ES2879838T3 - Composición que comprende FSH para el tratamiento de la esterilidad - Google Patents

Abstract

Una composición para uso en el tratamiento de la esterilidad, comprendiendo la composición 9 a 24 μg de hormona estimulante del folículo (FSH), en donde la composición es para administración a un paciente identificado como que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende FSH para el tratamiento de la esterilidad

La presente invención se refiere a composiciones y a productos farmacéuticos para el tratamiento de la esterilidad.

Las técnicas de tecnología de reproducción asistida (ART), tales como la fecundación in vitro (IVF), son bien conocidas. Estas técnicas de ART requieren generalmente una etapa de estimulación ovárica controlada (COS), en la que se estimula una cohorte de folículos hasta la madurez completa. Los regímenes estándares de COS incluyen la administración de gonadotropinas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH) sola o en combinación con la actividad de la hormona luteinizante (LH) para estimular el desarrollo folicular, normalmente con la administración de un análogo de GnRH antes y/o durante la estimulación para prevenir una escalada prematura de la LH. Las composiciones farmacéuticas generalmente utilizadas para la COS incluyen hormona estimulante del folículo recombinante (rFSH), FSH derivada de la orina, preparaciones de FSH LH recombinante, menotropina derivada de la orina [gonadotropina menopáusica humana (hMG)] y gonadotropina menopáusica humana altamente purificada (HP-hMG). La IVF puede asociarse con un riesgo de síndrome de hiperestimulación ovárica (OHSS), que puede ser mortal en casos graves.

Como se indicó arriba, los protocolos COS estándares implican generalmente la administración de FSH. La dosis de FSH depende generalmente de un cierto número de factores, incluyendo la edad, cualquier respuesta previa a la estimulación de la FSH, el nivel basal de la FSH, el recuento de folículos antrales y, más recientemente, la hormona antimülleriana (AMH). El médico esperará un desarrollo multifolicular ovárico en respuesta a una dosis dada, junto con un aumento del 17-p-estradiol circulante.

Si la respuesta (desarrollo multifolicular ovárico, aumento del 17-p-estradiol circulante) a una dosis dada es adecuada o, como era de esperar, esto indica una función ovárica normal, a lo que también se alude como reserva ovárica normal. Los pacientes que no responden bien a la estimulación con la FSH producen pocos folículos y, en consecuencia, sus niveles de 17-p-estradiol durante la estimulación aumentan lentamente y alcanzan niveles comparativamente bajos. Estos pacientes se denominan "respondedores bajos" y se puede decir que tienen una reserva ovárica disminuida. Se cree que varios factores están implicados en la respuesta baja, incluido el aumento de la edad, las adherencias pélvicas, la enfermedad ovárica y factores inmunológicos.

La capacidad de predecir el potencial de respuesta de las mujeres a la estimulación ovárica controlada (COS) puede permitir el desarrollo de protocolos de COS individualizados. Esto podría, por ejemplo, reducir el riesgo del OHSS en mujeres que se predice que tendrán una respuesta excesiva a la estimulación, mejorar los resultados del embarazo en mujeres clasificadas como respondedores deficientes y/o conducir a una dosis reducida de (y exposición a) la FSH y, por lo tanto, un costo reducido. de la terapia (y seguridad incrementada de la terapia) en pacientes específicos.

La concentración sérica de hormona antimülleriana (AMH) se ha establecido ahora como un marcador fiable de reserva ovárica. La disminución de los niveles de AMH se correlaciona con la reducción de la respuesta ovárica a las gonadotropinas durante la COS. Además, los niveles altos de AMH son un buen predictor de una respuesta ovárica excesiva y un indicador de riesgo del OHSS.

En un estudio preliminar de mujeres menores de 35 años sometidas a ART, se utilizó el algoritmo de dosificación CONSORT (que incorpora FSH basal, IMC, edad y AFC) para predecir la dosis inicial óptima de FSH para COS en mujeres con riesgo de desarrollar el OHSS (Olivennes et. al., 2009). La individualización de la dosis dio lugar a una producción adecuada de oocitos y una buena tasa de embarazo. Sin embargo, hubo altas tasas de cancelaciones en el grupo de dosis baja (75 UI de FSH) debido a una respuesta inadecuada, y el OHSS ocurrió en una proporción significativa de los pacientes.

Como se indicó arriba, los protocolos COS estándares pueden incluir la administración de FSH. La FSH es secretada de forma natural por la glándula pituitaria anterior y funciona sustentando el desarrollo folicular y la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glicoproteicas LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos exclusiva de la FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada una de las subunidades se modifica pos-traducción mediante la adición de residuos de hidratos de carbono complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para la unión de glicano enlazado a N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los residuos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por lo tanto, la FSH se glicosila hasta aproximadamente un 30% en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).

La FSH purificada de orina humana pos-menopáusica se ha utilizado durante muchos años en el tratamiento de la esterilidad; tanto para fomentar la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar oocitos para tecnologías de reproducción asistida. Los productos de FSH recombinante (rFSH) actualmente aprobados para la estimulación ovárica, tales como la folitropina alfa (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) y la folitropina beta (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough), se derivan de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Actualmente, no se encuentran disponibles comercialmente productos de rFSH de una línea celular humana.

Existe una heterogeneidad considerable asociada con las preparaciones de FSH que se relaciona con las diferencias en las cantidades de diversas isoformas presentes. Las isoformas de FSH individuales exhiben secuencias de aminoácidos idénticas, pero difieren en el grado en que se modifican pos-traducción; isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras ramificadas de los hidratos de carbono y diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), las cuales parecen influir en la bioactividad de la isoforma específica.

La glicosilación de FSH natural es muy compleja. Los glicanos en la FSH pituitaria derivados de forma natural pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glucanos mono-, bi-, tri- y tetraantenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987 Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, bisección de glucosamina, cadenas extendidas con acetil lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces a2,3 y a2,6 y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, existen diferencias entre las distribuciones de las estructuras de glicanos en los sitios de glicosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos en la FSH derivada del suero de individuos y de la orina de mujeres pos-menopáusicas (Wide et al., 2007).

La glicosilación de los productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosiltransferasas presentes en la línea de células huésped. Los productos rFSH disponibles comercialmente se derivan de células de ovario de hámster chino (células CHO) manipuladas. La gama de modificaciones de glicanos en rFSH derivada de células CHO es más limitada que las que se encuentran en los productos naturales. Ejemplos de la heterogeneidad reducida de glicanos encontrada en rFSH derivada de células CHO incluyen una ausencia de glucosamina bisectante y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil lactosamina (Hard et.al., 1990). Además, las células CHO solo son capaces de añadir ácido siálico utilizando el enlace a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); la rFSH derivada de células CHO solo incluye ácido siálico enlazado a a2,3 y no incluye ácido siálico enlazado a a2,6.

Por lo tanto, la FSH derivada de células CHO es diferente de la FSH producida de forma natural (p. ej. FSH pituitaria/sérica/urinaria humana) que contiene glicanos con una mezcla de ácido siálico enlazado a a2,3 y a2,6, con predominio de la primera. Por lo tanto, las proteínas recombinantes expresadas utilizando el sistema CHO diferirán de sus contrapartes naturales en su tipo de enlaces terminales de ácido siálico. Esta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico, ya que los restos de hidratos de carbono pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula.

La presente solicitante ha desarrollado una FSH recombinante de origen humano que es el objeto de la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/GB2009/000978, publicada como WO2009/127826A. Se preparó FSH recombinante con una mezcla tanto de ácido siálico enlazado a a2,3 como a a2,6 manipulando una línea celular humana para expresar tanto rFSH como a2,3 sialiltransferasa. El producto expresado es muy ácido y porta una mezcla de ácidos siálicos con enlaces tanto a2,3 como a2,6; la última proporcionada por la actividad sialiltransferasa endógena. Se encontró que el tipo de enlace de ácido siálico, a2,3- o a2,6-, puede tener una influencia drástica en el aclaramiento biológico de FSH. La FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico enlazado tanto a a2,3 como a a2,6 tiene dos ventajas frente a la rFSH expresada en células CHO convencionales: primero, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y, en segundo lugar, el material se parece más a la FSH natural. Es probable que esto sea más apropiado biológicamente en comparación con los productos recombinantes derivados de células CHO que han producido solo ácido siálico enlazado a a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y han disminuido el contenido de ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).

