KR20170137041A

KR20170137041A - 불임 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170137041A
Application number: KR1020177022439A
Authority: KR
Inventors: 세즈 조안 카를로스 아르크; 리즈베스 헬름가드; 비아케 미르너 클라인
Original assignee: 훼링 비.브이.
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-12-12
Also published as: KR20240073153A; JP2021020915A; PL3283097T3; RU2704252C2; SI3283097T1; EP3283097B1; US20230139407A1; DK3662925T3; CN107405385A; EP3662925B1; MX2017010883A; US20200353053A1; MA46548A; ES2784625T3; PL3662925T3; CA2975444A1; JP7161511B2; SI3662925T1; US11439686B2; US10660938B2

Abstract

불임 치료에 사용하기 위한, FSH, 예를 들어, 재조합 FSH를 포함하는 조제물.

Description

불임 치료용 조성물

본 발명은 불임 치료용 조성물 및 약학 제품에 관한 것이다.

시험관내 수정 (IVF)과 같은 보조 생식술 (assisted reproduction technology)(ART) 기법들이 잘 알려져 있다. 이들 ART 기법에는, 일반적으로, 난포 집단을 완전히 성숙되도록 자극하는 과배란 유도 (COS: controlled ovarian stimulation) 과정이 수반된다. 표준 COS 요법은, 난포 발달을 자극하기 위해, 난포 자극 호르몬 (FSH)과 같은 고나도트로핀을 단독으로 또는 황체 형성 호르몬 (LH) 활성과 조합하여 투여하는 것으로, 통상적으로는, 황체 형성 호르몬 (LH)의 조기 상승을 방지하기 위해, 자극 전 및/또는 자극 시 GnRH 유사체의 투여와 함께 이루어진다. COS를 위해 일반적으로 사용되는 약학적 조성물은 재조합 난포 자극 호르몬 (rFSH), 뇨 유래 FSH, 재조합 FSH + LH 조제물, 뇨 유래 메노트로핀 [인간 폐경기 고나도트로핀 (hMG)] 및 고도로 정제된 인간 폐경기 고나도트로핀 (HP-hMG)을 포함한다. IVF는 심각할 경우 생명을 위협할 수 있는 난소 과잉자극 증후군 (OHSS)의 발병 위험성과 연관될 수 있다.

전술한 바와 같이, 표준 COS 프로토콜은 일반적으로 FSH의 투여를 수반한다. FSH의 투여량은 일반적으로 나이, 과거 FSH 자극에 대한 반응성, FSH의 기저 수준, 동난포수 (antral follicle count)와 최근에는 항-뮐러 호르몬 (AMH) 등의 다수의 인자들에 의해 결정된다. 임상의는 주어진 투여량에 대한 반응으로 난소에서 다발성 난포 발달과 순환성 17-β-에스트라디올 농도 증가를 기대할 것이다.

주어진 투여량에 대한 반응 (난소에서 다발성 난포 발달, 순환성 17-β-에스트라디올 증가)이 적절하거나 또는 예상된 바와 같다면, 이는 난소 기능이 정상적이라는 것을 의미하며, 또한 난소 예비력 (ovarian reserve) 정상이라 한다. FSH 자극에 반응성이 좋지 않은 환자는 난포를 거의 생산하지 않으며, 그래서 17-β-에스트라디올 농도는 자극시 천천히 상승하여 비교적 낮은 수준에 도달한다. 이런 환자들을 "저 반응자 (low responder)"라고 하며, 난소 예비력이 낮다고 할 수 있다. 낮은 반응성에는, 연령 증가, 골반 유착, 난소 질환 및 면역학적 요인 등의 몇 가지 인자들이 관련된 것으로 보인다.

여성에서 과배란 유도 (COS)에 대한 반응 가능성을 예측하는 예측력은 개별 맞춤형 COS 프로토콜 개발을 가능케 할 수 있다. 이는, 예를 들어, 자극에 대해 과도한 반응을 나타낼 것으로 예측되는 여성에서 OHSS 발병 위험도를 낮추거나, 미약 반응자 (poor responder)로 분류되는 여성의 임신 가능성을 개선시키거나, 및/또는 FSH 투여량 (및 노출)을 낮추어, 특정 환자에서 치료 비용을 절감할 (및 치료 안전성 증가) 수 있다.

현재 혈청내 항-뮐러 호르몬 (AMH) 농도는 난소 예비력에 대한 신뢰성있는 마커로서 확립되어 있다. AMH 농도 감소는 COS 시술시 고나도트로핀에 대한 난소 반응성 저하와 연관되어 있다. 나아가, 높은 농도의 AMH는 과도한 난소 반응을 나타내는 양호한 예측인자이자, OHSS 위험성의 지표이다.

ART 시술 중인 35세 미만의 여성을 대상으로 하는 예비 실험에서, CONSORT 투약 알고리즘 (dosing algorithm) (기초 FSH, BMI, 연령 및 AFC 통합)을 이용하여 OHSS 발병 위험성이 있는 여성에서 COS를 위한 최상의 FSH 개시 투여량을 예측하였다 (Olivennes et. al., 2009). 개체별 맞춤 투여량은 충분한 난모 세포 수율과 양호한 임신율로 이어진다. 그러나, 저 투여량군 (75 IU FSH)은 불충분한 반응으로 인해 실패율이 높았으며, 상당한 비율의 환자들에서 OHSS가 발병하였다.

전술한 바와 같이, 표준 COS 프로토콜은 FSH 투여를 포함할 수 있다. FSH는 천연적으로 뇌하수체 전엽에서 분비되며, 난포 발달과 배란을 지원하는 기능을 한다. FSH는, 다른 당단백질 호르몬인 LH 및 CG에서도 공통적인, 92개의 아미노산으로 된 α 서브유닛과, 호르몬에 생물학적 특이성을 부여하는 111개의 아미노산으로 된 FSH에 고유한 β 서브유닛을 포함한다 (Pierce and Parsons, 1981). 각각의 서브유닛은 컴플렉스 탄수화물 잔기들의 부가에 의해 번역 후 수정된다. 이들 서브유닛 둘다 N-연결되는 글리칸 결합 사이트를 2개 가지고 있는데, α 서브유닛은 아미노산 52번 및 78번 위치에, β 서브유닛은 아미노산 7번 및 24번 위치에 존재한다 (Rathnam and Saxena, 1975, Saxena and Rathnam, 1976). 따라서, FSH는 약 30 중량%까지 당화된다 (Dias and Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).

폐경기 이후의 인간 뇨로부터 정제된 FSH는, 자연 임신에서 배란을 촉진하고, 보조 생식술에 난모 세포를 제공하기 위해, 다년간 불임 치료를 위해 사용되어 왔다. 현재 승인된 난소 자극용 재조합 FSH (rFSH) 제품들, 예를 들어, 폴리트로핀 α (follitropin alfa) (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) 및 폴리트로핀 β (follitropin beta) (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough)는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주로부터 유래된 것이다. 현재, 인간 세포주로부터 유래된 rFSH 제품은 시판되어 있지 않다.

FSH 조제물들은 존재하는 다양한 이소형의 양적 차이 측면에서 상당한 이종성 (heterogeneity)이 존재한다. 개개 FSH 이소형은 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 번역 후 수정되는 정도에는 차이가 있어; 개개 이소형들은 탄수화물 분지 구조체들의 이종성과 시알산 (말단의 당)의 혼입량 차이로 특정화되는데, 이 2가지 특징 모두 특정 이소형의 생활성에 영향을 미치는 것으로 보인다.

천연 FSH의 당화는 매우 복잡하다. 천연적으로 유래되는 뇌하수체 FSH에 존재하는 글리칸은 모노-, 바이-, 트리 및 테트라-안테나형 글리칸들의 조합을 포함할 수 있는 매우 다양한 범위의 구조들을 포함할 수 있다 (Pierce and Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger and Green, 1988). 글리칸은 또 다른 변형, 즉, 코어의 푸코실화 (fucosylation), 바이섹팅 글루코사민 (bisecting glucosamine), 아세틸 락토스아민을 이용한 체인 연장, 부분 또는 전체적인 시알산화, α2,3 및 α2,6 연결을 이용한 시알산화 및 갈락토스의 황산화 갈락토사민으로의 치환을 가질 수 있다 (Dalpathado et al., 2006). 또한, 각 당화 사이트에 글리칸 구조의 분포 차이가 존재한다. 상당한 수준의 글리칸 복잡성은 개체의 혈청으로부터 유래된 FSH와 폐경기 여성의 뇨로부터 유래된 FSH에서도 확인된다 (Wide et al., 2007).

재조합 FSH 제품의 당화는 숙주 세포주에 존재하는 글리코실-트랜스퍼라제들의 다양성을 반영한다. 시판되는 rFSH 제품들은 유전자 조작된 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)로부터 유래된 것이다. CHO 세포 유래 rFSH의 글리칸 변형 정도는 천연 제품에서 확인되는 것 보다 더 제한적이다. CHO 세포 유래 rFSH에서 확인되는 글리칸의 이종성 저하의 예로는 바이섹팅 글루코스아민의 결핍 및 코어 푸코실화 및 아세틸 락토스아민 연장의 양적 감소 등이 있다 (Hard et al., 1990). 또한, CHO 세포는 오직 α2,3 연결을 통해 시알산을 부가할 수 있어 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); CHO 세포 유래 rFSH는 α2,3-연결된 시알산만을 포함하며, α2,6-연결된 시알산은 포함하지 않는다.

따라서, 천연적으로 생성되는 FSH (예, 인간 뇌하수체/혈청/뇨 FSH)가 α2,3-연결된 시알산과 α2,6-연결된 시알산의 혼합물을 가진 글리칸을 포함하며 α2,3-연결 시알산이 현저하다는 점에서, CHO 세포 유래 FSH와 차이가 있다. 그러므로, CHO 시스템을 이용해 발현된 재조합 단백질은 말단의 시알산 연결 타입이 천연적인 카운터파트와는 다를 것이다. 이 점은, 탄수화물 모이어티가 분자의 약리학적 속성에 기여할 수 있어, 약학적 용도의 생물제제를 제조하는데 중요한 고려사항이다.

