er mindre enn 200. Fortrinnsvis vil forbedringen eller økningen være statistisk signifikant, fortrinnsvis med en sannsynlighetsverdi på mindre enn 0,05. Fremgangsmåter for å bestemme den statistiske signifikansen til resultatene er velkjent og dokumentert og enhver passende fremgangsmåte kan anvendes.
Oppfinnelsen vil nå illustreres med de følgende eksempler.
Eksempel 1
Bestemmelse av Z-nummer
Glykankartlegging tillater bestemmelsen av Z-nummer til et glykoprotein.
Glykanenheter ble frigjort fra rekombinant humant FSH ved anvendelse av Oxford GlycoSciences GlycoPrep<®> 1000 fullstendig automatisert instrument eller tilsvarende med hydrazin ved 100°C i 5 timer.
Glykantypene ble separert fra uomsatt hydrazin og aminosyrehydrazider ved anvendelse av en belagt glasskulekolonne. Glykantyper ble eluert med et natriumacetatreagens.
Glykantypene ble acetylert med eddiksyreanhydrid. Overskudd av reagens ble fjernet ved anvendelse av blandet-bunn ionebyttekolonne. Enhver ikke-redusert glykantype ble samlet i en fortynnet acetatbufferløsning.
Glykantyper ble samlet på et 0,5 m filter (Oxford GlycoSciences) og lyofilisert. De tørkede glykantypene ble merket ved omsetning med en reduktant med et fluorofor (f.eks. 2-aminbenzamid eller 2-AB) under sure betingelser i 120 min. ved 65°C.
De merkede glykantypene ble separert fra overskuddsreagens ved anvendelse av en hydrofil adsorpsjonsmembran som holder tilbake glykantypene. Glykantypene ble gjenvunnet i vann og lagret frosset inntil kromatografisk separering.
De merkede glykantypene ble separert ved hjelp av anionbyttekromatografi. Den kromatografiske fremgangsmåten ble utført som følger: • Kolonnen var en GlycoSep<®>C-kolonne, 4,6 x 100 mm, pakket med polymerbelagt divinylbenzenresin (5 m)
• Mobilfasen hadde en gjennomstrømningshastighet på 0,4 ml/min:
Mobilfase A: Acetonitril (kromatografisk kvalitet)
Mobilfase B: Ammoniumacetat 500 mM, pH 4,5
Mobilfase C: ultrarent vann
• Deteksjon var med et fluorimeter satt ved A,eksitering: 330 nm og Å.emjSjon: 420 nm;
• Eluering var under de følgende elueringsbetingelser:
Initiale betingelser: 20 % fase A, 80 % fase C
Lineær gradientfase B (0,25 % pr. min.) fra 5-21 min., 20 % fase A konstant.
Lineær gradientfase B (0,525 % pr. min.) fra 21-61 min., 20 % fase A konstant.
• Kolonnen ble opprettholdt ved en temperatur på 30 + 2°C.
Glykantypene eluerte i henhold til deres ladning fra nøytral, mono-, di-, tri- og tetrasialyserte typer. Et typisk kromatogram er vist i fig. 1.
I det oppnådde kromatogrammet ble toppene gruppert i henhold til retensjonstidsområdet som svarte til sialyseringsgraden angitt i tabell 1.
Resultatene for hver glykangruppe ble uttrykt som prosent av totalt område av de forskjellige glykangruppene (nøytral, mono-, di-, tri- og tetra-) og et Z-nummer ble beregnet fra forholdene til de forskjellige typene (Pgiykan):
Eksempel 2
Bestemmelse av antenneindeks (AI)
Glykanene ble frigjort fra peptidryggraden ved hydrazinolyse og deretter fluorescensmerket ved anvendelse av 2-aminobemzamid (2-AB), som beskrevet i eksempel 1.
2-AB-merkede glykaner ble desialysert enzymatisk med sialidase ( Vibrio cholerae) i 250 mM ammoniumacetat, pH 5,5 inneholdende 20 mM kalsiumklorid i 18 timer ved 37°C. Tilnærmet 0,05 U silidase ble anvendt for glykaner ved å starte fra en mengde på 100 ug rhFSH.
De desialyserte glykanene ble tørket under vakuum og lagret ved -20°C før separering ved hjelp av preparativ reversfase HPLC, under de følgende betingelser: • Kolonnen var en GlycoSep<®>R-kolonne;
• Mobilfasen hadde en gjennomstrømningshastighet på 0,7 ml/min.
Eluent A: ammoniumacetat 50 mM, pH 6,0;
Eluent B: ammoniumacetat 50 mM, pH 6,0 inneholdende 8 % acetonitril;
• Deteksjon var med et fluorimeter satt ved A,eksitering = 330 nm; A,emiSj0n= 420 nm.