Recientemente, se ha sugerido que el receptor de la hormona estimulante del folículo o receptor de FSH (FSHR) puede estar relacionado o implicado en la reserva ovárica disminuida. El receptor de FSH es un receptor transmembrana que interactúa con FSH. El receptor de FSH es un receptor 7-transmembrana acoplado a proteína G enlazado a adenilato ciclasa, con un gran dominio de unión al ligando N-terminal y una cola citoplasmática C-terminal rica en residuos de serina y treonina como sitios de fosforilación putativos. Su activación es necesaria para el funcionamiento hormonal de la FSH. Se ha postulado que las mutaciones en el receptor de FSH podrían conducir a una reserva ovárica disminuida. Además de las mutaciones, se encuentran variantes del receptor de FSH (polimorfismos del receptor de FSH). Dos de estos polimorfismos se encuentran en la posición 307 (Ala/Thr) y la posición 680 (Asn/Ser) en el exón 10 del receptor de FSH (Figura 4). Estos son la variante Ala o Thr en la posición 307 y Asn o Ser en la posición 680. Estos polimorfismos conducen a tres genotipos distintos del receptor de FSH con respecto a la posición 680: Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser [véase Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, N° 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005), y Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, N° 4, (abril de 2006)].

La presente solicitante ha encontrado que los pacientes identificados con AMH baja [nivel de AMH <15 pmol/L, que generalmente se asociarían con una respuesta baja], además de tener la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH, tienen una mayor duración del tratamiento con FSH, en comparación con pacientes con AMH baja y variante Asn/Asn o variante Asn/Ser en la posición 680 del receptor de FSH. Un aumento de la dosis inicial de FSH para pacientes que tienen una AMH baja [nivel de AMH < 15 pmol/L, (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L, p. ej., 5,0 pmol/L a 14,9 pmol/L)], además de tener la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH, puede ser, por lo tanto, una alternativa para evitar la duración más prolongada del tratamiento con FSH. Esto permite adaptar la dosis de FSH en pacientes específicos identificados con un nivel específico de AMH, así como un polimorfismo específico en el FSHR.

La administración de una dosis inicial más alta de FSH a pacientes con AMH baja [nivel de AMH < 15 pmol/L, (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L, p. ej. 5,0 pmol/L a 14,9 pmol/L)], así como tener la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH, es ventajoso porque puede proporcionar una probabilidad incrementada de éxito (en términos de embarazo y/o nacimiento vivo) y una mejor previsibilidad del éxito. El éxito es más probable si la paciente tiene una respuesta adecuada (desarrollo multifolicular ovárico esperado, aumento del 17-p-estradiol circulante) que se produce dentro de una ventana de tratamiento ideal. El éxito se potencia adicionalmente si la respuesta está dentro del centro de esta ventana de tratamiento; es decir, ni demasiado temprano en la ventana ni demasiado tarde. La reducción de la duración del tratamiento en pacientes que tienen baja AMH y variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH (aumentando la dosis por encima de 12 pg) puede llevar la respuesta hacia el centro de la ventana de tratamiento, con mayor probabilidad de éxito.

De acuerdo con la presente invención, en un primer aspecto, se proporciona una composición (p. ej., una composición farmacéutica) para uso en el tratamiento de la esterilidad, comprendiendo la composición 9 a 24 pg de hormona estimulante del folículo (FSH), en donde la composición es para administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH (antes del tratamiento). La composición puede ser para la administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p.ej., seleccionado como) que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH e identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/,L a 14,9 pmol/L) (antes del tratamiento). La composición puede comprender de 9 a 24 pg de FSH, por ejemplo, de 10 a 18 pg de FSH, por ejemplo, de 12 a 16 pg de FSH, por ejemplo, de 12 a 15 pg de FSH. La composición puede comprender > 12 pg de FSH, por ejemplo, de 12,3 a 24 pg de FSH, por ejemplo, de 12,33 a 24 pg de FSH, por ejemplo, de 12,67 a 24 pg de FSH, por ejemplo, de 13 a 24 pg de FSH, por ejemplo, de 13 a 16 pg de FSH, para ejemplo de 13 a 15 pg de FSH.

La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede comprender una dosis diaria o una dosis diaria equivalente a las cantidades de rFSH derivada de seres humanos arriba definidas, en esta memoria. y en las reivindicaciones. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para la administración (diaria) de FSH comenzando el día uno del tratamiento y continuando durante seis a dieciséis días, por ejemplo, siete a dieciséis días, por ejemplo, 8 a 16 días, por ejemplo, 8 a 13 días. El tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de identificar (p. ej., determinar, p. ej., medir) la variante en la posición 680 del receptor de FSH del paciente; y una etapa de administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH. El tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de identificar (p. ej. determinar, p. ej. medir) el nivel de AMH en suero del paciente y administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene un nivel de AMH en suero de < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L).

La FSH puede ser FSH recombinante. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 1 al 99% de la sialilación total es sialilación a2,6 y del 99% al 1 % de la sialilación total es sialilación a2,3. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 1 al 50% de la sialilación total es sialilación a2,6 y del 50% al 99% de la sialilación total es sialilación a2,3. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 5 al 40% de la sialilación total es sialilación en a2,6 y del 60% al 95% de la sialilación total es sialilación en a2,3. Preferiblemente, la FSH es una FSH recombinante derivada de una línea celular humana.

La composición (p. ej., una composición farmacéutica) puede ser para uso en el tratamiento de la esterilidad en un paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., de 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L) y que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH [en donde el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de identificar (p. ej., determinar) el nivel de AMH en suero del paciente; una etapa de identificar la variante en la posición 680 del receptor de FSH del paciente; y una etapa de administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L) y la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH].

La FSH puede ser FSH recombinante. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 1 al 99% de la sialilación total es sialilación wn a2,6 y del 99% al 1% de la sialilación total es sialilación en a2,3. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 1 al 50% de la sialilación total es sialilación en a2,6 y del 50% al 99% de la sialilación total es sialilación en a2,3. La FSH puede ser FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6, en donde del 5 al 40% de la sialilación total es sialilación en a2,6 y del 60% al 95% de la sialilación total es sialilación en a2,3. Preferiblemente, la FSH es una FSH recombinante derivada de una línea celular humana.

La dosis proporciona una respuesta eficaz al tiempo que minimiza el riesgo de OHSS.

Las dosis anteriores pueden ser para el tratamiento de la esterilidad en el primer protocolo de estimulación del paciente (sujeto). Se apreciará que, para ciclos de estimulación adicionales, las dosis se pueden ajustar de acuerdo con la respuesta ovárica real en el primer ciclo.

La rFSH puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.

La solicitante ha ideado protocolos COS "individualizados", en los que se utilizan dosis específicas de FSH recombinante para tratar a pacientes en función de sus niveles específicos de AMH y polimorfismo de nucleótido único de FSHR, aumentando con ello la probabilidad de una respuesta adecuada a la estimulación (p. ej., en pacientes que tienen un potencial de respuesta bajo) y/o un riesgo disminuido de OHSS u otros efectos secundarios.

El nivel sérico de AMH puede determinarse (p.ej., medirse) mediante cualquier método conocido en la técnica. Como un ejemplo, el nivel de AMH en suero se mide utilizando el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas AMH Gen-II, un kit (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/L con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/L. Pueden utilizarse otros ensayos. En esta memoria, los valores de AMH en suero se reseñan generalmente en términos de pmol/L. Esto se puede convertir a ng/mL utilizando la ecuación de conversión 1 ng/ml de AMH = 7,1 pmol/L de AMH.

Por lo tanto, la composición puede ser para la administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., de 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L) cuando se mide utilizando un ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas Gen-II de Beckmann-Coulter o un nivel de AMH comparable medido por un método diferente.

En esta memoria, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente.

La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede comprender una dosis diaria de o una dosis diaria equivalente a las cantidades de rFSH derivada de seres humanos arriba definidas, en esta memoria. y en las reivindicaciones. La dosis (diaria) puede ser una dosis inicial (es decir, puede reducirse, aumentarse o mantenerse durante el tratamiento).