본 출원인은 WO2009/127826A로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB2009/000978의 내용인 인간 유래 재조합 FSH를 개발한 바 있다. 재조합 FSH는 α2,3- 및 α2,6-연결된 2가지 시알산들이 혼합된 형태로, rFSH와 α2,3 시알릴 트랜스퍼라제를 모두 발현하도록 인간 세포주를 조작함으로써, 제조되었다. 발현되는 생산물은 산성이 강하며, α2,3- 및 α2,6-연결된 시알산들의 혼합을 함유하고 있으며; 후자는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공된다. 시알산이 연결된 유형, 즉, α2,3-연결 또는 α2,6-연결은 FSH의 생물학적 소거에 놀라운 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다. α2,3 및 α2,6-연결된 시알산들의 혼합물을 포함하는 재조합 FSH는 기존의 CHO 세포에서 발현되는 rFSH에 비해 2가지 이점을 가지고 있는데, 첫번째는 2종의 시알릴 트랜스퍼라제 조합물의 활성으로 인해 물질이 보다 고도로 시알산화된다는 것이고, 두번째는 물질이 천연 FSH과 매우 비슷해진다는 것이다. 이런 점으로 인해, α2,3 연결된 시알산만 생산하고 ( Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) 시알산 함량이 낮은 ( Ulloa - Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004), CHO 세포 유래의 재조합 산물에 비해, 생물학적으로 더 적합할 것임은 자명한 일이다.

최근 들어, 난포 자극 호르몬 수용체 또는 FSH 수용체 (FSHR)가 난소 예비력 저하와 관련있거나 또는 관여할 수 있는 것으로 시사되었다. FSH 수용체는 FSH와 상호작용하는 트랜스멤브레인 수용체이다. FSH 수용체는 아데닐레이트 사이클라제에 연결된 G-단백질-커플링된 7-트랜스멤브레인 수용체로서, 거대 N-말단 리간드-결합 도메인과 인산화 추정 사이트로서 세린과 트레오닌 잔기가 풍부한 C-말단 꼬리를 가지고 있다. 이 수용체의 활성화에는 반드시 FSH의 호르몬 기능이 요구된다. FSH 수용체의 돌연변이는 난소 예비력 저하를 야기할 수 있는 것으로 추정된다. 돌연변이 뿐 아니라, FSH 수용체 변이체 (FSH 수용체 다형성)도 발견된다. 상기한 2가지 다형성이 FSH 수용체 엑손 10번내 307 (Ala/Thr) 및 680 (Asn/Ser) 위치에 존재한다 (도 4). 이는, 307번 위치의 변이체 Ala 또는 Thr과, 680번 위치의 변이체 Asn 또는 Ser이다. 이들 다형성으로 인해 680번 위치에서의 FSH 유전자형은 3가지이다: Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser [Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, No. 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005), 및 Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, No. 4, (April 2006)].

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본 출원인은, AMH가 적고 [AMH 수준 < 15 pmol/L, 일반적으로 낮은 반응성과 연관됨], FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 환자가, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 AMH 수준이 낮은 환자와 비교해, FSH 치료 기간이 더 길다는 것을 발견하였다. 따라서, AMH 수준이 낮을 뿐만 아니라 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에게는 FSH 개시 투여량을 증가시켜 투여하는 것이 FSH 치료 기간 연장을 방지하는 대안책이 될 수 있다. 이로써, 특정한 AMH 수준과 FSHR에 특정 다형성을 가진 것으로 동정된 특정 환자에 대해 FSH 투여량을 맞춤 조정할 수 있다.

AMH가 낮고 [AMH 수준 < 15 pmol/L, (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L, 예로, 5.0 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)], FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에게 FSH 개시 투여량을 고 투여량으로 투여하는 것이, (임신 및/또는 출산 측면에서) 성공 가능성 증가 및 우수한 성공 예측가능성을 제공할 수 있기 때문에, 유익하다. 환자가 이상적인 치료 기간내에 발생하는 적절한 반응성 (예상된 난소 다발성 난포 발달, 순환성 17-β-에스트라디올 상승)을 보인다면, 성공할 가능성은 더 높다. 반응이 이러한 치료 시기의 중간 시점에 나타난다면, 즉, 치료 시기에서 너무 이르지도 너무 늦지도 않은 시점에 나타난다면, 성공은 더 증가된다. AMH가 낮고 FSH 수용체의 680번 위치에 Ser/Ser 변이체를 가진 환자에서 (투여량을 12 ㎍ 보다 많게 증가시킴으로써) 치료 시기 단축은, 치료 시간의 중간 시점쪽으로 반응을 이동시킬 수 있으며, 성공 가능성을 높일 수 있다.

본 발명은, 제1 측면에서, 난포 자극 호르몬 (FSH) 9 내지 24 ㎍을 포함하는, 불임 치료에 사용하기 위한 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 (치료하기 전에) FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 (예, 선택된) 환자에게 (예, 매일) 투여하기 위한 것이다. 이 조성물은, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정 (예, 선택)되고; (치료 전) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 것으로 동정 (예, 선택)된, 환자에게 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 조성물은 FSH를 9 내지 24 ㎍, 예를 들어 10 내지 18 ㎍, 예를 들어 12 내지 16 ㎍, 예를 들어 12 내지 15 ㎍으로 포함할 수 있다. 이 조성물은 FSH를 >12 ㎍, 예를 들어 12.3 내지 24 ㎍, 예를 들어 12.33 내지 24 ㎍, 예를 들어 12.67 내지 24 ㎍, 예를 들어 13 내지 24 ㎍, 예를 들어 13 내지 16 ㎍, 예를 들어 13 내지 15 ㎍으로 포함할 수 있다.

이 조성물 (예, 약학적 조성물)은 본원 및 청구항에서 전술한 인간 유래 rFSH의 양을 일일 투여량 (daily dose)으로 또는 이와 등가의 일일 투여량을 포함할 수 있다. 이 조성물 (예, 약학적 조성물)은 치료 1일에 개시되어, 6일 내지 16일간, 예를 들어, 7일 내지 16일, 예를 들어, 8일 내지 16일, 예를 들어, 8일 내지 13일간 지속되는, FSH의 (일일) 투여를 위한 것일 수 있다. 불임 치료는, 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정 (예, 확인, 예를 들어, 측정)하는 단계; 및 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 불임 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

FSH는 재조합 FSH일 수 있다. FSH는 α2,3- 및 α2,6-시알산화를 함유한 재조합 FSH일 수 있다.　FSH는, 전체 시알산화의 1 내지 99%가 α2,6-시알산화이고 전체 시알산화의 99% 내지 1%가 α2,3-시알산화인, α2,3- 및 α2,6-시알산화를 포함하는, 재조합 FSH일 수 있다. FSH는, 전체 시알산화의 1 내지 50%가 α2,6-시알산화이고 전체 시알산화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알산화인, α2,3- 및 α2,6-시알산화를 포함하는, 재조합 FSH일 수 있다. FSH는, 전체 시알산화의 5 내지 40%가 α2,6-시알산화이고 전체 시알산화의 60% 내지 95%가 α2,3-시알산화인, α2,3- 및 α2,6-시알산화를 포함하는, 재조합 FSH일 수 있다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다.

본 발명은, 또 다른 측면에서, 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고; FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서, 불임을 치료하는데 사용하기 위한, 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 1일 당 재조합 FSH 9 - 24 ㎍의 투여량으로 또는 이와 등가의 투여량으로 투여되며, 불임의 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정)하는 단계; 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이 조성물은 9 내지 24 ㎍의 FSH, 예를 들어 10 내지 18 ㎍의 FSH, 예를 들어 12 내지 16 ㎍의 FSH, 예를 들어 12 내지 15 ㎍의 FSH를 포함할 수 있다. 이 조성물은 >12 ㎍의 FSH, 예를 들어 12.3 내지 24 ㎍의 FSH, 예를 들어 12.33 내지 24 ㎍의 FSH, 예를 들어 12.67 내지 24 ㎍의 FSH, 예를 들어 13 내지 24 ㎍의 FSH, 예를 들어 13 내지 16 ㎍의 FSH, 예를 들어 13 내지 15 ㎍의 FSH를 포함할 수 있다.

조성물 (예, 약학적 조성물)은 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서 불임을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다 [여기서, 불임 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정)하는 단계; 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함한다].

투여량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서도 유효한 반응을 제공해준다.

상기 투여량은 환자 (개체)의 1차 자극 프로토콜에서 불임을 치료하기 위한 것일 수 있다. 추가적인 자극 사이클에서, 투여량은 1차 사이클에서 실제 난소 반응에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

rFSH는 한가지 이소형으로 또는 이소형들의 혼합물로서 존재할 수 있다.

본 출원인은, 재조합 FSH을 특정 투여량으로 사용함으로써, 환자의 개별 AMH 수준과 FSHR 단일 뉴클레오티드 다형성을 토대로 환자를 치료하고, 이로써 (예를 들어, 반응 가능성이 낮은 환자에서) 자극에 대한 적절한 반응 가능성을 높이고, 및/또는 OHSS 또는 다른 부작용의 위험성을 낮추는, "개별 맞춤형 (individualised)" COS 프로토콜을 고안하게 되었다.

혈청내 AMH 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로 확인 (예, 측정)할 수 있다. 예를 들어, 혈청내 AMH 수준은 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용하여 측정한다. 이 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다. 다른 분석도 사용될 수 있다. 본원에서, 혈청내 AMH 수치는 일반적으로 pmol/L로 표시된다. 이는 변환 등식 1 ng/ml AMH = 7.1 pmol/L AMH을 이용해 ng/mL로 변환할 수 있다.

따라서, 본 조성물은, Beckmann-Coulter Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석으로 측정하였을 때 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 것으로 또는 다른 방법으로 측정시 상응하는 AMH 수준을 가진 것으로 동정된 (예, 선택된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것일 수 있다.

본원에서, 용어 "환자" 및 "개체"는 상호 호환적으로 사용된다.

본 조성물 (예, 약학적 조성물)은, 바람직하게는, 상기에서, 본원에서, 청구항에서 규정된 양의 인간 유래 rFSH를 일일 투여량으로 포함하거나 또는 이와 등가의 일일 투여량을 포함한다. (일일) 투여량은 개시 투여량일 수 있다 (즉, 치료 중에 감소, 증가 또는 유지될 수 있음).

FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 환자는, 당해 기술 분야에 널리 공지된 수단에 의해, 예를 들어, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법 [예를 들어, Gromoll et al, Methods, 21, 83-97 (2000), Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, No. 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005) 및 이들의 참조 문헌에 기술된 바와 같은, 혈액에서 게놈 DNA를 추출하기 위한 키트 및 이후 DNA 서열 분석에 의해, 또는 DNA 추출 후 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP 및 후속적인 겔 전기영동 등), 또는 Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, No. 4, April 2006)에 언급된 바와 같은 PCR 및 RFLP 방법에 의해]을 통해 게놈 DNA를 추출한 후 FSH 수용체의 680번 위치에서 대립유전자 변이체를 동정함으로써, 식별할 수 있다. 즉, 본 조성물은, (예, 혈액으로부터) 게놈 DNA를 추출한 다음 Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, No. 4, April 2006에 언급된 PCR 및 RFLP 방법 또는 이와 상응하는 방법에 의해 분석하여 측정하였을 때, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정 (예, 선택)된 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것일 수 있다.