• Kolonnetemperatur: 30°C.
Forut for påføring til kolonnen ble tørkede prøver rekonstituert med eluent A (200 ul): 50 (al av denne løsningen ble påført.
Den følgende gradient ble anvendt:
t = 0 (min.) 55 % A; 45 % B
t= 15 (min.) 55 % A; 45 %B
t = 70(min.) 0 % A; 100 %B
t = 75 (min.) 0 % A; 100 % B
t = 76 (min.) 55 % A; 45 % B
Topper ble angitt som di-, tri- og tetra-antenner ved anvendelse av elektrospray massespektrometri (ESMS) og matriksassistert laserdesorpsjonsionisering "Time-Of-Flight"-massespektrometri (MALDI-TOF MS).
Resultater er uttrykt som relativ prosent P av di-antenne; tri-antenne og tetra-antenne hvor 100 % er summen av alle glykaner. AI beregnes deretter ved anvendelse av den følgende ligning:
hvori AI er antenneindeks og Pdi, Ptri og Ptetra er den prosent av totalt karbohydrat som er henholdsvis di-, tri- og tetra-forgrenet.
Eksempel 3
Separering av FSH til fraksjoner basert på sialyseringsgrad
Rekombinant FSH ble separert i sure og basiske fraksjoner ved anvendelse av anionbyttekromatografi på DEAE-sefarose FF. • Den anvendte kolonnen var 0 1,6 x 20 cm (XK Pharmacia eller tilsvarende) for laboratorieskalarensing (tilnærmet 60 mg bulkprotein), og 0 3,4 x 40 cm (Vantadge Amicon eller tilsvarende) for storskalarensinger, pakket med DEAE-sefarose FF-resin;
Mobilfasen hadde en gjennomstrømningshastighet på 150-250 cm/time Ekvilibreringsbuffer 1: 2M Tris-HCl pH 7,0 + 0,1;
Ekvilibreringsbuffer 2: 25 mM Tris-HCl pH 7,0 ± 0,1, konduktivitet 2,15 ± 1,5 mS/cm;
Ekvilibreringsbuffer 1: 25 mM Tris pH 7,0 + 0,1, 150 mM NaCl, konduktivitet 18,3 + 0,5 mS/cm (denne buffereluerer surere isoformer);
Regenereringsløsning: 0,5M NaOH, IM NaCl
Lagringsløsning: 10 mM NaOH
Kolonnen ble opprettholdt ved 23°C ± 3°C eller 5 + 3°C.
FSH ble fremstilt for påføring på kolonnen som følger:
Frossen rhFSH-masse ble tint ved 5 + 3°C. Etter tiningen var fullstendig ble løsningen (3-4 mg rhFSH estimert ved optisk tetthet ved 276,4 nm, pr. ml resin) fortynnet med 2M Tris-HCl pH 7,0 + 0,1 i det følgende forhold: 1 del buffer og 79 deler rhFSH-masse. Den endelige konsentrasjonen av tris-HCl var 25 mM. pH ble justert til 7,0 ± 0,1 med HC1 IM.
Kolonnen ble fremstilt ved å vaske med 3 bunnvolumer (bed volumes, BV) NaOH 0,5 M etterfulgt av 6 BV vann. Ekvilibrering ble utført ved å vaske med 4-5 BV ekvilibreringsbuffer 1, inntil en pH på tilnærmet 7 ble målt. Vaskingen fortsatte deretter med 7-8 BV ekvilibreringsbuffer 2.
En rhFSH-prøve, fremstilt som ovenfor ble påført på kolonnen. Etter at påføringen var fullstendig ble kolonnen vasket med 3 BV ekvilibreringsbuffer 1.
Eluering med elueringsbuffer 1 ble deretter startet og samlingen av de basiske fraksjonene begynte når absorbansverdien (276,3 nm) begynte å stige, og fortsatte i 20 + 1 bed volumer. Eluenten ble deretter endret til elueringsbuffer 2, og samlingen av de sure fraksjonene begynte så snart absorbansverdien (276,4 nm) begynte å stige og fortsatte i 3 + 1 bed volumer.
Fraksjonene ble deretter utsatt for ultrafiltrering for å konsentrere dem, med en ultrafiltreringscelletype 8400 (Amicon eller tilsvarende) utstyrt med en YM3-membran for den basiske fraksjonen og med en YM 10 for den sure fraksjonen. Alle operasjonene ble utført ved 5 + 3°C.
Eksempel 4
Klinisk studie for sammenligning av FSH-isoformer
Den komparative virkningen på frivillige av to eksperimentelle rhFSH-batcher ble vurdert.