El paciente identificado con la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH puede identificarse por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la identificación de la variante alélica en la posición 680 del receptor de FSH después de la extracción de ADN genómico mediante métodos bien conocido en la técnica [p. ej., por medio de un kit para la extracción de ADN genómico de la sangre, y posterior secuenciación del ADN, tal como se describe, p. ej., en Gromoll et al, Methods, 21, 83-97 (2000), Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, N° 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005), y referencias en el mismo, o extracción de ADN seguida de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP, seguida de electroforesis en gel, etc.), o mediante un método de PCR y RFLP, tal como el recogido en Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, N° 4, abril de 2006)]. Por lo tanto, la composición puede ser para la administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH cuando se mide mediante extracción de ADN genómico (p. ej., de sangre) y análisis posterior por métodos de PCR y RFLP tales como los recogidos en Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, N°4, abril de 2006 o método comparable.

La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para la administración (diaria) de FSH comenzando el día uno del tratamiento y continuando durante seis a dieciséis días, por ejemplo, siete a dieciséis días, por ejemplo, 8 a 16 días, por ejemplo, 8 a 13 días. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para la administración durante 12 a 16, p. ej., de 13 a 15, p. ej., 14 días después de la administración de (p. ej., después del inicio de la administración de, p. ej., después del inicio de la administración diaria de) un agonista de GnRH (p. ej., Synarel, Lupron, Decapeptyl). La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para administración con un agonista de GnRH. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para administración antes de la administración de un antagonista de GnRH (p. ej., ganirelix, cetrorelix), por ejemplo, para administración cinco o seis días antes de la administración de un antagonista de GnRH. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para administración con un antagonista de GnRH. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para administración con un antagonista de GnRH (p. ej., ganirelix, cetrorelix) administrado (p. ej., diariamente) desde el día seis de tratamiento. Preferiblemente, la composición (por ejemplo, composición farmacéutica) es para la administración antes de la administración de una dosis alta (ovulatoria) de hCG (por ejemplo, de 4.000 a 11.000 UI de hCG , p. ej., 5.000 UI de hCG , 10.000 UI de hCG, etc ; o de 150 a 350 microgramos de hCG recombinante, por ejemplo, 250 microgramos de hCG recombinante) para inducir la maduración folicular final.

Se apreciará que la composición puede ser para la dosificación a frecuencias más (o menos) que diarias, en cuyo caso las dosis relevantes serán equivalentes a las dosis (diarias) especificadas en esta memoria.

En esta memoria, la expresión "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad mediante estimulación ovárica controlada (COS) o métodos que incluyen una etapa o fase de estimulación ovárica controlada (COS), por ejemplo, inseminación intrauterina (IIU), fecundación in vitro (IVF) o inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La expresión "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad por inducción de la ovulación (OI) o por métodos que incluyen una etapa o fase de inducción de la ovulación (OI). La expresión "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene esterilidad tubárica o inexplicable, incluido el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo, endometriosis de fase I o fase II, y/o en un sujeto que tiene esterilidad anovulatoria, por ejemplo, esterilidad anovulatoria tipo II de la OMS, y/o en un sujeto con una pareja con esterilidad por factor masculino. La composición puede ser para (uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene endometriosis, por ejemplo, en un sujeto que tiene endometriosis en fase I o en fase II, según lo define el sistema de clasificación de The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) paras diversas fases de la endometriosis (fase IV más grave; fase I menos grave) [[American Society for Reproductive Medicine Clasificación revisada de la endometriosis de [American Society for Reproductive Medicine: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817 821.].

La composición puede ser para (uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene un nivel normal de FSH en suero de 1 a 16 UI/L, por ejemplo, de 1 a 12 UI/L, en la fase folicular inicial.

La composición puede ser para (uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto identificado como de 18 a 42 años, por ejemplo, de 25 a 37 años. El producto puede ser para (uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto identificado con un IMC > 15 y un IMC <38 kg/m2, por ejemplo, un sujeto identificado con un IMC > 18 y un IMC <25 kg/m2, por ejemplo, un sujeto que tiene un IMC > 20 y un IMC < 25 kg/m2.

La rFSH puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor, por ejemplo, entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, p. ej., entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, p. ej., entre 9 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo, entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, p. ej. entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, p . ej. entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, p. ej., entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana.

La FSH (rFSH) para uso de acuerdo con la invención puede tener 1% a 99% de la sialilación total siendo sialilación en a2,3. La rFSH puede tener un 10% o más de la sialilación total siendo sialilación en a2,3. por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la sialilación total puede ser sialilación en a2,3. La rFSH puede incluir preferiblemente sialilación en a2,3 en una cantidad que es de 50 a 95% de la sialilación total, por ejemplo, de 50 a 70% de la sialilación total, por ejemplo, de 60 a 69% de la sialilación total, por ejemplo, de 63 a 67%, por ejemplo, alrededor de 65% de la sialilación total. La FSH (rFSH) para uso de acuerdo con la invención puede tener 1% a 99% de la sialilación total siendo sialilación en a2,6. La rFSH (o preparación de rFSH ) de la invención puede tener 5% o más, por ejemplo, 5% a 99%, por ejemplo, 5% a 50%, de la sialilación total siendo sialilación en a2,6. La rFSH puede tener un 50% o menos de la sialilación total siendo sialilación en a2,6. La rFSH puede incluir preferiblemente sialilación en a2,6 en una cantidad que es de 5 a 50% de la sialilación total, por ejemplo, de 10 a 50% de la sialilación total, por ejemplo, de 31 a 38%, por ejemplo, alrededor de 35% de la sialilación total. Por sialilación se entiende la cantidad de residuos siálicos presentes en las estructuras de hidratos de carbono de FSH. Sialilación en a2,3 significa sialilación en la posición 2,3 (como es bien conocido en la técnica) y sialilación en a2,6 en la posición 2,6 (también bien conocida en la técnica). Por lo tanto, "% de la sialilación total puede ser sialilación en a 2,3" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. La expresión "% de la sialilación total que es sialilación en a2,6" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6.

La rFSH puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de FSH) de (basado en la masa de proteína, en lugar de la masa de proteína más hidrato de carbono) de 6% o más (p. ej., entre 6% y 15%, p. ej., entre 7% y 13%, p. ej. entre 8% y 12%, p. ej. entre 11% y 15%, p. ej. entre 12% y 14%) en masa.

La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular Per.C6, una línea celular HT1080, etc. Esto puede simplificar (y hacer más eficiente) el método de producción debido a la manipulación y el control de, p. ej., el medio de crecimiento celular para retener la sialilación puede ser menos crítico que con los procedimientos conocidos. El método también puede ser más eficaz porque se produce poca rFSH de carácter básico en comparación con la producción de productos de rFSH conocidos; se produce más rFSH de carácter ácido y la separación/eliminación de FSH de carácter básico es menos problemática. La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular PER.C6®, una línea celular derivada de PER.C6® o una línea celular PER.C6® modificada. La rFSH que se produce o expresa en una línea celular humana (p. ej., línea celular PER.C6®, línea celular HT1080, etc.) incluirá algunos ácidos siálicos enlazados a a2,6 (sialilación en a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular] e incluirá algunos ácidos siálicos enlazados a a2,3 (sialilación en a2,3) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. La línea celular se puede modificar utilizando a2,3-sialiltransferasa. La línea celular se puede modificar utilizando a2,6-sialiltransferasa. Alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos enlazados a a2,6 (sialilación en a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular]. En esta memoria, la expresión "FSH recombinante derivada de seres humanos" significa FSH recombinante que se produce o expresa en una línea celular humana (p. ej., FSH recombinante preparada mediante manipulación de una línea celular humana).

La rFSH se puede producir utilizando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa. En un ejemplo, la rFSH se produce utilizando a2,3- sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos enlazados en a2,6 (sialilación en a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena.

La composición puede ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica es para el tratamiento de la esterilidad. El tratamiento de la esterilidad puede comprender tecnologías de reproducción asistida (ART), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IUI). La composición farmacéutica puede utilizarse, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se utilizan preparaciones de FSH conocidas.