본 조성물 (예, 약학적 조성물)은, 치료 첫날부터 시작하여 6-16일간, 예컨대 7-17일간, 예컨대 8-16일간, 예컨대 8-13일간 지속적으로 FSH를 (일일) 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은, GnRH 작용제 (예, 시나렐, 루프론, 데카펩틸)를 투여한 후 (예, 투여 개시 후, 예를 들어, 일일 투여 개시 후), 12-16일, 예를 들어, 13-15일, 예를 들어, 14일간 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은 GnRH 작용제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은 GnRH 길항제 (예, 가니렐릭스, 세트로렐릭스)를 투여하기 전에, 예를 들어 GnRH 길항제를 투여하기 5 또는 6일 전에 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은 GnRH 길항제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은, 치료 6일째부터 (예, 일일) 투여되는 GnRH 길항제 (예, 가니렐릭스, 세트로렐릭스)와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 조성물 (예, 약학적 조성물)은, 최종 난포 성숙 (final follicular maturation)을 유도하기 위해, hCG를 고 (배란성) 투여량 (예, 4,000 - 11,000 IU hCG, 예, 5,000 IU hCG, 10,000 IU hCG 등; 또는 재조합 hCG 150 - 350 ㎍, 예로, 재조합 hCG 250 ㎍)으로 투여하기 전에, 투여하기 위한 것이다.

본 조성물은 매일 보다 자주 (또는 적은 빈도로) 투여하기 위한 것일 수 있으며, 이 경우 적정 투여량은 본원에 명시된 (일일) 투여량과 등가일 것으로 이해된다.

본원에서, 용어 "불임 치료"는 과배란 유도 (COS)에 의한, 또는 과배란 유도 (COS) 단계 또는 시기를 포함하는 방법, 예를 들어, 인공 수정 (IUI: Intra Uterine Insemination), 시험관 수정 (IVF) 또는 세포질내 정자 주입 (ICSI: intracytoplasmic sperm injection)에 의한 불임의 치료를 포함한다. 용어 "불임 치료"는 배란 유도 (OI) 또는 배란 유도 (OI) 단계 또는 시기를 포함하는 방법에 의한 불임 치료를 포함한다. 용어 "불임 치료"는, 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 예를 들어 1기 또는 2기 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 및/또는 무배란성 불임, 예컨대 WHO II형 무배란성 불임을 앓고 있는 개체, 및/또는 남성 요인의 불임인 파트너를 가진 개체에서의 불임 치료를 비롯하여, 난관 불임 (tubal infertility) 또는 이유 불명의 불임을 가진 개체에서의 불임 치료를 포함한다. 본 조성물은, 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 예를 들어, 미국 생식 의학회 (ASRM)의 자궁내막증의 다양한 단계 분류 체계에 따라 정의되는 바에 따라, 1기 또는 2기 자궁내막증을 앓고 있는 개체에서의 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (에 사용하기) 위한 것일 수 있다 (4기가 가장 심각함; 1기가 중증도가 가장 낮음) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817 821.].

본 조성물은, 초기 난포기에 혈청내 FSH 수준이 1 - 16 IU/L, 예를 들어 1 - 12 IU/L로 정상인 개체에서 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다.

본 조성물은 18-42세, 예컨대 25-37세 개체에서 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다. 본 조성물은 15 < BMI < 38 kg/m²인 개체, 예를 들어, 18 < BMI < 25 kg/m²인 개체, 예를 들어, 20 < BMI < 25 kg/m²인 개체에서 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다.

rFSH는, [단백질 몰 수에 대한 시알산의 몰 수 비율로 표시되는] 시알산 함량이 6 mol/mol 이상, 예를 들어 6 mol/mol - 15 mol/mol, 예를 들어, 8 mol/mol - 14 mol/mol, 예컨대 9 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 10 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 11 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 12 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 12 mol/mol - 13 mol/mol일 수 있다. rFSH는 인간 세포주에서 생산 또는 발현될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 FSH (rFSH)는 전체 시알산화의 1% - 99%가 α2,3-시알산화일 수 있다. rFSH는 전체 시알산화의 10% 이상이 α2,3-시알산화일 수 있다. 예컨대, 전체 시알산화의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 또는 그 이상이 α2,3-시알산화일 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 전체 시알산화의 50 - 95%, 예컨대 전체 시알산화의 50 - 70%, 예를 들어, 전체 시알산화의 60 - 69%, 예를 들어, 63 - 67%, 예컨대 전체 시알산화의 약 65%에 해당되는 양으로 α2,3-시알산화를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 FSH (rFSH)는 전체 시알산화의 1% - 99%가 α2,6-시알산화일 수 있다. 본 발명의 rFSH (또는 rFSH 조제물)는, 전체 시알산화의 5% 이상, 예를 들어, 5% - 99%, 예를 들어, 5% 내지 50%가 α2,6-시알산화일 수 있다. rFSH는 전체 시알산화의 50% 이하가 α2,6-시알산화일 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 전체 시알산화의 5 내지 50%, 예를 들어, 전체 시알산화의 10 - 50%, 예를 들어, 전체 시알산화의 31 - 38%, 예를 들어, 전체 시알산화의 약 35%에 해당되는 양으로 α2,6-시알산화를 포함할 수 있다. 시알산화는, FSH 탄수화물 구조에 존재하는 시알산 잔기의 양을 의미한다. α2,3-시알산화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,3 위치에서의 시알산화를 의미하며, α2,6-시알산화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,6 위치에서의 시알산화를 의미한다. 즉, "전체 시알산화의 %가 α2,3-시알산화일 수 있다"는 것은, FSH에 존재하는 시알산 잔기의 총 수에 대한 2,3 위치에서 시알산화된 것의 %를 나타낸다. 용어 "전체 시알산화의 %가 α2,6-시알산화이다"라는 것은, FSH에 존재하는 시알산 잔기의 총 수에 대한 2,6 위치에서의 시알산화된 것의 %를 나타낸다.

rFSH는, 중량 기준으로 (단백질 + 탄수화물의 중량이 아니라, 단백질 중량을 기준으로) 시알산 함량 (FSH 분자 당 시알산 함량)이 6% 이상 (예, 6% - 15%, 예로, 7% - 13%, 예로, 8% - 12%, 예로, 11% - 15%, 예로, 12% - 14%)일 수 있다.

rFSH는 인간 세포주, 예컨대 Per.C6 세포주, HT1080 세포주 등에서 생산 또는 발현될 수 있다. 이는, 시알산화를 보유하기 위한, 예를 들어, 세포 배양 배지의 조작 및 조절이, 공지된 프로세스를 이용한 경우 보다 덜 중요할 수 있기 때문에, 생산 방법을 단순 (및 보다 효율적이게)하게 만들 수 있다. 본 방법은 또한 공지된 rFSH 제품 생산에 비해 염기성인 rFSH가 생산되는 수준이 낮기 때문에, 더욱 효율적일 수 있으며; 더 산성인 rFSH가 생산되어, 염기성 FSH의 분리/제거는 큰 문제가 되지 않는다. rFSH는 PER.C6^®세포주, PER.C6^® 유래 세포주 또는 변형된 PER.C6^® 세포주에서 생산 또는 발현될 수 있다. 인간 세포주 (예, PER.C6^® 세포주, HT1080 세포주 등)에서 생산 또는 발현되는 rFSH는, [세포주의] 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 일부 α2,6-연결된 시알산 (α2,6-시알산화)을 포함할 것이며, 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 일부 α2,3-연결된 시알산 (α2,3-시알산화)을 포함할 것이다. 세포주는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제로 변형될 수도 있다. 세포주는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 이용해 변형될 수도 있다. 다른 예로 또는 부가적으로, rFSH는 [세포주의] 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 α2,6-연결된 시알산 (α2,6-시알산화)을 포함할 수 있다. 본원에서, 용어 "인간 유래 재조합 FSH"는, 인간 세포주에서 발현 또는 생산되는 (예, 인간 세포주를 조작함으로써 제조되는 재조합 FSH) 재조합 FSH를 의미한다.

rFSH는 α2,3- 및/또는 α2,6-시알릴트랜스퍼라제를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, rFSH는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제를 이용하여 제조된다. rFSH는 내인성 시알릴 트랜스퍼라제 활성에 의해 제공되는 α2,6-연결된 시알산 (α2,6-시알산화)을 포함할 수 있다.

본 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 약학적 조성물은 불임 치료용이다. 불임 치료는 보조 생식술 (ART), 배란 유도 또는 인공 수정 (IUI)을 포함할 수 있다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 공지의 FSH 조제물이 사용되는 의학 증상들에도 사용될 수 있다.

본 생산물 또는 조성물은 임의의 약물 투여 경로용으로 잘 알려진 조성물로, 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 경피 (예, 패치 기술), 정맥내, 근육내, 피하, 수조내(intrasusternal), 질내, 복막내, 국소 (산제, 연고제 또는 점적제) 투여용으로 또는 볼 또는 코 스프레이제로서 제형화될 수 있다. 전형적인 조성물은, 특히 Remington's Pharmaceutical Sciences fifteenth edition (Matt Publishing Company, 1975), at pages 1405 - 1412 and 1461 - 87, 및 national formulary XIV fourteenth edition (American Pharmaceutical Association, 1975)에 기술된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 수성 용액, 무-독성 부형제, 예로, 염 및 보존제, 완충제 등을 포함한다.

적합한 수성 및 비-수성 약제학적 담체, 희석제, 용매 또는 비히클에 대한 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로스 및 이들의 적정 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일) 및 에틸 올리에이트 등의 주사가능한 유기 에스테르 등이 있다. 또한, 본 발명의 조성물은, 비제한적인 예로서, 보존제, 습윤제, 유화제, 계면활성제 및 분산화제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 항세균제 및 항진균제도 미생물 증식을 방지하기 위해 포함될 수 있으며, 예를 들어, m-크레졸, 벤질 알코올, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등이 있다. 보존제가 포함되는 경우, 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸이 바람직하지만, 보존제가 이들 예로 제한되는 것은 아니다. 아울러, 당, 염화나트륨 등의 등장제를 포함하는 것이 적절할 수도 있다. 본 생산물 또는 조성물은 Na⁺-염, K⁺-염 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 염은 Na+-염, 예를 들어, NaCl 또는 Na₂SO₄이다.

바람직하게는, 생산물 또는 조성물은 재조합 FSH와, 폴리소르베이트 20, L-메티오닌, 페놀, 디소듐 설페이트 및 소듐 포스페이트 완충액 중 하나 이상을 포함한다.