To FSH-preparater ble dannet ved å splitte rhFSH i to fraksjoner ved anvendelse av ionebyttekromatografi som beskrevet ovenfor i eksempel 3. Batch A ble kalt "sur" og hadde et Z-nummer på 220 (dvs. sur fraksjon fra eksempel 3), mens batch B ble kalt "basisk" og hadde et Z-nummer på 160 (dvs. basisk fraksjon fra eksempel 3).
Ved anvendelse av den konvensjonelle analysen for ovarievektøkning i rotter ble ampuller med batch A og batch B fylt slik at de inneholdt tilnærmet 150 IU FSH hver.
Egenskapene til de to batchene er vist i tabell 2. Det bør bemerkes at siden rørene ble fylt ved IU, var den aktuelle mengden FSH i ampullene av basisk batch B omtrent 250 % av den sure batch A (omtrent 24 ug kontra omtrent 9 ug). Spesifikk bioaktivitet ble beregnet ved å dele aktiviteten i IU med vekten av protein.
Pasientgruppen var 32 frivillige kvinner som ikke hadde nådd overgangsalderen. Pasientene ble utsatt for hypofysenedregulering gjennom daglige injeksjoner av dekapeptyl (0,1 mg). Etter 14 dager ble en sonografisk undersøkelse utført og i fravær av cyster ble stimuleringen med rFSH (150 IU/dag) av enten batch A eller batch B igangsatt. Follikkelvekst ble vurdert ved hjelp av sonografi og serum E2-konsentrasjoner på en daglig basis.
Gjennom FSH-stimulering vil follikler utvikles og vokse i diameter. Folliklene til hver pasient ble målt og talt ved dag 8 og 10 etter stimulering og antallet follikler som falt innenfor størrelseskategori en 0-10 mm, 11-15 mm og 16-25 mm ble notert. I fig. 2 vises det gjennomsnittelige antall follikler pr. pasient som faller i hver kategori for pasientgrupper behandlet med sure og basiske isoformer på dag 8.1 fig.
3 vises det samme plottet for dag 10.
Resultatene av studien viser at mens follikkelstørrelsen utvikles regulært med tiden i den basiske gruppen ga den sure gruppen opphav til en annen generasjon follikler, noe forsinket med hensyn til den første, med en påfølgende sterk økning i follikkeldannelse, omtrent dobling i forhold til den basiske gruppen. Denne andre gruppen økte i størrelse fra dag 8 til dag 10. Resultatet er at i pasientgruppen behandlet med "sur" FSH, på dag 10 var det gjennomsnittelig et totalt 18 follikler som var større enn 11 mm, mens det i gruppen behandlet med "basisk" isoform, var gjennomsnittsantallet follikler større enn 11 mm på dag 10 kun 11.
Det gjennomsnittelige totale antall follikler på dag 10 i den "sure" gruppen er 28, mens det i den basiske gruppen er 19.
Det gjennomsnittelige totale follikkelvolumet (TFV) pr. pasient ble bestemt ved anvendelse av sonografi. TFV i gruppen som mottok "surt" FSH var 30 % høyere enn gruppen som mottok "basisk" FSH.
FSH-serumnivåer i pasientene, målt ved hjelp av radioimmunanalyse, var høyere i den basiske gruppen som forventet fra den injiserte proteinmassen; imidlertid var forskjellen kun omtrent 30 % (se fig. 4), sammenlignet med den administrerte forskjellen på 250 %, på linje med den høyere metabolske varigheten til de sure formene.
Eksempel 5
Separering av FSH i fraksjoner basert på antenneindeks (AI)
FSH-preparater med høyere enn normale antenneindekser kan isoleres ved anvendelse av HPLC eller affinitetskromatografi med Concanavalin A (Con-A)-derivatisert separose.
Eksempel 6
"Sialylforsterkning" med sialyltransferase
Rekombinant humnat FSH ("utgangsmateriale"; 10 mg) ble løst i buffer (0,1 M HEPES, pH 7,5) ved en konsentrasjon på 4,3 mg/ml. Til denne løsningen ble det tilsatt rekombinant rottesialyltransferase (ST3GalIII) til en konsentrasjon på 100 mU/ml, og cytidin-5'-monofosfat-N-acetyl nevraminsyre (CMP-NeuAc) som sialinsyredonor ved en konsentrasjon på 20 mM. Alternativt kan sialinsyredonor genereres in situ ved anvendelse av 20 mM NeuAc og 2 mM CMP i nærværet av CMP-sialinsyresyntetase. Reaksjonen ble inkubert ved 37°C i 24 timer. Fraksjoner beriket med sialinsyre ble isoler ved anvendelse av teknikker beskrevet i eksempel 3.
Sialylforsterkning kan også utføres ved anvendelse av utgangsmaterialer bestående av FSH med en forsterket antenneindeks, fremstilt i henhold til eksempel 5.