El producto o la composición se puede formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, p. ej., oral, rectal, parenteral, transdérmica (p. ej., tecnología de parche), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrasusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, ungüentos). o gotas) o como un espray bucal o nasal. Una composición típica comprende un soporte farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes no tóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describe en Remington’s Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412. y 1461 - 87, y el formulario nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.

Ejemplos de soportes, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos, tales como, pero no limitados a conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, tensioactivos y agentes dispersantes. Pueden incluirse agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluye, por ejemplo, mcresol, alcohol bencílico, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en modo alguno a estos ejemplos. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. El producto o la composición puede comprender, además, una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinación de los mismos. Preferiblemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.

Preferiblemente, el producto o la composición comprende FSH recombinante y uno o más de polisorbato 20, L-metionina, fenol, sulfato disódico y tampón fosfato sódico.

En algunos casos, para lograr una acción prolongada es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros ingredientes activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede conseguirse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con baja solubilidad en agua. La tasa de absorción de FSH depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una formación de combinación de FSH administrada por vía parenteral se consigue disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas de la FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de FSH a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberación de FSH. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier recipiente adecuado, p. ej., vial, jeringa precargada, cartuchos de inyección y similares.

El producto o la composición se puede formular para un solo uso o para uso múltiple (dosis múltiples). Si el producto o la composición está formulado para usos múltiples, se prefiere que se incluya un conservante. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en modo alguno a estos ejemplos. El producto o la composición formulado para uso único o para uso múltiple puede comprender, además, una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en sales de Na+ o K+, o una combinación de los mismos. Preferiblemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.

El producto o la composición puede incluirse en un recipiente, tal como un vial, un cartucho precargado (p. ej., para una sola administración o un uso múltiple) o un dispositivo de inyección tal como un "bolígrafo", p. ej., para la administración de múltiples dosis.

El producto o la composición puede ser una formulación (p. ej., formulación inyectable) que incluye FSH (opcionalmente con hCG, LH, actividad LH, etc.). La actividad LH, si está presente, puede originarse a partir de LH o gonadotropina coriónica humana, hCG. Si hay más de un ingrediente activo (es decir, FSH y, p. ej., hCG o LH), estos pueden ser adecuados para la administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto puede suministrarse en cualquier envase apropiado. por ejemplo, un producto puede incluir un cierto número de recipientes (p. ej., jeringas o viales precargados) que contienen FSH o hCG , o una combinación (o combinación) tanto de FSH como de hCG. La hCG puede ser hCG recombinante o hCG urinaria. Si el producto incluye un cierto número de recipientes (p. ej., jeringas o viales precargados) que contienen FSH, p. ej., FSH recombinante, cada uno de los recipientes puede incluir la misma cantidad de FSH. Uno o más recipientes pueden incluir diferentes cantidades de FSH. Las jeringas o los viales pueden empaquetarse en un envase blister u otros medios para mantener la esterilidad. Cualquier producto puede contener opcionalmente instrucciones para utilizar las formulaciones de FSH (y, p. ej., hCG si está presente). El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con la práctica rutinaria en este sector. Véase THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES de GOODMAN y GILMAN, 7a ed. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para administración parenteral. Métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales se conocen en la técnica y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales pueden suministrarse en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de su administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.

La presente solicitante también encontró que la administración de FSH a pacientes identificados con AMH baja [nivel de AMH < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L), que generalmente se asociaría con una respuesta baja], también por tener la variante Asn/Asn o la variante Asn/Ser en la posición 680 del receptor de FSH, proporciona una buena respuesta en términos de desarrollo folicular. Esto se logra con una dosis reducida de FSH y/o una duración reducida del tratamiento, en comparación con el tratamiento de pacientes con AMH baja y la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH. Esto permite adaptar la dosis de FSH en pacientes específicos identificados con un nivel específico de AMH, así como estos polimorfismos específicos en el FSHR. Como se indica más adelante, la duración esperada de la estimulación para un paciente que tiene un nivel de AMH < 15 pmol/L y una variante de Asn/Asn es 1,5 días menos que la duración de la estimulación requerida para un paciente que tiene un nivel de AMH < 15 pmol/L y una variante de Ser/Ser (véase la Figura 7). Por consiguiente, adaptar la dosis a los pacientes identificados, antes del tratamiento, con un nivel de AMH < 15 pmol/L y una variante de Asn/Asn (o ambos, nivel de AMH < 15 pmol/ L y una variante de Asn/Ser) puede permitir un ahorro considerable en términos del costo farmacéutico, así como la reducción del riesgo de posibles efectos secundarios debido a la administración de una dosis total de FSH más alta que la requerida en estos pacientes.

De acuerdo con la presente invención, en un aspecto adicional se proporciona una composición (p. ej., una composición farmacéutica) para uso en el tratamiento de la esterilidad, comprendiendo la composición 10 a 12 pg de hormona estimulante del folículo (FSH), en donde la composición es para administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene la variante Asn/Asn en la posición 680 del receptor de FSH (antes del tratamiento). La composición puede ser para la administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p.ej., seleccionado como) que tiene la variante Asn/Ser en la posición 680 del receptor de FSH e identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/,L a 14,9 pmol/L) (antes del tratamiento). La composición puede ser para la administración (p. ej., diaria) a un paciente identificado como (p.ej., seleccionado como) que tiene la variante Asn/Asn en la posición 680 del receptor de FSH e identificado como (p. ej., seleccionado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/,L a 14,9 pmol/L (antes del tratamiento). La composición puede comprender de 10 a < 12 pg de FSH, por ejemplo, de 10 a 11,9 pg de FSH, por ejemplo, de 11 a 11,9 pg de FSH, por ejemplo, de 11,33 a 11,67 pg de FSH.

La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede comprender una dosis diaria o una dosis diaria equivalente a las cantidades de rFSH derivada de seres humanos arriba definidas, en esta memoria. y en las reivindicaciones. La composición (p. ej., composición farmacéutica) puede ser para la administración (diaria) de FSH comenzando el día uno del tratamiento y continuando durante seis a dieciséis días, por ejemplo, siete a dieciséis días, por ejemplo, 8 a 16 días, por ejemplo, 8 a 13 días.

El tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de identificar (p. ej., determinar, p. ej., medir) la variante en la posición 680 del receptor de FSH del paciente; y una etapa de administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene la variante Asn/Asn o variante Asn/Ser en la posición 680 del receptor de FSH. El tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de identificar (p. ej. determinar, p. ej. medir) el nivel de AMH en suero del paciente y administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene un nivel de AMH en suero de < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L).

La composición (p. ej., una composición farmacéutica) puede ser para uso en el tratamiento de la esterilidad en un paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., de 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L) y que tiene la variante Asn/Asn en la posición 680 del receptor de FSH [en donde el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de identificar (p. ej., determinar) el nivel de AMH en suero del paciente; una etapa de identificar la variante en la posición 680 del receptor de FSH del paciente; y una etapa de administrar la dosis a un paciente (identificado como) que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/L (p. ej., 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L) y la variante Asn/Asn en la posición 680 del receptor de FSH].

Se apreciará que la FSH, la identificación del nivel de AMH en suero del paciente y la variante en la posición 680 del receptor de FSH, etc. para estos aspectos de la invención puede ser igual que para los otros aspectos de la invención reseñados en esta memoria.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un mapa de plásmido del vector de expresión pFSHalfa/beta;

la Figura 2 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la Figura 3 muestra el vector de expresión de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);

la Figura 4 es un diagrama esquemático del Receptor de FSH, indicando la posición de polimorfismos en las posiciones de aminoácidos 307 y 680 del exón 10, y la posición 29 en el promotor;

la Figura 5 muestra la distribución de los haplotipos de SNP en el gen del receptor de FSH para los 222 pacientes tratados con FSH en el estudio del Ejemplo 8;

la Figura 6 es una tabla de resultados que muestra, para el conjunto de análisis completo, la duración observada del tratamiento con gonadotropina (FSH) (días) y la dosis total de gonadotropina (FSH) administrada (pg) a pacientes/sujetos que tienen una AMH <15 pmol/L en cada uno de los tres genotipos distintos del receptor de FSH con respecto a la posición 680: Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser; y

la Figura 7 es una tabla de resultados que muestra, para el conjunto de análisis completo, la duración esperada del tratamiento con gonadotropina (FSH) (días) administrada a pacientes/sujetos que tienen una AMH <15 pmol/L en cada uno de los tres genotipos distintos del receptor de FSH con respecto a la posición 680: Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser, ajustada para la dosis.