일부 경우에, 장기적인 작용을 달성하기 위해, 피하 또는 근육내 주입을 통한 FSH (및 존재하는 경우 기타 활성 성분들)의 흡수를 서행시키는 것이 바람직하다. 이는 수 난용성의 결정질 또는 비결정질 물질의 액체 현탁물을 이용함으로써 달성할 수 있다. 그러면, FSH의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 결정되는데, 용해 속도는 결정의 크기와 결정 형태에 따라 결정될 수 있다. 다른 예로, 비경구로 투여되는 FSH 조합 형태의 지연성 흡수는 오일 비히클에 FSH 조합을 용해 또는 현탁함으로써 달성된다. 주사가능한 데포트 형태 (depot form)는 폴리락티드-폴리글리콜라이드 등의 생분해성 폴리머 안에 FSH (존재하는 경우 다른 제제)의 마이크로엔캡슐 매트릭스를 형성함으로써 만들 수 있다. FSH 대 폴리머의 비율 및 사용되는 특정 폴리머의 특성에 따라, FSH의 방출 속도를 조절할 수 있다. 그외 생분해성 폴리머의 예로는 폴리비닐피롤리돈, 폴리(오르토에스테르), 폴리(안하이드라이드) 등이 있다. 또한, 주사가능한 데포트 제형들은 또한 신체 조직과 친화적인 리포좀 또는 마이크로에멀젼 안에 FSH를 포집 (entrapping)함으로써 제조된다.

주사가능한 제형들은, 예를 들어, 박테리아-체류 필터를 통한 여과 또는 사용 직전에 멸균수 또는 기타 주사용 무균 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균한 고체 조성물 형태에 살균제를 투입함으로써, 멸균 처리할 수 있다. 주사가능한 제형들은 임의의 적정 용기, 예를 들어 바이얼, 사전 충전되는 주사기, 주입 카트리지 등의 안에 든 형태로 공급될 수 있다.

본 생산물 또는 조성물은 1회용 또는 다회용 (다회 투약용)으로 제형화될 수 있다. 본 생산물 또는 조성물이 다회용으로 제형화된다면, 보존제가 포함되는 것이 바람직하다. 보존제가 포함되는 경우, 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸이 바람직하지만; 보존제는 이러한 예들로 한정되지 않는다. 1회용 또는 다회용으로 제형화된 생산물 또는 조성물은 Na⁺-염, K⁺-염 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 염은 Na+-염, 예컨대 NaCl 또는 Na₂SO₄이다.

본 생산물 또는 조성물은 바이얼, 사전 충전된 카트리지 (예, 1회 투여 또는 다회용) 등의 용기 또는 예를 들어 다회 투여량을 투여하기 위해 "펜 (pen)" 등의 주사 기구 안에 함유될 수 있다.

본 생산물 또는 조성물은 FSH (선택적으로, hCG, LH, LH 활성 등과 함께)를 포함하는 제형 (예, 주사용 제형)일 수 있다. LH 활성은, 존재하는 경우, LH 또는 인간 융모막성 고나도트로핀 hCG로부터 기원할 수 있다. 활성 성분이 2종 이상 (즉, FSH + 예로, hCG 또는 LH)이라면, 이는 각각 또는 함께 투여하는 것이 적합할 수 있다. 개별 투여하는 경우, 투여는 순차적일 수 있다. 본 생산물은 임의의 적절한 패키지로 제공될 수 있다. 예를 들어, 생산물은 FSH 또는 hCG 중 하나 또는 FSH 및 hCG의 조합 (또는 조합)이 든, 복수의 용기들 (예, 사전 충전된 주사기들 또는 바이얼들)을 포함할 수 있다. hCG는 재조합 hCG 또는 뇨 hCG일 수 있다. 본 생산물이 FSH, 예를 들어 재조합 FSH가 든 복수의 용기들 (예, 사전 충전된 주사기들 또는 바이얼들)을 포함한다면, 각 용기에는 동량의 FSH가 함유될 수 있다. 하나 이상의 용기는 FSH를 여러가지 양으로 포함할 수 있다. 시린지 또는 바이얼은 블리스터 패키지 또는 무균성을 유지하기 위한 다른 수단으로 포장될 수 있다. 임의의 생산물은, 선택적으로, FSH (및, 존재한다면, 예, hCG) 제형들에 대한 사용 설명서를 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 pH 및 다양한 성분들의 실제 pH는 당해 기술 분야의 일상적인 실무에 따라 조정된다. GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7^th ed을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물로서 제공된다. 비경구 제형을 제조하기 위한 일반적인 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, at pages 780-820에 언급되어 있다. 비경구 조성물은 액체 제형으로 또는 투여 직전에 무균성 주사 매질에 혼합되는 고체로서 제공될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 단위 투약 형태 (dosage unit form)로 제공된다.

본 발명은, 다른 측면으로, (a) 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; (b) 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 (c) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 (동정된) 환자에게, 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 9 - 24 ㎍의 투여량 또는 이와 등가의 투여량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 [예, 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서의 불임]의 치료 방법을 제공한다. 본 조성물은 FSH 9 내지 24 ㎍, 예를 들어 FSH 10 내지 18 ㎍, 예를 들어 FSH 12 내지 16 ㎍, 예를 들어, FSH 12 내지 15 ㎍을 포함할 수 있다. 조성물은 FSH >12 ㎍, 예를 들어, FSH 12.3 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 12.33 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 12.67 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 16 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 15 ㎍을 포함할 수 있다.

FSH의 투여는 치료 첫날 개시하여 6 - 16일간, 예를 들어 7 - 16일간, 예를 들어 8 - 16일간, 예를 들어 8 -13일간 유지될 수 있다.

투여는, 바람직하게는, 상기에서 및 청구항에서 규정된 양의 FSH를 일일 투여량으로 포함하거나 또는 이와 등가의 양을 일일 투여량으로 포함한다. (일일) 투여량은 개시 투여량일 수 있다 (즉, 치료 중에 감소, 증가 또는 유지될 수 있음).

본 방법은 환자 (개체)의 1차 자극 프로토콜에서 불임을 치료하기 위한 것일 수 있다. 추가적인 자극 사이클에서, 투여량은 1차 사이클에서의 실제 난소 반응에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은, 다른 측면에서, 불임 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 FSH를 포함하는 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 조성물은 난포 자극 호르몬 (FSH)을 9 - 24 ㎍으로 포함하며, 약제는 (치료 전에) FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것이다. 약제는, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가지고 있으며, (치료 전에) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 조성물은 FSH 9 내지 24 ㎍, 예를 들어 FSH 10 내지 18 ㎍, 예를 들어 FSH 12 내지 16 ㎍, 예를 들어, FSH 12 내지 15 ㎍을 포함할 수 있다. 이 조성물은 FSH >12 ㎍, 예를 들어, FSH 12.3 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 12.33 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 12.67 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 24 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 16 ㎍, 예를 들어, FSH 13 내지 15 ㎍을 포함할 수 있다.

또한, 본 출원인은, AMH 수준이 낮고 [AMH 수준 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L), 일반적으로 저 반응성과 연관됨], FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에게 FSH의 투여가, 난포 발달 측면에서 양호한 반응을 제공한다는 것을 확인하였다. 이는, AMH 수준이 낮고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에 대한 치료와 비교해, FSH 투여량 감소 및/또는 치료 기간 단축으로 달성된다. 이는, 특정 AMH 수준을 가질 뿐 아니라 FSHR에 상기한 특정 다형성을 가진 것으로 동정된 특정 환자에 대한 FSH 투여량을 조정할 수 있게 해준다. 후술한 바와 같이, AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Asn/Asn을 가진 환자의 경우, 예상되는 자극 기간은 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서 요구되는 자극 기간 보다 1.5일 짧다 (도 7 참조). 즉, 치료 전에 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Asn/Asn를 가진 것으로 (또는 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로) 동정된 환자에 대한 투여량 맞춤 조정은, 약제 비용 측면에서의 상당한 절감 뿐만 아니라 이들 환자에서 필요한 양 보다 FSH를 더 많은 총 투여량으로 투여함으로 인한 잠재적인 부작용 위험성을 상당히 낮출 수 있다.

본 발명은, 다른 측면에서, 난포 자극 호르몬 (FSH)을 10 - 12 ㎍ 포함하는 불임 치료에 사용하기 위한 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 (치료하기 전에) FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것이다. 이 조성물은 (치료하기 전에) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 조성물은 (치료하기 전에) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn을 가진 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 조성물은 FSH를 10 내지 <12 ㎍으로, 예를 들어 FSH를 10 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어 FSH를 11 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어 FSH를 11.33 또는 11.67 ㎍으로 포함할 수 있다.

본 조성물 (예, 약학적 조성물)은 상기에서 및 청구항에서 규정된 인간 유래 rFSH의 양을 일일 투여량으로 또는 이의 등가를 일일 투여량으로 포함한다. 조성물 (예, 약학적 조성물)은 치료 첫날 개시하여, 6 - 16일간, 예를 들어 7 - 16일간, 예를 들어 8 - 16일간, 예를 들어 8 -13일간 유지되는, FSH의 (일일) 투여를 위한 것일 수 있다.

불임 치료는 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정 (예, 확인, 예를 들어, 검출)하는 단계; 및 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser를 가진 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 불임 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정, 예를 들어 측정)하는 단계 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은, 다른 측면에서, 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser를 가진 환자에서 불임을 치료하는데 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 1일 당 재조합 FSH 10 내지 12 ㎍ 또는 이의 등가의 양을 투여량으로 투여하며; 불임 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정)하는 단계; 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이 조성물은 FSH를 10 내지 <12 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 10 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 11 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 11.33 또는 11.67 ㎍으로 포함할 수 있다.

조성물 (예, 약학적 조성물)은 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn를 가진 환자에서 불임을 치료하는데 사용하기 위한 것일 수 있다 [불임 치료는 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정)하는 단계; 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn를 가진 (동정된) 환자에게 투여량을 투여하는 단계를 포함할 수 있음].

본 발명은, 다른 측면에서, (a) 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 결정)하는 단계; (b) 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 (c) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)를 1일 당 10 내지 12 ㎍이거나 또는 이의 등가의 양의 투여량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 [예를 들어, 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)이고, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 환자에서의 불임]을 치료하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 FSH를 10 내지 <12 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 10 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 11 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 11.33 또는 11.67 ㎍으로 포함할 수 있다.

FSH의 투여는 치료 첫날 개시하여, 6 내지 13일간, 예를 들어, 7 내지 13일간, 예를 들어, 8 내지 13일간, 예를 들어, 8 내지 11일간 지속될 수 있다.

본 발명은, 다른 측면에서, 10 내지 12 ㎍의 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는, 불임 치료용 약제를 제조하는데 사용하기 위한 FSH를 포함하는 조성물 (예, 약학적 조성물)을 제공하며, 이 약제는 (치료 전에) FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것이다. 이 약제는, FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가지고 있으며, (치료 전에) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 (예, 일일) 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 약제는 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn를 가지며 (치료 전에) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)인 것으로 동정된 (예, 선별된) 환자에게 투여하기 위한 것일 수 있다. 이 조성물은 FSH를 10 내지 <12 ㎍으로, 예를 들어 FSH를 10 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어 FSH를 11 내지 11.9 ㎍으로, 예를 들어, FSH를 11.33 또는 11.67 ㎍으로 포함할 수 있다.