Alternativt kan sialylforsterkning utføres med et FSH-utgangsmateriale som allerede har et forhøyet Z-antall sammenlignet med konvensjonell rekombinant FSH. Slikt utgangsmateriale kan isoleres ved anvendelse av teknikkene beskrevet i eksempel 3.
Eksempel 7
Dannelse av FSH-mutanter
cDNA til a- og (3-underenheter av humant FSH ble subklonet i pDONR-vektoren (Invitrogen). QuickChange™ seterettet mutagenesekit (Stratagene) ble anvendt for å introdusere N-bundede glykosyleringsseter i a- og p-subenhetene til FSH.QuichChange TII-systemet utnytter to syntetiske oligonukleotidprimere inneholdende den ønskede mutasjonen/mutasjonene. De følgende oligonukleotid-parene ble anvendt for å introdusere N-bundede glykosyleringsseter: CC TTG
sekvensene til de mutante cDNA ble bekreftet ved anvendelse av ABI PRIM BigDye™ Terminator ved 3,0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit etterfulgt av analyse med ABI PRIM 310 Genetic Analyzer.
pCI-pattedyrekspresjonsvektor (Promega) ble omdannet til en GATEWAY-destinasjonsvektor ved anvendelse av GATEWAY Vector Conversion System (Invitrogen). a- og p-mutantene sammen med villtypeunderenhetene ble subklonet i pCI-ekspresjonsvektoren ved anvendelse av Gateway™ Cloning Technology (Invitrogen). pCI-ekspresjonsvektoren inneholder den humane cytomegalovirus umiddelbart tidlig forsterker/promoter for å regulere ekspresjonen av det innsatte genet, og intron oppstrøms for genet for å fremme ekspresjonen simianvirus 40 sent polyadenyleringssignal nedstrøms for det innsatte genet for å avbryte transkripsjon. E56N og F17T-alfamutanter i pCI ble samtidig transfektert med villtype FSH P i pCI mens A70N, G100N, V78N og D41N/A43T p-mutanter i pCI ble samtidig transfektert med villtype a-subenhet i pCI. Som en kontroll ble villtype P-subenhet av FSH i pCI og a-subenhet i pCI samtidig transfektert. Plasmidene ble forbigående transfektert i HEK293-celler (ATTC, CRL-10852) ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (f.eks. som beskrevet i WO 96/07750). Alternativt ble pCI-plasmidet inneholdende enten villtype P-subenheten eller ved 78N~P-mutanten samtidig transfektert med villtype a-subenhet i pCI. Plasmidene kan også forbigående eller stabilt transfekteres i CHO-celler. En dag etter transfeksjonen ble mediet endret til DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) inneholdende 1 jag/ml insulin (Invitrogen, 18140-020), 6,8 ng/ml natriumselenitt (Sigma, S5261) og 12,2 ng/ml jernsitrat (Sigma, F3388). En dag etter endringen i mediet ble kondisjonert medium samlet og sentrifugert i 5 min. ved tilnærmet 800 x g ved 4°C for å fjerne ethvert cellulært debris. Supernatanten ble fjernet og sentrifugert ved 16000 x g i en Biofuge fresco (Heraeus Instruments) i 5 min. og deretter ble mediet ytterligere klaret ved filtrering gjennom et 0,45 um Acrodisc-filter (Gelman Sciences, 4184). Til det klarede cellulære ekstraktet ble 1 M Tris pH 7,4 tilsatt til en endelig
konsentrasjon på 50 mM Tris og Tween 20 tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,1 % Tween 20.
FSH-mutantene ble renset fra det cellulære ekstraktet ved anvendelse av immunaffinitetskromatografi på sefarose derivatisert med anti-FSH-monoklonale antistoffer immobilisert ved anvendelse av divinylsulfon (immunresin anti-FSH-McAb-DVS-sefarose). Slike resiner kan fremstilles ved fremgangsmåter kjent for fagmannen på området, f.eks. som beskrevet i WO 88/10270.
Resinet ble ekvilibrert i ekvilibreringsbuffer, bestående av 0,1 m Tris-HCl, 0,3M NaCl-buffer ved pH 7,5 ved 4°C. Kolonnen ble lastet med en mengde IU FSH (ved hjelp av radioimmunanalyse, RIA) svarende til 80-90 % av den totale FSH-bindingskapasiteten til kolonnen.
Ikke-bibeholdte proteiner ble eluert med ekvilibreringsbuffer (som ovenfor) inntil OD280 til eluatet var lavere enn 0,02.