Selección de la Secuencia

FSH Humana

La región codificante del gen para el polipéptido alfa de FSH se utilizó de acuerdo con Fiddes y Goodman. (1981). La secuencia se almacena como AH007338 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteínas. A la secuencia se la alude en esta memoria como SEQ ID NO: 1.

La región codificante del gen para el polipéptido beta de FSH se utilizó de acuerdo con Keene et al (1989). La secuencia se almacena como NM_000510 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteínas. A la secuencia se la alude en esta memoria como SEQ ID NO: 2

Sialiltransferasa

a2,3-sialiltransferasa - Se utilizó la región codificante del gen de la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) de acuerdo con Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia se almacena como L23767 y se la alude en esta memoria como SEQ ID NO: 3.

a2,6-sialiltransferasa - Se utilizó la región codificante del gen de la beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) de acuerdo con Grundmann et al. (1990). La secuencia se almacena como NM_003032 y se la alude en esta memoria como SEQ ID NO: 4.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión FSH

La secuencia codificante del polipéptido FSH alfa (AH007338, SEQ ID NO: 1) y el polipéptido FSH beta (NM_003032, SEQ ID NO: 2) se amplificaron mediante PCR utilizando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHa -rev y FSHb-fw y FSHb -rec, respectivamente.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (SEQ ID NO:9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO:10)

FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11)

FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)

El ADN beta de FSH amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción ^scI y HpaI y se insertó en los sitios ^scI y HpaI en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. De manera similar, el ADN de FSH alfa se digirió con fíamHI y NheI y se insertó en los sitios fíamHI y NheI en el vector de expresión que ya contenía el ADN del polipéptido beta de FSH.

El ADN del vector se utilizó para transformar la cepa DH5a de E.coli.. Se seleccionaron colonias para la amplificación. Las colonias que contenían el vector que contenía tanto FSH alfa como beta se seleccionaron para la secuenciación y todas contenían las secuencias correctas de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Se seleccionó el plásmido pFSH A B n° 17 para la transfección (Figura 1).

Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión ST3

La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) se amplificó mediante PCR utilizando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 14)

El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción fíamHI y M II y se insertó en los sitios fíamHI y Af/II en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se describió previamente y se secuenció. El clon pST3 n° 1 (Figura 2) contenía la secuencia correcta de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y se seleccionó para la transfección.

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión ST6

La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) se amplificó mediante PCR utilizando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 16)

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción fíamHI y Af/II y se insertó en los sitios fíamHI y Af/II en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se describió previamente y se secuenció. El clon pST6 n° 11 (Figura 3) contenía la secuencia correcta de acuerdo con SEQ ID NO: 4 y se seleccionó para la transfección.

Ejemplo 4 Expresión estable de pFSH a+p en células PER.C6®. Aislamiento por transfección y rastreo de clones.

Los clones PER.C6® que producen FSH se generaron expresando las dos cadenas polipeptídicas de FSH a partir de un solo plásmido (véase el Ejemplo 1).

Para obtener clones estables, un agente de transfección basado en liposomas con la construcción pFSH a+p. Se seleccionaron clones estables en VPRO complementado con FCS al 10% y que contenía G418. Tres semanas después de la transfección, crecieron los clones resistentes a G418. Se seleccionaron clones para el aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta un 70-80% de confluencia. Los sobrenadantes se sometieron a ensayo para determinar el contenido de proteína FSH utilizando un ELISA selectivo para FSH y actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, utilizando un ensayo de acumulación de AMPc. Los clones que expresan proteína funcional se hicieron progresar para la expansión del cultivo a matraces de 24 pocillos, 6 pocillos y T80.

Se iniciaron estudios para determinar la productividad y la calidad del material de siete clones en matraces T80 para generar suficiente material. Las células se cultivaron en medio complementado como se describió previamente durante 7 días y se recogió el sobrenadante. La productividad se determinó utilizando el ELISA selectivo para FSH. El perfil isoeléctrico del material se determinó mediante enfoque isoeléctrico (IEF), mediante métodos conocidos en la técnica. Se seleccionaron clones con suficiente productividad y calidad para la manipulación de sialiltransferasa.

Ejemplo 5 El nivel de sialilación se incrementa en células que sobre-expresan a2,3-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 en células PER.C6® que expresan FSH; Aislamiento por transfección y rastreo de clones.

Clones PER.C6® que producen FSH muy sialilada se generaron mediante la expresión de a2,3-sialiltransferasa a partir de plásmidos separados (Ejemplo 2) en células PER.C6® que ya expresan ambas cadenas polipeptídicas de FSH (del Ejemplo 4). Los clones producidos a partir de células PER.C6® como se establece en el Ejemplo 4 se seleccionaron en cuanto a sus características, incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional y FSH producida que incluía algo de sialilación. Se generaron clones estables como se describió previamente en el Ejemplo 4. Los clones se aislaron, expandieron y ensayaron. Los clones de a2,3-sialiltransferasa se adaptaron a las condiciones de suspensión y medios sin suero.

Como antes, los clones se sometieron a ensayo utilizando un ELISA selectivo para FSH, respuesta funcional en una línea celular receptora de FSH, IEF, tasa de aclaramiento metabólico y análisis de Steelman Pohley . Los resultados se compararon con una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal -f, Serono) y las líneas celulares de FSH PER.C6® parentales. La FSH producida por la mayoría de los clones tiene una sialilación significativamente mejorada (es decir, un promedio de isoformas más de FSH con alto número de ácidos siálicos) en comparación con FSH expresadas sin a2,3-sialiltransferasa. En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células PER.C6® resultó en niveles incrementados de FSH sialilada en comparación con las células que expresan solo FSH.

Ejemplo 6 Resumen de producción y purificación

Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6® que se cultivaron en suspensión en medio libre de suero. El proceso se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6® productoras de FSH.

Se preparó FSH a partir de un clon a2,3 (Ejemplo 5) utilizando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976).

Para la producción de PER.C6®-FSH, las líneas celulares se adaptaron a un medio libre de suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). Las células se cultivaron primero para formar una monocapa confluente al 70% -90% en un matraz de cultivo T80. En el paso, las células se resuspendieron en el medio libre de suero, Excell 525 L-glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0.3x106células/ml. Una suspensión de 25 ml de células se dispuso en un matraz con agitador de 250 ml y se agitó a 100 rpm a 37°C en 5% de CO2. Después de alcanzar una densidad celular de > 1 x 106 células/ml, las células se sub-cultivaron hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3 x 106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en matraces con agitador a 37°C, 5% de CO2 y 100 rpm.

Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción libre de suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que apoya el crecimiento de las células PER.C6® a densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo por tandas). Las células se cultivaron primero en > 1 x 106 células/ml en Excell 525, a continuación, se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y posteriormente se suspendieron en medio VPRO L-glutamina 6 mM a una densidad de 1 x 106 células/ml. Las células se cultivaron a continuación en un matraz con agitador durante 7-10 días a 37°C, 5% de CO2 y 100 rpm. Durante este período, las células crecieron hasta una densidad de > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular comenzara a disminuir. Las células se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y el sobrenadante se utilizó para la cuantificación y purificación de FSH. La concentración de FSH se determinó utilizando ELISA (DRG EIA 1288).

Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de FSH utilizando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Se llevó a cabo una purificación utilizando cromatografía de carga selectiva para enriquecer las formas muy sialiladas mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Durante todos los procesos cromatográficos, el enriquecimiento de las formas sialiladas de FSH como se reivindica en esta memoria fue confirmado por RIA (DRG EIA 1288) y/o IEF.

Ejemplo 7 Cuantificación de cantidades relativas de ácido siálico a2,3 y a2,6

Se midieron las cantidades porcentuales relativas de ácido siálico a2,3 y a2,6 sobre rFSH purificada (Ejemplo 6) utilizando técnicas conocidas.