본 발명의 이러한 측면들에서 FSH, 환자의 혈청내 AMH 수준 확인 및 FSH 수용체의 680번 위치에서의 변이체 동정 등은 본원에 언급된 본 발명의 다른 측면들에서와 같을 수 있는 것으로 이해될 것이다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 pFSHα/β 발현 벡터의 플라스미드 맵이고;
도 2는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제 (ST3GAL4) 발현 벡터이고;
도 3은 α2,6-시알릴트랜스퍼라제 (ST6GAL1) 발현 벡터이고;
도 4는 엑손 10의 아미노산 위치 307 및 680번 위치에서의 다형성과 프로모터내 29번 위치를 나타낸 FSH 수용체의 도식도이고;
도 5는 실시예 8의 실험에서 FSH로 치료받은 환자 222명에서 FSH 수용체 유전자의 SNP 반수체형 (haplotype)의 분포를 나타낸 것이고;
도 6은 680번 위치에서의 3종의 FSH 수용체 유전자형 Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser 각각에 대한, 전체 분석 세트, 관찰한 고나도트로핀 (FSH) 치료 기간 (일) 및 AMH < 15 pmol/L인 환자/개체에게 전달되는 고나도트로핀 (FSH) 총 투여량 (㎍)을 나타낸 결과 표이고;
도 7은 680번 위치에서의 3종의 FSH 수용체 유전자형 Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser 각각에 대한, 전체 분석 세트, AMH < 15 pmol/L인 환자/개체에게 전달되는 고나도트로핀 (FSH)의 예상 치료 기간을 나타낸 결과 표이다.
도 1, 2 및 3: pFSHα/β, pST3 및 pST6 발현 벡터들의 플라스미드 맵. CMV = 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHp(A) = 보바인 성장 호르몬 폴리-아데닐화 서열, fl ori = fl 복제 오리진, SV40 = 시미안 바이러스 40 프로모터, Neo = 네오마이신 내성 마커, Hyg = 히그로마이신 내성 마커, SV40 p(A) = 시미안 바이러스 40 폴리-아데닐화 서열, FSH A = 난포 자극 호르몬 α 폴리펩타이드, FSH B = 난포 자극 호르몬 β 폴리펩타이드, ST3GAL4 = α2,3-시알릴트랜스퍼라제, ST6GAL1 = α2,6-시알릴트랜스퍼라제, CoIEl = CoIEl 복제 오리진, Amp = 암피실린 내성 마커.

서열 선택

인간 FSH

FSH α 폴리펩타이드의 유전자를 코딩하는 영역을 Fiddes and Goodman. (1981)에 따라 이용하였다. 이 서열은 AH007338로 유전자은행에 등록되어 있으며, 구축시 이 단백질 서열에 다른 변이는 존재하지 않았다. 이 서열은 본원에서 서열번호 1로 지칭된다.

FSH β 폴리펩타이드의 유전자를 코딩하는 영역을 Keene et al (1989)에 따라 이용하였다. 이 서열은 NM_000510로 유전자은행에 등록되어 있으며, 구축시 이 단백질 서열에 다른 변이는 존재하지 않았다. 이 서열은 본원에서 서열번호 2로 지칭된다.

시알릴트랜스퍼라제

α2,3-시알릴트랜스퍼라제 - β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4 (α2,3-시알릴트랜스퍼라제, ST3GAL4) 유전자의 코딩 영역을 Kitagawa and Paulson (1994)에 따라 이용하였다. 이 서열은 L23767로 유전자은행에 등록되어 있으며, 본원에서는 서열번호 3으로 지칭된다.

α2,6-시알릴트랜스퍼라제 - β-갈락토사미드 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1 (α2,6-시알릴트랜스퍼라제, ST6GAL1) 유전자의 코딩 영역을 Grundmann et al. (1990)에 따라 이용하였다. 이 서열은 NM_003032로 유전자은행에 등록되어 있으며, 본원에서는 서열번호 4로 지칭된다.

실시예

실시예 1 FSH 발현 벡터 구축

FSH α 폴리펩타이드의 코딩 서열 (AH007338, 서열번호 1)과 FSH β 폴리펩타이드의 코딩 서열 (NM_003032, 서열번호 2)을, 프라이머 조합 FSHa-fw 및 FSHa-rev와 FSHb-fw 및 FSHb-rec을 각각 사용해 PCR로 증폭시켰다.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (서열번호9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (서열번호10)

FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (서열번호 11)

FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (서열번호 12)

제조된 FSH β DNA 증폭 산물을 제한 효소 AscI 및 HpaI으로 절단하고, 네오마이신 선택 마커를 가진 CMV 구동형 포유류 발현 벡터 상의 AscI 및 HpaI 사이트에 삽입하였다. 마찬가지로, FSH α DNA를 BamHI 및 NheI으로 절단하고, 이미 FSH β 폴리펩타이드 DNA를 가진 발현 벡터 상의 BamHI 및 NheI 사이트에 삽입하였다.

벡터 DNA를 사용해 E. coli DH5α 균주를 형질전환하였다. 증폭시키기 위해 콜로니를 취하였다. FSH α 및 β를 가진 벡터를 함유한 콜로니를 서열분석을 위해 선별하였으며, 이들 모두 서열번호 1 및 서열번호 2에 따른 바른 서열을 가지고 있었다. 플라스미드 pFSH A+B#17을 형질전환용으로 선택하였다 (도 1).

실시예 2 ST3 발현 벡터 구축

β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4의 코딩 서열 (ST3, L23767, 서열번호 3)을 프라이머 조합 2,3STfw 및 2,3STrev를 사용해 PCR로 증폭시켰다.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (서열번호 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (서열번호 14)

제조된 ST3 DNA 증폭 산물을 제한 효소 BamHI 및 AflII로 절단하고, 히그로마이신 내성 마커를 가진 CMV 구동형 포유류 발현 벡터 상의 BamHI 및 AflII 사이트에 삽입하였다. 이 벡터를 상기와 같이 증폭시켜 서열분석하였다. 클론 pST3#1 (도 2)이 서열번호 3에 따른 올바른 서열을 가지고 있었으며, 이를 형질전환용으로 선택하였다.

실시예 3 ST6 발현 벡터 구축

β-갈락토사미드 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1의 코딩 서열 (ST6, NM_003032, 서열번호 4)을 프라이머 조합 2,6STfw 및 2,6STrev을 사용해 PCR로 증폭시켰다.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (서열번호 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (서열번호 16)

제조된 ST6 DNA 증폭 산물을 제한 효소 BamHI 및 AflII로 절단하고, 히그로마이신 내성 마커를 가진 CMV 구동형 포유류 발현 벡터 상의 BamHI 및 AflII 사이트에 삽입하였다. 이 벡터를 상기와 같이 증폭시켜 서열분석하였다. 클론 pST6#11 (도 3)이 서열번호 4에 따른 올바른 서열을 가지고 있었으며, 이를 형질전환용으로 선택하였다.

실시예 4 PER.C6 ^® 세포에서 pFSH α+β의 안정적인 발현. 형질전환주의 단리 및 클론 스크리닝.

하나의 플라스미드에서 FSH의 양쪽 폴리펩타이드 체인을 발현시킴으로써, FSH를 생산하는 PER.C6^® 클론을 제조하였다 (실시예 1).

안정적인 클론을 수득하기 위해, 리포좀계 형질전환제를 pFSH α+β 구조체와 함께 사용하였다. 10% FCS가 첨가되고 G418이 함유된 VPRO에서 안정적인 클론을 선별하였다. 형질전환 3주 후, G418 내성 클론이 배양되었다. 클론을 단리하기 위해 선별하였다. 단리된 클론을, 70-80% 컨플루언트가 될 때까지 선별 배지에서 배양하였다. 상층액에서, FSH 선택적인 ELISA를 사용해 FSH 단백질 함량을 측정하고, 클로닝한 세포주에서 FSH 수용체에 대한 약리학적 활성을 cAMP 축적 분석을 사용해 평가하였다. 기능적인 단백질을 발현하는 클론들을 대상으로 24웰, 6웰 및 T80 플라스크에서 배양 확대를 진행하였다.

클론 7주의 물질 생산성과 품질을 측정하기 위한 실험을 T80 플라스크에서 개시하여, 충분한 물질을 입수하였다. 7일간 전술한 첨가된 배지에서 세포를 배양하고, 상층액을 회수하였다. 생산성을 FSH 선택적인 ELISA로 측정하였다. 물질의 등전점 프로파일을 등전점 포커싱 (IEF)에 의해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 측정하였다. 생산성 및 품질이 우수한 클론들을 시알릴트랜스퍼라제 조작용으로 선별하였다.

실시예 5 시알산화의 수준은 α2,3- 시알릴트랜스퍼라제를 과다 발현하는 세포에서 증가된다. FSH를 발현하는 PER.C6 ^® 세포에서 안정적인 pST3 발현: 형질전환주의 단리 및 클론 스크리닝.

FSH의 양쪽 폴리펩타이드 체인을 이미 발현하고 있는 PER.C6^® 세포 (실시예 4)에 별개의 플라스미드로부터 α2,3 시알릴트랜스퍼라제를 발현 (실시예 2)시킴으로써, 시알산화된 FSH를 다량 생산하는 PER.C6^® 클론들을 제작하였다. 실시예 4에 언급된 PER.C6^® 세포로부터 제조된 클론들을, 생산성, 우수한 생장 프로파일, 기능성 단백질의 생산 및 일부 시알산화가 포함된 생산된 FSH 등의 특징 규명을 위해 선별하였다. 안정적인 클론들을 실시예 4에 언급된 바와 같이 제작하였다. 클론들을 단리, 증식 및 분석하였다. α2,3-시알릴트랜스퍼라제 클론들을 무혈청 배지 및 현탁 조건에 적응시켰다.

전술한 바와 같이, FSH 선택적인 ELISA, FSH 수용체 세포주에서의 기능적인 반응, IEF, 대사성 소거율 및 Steelman Pohley 분석을 이용해 클론들을 분석하였다. 결과를 시판 재조합 FSH (Gonal-f, Serono) 및 모세포 FSH PER.C6^® 세포와 비교하였다. 대부분의 클론들에 의해 생산된 FSH는 α2,3-시알릴트랜스퍼라제 없이 발현시킨 FSH와 비교해 현저하게 개선된 시알산화를 나타내었다 (시알산을 더 많이 가진 FSH 이소형이 평균적으로 더 많음). 결론적으로, PER.C6^® 세포에서 시알릴트랜스퍼라제와 함께 FSH를 발현시키면, FSH만 발현하는 세포에 비해 시알산화된 FSH의 수준이 증가되었다.

실시예 6 생산 및 정제에 대한 개괄

무혈청 배지에서 현탁 배양된 PER.C6^® 세포에서 FSH를 생산하기 위한 공정을 개발하였다. 이 공정은 아래에 기술하며, FSH를 생산하는 수종의 PER.C6^® 세포에 적용하였다.

α2,3- 클론에서의 FSH (실시예 5)는 Lowry et al. (1976)에 기술된 방법을 변형시킨 방법을 사용해 생산하였다.

PER.C6^®-FSH를 생산하기 위해, 세포주를 무혈청 배지, 즉 Excell 525 (JRH Biosciences)에 적응시켰다. 먼저, 세포를 T80 배양 플라스크에서 70-90% 컨플루언트 단일층을 형성하도록 배양하였다. 계대 배양으로, 세포를 무혈청 배지, Excell 525 + 4 mM L-글루타민에 세포 밀도 0.3 x 10⁶ 세포/ml로 다시 현탁하였다. 세포 현탁물 25 ml을 250 ml 셰이커 플라스크에 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 100 rpm으로 교반하였다. 세포 밀도가 > 1 x 10⁶ 세포/ml에 도달하면, 세포를 세포 밀도 0.2 또는 0.3 x 10⁶ 세포/ml로 서브-배양하였으며, 셰이커 플라스크에 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 100 rpm으로 교반하여 배양하였다.

FSH를 생산하기 위해, PER.C6^® 세포를 매우 높은 세포 밀도 (통상 배치 배양시 > 10⁷ 세포/ml)로 배양하는 무혈청 생산 배지, 즉, VPRO (JRH Biosciences)로 세포를 이동시켰다. 먼저, 세포를 Excell 525에서 > 1 x 10⁶ 세포/ml로 배양한 다음 1000 rpm에서 5분간 스핀 다운하고, VPRO 배지 + 6 mM L-글루타민에 세포 밀도 1 x 10⁶ 세포/ml로 현탁하였다. 그런 후, 세포를 셰이커 플라스크에서 37℃, 5% CO₂ 및 100 rpm 조건 하에 7-10일간 배양하였다. 이 기간 중에, 세포는 > 10⁷ 세포/ml의 밀도까지 증식하였다. 세포 생존성이 감소되기 시작하면 배양물 배지를 회수하였다. 세포를 1000 rpm으로 5분간 스핀 다운한 다음 상층액에 대해 FSH 정량 및 정제를 실시하였다. FSH 농도는 ELISA (DRG EIA 1288)를 사용해 측정하였다.

그런 후, Lowry et al. (1976)에 언급된 방법을 변형시켜 FSH를 정제하였다. 전하 선택적인 크로마토그래피를 이용한 정제를 수행하여, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 고도로 시알산화된 형태를 농축시켰다.

모든 크로마토그래피 공정에서, 본원에 청구된 FSH의 시알산화된 형태의 농축은 RIA (DRG EIA 1288) 및/또는 IEF에 의해 검증하였다.

실시예 7 α 2 ,3 및 α 2 ,6 시알산의 상대적인 양적 정량

정제된 rFSH (실시예 6)에서 α2,3 및 α2,6 시알산의 상대적인 함량 백분율을 공지 기법을 이용하여 측정하였다.

N-글리칸을 변성 조건 하에 PNGase F를 이용하여 샘플에서 해리시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 해리된 글리칸 형태들을 분리한 다음 약 음이온 교환 (WAX) 컬럼으로 분석하여 전하 분포를 확인하였다. 표지된 글리칸에 총 시알산을 결정하기 위해 2,3,6,8 시알리다제를, 2,3 시알산을 결정하기 위해 2,3 시알리다제를 처리하여, wax 컬럼으로 추가로 분석하였다.

하전된 글리칸의 상대적인 백분율을 비-절단 및 절단 처리된 글리칸 풀에 존재하는 구조체들로부터 계산하여, 도 4 (샘플 8종)에 나타내었다. α2,3 시알산화는 50% - 95% (예, 약 80% 또는 90%) 범위이고, α2,6 시알산화는 5% - 50%, 일반적으로 약 10 - 20% (예, 약 31% 또는 35%) 범위인 것으로 확인되었다.

실시예 8 - GONAL -F 대비 FE 999049 다중 투여 실험

하기는, 시험관내 수정 (IVF) / 세포질내 정자 주입 (ICSI)을 위한 과배란 유도를 시술 중인 환자를 대상으로 FE 999049의 투여량-반응 관계를 분석하는, 무작위, 대조 시험의, 분석자-맹검의, 병렬 군, 다국가, 다기관 실험을 기술한다. 환자 집단은 BMI가 18.5 - 32.0 kg/m²인 18-37세의 IVF 환자 265명으로 구성되었다.

실험은 1차 목표 (endpoint)로 회수되는 난모 세포 갯수를 이용한 투여량-반응 실험으로서 설계하였다. 2차 목표는, 엔도크린 프로파일, 난포 발달, 난모 세포 수정, 배아 품질 및 처리 효율 (즉, 총 고나도트로핀 소비 및 자극 지속 기간)에 대해, 여러가지 투여량의 FE 999049에 대한 정성적 및 정량적 효과를 조사하는 것이다. 실험은 IVF/ICSI 사이클 시 과배란 유도에 사용되었을 때, FE 999049의 임신 성공 효율을 평가하기 위해 설계된 것이다.

난소 반응과 관련된 실험 집단의 균질성을 높이고 실험에 사용되는 FE　999049 투여량 및 GONAL-F 투여량에 대한 잠재적인 미약 및 과도-반응자의 수를 최소화하기 위해, 항-뮐러 호르몬 (AMH) 평가 등의, 포함 및 배제 기준에 부합되는지를 무작위 추출하기 전 3달 동안 개체에서 조사하였다. AMH 평가는 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용하여 측정하였다. 이 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다.

월경 주기 2-3일째에, 개체를 90 IU, 120 IU, 150 IU, 180 IU 또는 210 IU FE 999049, 또는 150 IU GONAL-F 중 어느 한가지로 치료하는 것으로 1:1:1:1:1:1로 무작위 할당하고, 난소 자극을 개시하였다. 스크리닝시 무작위 할당을 AMH의 수준에 따라 계층화하였다 [5.0 - 14.9 pmol/L (AMH 저수준) 및 15.0 - 44.9 pmol/L (AMH 고수준)).

Gonal-F는 FDA 요청으로 중량 (FbM)으로 기입되며; 따라서 ㎍ 용량으로 기재하는 것이 적절하다. Gonal-F 라벨은 600 IU/44 ㎍으로 표시되어 있으며, 이는 150 IU이 11 ㎍이라는 의미이다. 그러나, 일부 편차가 있으며, 본 실험을 위한 배치 증명서 (batch certificate)에는 11.3 ㎍ Gonal-F가 150 IU에 해당되는 것으로 표시되어 있다. FE 999049 투여량은 생물 활성이 아닌 단백질 함량 (㎍)으로 표시된다. 즉, FE 999049 투여량은 5.2 ㎍ (90 IU), 6.9 ㎍ (120 IU), 8.6 ㎍ (150 IU), 10.3 ㎍ (180 IU) 또는 12.1 ㎍ (210 IU)이었다.

개체 및 투여량 배분은 다음과 같이 설정하였다 (데이타는 개체의 수임):

	FE 999049					GONAL-F	총
	5.2 ㎍	6.9 ㎍	8.6 ㎍	10.3 ㎍	12.1 ㎍	11.3(11) ㎍	총
스크리닝							334
무작위 할당 및 노출	42	45	44	45	46	43	265
AMH 고수준 계층 (15.0-44.9 pmol/L)	23	26	24	24	26	25	148 (56%)
AMH 저수준 계층 (5.0-14.9 pmol/L)	19	19	20	20	21	18	117 (44%)
Per-protocol	40	42	42	44	44	43	255

FE　999049 또는 GONAL-F의 일일 투여량 수준은 자극 실험 전체 기간 동안 고정된다. 자극 중에, 자극 1, 4 및 6일에, 그리고 이후 적어도 2일 마다 개체를 모니터링한다. ≥15 mm인 난포 3개가 관찰되면 매일 모니터링한다. 최대 16일간 개체에게 FE999049 또는 GONAL-F를 처리한다.

조기 LH 서지를 방지하기 위해, GnRH 길항제 (가니렐릭스 아세테이트, 오르가루트란 (ORGALUTRAN), MSD / 쉐링 푸라우 (Schering-Plough))를 매일 투여량 0.25 mg으로 자극 6일째에 투여 개시할 수 있으며, 자극 기간 동안 지속할 수 있다. 최종 난포 성숙화 촉발은, 직경이 ≥17 mm인 난포가 3개 이상 관찰되는 당일에 수행한다. 직경이 ≥12 mm인 난포가 <25개이면, 재조합 hCG (융모막성 고나도트로핀 α, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono)를 250 ㎍ 투여한다. 직경이 ≥12 mm인 난포가 25-35개이면, GnRH 작용제 (트립토렐린 아세테이트, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals)를 0.2 mg 투여한다. 직경이 ≥12 mm인 난포의 수 >35개로 정의되는 과도한 난소 반응이 발생한 경우, 치료를 중지한다. 자극 10일째 관찰되는 직경이 ≥10 mm인 난포의 수가 <3개인 것으로 정의되는, 미약한 난소 반응이 나타난 경우에는, 사이클을 취소할 수 있다.

최종 난포 성숙화의 촉발 후 36시간 (±　2h)째에 난모 세포를 채취하고, IVF 및/또는 ICSI로 난모 세포를 수정시킨다. 수정과 배아 발생을 난모 세포 채취시부터 이식 당일까지 평가한다. hCG를 이용한 최종 난포 성숙화 촉발을 시술받은 개체의 경우, 난모 세포 채취 5일째에, 이용가능한 최상의 품질을 가진 배반포 1개를 이식하고, 나머지 배반포들은 냉동시킨다. GnRH 작용제를 이용한 최종 난포 성숙화 촉발을 시술받은 개체의 경우에는, 배아 이식을 새로운 사이클 (fresh cycle)에서 수행하지 않고, 배반포들을 대신 5일째에 냉동시킨다. 난모 세포를 채취 당일부터 임상 임신을 위해 방문할 때까지 황체기 보조 요법을 위해, 질 프로게스테론 정제 (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg을 1일 3회로 제공한다. 수정란 이식 후 13-15일 동안 βhCG 검사를 수행하고, 수정란 이식 후 5-6주째에 질을 통한 초음파 검사 (TVU)로 임상적인 임신을 확인하게 될 것이다.

결과

아래 표에 채취된 난모 세포의 수 (1차 목표)를 나타낸다.

	FE 999049					GONAL-F
	5.2 ㎍	6.9 ㎍	8.6 ㎍	10.3 ㎍	12.1 ㎍	11.3 (11)㎍
채취한 난모 세포
전체	5.2 (3.3)	7.9 (5.9)	9.2 (4.6)	10.6 (7.0)	12.2 (5.9)	10.4 (5.2)
AMH 고수준	5.9 (3.9)	9.1 (6.4)	10.6 (4.8)	13.6 (7.8)	14.4 (5.8)	12.4 (5.4)
AMH 저수준	4.5 (2.2)	6.3 (4.9)	7.4 (3.8)	6.9 (3.6)	9.4 (4.9)	7.8 (3.4)

데이타는 평균 (SD)임.

1차 목표는 충족되었음: FE 99049는 채취한 난모 세포의 수에 대한 유의한 투여량-반응 상관성이 확립되었다. 이 결과는, 전체 실험 집단에서 관찰되었을 뿐만 아니라, 임의 추출에 사용된 2가지 AMH 계층 각각에서도 관찰되었다.

FE 999049의 유의한 투여량-반응은 모든 중요한 객관적인 약력학적 파라미터들, 예를 들어, 에스트라디올, 인히빈 B 및 인히빈 A에서 확인되었다. 비슷한 ㎍ 투여량 범위에서, FE 999049를 이용한 경우의 약력학적 반응이, GONAL-F를 이용한 경우보다 더 컸다 (이 결과는 도시 안함).

FE 9909049에 노출된 후 혈청내 FSH 농도는 GONAL-F의 경우 보다 유의하게 높았다. 이 결과는, FE 999049의 PK 프로파일이 GONAL-F의 결과와 다르다는 것을 검증해준다.

FE 999049로 치료받은 IVF/ICSI 환자에서 수정율, 배반포 발생 및 임신율은 예상한 범위내였다.

FE 999049의 사용과 관련된 안전성 문제는 발생하지 않았다. 양호한 국소 허용성 (local tolerability)이 확인되었다.

추가 분석

본 출원인은 채취된 난모 세포의 수와 관련하여 아래 기준에 부합되는 FE 999049의 투여량(들)을 동정하기 위해 데이타를 추가로 분석하였다:

- 회수되는 난모 세포의 수 8-14개

- 난모 세포가 <8개인 환자의 비율 최소화

- 난모 세포가 <4 또는 ≥20개인 환자의 비율 최소화

AMH 저수준 계층

표 2에 나타낸 바와 같이, 첫번째 기준 (채취된 난모 세포의 수가 8-14개임)에 부합되는 FE 999049의 투여량은 12.1 ㎍이었다 (채취된 평균 난모 세포 수 9.4개). 난모 세포의 분포는 아래 표 3에 나타낸다.

데이타는 개체의 %임.

박스 및 화살표로 나타낸 바와 같이, FE999049 용량 12.1 ㎍에서 AMH 저수준 그룹의 개체들 중 60%에서 가장 바람직한 수로 난모 세포가 회수된다. 이는 Gonal-F (개체들 중 33%에서만 가장 바람직한 수의 난모 세포가 회수됨)에 비해 개선되었음을 보여준다. 중등도 또는 중증 수준의 초기 OHSS 증상은 나타나지 않았으며, 예방적 조치는 필요없었으며, AMH 저수준 환자에서 FE999049 투여량 12.1 ㎍의 투여와 관련된 문제는 발생되지 않았다.

따라서, 본 출원인은, 인간 유래 재조합 FSH를 6 - 24 ㎍, 예를 들어, 9 - 14 ㎍, 예를 들어, 12 ㎍의 투여량으로 또는 이와 등가의 투여량으로, 혈청내 AMH가 <15 pmol/L, 예를 들어 0.05 - 14.9 pmol/L, 예를 들어 5.0 - 14.9 pmol/L인 환자에서 불임을 치료하는데 사용하기 적합하다는 것을 확인하였다. 이 투여량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공해준다.

예비 평가

예비 평가로서, 본 발명의 발명자들은 FE999049를 이용한 자극 후 난소 반응 및 치료 효과에 대한 FSH 수용체 다형성이 미치는 영향을 조사하였다.

실험에서 모든 환자들에서 추출된 게놈 DNA에 대해, 이탈리아 모데나 & 레기오 에밀라 대학에서, FSH-R의 29, 307 및 680번 위치에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)를 분석하였다. 도 4는 FSH 수용체를 도식적으로 나타낸 것으로, 엑손 10의 307 및 680번 아미노산 위치와 프로모터내 29번 위치에서의 다형성을 보여준다. 이러한 SNP FSH-R 조합들의 분포는 다음과 같다: 29번 AA 7%, AG 35% 및 GG 58%; 307번 Thr/Thr 29%, Ala/Thr 54% 및 Ala/Ala 17%; 680번 Asn/Asn 30%, Asn/Ser 53% 및 Ser/Ser 17%. 도 5는 실시예 8의 실험에서 FSH로 치료받은 환자 222명의 FSH 수용체 유전자에서 SNP 반수체형 분포를 나타낸 것이다. 각 위치에서의 분포와 전체 조합은 AMH 저수준 계층과 AMH 고수준 계층 간에 유의한 차이가 없었다.

임상 실험의 결과들을 추가로 분석하여, SNP가 치료 지속 기간과 필요한 총 투여량에 어떠한 영향이 있는 지를 조사하였다. 이는 AMH 저수준 그룹과 AMH 고수준 그룹에서 행하였다.

FSHR 다형성을 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 PCR (중합효소 연쇄 반응) 및 RELP (제한효소 절편 길이 다형성)로 평가하였다. 여성을 Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser 유전자형으로 분류하였다. 유전자 분석은 아래 개괄적인 프로토콜로 기술하였으며, 환자들을 특별한 사전동의에 사인하였다. 자극 1일에 다른 혈액 샘플의 일부로서 샘플을 취하였다. 이를 모데나 & 레기오 에밀라 대학에서 측정하였다.

FSH 수용체 유전자에서 SNP-분석을 위해 사용한 공정에 대한 개괄

일반 공정:

1. 게놈 DNA 추출 (Nucleon 게놈 DNA 추출 키트를 사용해 혈액으로부터, GE HEALTHCARE)

2. 나노드롭 (nanodrop)을 이용한 공정 수행.

HRM 공정:

고 해상도 멜팅 (HRM) 방법에 의한 SNP 유전자형 확인 (SsoFast EvaGreen Supermix cod enzyme. 172-5201, Bio-Rad; HSP-96 plates, cat. HSP9645, Bio-Rad; 및 CFX96 real-time thermal cycler Bio-Rad 이용)

서열분석 공정:

HRM 결과가 의심되는 경우, (동일 샘플에 대해 2번의 독립적인 HRM을 수행한 후), 아래 서열분석 공정을 수행하였다:

1. PCR 반응 및 증폭.

2. PCR 산물 정제.

3. 정제된 PCR 정량.

4. 서열 반응 프로토콜.

5. 서열 산물 정제.

6. ABI PRISM 3130 장치에 의한 모세관 전기영동.

7. ABI PRISM 3100을 이용한 모세관 전기영동을 통해 수득한 결과 평가 및 검증.

결과

도 7은, 전체 분석 세트에 대한, 680번 위치에 구분되는 3종의 FSH 수용체 유전자형, Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser 각각에서, AMH가 < 15 pmol/L인 환자/개체에게 전달되는, 투여량 적정된, 고나도트로핀 (FSH)의 예상되는 치료 지속 기간 (일)을 나타낸, 결과 표이다.

도 7은, AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Ser을 가진 환자의 경우 예상되는 필수 치료 지속 기간의 평균은 9.59일이며, 이는 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Asn/Asn을 가진 환자의 필수 자극 기간 (8.13일) 보다 약 1.5일 길고, AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Asn을 가진 환자의 필수 자극 기간 (8.26일) 보다 약 1.3일 길다는 것을 보여준다.

전술한 바와 같이, (임신 및/또는 출산 측면에서) 성공은, 환자가 이상적인 치료 기간 중에 적절한 반응 (예상되는 난소의 다발성 난포 발달, 순환성 17-β-에스트라디올 상승)을 나타낸 경우, 성공할 가능성이 더 높다. 반응이 이러한 치료 기간의 중간 시기에 있다면, 즉, 기간에서 너무 이르지도 너무 늦지도 않은 시기에 나타났다면, 더 높아진다. AMH 수준이 낮고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서 (투여량을 12 ㎍ 보다 높임으로써) 치료 기간의 단축은 치료 기간의 중간 시점쪽으로 반응을 이동시킬 수 있으며, 성공 가능성을 높인다.

즉, 치료 전에 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에 대한 투여량 맞춤 조절이 가능해질 수 있다. 치료 전에 Ser/Ser을 가진 환자가 동정되면, Ser/Asn 및 Asn/Asn을 가진 환자와 비교해, 이들 환자에서 개시 투여량을 높일 수 있다.

전술한 바와 같이, FE999049 투여량 12.1 ㎍시, AMH 저수준 그룹의 개체들 중 60%에서 가장 바람직한 난모 세포 수가 채취되었다 (표 3). 표 3에 나타낸 AMH 저수준 그룹에는 변이체 Ser/Ser을 가진 환자 뿐만 아니라 Ser/Asn 및 Asn/Asn을 가진 환자도 포함되었다. AMH 수준이 낮고 [AMH 수준 < 15 pmol/L, (예, 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L, 예를 들어 5.0 pmol/L 내지 14.9 pmol/L)] FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에게, FSH를 높은 개시 투여량 (예, 인간 유래 재조합 FSH 9 - 24 ㎍, 예를 들어 >12 - 24 ㎍, 예컨대 12.33 ㎍ - 13 ㎍)으로 투여하면, (임신 및/또는 출산 측면에서) 성공 가능성 증가와 양호한 성공 예측력을 제공할 수 있다.

도 7은, AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Asn/Asn을 가진 환자의 경우 자극을 위해 필요한 평균 치료 지속 기간이 8.13일이고, AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Asn인 환자의 경우 자극에 필요한 기간이 8.26일로서, 이는 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Ser을 가진 환자의 해당 치료 지속 기간 (9.59일) 보다 약 1.5 - 1.3일 짧다는 것을 보여준다. 즉, 치료 전에 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 변이체 Ser/Asn 및 Asn/Asn을 가진 환자를 동정하면, 이러한 환자에 대한 개시 투여량을 FE 999049 12 ㎍ 이하로, 예를 들어 10 - 12 ㎍으로 줄이거나 또는 치료 지속 기간을 단축시킬 수 있으면서도, 여전히 난포 발달 측면에서는 양호한 반응성을 제공해 줄 수 있다. 이는, 약제의 비용 측면에서 유익할 수 있으며, 또한 이들 환자에서 효능을 위해 필요한 투여량 보다 높은 투여량의 투여와 관련된 위험성 저하 측면에서 유익할 수 있다.

도 6은, 전체 분석 세트에 대한, 680번 위치에 구분되는 3종의 FSH 수용체 유전자형, Asn/Asn, Asn/Ser 및 Ser/Ser 각각에서의, AMH가 < 15 pmol/L인 환자/개체에게 전달되는, 고나도트로핀 (FSH) 총 투여량 (㎍) 및 관찰되는 고나도트로핀 (FSH) 치료 지속 기간 (일)을 나타낸, 결과 표이다. 이는 도 7에서 확인된 효능을 검증해준다.

이 결과에서, AMH 고수준 개체에서의 SNP 관련 효과는 나타나지 않았다.

이는, 특정 AMH 수준과 FSHR에 특정 다형성을 가진 것으로 동정된 특정 환자들에서 FSH 투여량을 맞춤 조절할 수 있게 해준다.

실시예 9 - 개별 맞춤형 COS 프로토콜 ( AMH 저수준)

선정된 환자들은 시험관내 수정 (IVF)/세포질내 정자 주입 (ICSI)을 위해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 COS를 시술받을 예정이다. 전-처리 프로토콜은 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용한 환자의 혈청내 AMH 평가/스크리닝을 포함한다. 이 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 이의 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다. AMH는 다른 분석 키트를 사용해 측정할 수 있다 (예, Roche). 전-처리 프로토콜은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 게놈 DNA를 추출한 다음 FSH 수용체의 680번 위치에서 대립유전자 변이체의 동정을 포함한다 (예, Gromoll et al, Methods, 21, 83-97 (2000), Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, No. 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005) 및 이의 참조문헌에 언급된 바와 같이, 혈액에서 게놈 DNA를 추출하기 위한 키트를 사용한 다음 DNA 서열분석에 의해, 또는 Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, No. 4, April 2006에 언급된 바와 같은 PCR 및 RFLP 방법에 의해).

COS 프로토콜은 스크리닝시 AMH 수준에 따라 FE 999049의 초기 투여량의 투여를 제외하고는 통상적인 방식으로 진행한다. AMH 수준이 <15 pmol/L이고 변이체 Ser/Asn 또는 Asn/Asn을 가진 환자에게는, 실시예 6의 방법에 따라 제조된 인간 유래 재조합 FSH인 FE 999049 약 12 ㎍, 또는 <12 ㎍ FE 999049, 예를 들어, 인간 유래 재조합 FSH 10 - 12 ㎍, 예컨대 11.33 ㎍ 또는 11.67 ㎍을 일일 초기 투여량으로 투여하게 된다. AMH 수준이 <15 pmol/L이고 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에게는 인간 유래 재조합 FSH >12 ㎍ (예, 12.33 내지 24 ㎍, 또는 13 - 24 ㎍)을 일일 고 투여량으로 투여하게 된다.

서열번호 1

난포 자극 호르몬 α 폴리펩타이드

등록번호 AH007338

FSH α의 뉴클레오티드 서열

FSH α의 단백질 서열 (서열번호 5)

서열번호 2

난포 자극 호르몬 β 폴리펩타이드

등록번호 NM_000510

FSH β의 뉴클레오티드 서열

FSH β의 단백질 서열 (서열번호 6)

서열번호 3

β-갈락토시드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 4

등록번호 L23767

ST3GAL4의 뉴클레오티드 서열

ST3GAL4의 단백질 서열 (서열번호 7)

서열번호 4

β-갈락토사미드 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1

등록번호 NM_003032

ST6GAL1의 뉴클레오티드 서열

0p-

ST6GAL1의 단백질 서열 (서열번호 8)

SEQUENCE LISTING <110> Ferring BV <120> Composition For Treatment of Infertility <130> P/72834.EP01 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60 gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120 ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180 tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240 tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300 gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351 <210> 2 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc 60 tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120 atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 180 gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatatga aacagtgaga 240 gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt 300 cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 360 tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa 390 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtgtcctg caggctggaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctggt cgtcatggtg 60 tggtattcca tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120 aagaaggagc cgtgcctcca gggtgaggca gagagcaagg cctctaagct ctttggcaac 180 tactcccggg atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240 tctgcttacg agctgcccta tgggaccaag gggagtgagg atctgctcct ccgggtgcta 300 gccatcacca gctcctccat ccccaagaac atccagagcc tcaggtgccg ccgctgtgtg 360 gtcgtgggga acgggcaccg gctgcggaac agctcactgg gagatgccat caacaagtac 420 gatgtggtca tcagattgaa caatgcccca gtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480 aagaccacca tgcgtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa agtagaaaac 540 aacccagaca cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600 accatcctga gtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660 tgggatgtca atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgcagct 720 gacaaactgc tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780 ggcctgttgg ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tggtgcacat tgccggcttt 840 ggctacccag acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagca gatcacgctc 900 aagtccatgg cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960 ctggagatgg gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999 <210> 4 <211> 1221 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgattcaca ccaacctgaa gaaaaagttc agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt 60 gcagtcatct gtgtgtggaa ggaaaagaag aaagggagtt actatgattc ctttaaattg 120 caaaccaagg aattccaggt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc 180 cagtctgtat cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt 240 ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc 300 tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagatctgga agaattacct aagcatgaac 360 aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420 cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480 aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc aaggagagca ttaggaccaa ggctgggcct 540 tggggcaggt gtgctgttgt gtcgtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600 gaaatcgatg atcatgacgc agtcctgagg tttaatgggg cacccacagc caacttccaa 660 caagatgtgg gcacaaaaac taccattcgc ctgatgaact ctcagttggt taccacagag 720 aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg ggacccatct 780 gtataccact cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840 tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900 ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960 ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020 tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gacgtgtgct actactacca gaagttcttc 1080 gatagtgcct gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140 catctcaacc agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200 ttccggacca ttcactgcta a 1221 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 6 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile Glu 20 25 30 Leu Phe Tyr Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly 35 40 45 Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp 50 55 60 Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro 65 70 75 80 Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln 100 105 110 Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu 115 120 125 Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile 130 135 140 Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro 165 170 175 Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys 180 185 190 Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg 195 200 205 Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn 210 215 220 Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala 225 230 235 240 Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln 245 250 255 Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys 260 265 270 Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys 275 280 285 Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala 290 295 300 Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met 305 310 315 320 Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 330 <210> 8 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu 35 40 45 Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser 65 70 75 80 Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp 85 90 95 Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile 100 105 110 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly 115 120 125 Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu 130 135 140 Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe 145 150 155 160 Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr 165 170 175 Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val 195 200 205 Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly 210 215 220 Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu 225 230 235 240 Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val 245 250 255 Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn 260 265 270 Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His 275 280 285 Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu 290 295 300 Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro 305 310 315 320 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp 325 330 335 Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val 340 345 350 Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365 Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln 370 375 380 Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400 Phe Arg Thr Ile His Cys 405 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHa-fw <400> 9 ccaggatccg ccaccatgga ttactacaga aaaatatgc 39 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHa-rev <400> 10 ggatggctag cttaagattt gtgataataa c 31 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHb-fw <400> 11 ccaggcgcgc caccatgaag acactccagt ttttc 35 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHb-rev <400> 12 ccgggttaac ttattattct ttcatttcac caaagg 36 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,3STfw <400> 13 ccaggatccg ccaccatgtg tcctgcaggc tggaagc 37 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,3STrev <400> 14 tttttttctt aagtcagaag gacgtgaggt tcttg 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,6STfw <400> 15 ccaggatccg ccaccatgat tcacaccaac ctgaag 36 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,6STrev <400> 16 tttttttctt aagttagcag tgaatggtcc gg 32

Claims

불임 치료용 조성물로서,
난포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone, FSH) 9 - 24 ㎍을 포함하며,
상기 조성물이 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 일일 투여 (daily administration)하기 위한 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물이 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가지며 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L인 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가지며 혈청내 AMH 수준이 0.05 pmol/L 내지 14.9 pmol/L인 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 불임 치료가 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 (동정된) 환자에게 FSH를 투여하는 단계를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 불임 치료가 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 (동정된) 환자에게 FSH를 투여하는 단계를 포함하는, 조성물.
조성물로서,
난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며,
혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서의 불임 치료용이며,
상기 조성물은 1일 당 재조합 FSH를 9 내지 24 ㎍의 투여량 또는 이와 등가의 투여량으로 투여되며,
상기 불임 치료가 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계; 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 조성물.
제7항에 있어서,
혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 환자에서 불임을 치료하기 위한 것인, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서,
FSH를 12 ㎍ 보다 높은 함량 내지 24 ㎍으로 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서,
상기 조성물이 치료 첫날부터 시작하여 6일 내지 16일간 지속되는 FSH의 투여를 위한 것인, 조성물.
불임 치료용 조성물로서,
상기 조성물은 난포 자극 호르몬 (FSH)을 12 ㎍ 보다 높은 함량 내지 24 ㎍으로 포함하며,
상기 조성물이, 치료 전에 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가지고 있으며 치료 전에 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L인 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
불임 치료용 조성물로서,
상기 조성물은 난포 자극 호르몬 (FSH)을 10 내지 12 ㎍ 포함하며,
상기 조성물이, (치료 전에) FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
불임 치료용 조성물로서,
상기 조성물은 난포 자극 호르몬 (FSH)을 10 내지 12 ㎍ 포함하며,
상기 조성물이, 치료 전에 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가지고 있으며 치료 전에 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L인 것으로 동정된 환자에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 FSH가 재조합 FSH인, 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서,
상기 FSH가 α2,3-시알산화 (α2,3-sialylation) 및 α2,6-시알산화를 포함하는 재조합 FSH인, 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 재조합 FSH가 α2,3-시알산화와 α2,6-시알산화를 포함하며,
전체 시알산화의 1 내지 99%가 α2,6-시알산화이고, 전체 시알산화의 99% 내지 1%가 α2,3-시알산화인, 조성물.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 FSH가 α2,3-시알산화와 α2,6-시알산화를 포함하며,
전체 시알산화의 1 내지 50%가 α2,6-시알산화이고, 전체 시알산화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알산화인, 조성물.
불임 치료 방법으로서,
(a) 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계;
(b) 상기 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및
(c) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Ser/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에게, 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 1일 당 9 내지 24 ㎍의 투여량 또는 이와 등가의 투여량을 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법.
불임 치료 방법으로서,
(a) 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계;
(b) 상기 환자의 FSH 수용체의 680번 위치에서 변이체를 동정하는 단계; 및
(c) 혈청내 AMH 수준이 < 15 pmol/L이고 FSH 수용체의 680번 위치에 변이체 Asn/Asn 또는 변이체 Asn/Ser을 가진 것으로 동정된 환자에게, 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 1일 당 10 내지 12 ㎍의 투여량 또는 이와 등가의 투여량을 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법.