Den absorberte mutante FSH ble eluert fra immunoresinet med 1 M ammoniakkløsning ved 4°C. Eluater svarende til omtrent fire ganger immunresinvolumet ble samlet, pH ble justert til 9,0 ved tilsetting av iseddiksyre ved 4°C, så raskt som mulig etter samling, og løsningen ble ultrafiltrert i et Amicon apparat (membranavskjæring 10000 Da) og konsentrert til et lite volum.
Den konsentrerte mutant-FSH-løsningen ble deretter utsatt for et revers fase HPLC-trinn, ved anvendelse av Waters Prep LC 500A væskekromatograf utstyrt med UV-detektor og en preparativ gradientgenerator. Forut for påføring til kolonnen ble pH i løsningen justert til omtrent 5,6. Løsningen ble lastet på en Cis revers fasekolonne (Prepak 500 C]g cartridges Waters) som tidligere var ekvilibrert med 0,05 M ammoniumacetafbuffer pH = 5,6 ved romtemperatur. Gjennomstrømningshastigheten var 100 ml/min. og eluatet ble monitorert ved 280 nm.
Mutant FSH ble eluert med en gradient isopropanol opptil 50 av den mobile fasen. Fraksjoner ble undersøkt ved hjelp av analytisk gassfasekromatografi (GPC), og radioimmunanalyse (RIA). Det organiske løsningsmidlet ble fjernet ved destillering under vakuum ved i det minste 40°C og løsningen ble frosset og lyofilisert.
De mutante FSH-preparatene uttrykt i CHO-celler ble utsatt for ionebyttekromatografi som beskrevet i eksempel 3 for å isolere fraksjoner med Z<+->nummere større enn 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 og høyere.
Mutante FSH-preparater uttrykt i CHO eller HEK 293-celler ble utsatt for sialylforsterkning som beskrevet i eksempel 6. Etter sialylforsterkning ble det mutante FSH utsatt for ionebyttekromatografi i henhold til eksempel 3 for å isolere fraksjoner med Z<+->numre større enn 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 og høyere.
Referanser:
<1> Wide, L; The regulation ofmetabolic ctearance of human FSH in mice byvariation of the molecular strvcture of the hormone; Acta Endocrinologica 112 1986; 336-344; <2> Chappel et al. ; Endocr. Rev. 41983; 179-211; Padmanabhan et ai; J. Clin. Endocrinol. Met 67 1988; 465-473; Wide ef al. ; J. Clin. Endocrinol. Met 70 1990; 271-276; Anobile et al. Glycoform composition of serum gonadotropins through the normal menstrual cycle and in the post-menopausal state; Mol. Human Reproduct 4 1998; 631-639 <3> Moren et ai; J. Biol. Chern. 246 1971; 1461-1467; Ashwell et ai; Annu. Rev. Biochem. 51 1982;
531-554
<4> Steelman & Pohley; Assayofthe follide stimulating hormone based on the augmentation wrt' h
human chorionic gonadotropin; Endocrinology 53 7953; 604-616
<5> D'Antonio ef al. ; Biological characterisation of recombinant human foliicle stimulating hormone
isofomis; Human Reproduction 14 1999; 1160-1167
<6> Vitt ef a/.; Isofonns of human recombinant follicle- sfimulating hormone: comparison of effects on
munne foliicle development In Vrtro; Biol. Reproduct 59 1998; 854-861
7 Timossi ef at; DifferenGal effects of the charge variants of human follicle- stimulafing honnone; J. Endocrinol. 165 2000; 193-205 <8> Zambrano ef al. ; Studies on the relative in- vitro biological potency of the naturally- occurring
isofonns of intrapituUary foliicle stimulating honnone; Moi Hum. Reprod. 2 1996; 563-71
<9> Zambrano ef at; Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH
charge isofomis as disdosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure- function relationship of the FSH variants; Endocrine 10 1999; 113-121
<10> Wide ef a/.; Influence of the assay method used on the selection of the most active forms of
FSH from pie human pituitary, Ada Endocrinol. (Copenhagen) 113 1986; 17-22
<11> Mulders ef a/.; Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant foliicle
stimulating hormone using quantitative isoelectric focussingr, Biologicals 25 1997; 269-281
12 Timossi ef al. ; A less acidic human follicle- sitmulating hormone preparation induces tissueJype
plasminogen activalor enzyme activity eartierthan a predominantly acidic analogue in Phenobarbital- blocked pro- oestrous rats; Mol. Human Reproduct. 4 1998; 1032-1038 <13> Healy ef ai; tancet 343 1994; 1539-1544
<14> forexample, a technique is described in EP 0 170 502 (Serono Laboratories, Inc.)