Se liberaron N-glicanos de las muestras utilizando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. A continuación, las formas de glicano liberadas se separaron y analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para determinar la distribución de carga. Los glicanos marcados tratados con 2,3,6,8 sialidasa para la determinación del ácido siálico total y 2,3 sialidasa para la determinación del ácido 2,3 siálico, se analizaron adicionalmente mediante una columna de cera.

Los porcentajes relativos de los glicanos cargados se calcularon a partir de las estructuras presentes en los conjuntos de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la Figura 4 (para 8 muestras). Se encontró que estos estaban en los intervalos del 50%-95% (p. ej., aproximadamente del 80% al 90%) para la sialilación en a2,3 y del 5% al 50%, en general aproximadamente del 10 al 20% (o aproximadamente del 31% o 35%) para la sialilación en a2,6.

Ejemplo 8 - Un estudio de dosis múltiples que investiga FE 999049 en comparación con GONAL-F.

Lo siguiente describe un ensayo aleatorizado, controlado, ciego al evaluador, de grupos paralelos, multinacional y multicéntrico que evalúa la relación dosis-respuesta de FE 999049 en pacientes sometidas a estimulación ovárica controlada para la fecundación in vitro (IVF)/inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La población de pacientes fue de 265 pacientes de IVF con edades comprendidas entre 18 y 37 años, con un IMC de 18,5 a 32,0 kg/m2.

El ensayo se diseñó como un ensayo de dosis-respuesta con el número de oocitos recuperados como criterio de valoración principal. Los criterios de valoración secundarios explorarán el impacto cualitativo y cuantitativo de diferentes dosis de FE 999049 con respecto al perfil endocrino, desarrollo folicular, fertilización de oocitos, calidad del embrión y eficacia del tratamiento (es decir, consumo total de gonadotropina y duración de la estimulación). El ensayo está diseñado para evaluar la eficacia de FE 999049 para establecer el embarazo cuando se utiliza en estimulación ovárica controlada para ciclos de IVF/ICSI.

Los sujetos fueron evaluados dentro de los 3 meses previos a la aleatorización para verificar el cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión, incluyendo una evaluación de la hormona antimülleriana (AMH) para aumentar la homogeneidad de la población del ensayo en relación con la respuesta ovárica y minimizar el número de potenciales respondedores pobres e hiperactivos a las dosis de FE 999049 y a la dosis de GONAL-F utilizadas en el ensayo. . La evaluación de AMH se midió utilizando el kit de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/L con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/L.

En el día 2-3 de su ciclo menstrual, los sujetos fueron aleatorizadas en una forma 1: 1: 1: 1: 1: 1 para recibir tratamiento con 90 UI, 120 UI, 150 UI, 180 UI o 210 UI de FE 999049 o 150 UI de GONAL-F, y estimulación ovárica iniciada. La asignación al azar se estratificó de acuerdo con el nivel de AMH en el rastreo [5,0-14,9 pmol/L (AMH baja) y 15,0 a 44,9 pmol/L (AMH alta)).

Gonal -F se llena en masa (FbM) a petición de la FDA; por lo tanto, es apropiado referirse a la dosis en pg. La etiqueta Gonal -F indica 600 UI/44 pg, lo que indica que 150 UI son 11 pg. Sin embargo, existe alguna variación y el certificado de tanda para este ensayo indicó que 11,3 pg de Gonal -F eran equivalentes a 150 UI. Las dosis de FE999049 se presentan por contenido en proteína (pg) más que por actividad biológica. Por lo tanto, las dosis de FE999049 fueron 5,2 pg (90 UI), 6,9 pg (120 UI), 8,6 pg (150 UI), 10,3 pg (180 UI) o 12,1 pg (210 UI).

El sujeto y la distribución de la dosis se establecen de la siguiente manera (los datos son el número de sujetos):

Tabla 1

FE 999049 GONAL-F

5,2 6,9 8,6 10,3 12,1 11,3 (11) _Total pg pg pg pg pg pg

Rastreado 334 Aleatorizado y expuesto 42 45 44 45 46 43 265 Estrato alto de AMH (15,0 - 44,9 23 26 24 24 26 25 148 _pmol/L) (56%) Estrato bajo de AMH (5,0 - 14,9 117

19 19 20 20 21 18 _pmol/L) (44%) Según protocolo 40 42 42 44 44 43 255

El nivel de dosis diaria de FE 999049 o GONAL-F se fija a lo largo de todo el período de estimulación. Durante la estimulación, los sujetos se controlan los días de estimulación 1, 4 y 6 y, en lo sucesivo, al menos cada dos días. Cuando se observan 3 folículos de >15 mm, las visitas se realizan diariamente. Los sujetos se tratan con FE 999049 o GONAL-F durante un máximo de 16 días.

Para prevenir un aumento prematuro de LH, se puede iniciar un antagonista de GnRH (acetato de ganirelix, ORGALUTRAN, MSD / Schering-Plough) el día 6 de la estimulación a una dosis diaria de 0,25 mg y continuar durante todo el período de estimulación. El desencadenamiento de la maduración folicular final se realiza el día en que se observan > 3 folículos con un diámetro > 17 mm. Si hay < 25 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 250 pg de hCG recombinante (coriogonadotropina alfa, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono). Si hay 25-35 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 0,2 mg de agonista de GnRH (acetato de triptorelina, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). En caso de respuesta ovárica excesiva, definida como > 35 folículos con un diámetro > 12 mm, se cancela el tratamiento. En caso de una respuesta ovárica deficiente, definida como < 3 folículos con un diámetro > 10 mm observado el día 10 de estimulación, el ciclo podría cancelarse.

La recuperación de los oocitos tiene lugar 36 h (± 2 h) después de desencadenar la maduración folicular final y los oocitos inseminados por IVF y/o ICSI. La fecundación y el desarrollo embrionario se evalúan desde la recuperación de los oocitos hasta el día de la transferencia. Para los sujetos que experimentaron el desencadenamiento de la maduración folicular final con hCG , se transfiere un blastocisto de la mejor calidad disponible el día 5 después de la recuperación de los oocitos, mientras que los blastocistos restantes se congelan. Para los sujetos que experimentan el desencadenamiento de la maduración folicular final con agonista de GnRH, no se produce transferencia de embriones en el ciclo fresco y los blastocistos se congelan el día 5. Comprimidos vaginales de progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) se proporcionan 100 mg 3 veces al día para el apoyo de la fase lútea desde el día posterior a la extracción de los oocitos hasta el día de la visita clínica de embarazo. Se realiza una prueba de phCG 13-15 días después de la transferencia del embrión y el embarazo clínico se confirmará mediante ecografía transvaginal (TVU) 5-6 semanas después de la transferencia del embrión.

Resultados

El número de oocitos recuperados (criterio de valoración principal) se muestra en la siguiente Tabla.

Tabla 2

FE 999049 GONAL-F

5,2 gg 6,9 gg 8,6 gg 10,3 gg 12,1 gg 11,3 (11) gg Oocitos recuperados

Todos 5,2 (3,3) 7,9 (5,9) 9,2 (4,6) 10,6 (7,0) 12,2 (5,9) 10,4 (5,2)

AMH alta 5,9 (3,9) 9,1 (6,4) 10,6 (4,8) 13,6 (7,8) 14,4 (5,8) 12,4 (5,4)

AMH baja 4,5 (2,2) 6,3 (4,9) 7,4 (3,8) 6,9 (3,6) 9,4 (4,9) 7,8 (3,4)

Los datos son la media (DE)

Se alcanzó el objetivo principal: se estableció una relación dosis-respuesta significativa para FE 999049 con respecto al número de oocitos recuperados. Este hallazgo se observó no solo para la población general del ensayo, sino también para cada uno de los dos estratos de AMH utilizados en la aleatorización.

Se demostró una dosis-respuesta significativa para FE 999049 para todos los parámetros farmacodinámicos objetivos clave, p. ej., estradiol, inhibina B e inhibina A. A un nivel de dosis similar en microgramos, las respuestas farmacodinámicas con FE 999049 fueron mayores que con GONAL-F (estos resultados no mostrados).