<15> Buckler ef ai; Ovulation induction wrth low dose alternate day recombinant foliicle stimulating hormone; Hum. Reprod. 14 1999; 2969-73 <16> Hård ef al.', feo/afibn and structure determination of the intact sialytation N- linked carbohydrate chains of recombinant human follrtropin expressed in Chinese hamseter ovary cells, Eur. J. Biochem. 193 1990; 263-271 <17> Nadano ef al. ; J. Biol. Chem. 261 1986; 11550-11557; Kanamori ef al. ; J. Biol. Chem. 265 1990; 21811-21819 <18>Swedlow at al. ; Deglycosyiation of gonadotropins with an eridoglycosidase; Proe. Soc. Experiment, Biol. & Med. 181 1986; 432-437
<19>Mulders ef al; Biologicals 25 1997; 269-281
<20>Zambrano ef al. ; Mol. Hum. Reprod. 2 1996; 563-571
<21> Timossi ef al. ; NeuroendocirnologyG? 1998; 153-163
<22>Boime ef al. ; Glycoprotein honnone structure- function and analog design; Recent Prog. Horm. Res. 54 1999; 271-88 <23> Wen et al. ; J. Biol. Chem. 267 1992; 21011; Van den Eijnden ef al. Enzymatic amplification involving giycosyltransférases forms the basis for the increased srze of asparagineSnked glycans at the surface of NIH 373 ce//s expressing the N- ras proto- oncogene; J. Biol Chem. 266 1991; 21674
<24> Weinstein ef al. J. Biol. Chem. 257 1982; 13845
<25>Sasaki et al. J. Biol. Chem. 268 1993; 22782-22787; Kitagawa & Paulson; J. BM Chem. 269 1994;1394-1401 .
<28> Kitagawa ef al. ; J. Biol. Chem. TJA 1996; 931-938
<27> for example, aconventional technique fs described in EP 0 170 502 (Serono Laboratories, Inc.)
Claims (22)
1. Farmasøytisk preprat som omfatter rekombinant FSH,
karakterisert ved at det rekombinante FSH har et Z-nummeret som er i det minste 220, fortrinnsvis i det minste 240, mer foretrukket i det minste 260, for anvendelse i human medisin.
2. Farmasøytisk preparat som omfatter rekombinant FSH ifølge krav 1, karakterisert ved at det rekombinante FSH har et Z-nummeret som er i det minste 220 og en antenneindeks AI på fra 220- 280.
3. Farmasøytisk preparat i følge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det rekombinante FSH uttrykkes i eggstokkceller fra kinesiske hamstre.
4. Anvendelse av rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for human follikellogenese, hvori det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
5. Anvendelse i følge krav 4, hvori FSH administreres daglig eller semidaglig ved en dose på 50-75 IU i løpet av mindre enn 14 dager.
6. Anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for å kontrollere hyperstimulering av humane eggstokker, hvori det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
7. Anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for eggløsningsinduksjon eller intrauterin inseminasjon, hvori det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
8. Anvendelse av et rekombinant FSH til fremstilling av et medikament for behandling av infertilitet hos menn hvori det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 220.
9. Anvendelse i følge krav 8, hvori 150 til 300 IU FSH administreres 3 ganger per uke inntil spermatogenesen når adekvate nivåer for inseminasjon.
10. Anvendelse i følge hvilket som helst av kravene 4 til 9, hvori det rekombinante FSH her et Z-nummer som er i det minste 240, fortrinnsvis i det minste 260.
11. Farmasøytisk preparat eller anvendelse i følge hvilket som helst av de foregående krav, hvori FSH har en gjennomsnittlig pl på mindre enn 3,4, mer foretrukket mindre enn 3,3, enda mer foretrukket mindre enn 3,2.<*>
12. Farmasøytisk preparat eller anvendelse i følge hvilket som helst av de foregående krav, hvori FSH har en økt sialyleringsgrad ved en eller flere glykosyleringsseter til stede i et peptid festet til FSH-proteinet.
13. Farmasøytisk preparat eller anvendelse i følge krav 12, hvori det festede peptidet er den karboksyterminale delen av P-underenheten til hCG.
14. Farmasøytisk preparat eller anvendelse i følge hvilket som helst av de foregående krav, hvori FSH har en eller flere mutasjoner som introduserer en eller flere ytterligere glykosyleringsseter i FSH-proteinet og som øker sialyleringsgraden.
15. Farmasøytisk preparat eller anvendelse i følge krav 14, hvori mutasjonene er utvalgt fra en eller flere av A70N, V78M, G100N, D41, N/A43T i p-underenheten til FSH og/eller en eller flere av F17T, E56N, H83N i a-underenheten til FSH.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant FSH preparat med et Z-nummer som er i det minste 220 for anvendelse i human medisin, karakterisert ved at fremgangsmåte omfatter trinnene å reagere FSH med en sialinsyredonor i nærværet av 2,3-sialyltransferase.
17. Fremgangsmåte i følge krav 16,
karakterisert ved at det rekombinante FSH har et Z-nummer som er i det minste 240, fortrinnsvis i det minste 260.
18. Fremgangsmåte i følge hvilket som helst av kravene 16 eller 17, karakterisert ved at sialinsyredonoren er CMP-sialinsyre.
19. Fremgangsmåte i følge hvilket som helst av kravene 16 til 18, karakterisert ved at sialyltransferase er ST3Gal III fra rotte.
20. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant FSH preparat med et Z-nummer som er i det minste 220 for anvendelse i human medisin, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter et trinn for isoelektrisk fokusering, kromatofokusering eller ionebyttekromatografi.
21. Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant FSH preparat med et Z-nummer som er i det minste 220 for anvendelse i human medisin,
karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å tilføre kulturmediet hvori det rekombinante FSH uttrykkes med neuraminidaseinhibitorer og/eller direkte intracellulære forløpere for sialinsyresyntese, slik som acetylmannosamin.
22. Fremgangsmåte i følge krav 20 eller 21,
karakterisert ved at det rekombinante FSH uttrykkes i eggstokkceller fira kinesiske hamstere.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33808801P | 2001-10-22 | 2001-10-22 | |
PCT/EP2002/011501 WO2003035686A2 (en) | 2001-10-22 | 2002-10-15 | Compositions of fsh with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20042061L NO20042061L (no) | 2004-07-13 |
NO327966B1 true NO327966B1 (no) | 2009-11-02 |
Family
ID=23323355
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20042061A NO327966B1 (no) | 2001-10-22 | 2004-05-18 | Farmasoytisk preparat omfattende rekombinant FSH, anvendelse av rekombinant FSH, samt fremgangsmate for fremstilling av rekombinant FSH preparat. |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050085412A1 (no) |
EP (2) | EP1438336B1 (no) |
JP (1) | JP2005515974A (no) |
KR (1) | KR100929971B1 (no) |
CN (1) | CN1608078B (no) |
AR (1) | AR036926A1 (no) |
AT (1) | ATE329930T1 (no) |
AU (1) | AU2002340562B2 (no) |
CA (1) | CA2464368A1 (no) |
DE (1) | DE60212425T2 (no) |
DK (1) | DK1438336T3 (no) |
EA (1) | EA007030B1 (no) |
ES (1) | ES2261740T3 (no) |
HR (1) | HRP20040278B1 (no) |
IL (2) | IL161235A0 (no) |
ME (1) | MEP38608A (no) |
MX (1) | MXPA04003352A (no) |
NO (1) | NO327966B1 (no) |
PL (1) | PL369606A1 (no) |
PT (1) | PT1438336E (no) |
RS (1) | RS32804A (no) |
UA (1) | UA87433C2 (no) |
WO (1) | WO2003035686A2 (no) |
ZA (1) | ZA200402279B (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0524782D0 (en) * | 2005-12-05 | 2006-01-11 | Chiron Srl | Analysis of samples |
ES2620261T3 (es) * | 2006-09-10 | 2017-06-28 | Glycotope Gmbh | Uso de células humanas de origen leucémico mieloide para expresión de anticuerpos |
CN101264096B (zh) * | 2007-03-12 | 2011-11-09 | 中国医学科学院药物研究所 | 人参皂苷Rg1在制备生精产品中的应用 |
US8742079B2 (en) | 2007-08-20 | 2014-06-03 | Protalix Ltd. | Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof |
TWI488640B (zh) * | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
AU2010238758A1 (en) * | 2009-04-22 | 2011-12-15 | The Regents Of The University Of California | In vivo 1H magnetic resonance spectroscopy for the diagnosis of testicular function and disease |
TWI532495B (zh) * | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
US9194011B2 (en) | 2009-11-17 | 2015-11-24 | Protalix Ltd. | Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof |
WO2012016576A1 (en) * | 2010-08-04 | 2012-02-09 | Glycotope Gmbh | Improved recombinant human follicle-stimulating hormone |
CN102464713A (zh) * | 2010-12-21 | 2012-05-23 | 上海丽珠制药有限公司 | 一种卵泡刺激素的制备方法 |
DK2665814T3 (en) | 2011-01-20 | 2017-09-11 | Protalix Ltd | NUCLEIC ACID CONSTRUCTION FOR EXPRESSION OF ALPHA-GALACTOSIDASE IN PLANTS AND PLANT CELLS |
JP6087338B2 (ja) | 2011-03-31 | 2017-03-01 | フェリング ベスローテン フェンノートシャップ | 医薬製剤 |
EP2717904A1 (en) * | 2011-06-06 | 2014-04-16 | Ferring BV | Pharmaceutical preparation comprising recombinant fsh |
JO3092B1 (ar) | 2011-08-08 | 2017-03-15 | Ferring Bv | مركب لتحفيز مسيطر عليه للمبيض |
JP2017513853A (ja) | 2014-04-18 | 2017-06-01 | グリコトープ ゲーエムベーハー | 改良された組換えヒト卵胞刺激ホルモンを用いた制御された卵巣過剰刺激 |