Las concentraciones séricas de FSH después de la exposición a FE 999049 fueron significativamente más altas que para GONAL-F. Los resultados confirman que el perfil PK de FE 999049 difiere del de GONAL-F. Las tasas de fertilización, el desarrollo de blastocistos y las tasas de embarazo en pacientes con IVF/ ICSI tratados con FE 999049 estuvieron dentro de las expectativas.

No hubo problemas de seguridad con el uso de FE 999049. Se documentó una buena tolerabilidad local.

Análisis Adicionales

La solicitante ha analizado adicionalmente los datos para identificar la o las dosis de FE 999049 que cumplen los siguientes criterios con respecto al número de oocitos recuperados:

• Oocitos recuperados en el intervalo 8-14

• Minimizar la proporción de pacientes con < 8 oocitos

• Minimizar la proporción de pacientes con < 4 o > 20 oocitos

Estrato de AMH baja

Como se ve en la Tabla 2, la dosis de FE999049 que cumplió con el primer criterio (Ovocitos recuperados en el intervalo 8-14) fue de 12,1 gg (media de 9,4 oocitos recuperados). La distribución de los oocitos se muestra en la Tabla 3 que figura a continuación.

Tabla 3

Como se muestra en el cuadro y la flecha, una dosis de 12,1 gg de FE999049 proporciona la recuperación del número más deseable de oocitos en el 60% de los sujetos del grupo de AMH baja. Esta es una mejora notable en Gonal -F (el número más deseable de oocitos en solo el 33% de los sujetos). No hubo indicios de OHSS temprano de naturaleza moderada o grave y no hubo incidentes de que requirieran acciones preventivas; no existen preocupaciones asociadas con la dosis de 12,1 gg de FE999049 en un paciente con AMH baja.

Por lo tanto, la solicitante ha descubierto que una dosis de, o una dosis equivalente a 6 a 24 pg, por ejemplo, 9 a 14 pg, por ejemplo, 12 pg de FSH recombinante de origen humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en un paciente que tiene AMH sérica <15 pmol/L, por ejemplo, 0,05-14,9 pmol/L por ejemplo, 5.0-14.9 pmol/L. La dosis proporciona una respuesta eficaz al tiempo que minimiza el riesgo de OHSS.

Evaluación Exploratoria

Como evaluación exploratoria, los autores de esta invención investigaron la contribución del polimorfismo del receptor de FSH sobre la respuesta ovárica y la eficacia del tratamiento después de la estimulación con FE999049.

Se analizó el ADN genómico de todos los pacientes en el ensayo para determinar el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en las posiciones 29, 307 y 680 del FSH-R en la Universidad de Módena y Reggio Emilia, Italia. La Figura 4 es un diagrama esquemático del Receptor de FSH, indicando la posición de polimorfismos en las posiciones de aminoácidos 307 y 680 del exón 10, y la posición 29 en el promotor. Esta distribución de combinaciones de SNP FSH-R es la siguiente: AA 7%, AG 35% y GG 58% para la posición 29; Thr/Thr 29%, Ala/Thr 54% y Ala/Ala 17% para la posición 307; y Asn/Asn 30%, Asn/Ser 53% y Ser/Ser 17% para la posición 680. La Figura 5 muestra la distribución de los haplotipos de SNP en el gen del receptor de FSH para los 222 pacientes tratados con FSH en el estudio del Ejemplo 8. La distribución para cada una de las posiciones y las combinaciones generales no fue significativamente diferente entre los estratos de AMH baja y AMH alta.

Los resultados del ensayo clínico se analizaron adicionalmente para evaluar si el SNP tenía algún efecto sobre la duración del tratamiento y la dosis total requerida. Esto se hizo para el grupo de AMH baja y el grupo de AMH alta.

El polimorfismo de FSHR se examinó mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) mediante métodos conocidos en la técnica. Las mujeres se clasificaron como genotipos Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser. El análisis genético se describió en el siguiente protocolo general y los pacientes firmaron un consentimiento informado especial. Las muestras se tomaron como parte de las otras muestras de sangre el día 1 de estimulación. Se midieron en la Universidad de Módena y Reggio Emilia.

Descripción General de los Procesos utilizados para el análisis de SNP en el Gen del Receptor de FSH

Procesos generales:

1. Extracción de ADN genómico (de sangre mediante el kit de extracción de ADN Nucleon Genomic, GE HEALTHCARE)

2. Procesos operativos utilizando nanodrop

Proceso HRM:

Genotipado de SNP mediante metodología de fusión de alta resolución (HRM) (utilizando la enzima de bacalao SsoFast EvaGreen Supermix. 172-5201, Bio-Rad; placas HSP-96, cat. HSP9645, Bio-Rad; y ciclador térmico en tiempo real CFX96 de Bio-Rad.)

Procesos de secuenciación:

En caso de duda sobre los resultados de HRM (después de dos HRM independientes en las mismas muestras), se utilizan los siguientes procesos de secuenciación:

1. Reacción PCR y amplificación.

2. Purificación del producto de PCR.

3. Cuantificación de PCR purificada.

4. Protocolo de reacción de la secuencia.

5. Purificación del producto de la secuencia.

6. Electroforesis capilar realizada por instrumento ABI PRISM 3130.

7. Evaluación y validación de los resultados obtenidos por secuenciación de electroforesis capilar con ABI PRISM 3100.

Resultados

la Figura 7 es una tabla de resultados que muestra, para el conjunto de análisis completo, la duración esperada del tratamiento con gonadotropina (FSH) (días) administrada a pacientes/sujetos que tienen una AMH <15 pmol/L en cada uno de los tres genotipos distintos del receptor de FSH con respecto a la posición 680: Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser, ajustada para la dosis.

La Figura 7 muestra que la duración media esperada del tratamiento requerido para la estimulación de un paciente que tiene un nivel de AMH <15 pmol/L y una variante de Ser/Ser es de 9,59 días, que es aproximadamente 1,5 días más larga que la requerida para la estimulación de un paciente que tiene un nivel de AMH. < 15 pmol/L y variante Asn/Asn (8.13 días), y aproximadamente 1.3 días más larga que la requerida para la estimulación de un paciente que tiene un nivel de AMH < 15 pmol/L y variante Ser/Asn (8.26 días).

Como se indica arriba, el éxito (en términos de embarazo y/o nacimiento vivo) es más probable si la paciente tiene una respuesta adecuada (desarrollo multifolicular ovárico esperado, aumento en el 17-p-estradiol circulante) que se produce dentro de una ventana de tratamiento ideal. El éxito se potencia adicionalmente si la respuesta está dentro del centro de esta ventana de tratamiento; es decir, ni demasiado temprano en la ventana ni demasiado tarde. La reducción de la duración del tratamiento en pacientes que tienen baja AMH y variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH (aumentando la dosis por encima de 12 gg) puede llevar la respuesta hacia el centro de la ventana de tratamiento, con mayor probabilidad de éxito.

Por consiguiente, puede ser posible adaptar la dosis a los pacientes identificados con un nivel de AMH < 15 pmol/L y variante Ser/Ser antes del tratamiento. La identificación de los pacientes que tienen Ser/Ser antes del tratamiento puede permitir aumentar la dosis inicial en estos pacientes, en comparación con los que reciben Ser/Asn y Asn/Asn.

Como se indicó anteriormente, una dosis de 12,1 gg de FE999049 proporciona la recuperación del número más deseable de oocitos en el 60% de los sujetos del grupo de AMH baja (Tabla 3). El grupo de AMH baja mostrado en la Tabla 3 incluyó pacientes que tenían la variante Ser/Ser, así como aquellos que tenían Ser/Asn y Asn/Asn. La administración de una dosis inicial más alta (por ejemplo, de 9 a 24 gg, por ejemplo, > 12 a 24 gg, p. ej., 12,33 gg o 13 gg de recombinante de origen humano) de FSH a pacientes que tienen una AMH baja [nivel de AMH <15 pmol/L, (p. ej. 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L, p. ej., 5,0 pmol/L a 14,9 pmol/L)], además de tener la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH, puede ser ventajoso, porque puede proporcionar una probabilidad incrementada de éxito (en términos de embarazo y/o nacimiento vivo) y una mejor previsibilidad del éxito.

La Figura 7 muestra que la duración media del tratamiento requerida para la estimulación de un paciente que tiene un nivel de AMH <15 pmol/L y una variante Asn/Asn es de 8,13 días, y la requerida para la estimulación de un paciente que tiene un nivel de AMH <15 pmol/L y una variante Ser/Asn es de 8,26 días, aproximadamente 1,5 a 1,3 días más corta que la duración del tratamiento equivalente de un paciente que tiene un nivel de AMH <15 pmol/L y la variante Ser/Ser (9,59 días). Por lo tanto, la identificación de pacientes con niveles de AMH <15 pmol/L y variantes Ser/Asn y Asn/Asn antes del tratamiento puede permitir que la dosis inicial para estos pacientes se reduzca a menos de 12 gg de FE 999049, p. ej., 10 a 12 gg, o que se reduzca la duración del tratamiento, sin dejar de proporcionar una buena respuesta en términos de desarrollo folicular. Esto puede proporcionar un beneficio en términos de costo del producto farmacéutico y también en términos de reducción del riesgo asociado con la administración de una dosis más alta que la requerida para el efecto en estos pacientes.

la Figura 6 es una tabla de resultados que muestra, para el conjunto de análisis completo, la duración observada del tratamiento con gonadotropina (FSH) (días) y la dosis total de gonadotropina (FSH) administrada (gg) a pacientes/sujetos que tienen una AMH <15 pmol/L en cada uno de los tres genotipos distintos del receptor de FSH con respecto a la posición 680: Asn/Asn, Asn/Ser y Ser/Ser Esto confirma los efectos mostrados en la Figura 7.

Los resultados no mostraron este efecto relacionado con SNP en la población con AMH alta.

Esto permite adaptar la dosis de FSH en pacientes específicos identificados por tener un nivel específico de AMH y un polimorfismo específico en el FSHR.

Ejemplo 9: Protocolo COS individualizado (AMH baja)

Los pacientes seleccionados están a punto de someterse a COS para la fecundación in vitro (IVF)/inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) mediante métodos conocidos en la técnica. El protocolo de pretratamiento incluye la evaluación/el rastreo de la AMH sérica del paciente utilizando el kit de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/L con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/L. La AMH se puede medir utilizando otros kits de ensayo (p. ej., disponibles de Roche). El protocolo de pretratamiento incluye la identificación de la variante alélica en la posición 680 del receptor de FSH después de la extracción de ADN genómico por métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., por medio de un kit para la extracción de ADN genómico de la sangre y posterior secuenciación del ADN, tal como se describe, p. ej., en Gromoll et al, Methods, 21, 83-97 (2000), Simoni et al, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 84, N° 2, 751-755 (1999), Falconer et al, Acta Obstet Gynecol Scand 2005: 84: 806-811 (2005), y referencias en el mismo, o por un método de PCR y RFLP tal como el establecido en Loutradis et al, Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol. 23, N° 4, abril de 2006).

El protocolo COS procede de la manera habitual, aparte de la administración de la dosis inicial de FE 999049 de acuerdo con el nivel de AMH en el rastreo. A un paciente con un nivel de AMH de < 15 pmol/L y una variante Ser/Asn o Asn/Asn se le administraría una dosis diaria inicial de aproximadamente 12 gg de FE 999049, un producto de FSH recombinante de origen humano fabricado de acuerdo con el método del Ejemplo 6, o < 12 pg de FE 999049, p. ej., de 10 a 12 pg, p. ej., 11,33 pg o 11,67 pg, de la FSH recombinante derivada de seres humanos. Un paciente con un nivel de AMH de < 15 pmol/L y una variante Ser/Ser recibiría una dosis diaria inicial superior a 12 pg (p. ej., de 12,33 a 24 pg, o 13 - 24 pg de FSH recombinante derivada de seres humanos).

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Figs 1,2 y 3: Mapas de plásmidos de los vectores de expresión pFSHalfa/beta, pST 3 y pST6. CMV = promotor de citomegalovirus, BGHp (A) = secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, fl ori = origen fl de replicación, SV40 = promotor del virus simio 40, Neo = marcador de resistencia a neomicina, Hyg = marcador de resistencia a higromicina, SV40 p (A) = Secuencia de poliadenilación del virus de simio 40, FSH A = polipéptido alfa de la hormona estimulante del folículo, FSH B = polipéptido beta de la hormona estimulante del folículo, ST3GAL4 = a2,3-sialiltransferasa, ST6GAL1 = a2,6-sialiltransferasa, ColEI = origen de replicación ColEI Amp = marcador de resistencia a ampicilina.

SEQ ID NO: 1

Polipéptido alfa de la hormona estimulante del folículo

Número de acceso AH007338

Secuencia de nucleótidos de FSH alfa

1 ATGGATTACTACAGAAAATATGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGTGTTTCTGCAT

61 GTTCTCCATTCCGCTCCTGATGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACAGGAAAACCCA

121 TTCTTCTCCCAGCCGGGTGCCCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTTCTCTAGAGCA

181 TATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTTGGTCC AAAAGAACGTCACCTCAGAG

241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAAATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG

301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTAA

Secuencia de proteínas de FSH alfa (SEQ ID NO: 5)

1 MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPILQCMGCCFSRA

61 YPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCSTCYYHKS

SEQ ID NO: 2

Polipéptido beta de la hormona estimulante del folículo

Número de acceso NM_000510

Secuencia de nucleótidos de FSH beta

1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC 61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC 121 ATCAACACCA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA 181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAGTGAGA 241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT 301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC 361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA

Secuencia de proteínas de FSH beta (SEQ ID NO: 6)

1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP 61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS 121 YCSFGEMKE

SEQ ID NO: 3

Beta- galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4

Número de Acceso L23767

Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4

1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG 61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG 121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC 181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA 241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA 301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG 361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC 421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC 481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC 541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG 601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC 661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT 721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG 781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT 841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC 901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG 961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA

Secuencia de proteínas de ST3GAL4 (SEQ ID NO: 7)

1 MCPAGWKLLA MLALVLWMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN 61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV 121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY DWIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN 181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA 241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL 301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF

SEQ ID NO: 4

Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1

Número de acceso NM_003032

Secuencia de nucleótidos de ST6GAL1

1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT 61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG 121 CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC 181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT 241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC 301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAAC 361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG 421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC 481 AATACCTCTG AATGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT 541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA 601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA 661 CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG 721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT 781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC 841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG 901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC 961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT 1021 TATGAGTTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC 1081 GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGTGAAG 1141 CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC 1201 TTCCGGACCA TTCACTGCTA A

0p-Secuencia de proteínas de ST6GAL1 (SEQ ID NO: 8)

1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS 61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN 121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP 181 WGRCAWSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE 241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM 301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF 361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso en el tratamiento de la esterilidad, comprendiendo la composición 9 a 24 pg de hormona estimulante del folículo (FSH), en donde la composición es para administración a un paciente identificado como que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH.

2. Una composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición es para administración diaria.

3. Una composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de identificar la variante en la posición 680 del receptor de FSH del paciente; y una etapa de administrar la FSH a un paciente (identificado como) que tiene la variante Ser/Ser en la posición 680 del receptor de FSH.

4. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende > 12 a 24 pg de FSH.

5. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la composición es para la administración de FSH comenzando el día uno del tratamiento y continuando durante seis a dieciséis días.

6. Una composición para uso en el tratamiento de la esterilidad, comprendiendo la composición 10 a 12 pg de hormona estimulante del folículo (FSH), en donde la composición es para administración a un paciente identificado como que tiene la variante Asn/Asn o la variante Asn/Ser en la posición 680 del receptor de FSH (antes del tratamiento).

7. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la FSH es FSH recombinante.

8. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la FSH es FSH recombinante que incluye la sialilación en a2,3 y a2,6.

9. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la FSH recombinante incluye sialilación en a2,3 y a2,6, en donde 1 a 99% de la sialilación total es sialilación en a2,6 y 99% a 1% de la sialilación total es sialilación en a2,3.

10. Una composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la FSH recombinante incluye sialilación en a2,3 y a2,6, en donde 1 a 50% de la sialilación total es sialilación en a2,6 y 50% a 99% de la sialilación total es sialilación en a2,3.