DK3794042T3 (da) | 2018-05-18 | 2024-04-15 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Anti-muc1-exatecet-antistof-lægemiddelkonjugat |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1057895B (it) * | 1975-02-17 | 1982-03-30 | Serono Lab | Gonadotropina corionica umana parzialmente desalinizzata per indurre l'ouvulazione |
IT1206302B (it) * | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
US5338835A (en) * | 1989-02-21 | 1994-08-16 | Washington University | CTP-extended form of FSH |
US5087615A (en) * | 1989-03-17 | 1992-02-11 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Novel method of ovulation induction in humans |
US5541083A (en) * | 1989-10-24 | 1996-07-30 | The Regents Of The University Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other golgi processing enzymes |
US5834251A (en) * | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
IL130964A0 (en) * | 1997-01-16 | 2001-01-28 | Cytel Corp | Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins |
JP4511042B2 (ja) * | 1998-08-07 | 2010-07-28 | メルク セローノ ソシエテ アノニム | 不妊症の治療のためのfsh模倣物 |
CA2348430A1 (en) * | 1998-10-28 | 2000-05-04 | Baylor College Of Medicine | Ovary-specific genes and proteins |
EP1171615B1 (en) * | 1999-04-26 | 2006-12-13 | Genentech, Inc. | Cell culture process for glycoproteins |
JP2001299362A (ja) * | 1999-12-17 | 2001-10-30 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ポリペプチドおよびそのdna |
WO2001058493A1 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | Conjugates of follicle stimulating hormones |
-
2002
- 2002-10-15 IL IL16123502A patent/IL161235A0/xx unknown
- 2002-10-15 DK DK02774712T patent/DK1438336T3/da active
- 2002-10-15 ME MEP-386/08A patent/MEP38608A/xx unknown
- 2002-10-15 UA UA20040402998A patent/UA87433C2/ru unknown
- 2002-10-15 KR KR1020047005861A patent/KR100929971B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-10-15 EA EA200400574A patent/EA007030B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-10-15 PT PT02774712T patent/PT1438336E/pt unknown
- 2002-10-15 MX MXPA04003352A patent/MXPA04003352A/es active IP Right Grant
- 2002-10-15 EP EP02774712A patent/EP1438336B1/en not_active Revoked
- 2002-10-15 CN CN028260090A patent/CN1608078B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-15 PL PL02369606A patent/PL369606A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-10-15 EP EP05107252A patent/EP1621549A3/en not_active Withdrawn
- 2002-10-15 CA CA002464368A patent/CA2464368A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-15 DE DE60212425T patent/DE60212425T2/de not_active Revoked
- 2002-10-15 WO PCT/EP2002/011501 patent/WO2003035686A2/en active IP Right Grant
- 2002-10-15 US US10/493,638 patent/US20050085412A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-15 AU AU2002340562A patent/AU2002340562B2/en not_active Ceased
- 2002-10-15 AT AT02774712T patent/ATE329930T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-15 RS YUP-328/04A patent/RS32804A/sr unknown
- 2002-10-15 ES ES02774712T patent/ES2261740T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-15 JP JP2003538199A patent/JP2005515974A/ja active Pending
- 2002-10-22 AR ARP020103989A patent/AR036926A1/es unknown
-
2004
- 2004-03-19 HR HR20040278A patent/HRP20040278B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-03-23 ZA ZA2004/02279A patent/ZA200402279B/en unknown
- 2004-04-01 IL IL161235A patent/IL161235A/en unknown
- 2004-05-18 NO NO20042061A patent/NO327966B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1438336B1 (en) | Compositions of fsh with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments | |
KR102111514B1 (ko) | 과배란 유도 조성물 | |
AU2002340562A1 (en) | Compositions of FSH with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments | |
Recombinant Human FSH Product Development Group | Recombinant follicle stimulating hormone: development of the first biotechnology product for the treatment of infertility | |
KR20170137041A (ko) | 불임 치료용 조성물 | |
EP3572515B1 (en) | Glycoprotein hormone long-acting superagonists | |
US7956034B2 (en) | FSH glycosylation variant D3N | |
JP5249044B2 (ja) | Fsh突然変異体 | |
KR101099809B1 (ko) | Fsh 당화 돌연변이체 | |
MX2008009199A (en) | Novel fsh glycosylation variant d3n |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CREP | Change of representative |
Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS |
|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |