KR20130136448A - 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 통상적으로 사용되는 소변 FSH 또는 CHO 세포로부터 수득된 재조합 FSH보다 훨씬 낮은 농도에서 성 스테로이드 방출을 자극할 수 있고, cAMP 신호전달과 독립적으로 작용하는 개선된 FSH 제조물에 관한 것이다. 이러한 개선된 FSH 제조물은 불임 치료에 사용될 수 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 생식샘자극호르몬의 분야에 관한 것이다. 특히, 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬(rhFSH)이 제공된다. 이러한 개선된 rhFSH는 불임, 특히 인간 환자에서의 불임의 치료에 유용하다.
발명의 배경
생식샘자극호르몬은 남성 및 여성에서 생식샘 기능을 조절함으로써 인간 불임에서 중요한 역할을 하는 단백질 호르몬의 군이다. 이들은 생식샘자극호르몬-방출 호르몬(GnRH)에 의한 자극 후에 척추동물의 뇌하수체의 생식샘자극세포에 의해 분비된다. 생식샘자극호르몬은 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH) 및 융모생식샘자극호르몬(CG)을 포함하는 이종이합체 당단백질이다. 생식샘자극호르몬은 동일한 알파-서브유닛을 공유하나, 수용체 결합 특이성을 보장하는 다양한 베타-서브유닛을 포함한다.
FSH는 92개의 아미노산 알파-서브유닛 및 FSH 수용체에 대한 특이적 결합을 부여하는 111개의 아미노산 베타-서브유닛을 포함한다. 자연 단백질의 둘 모두의 서브유닛은 당화에 의해 변형된다. 알파-서브유닛은 Asn52 및 Asn78에서 자연 당화되고, 베타-서브유닛은 Asn7 및 Asn24에서 자연 당화된다. 둘 모두의 서브유닛은 전구체 단백질로서 세포에서 생성된 후, 가공되고, 분비된다. FSH는 신체의 발달, 성장, 사춘기 성숙, 및 생식 과정을 조절한다. 특히, 이는 종자 세포의 성숙을 자극하고, 이에 따라 정자발생 및 난포생성과 관련된다.
난포생성은 FSH, 예를 들어, 과립막 세포의 표면 상의 FSH 수용체에 대한 FSH의 결합에 의해 유도된다. FSH 수용체는 FSH의 결합 후에 커플링된 G 단백질을 활성화시키는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 차례로, G 단백질은 아데닐릴 사이클라제를 활성화시켜, 두번째 메신저 분자인 cAMP를 생성시킨다. 세포 내에서 증가하는 cAMP 농도는 여러 다운스트림 표적, 특히 cAMP 의존성 단백질 키나제를 활성화시키고, 이는 이후에 프로게스테론 및 에스트라디올의 합성을 발생시킨다. 프로게스테론 및 에스트라디올은 과립막 세포에 의해 분비되어, 난포생성을 유도한다. FSH에 의한 과립막 세포의 자극 후, 이들은 또한 음성 피드백 루프를 형성하는 인히빈-B를 방출하여, 뇌하수체에서 FSH의 생성 및 분비를 억제한다. 인히빈-B는 FSH에 의한 난소 자극에 대한 우수한 대용 마커(surrogate marker)인 것으로 밝혀졌다.
FSH는 단독으로 또는 다른 작용제, 특히 LH와 조합하여 불임의 치료에 널리 사용된다. 당 분야에서, 일반적으로 폐경후 인간 소변로부터 정제된 FSH(소변 FSH) 또는 차이니즈 햄스터 난소(CHO)에 의해 재조합적으로 생성된 FSH가 인간 치료에 사용되어 왔다. 그러나, 다양한 이소형(isoform)이 존재함에 따라 FSH 제조와 관련된 상당한 이질성이 존재한다. 개별적 FSH 이소형은 동일한 아미노산 서열을 나타내지만, 이의 당화의 정도 및 특성에 있어서 다양하다. 특정 이소형은 탄수화물 분지 구조의 이질성 및 다양한 양의 시알산(음성으로 하전된 말단 단당류 단위) 통합을 특징으로 하며, 상기 특징 둘 모두는 이소형의 특정 생물활성에 영향을 미친다. 따라서, FSH의 당화 패턴은 이의 생물학적 활성에 대해 유의한 영향을 갖는다.
그러나, 다양한 공여자 및 다양한 제조로부터의 소변 FSH는 이의 탄수화물 구조에서 유의하게 다양할 수 있어, 높은 배치간 변화(batch-to-batch variation)를 발생시킨다. 소변 생성물 내의 바이러스의 존재에 대하여 안전성 우려가 또한 존재한다. 또한, CHO 세포로부터 수득된 FSH는 인간 당화 패턴과 동일하지 않은 상기 햄스터 세포에 특이적인 당화 패턴을 나타낸다. 이러한 차이는 수득되는 FSH, 및 이에 따른 환자에게 투여되는 약학적 제조물의 다양한 생물학적 활성 및 유해한 효과를 발생시킨다.
이러한 관점에서, 개선된 FSH 제조물을 제공하는 것이 본 발명의 한 목적이다.
또한, 새로운 치료적 또는 약리학적 특징을 갖는 FSH 제조물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
또한, 개선된 당화 패턴을 갖는 FSH 제조물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 개요
본 발명자는 바람직하게는 최적화된 당화에 대해 선택되는 인간 세포로부터 수득된 개선된 FSH 제조물이 인간 소변 또는 CHO 세포로부터 수득된 상응하는 FSH 제조물보다 낮은 농도에서 에스트라디올 및 프로게스테론과 같은 성 스테로이드의 분비를 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 FSH 제조물은 치료에 유용한 놀라운 특징을 갖는다.
본 발명은, 첫번째 양태에서, 재조합 FSH 제조물을 제공하며, 이러한 제조물 내의 재조합 FSH는 (i) 적어도 20%의 상대량의 이등분면(bisecting) N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및/또는 (ii) 적어도 30%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및/또는 (iii) 적어도 30%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산; 및/또는 (iv) 다양한 당화 패턴의 특징 중 하나 이상을 포함하는 당화 패턴을 갖는다.
두번째 양태에서, 본 발명은 인간 세포 또는 인간 세포주, 바람직하게는 세포주 GT-5s(DSM ACC3078, 2010년 7월 28일에 수탁됨)에서의 생성에 의해 수득가능한 재조합 FSH 제조물을 제공한다. 각각의 세포주에서 생성된 FSH가 상기 및 하기에 기재되는 바와 같은 개선된 당화 프로파일을 발생시키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 불임 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 cAMP와 또한 독립적인 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 실험에서 본 발명에 따른 FSH의 낮은 농도 효과가 표적 세포에서의 cAMP 신호전달과 독립적인 특정 상황에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 실험은 본 발명에 따른 개선된 FSH 제조물이 cAMP 분비의 증가가 없는 농도에서 프로게스테론과 같은 성 스테로이드의 분비를 유도할 수 있음을 암시한다. 따라서, 본 발명에 따른 개선된 FSH 제조물의 특정 구체예는 통상적으로 사용되는 FSH 제조물에 대해 기재되는 두번째 메신저로서 cAMP를 이용하는 공지된 신호전달 경로와 상이한 성 스테로이드 분비를 발생시키는 신호전달 경로를 유도할 수 있는 것으로 생각된다.
또한, 본 발명은 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의해 종자 세포 성숙을 자극하거나 공동 자극하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유의한 cAMP 방출이 유도되지 않는 FSH 농도에서 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기 기재 및 첨부된 청구항으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 출원의 바람직한 구체예를 나타내는 하기 기재, 첨부된 청구항, 및 특정 구체예는 단지 예시로 제공되는 것이 이해되어야 한다. 본원에 개시된 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 하기의 기재로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
정의
:
본원에서 사용되는 바와 같은 하기 표현은 일반적으로 이들이 사용되는 상황이 달리 나타내는 것을 제외하고는 하기에 기재되는 바와 같은 의미를 우선적으로 갖는다.
본원에서 사용되는 표현 "포함하다" 및 이의 통상적인 의미는 또한 표현 "-로 본질적으로 구성되다" 및 "-로 구성되다"를 포함하고, 특히 이를 의미한다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 나열된 구성요소를 "포함하는" 주제가 추가 구성요소를 포함하지 않는 구체예 뿐만 아니라, 특별히 나열된 구성요소를 "포함하는" 상기 주제가 추가 구성요소를 포함할 수 있고/있거나 상기 추가 구성요소를 확실히 포함하는 구체예를 나타낸다.
용어 "FSH"는 난포-자극 호르몬인 생식샘자극호르몬을 나타내고, FSH는 2개의 서브유닛인 표지된 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 당단백질이다. 바람직하게는, FSH는 인간 FSH, 특히 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 알파 서브유닛 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 베타 서브유닛으로 구성된 인간 FSH이다. 그러나, 하나 이상, 예를 들어, 1개, 1개 또는 2개, 3개 이하, 5개 이하, 10개 이하 또는 20개 이하의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 하나 또는 둘 모두의 서브유닛에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 알파 서브유닛의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 전체 상동성 또는 동일성을 공유한다. 또한, 베타 서브유닛의 아미노산 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 전체 상동성 또는 동일성을 공유한다. FSH의 서브유닛은 바람직하게는 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬이나, 본원에서 사용되는 용어 "FSH"는 또한 2개의 서브유닛이, 예를 들어, 가교제 또는 연결되는 폴리펩티드 사슬에 의해 서로 공유적으로 부착되는 구체예, 및 하나 또는 둘 모두의 서브유닛이 여러 폴리펩티드 사슬로 추가로 나누어지는 구체예를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 FSH는 FSH 수용체, 바람직하게는 인간 FSH 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "FSH"는 특히 제조물 내의 모든 FSH 단백질을 나타낸다. 따라서, 용어 "FSH"는 특히 FSH 제조물 또는 조성물 내의 모든 FSH 단백질의 전체를 나타낸다.
바람직하게는, FSH 단백질의 둘 모두의 서브유닛은 폴리펩티드 사슬에 부착된 하나 이상의 탄수화물 구조를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 탄수화물 구조는 서브유닛의 아스파라긴 잔기에 부착된다. 특히 바람직한 구체예에서, 알파 서브유닛은 Asn52 및 Asn78에 부착된 2개의 탄수화물 구조를 포함하고/하거나 베타 서브유닛은 Asn7 및 Asn24에 부착된 2개의 탄수화물 구조를 포함한다. 탄수화물 구조를 갖는 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:1 및 2 각각에 따른 알파 및 베타 서브유닛의 인간 아미노산 서열과 관련하여 표시된다. 인간 FSH의 당 부분은 바람직하게는, 푸코스, 갈락토스, 만노스, 갈락토사민, 글루코사민, 및/또는 시알산으로 구성된다.
본 발명에 따라 사용되는 FSH는 바람직하게는 재조합 FSH, 더욱 바람직하게는 재조합 인간 FSH이다. 용어 "재조합 FSH"는 살아있는 인간 또는 동물 신체에 의해 자연 생성되지 않고, 인간 또는 동물 신체로부터 유래된 샘플, 예를 들어, 인간 또는 동물 신체의 소변, 혈액 또는 다른 체액, 배설물 또는 조직으로부터 수득되는 FSH를 나타낸다. 바람직하게는, 재조합 FSH는 생물공학적으로 조작된 세포, 특히 FSH를 엔코딩하는 핵산 또는 FSH의 알파 또는 베타 서브유닛으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포로부터 수득된다. 바람직한 구체예에 따르면, 재조합 FSH는 FSH를 엔코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 인간 세포로부터 수득된다. 각각의 외인성 핵산은, 예를 들어, 숙주 세포로 도입될 수 있는 하나 이상의 발현 벡터를 이용함으로써, 예를 들어, 트랜스펙션을 통해 도입될 수 있다. 재조합적으로 생성되는 단백질 및 FSH에 대한 각각의 방법은 종래 분야에 널리 공지되어 있고, 따라서 추가 설명이 필요 없다.
본 발명에 따른 FSH는 바람직하게는 FSH, 더욱 바람직하게는 인간 세포, 바람직하게는 인간 세포주에서의 생성에 의해 수득가능한 인간 FSH이다. 인간 세포주는 바람직하게는 인간 혈액 세포로부터 유래되고, 특히 이는 골수 세포주, 바람직하게는 골수성 백혈병 세포주이다. 세포주는 바람직하게는 무한증식 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 FSH의 생성을 위한 세포주는 Glycotope GmbH(Robert-Rossle-Str, 10, 13125 Berlin (DE))에 의해 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)(Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 부다페스트 조약의 요구조건에 따라 등록 번호 DSM ACC3078로 2010년 7월 28일에 수탁된 세포주 GT-5s, 또는 이로부터 유래된 세포주, 또는 상동성 세포주이다. GT-5s는 본원에 기재된 바와 같은 특정 당화 패턴을 제공할 수 있는 무한증식 인간 골수성 백혈병 세포주이다. 본 발명에 따르면, 용어 "GT-5s" 및 "GT-5s 세포주"는 또한 GT-5s로부터 유래된 세포 또는 세포주를 포함한다. GT-5s로부터 유래되는 세포주는, 예를 들어, 이러한 세포주의 돌연변이 비율을 향상시키기 위해 임의로 GT-5s 세포를 처리한 후에 GT-5s 배양으로부터 세포의 단일한 클론 또는 세포군을 무작위적 또는 특별히 선택하거나, GT-5s 세포주를 유전적으로 변경시킴에 의해 수득될 수 있다. 선택된 세포의 클론 또는 세포군은 상기 기재된 바와 같이 추가로 처리될 수 있고/있거나 추가 라운드의 선택이 수행될 수 있다. GT-5s에 상동성인 세포주는 특히 무한증식 인간 골수성 세포주이다. 바람직하게는, GT-5s로부터 유래되거나 이와 상동성인 세포주는 GT-5s로부터 수득된 것과 유사한 당화 패턴을 갖는 FSH를 제공할 수 있다. 바람직하게는, GT-5s로부터 유래되거나 이와 상동성인 세포주에 의해 생성되는 FSH는 본원에 기재된 바와 같은 당화 특징, 특히 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및/또는 적어도 30%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및/또는 적어도 30%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산; 및/또는 다양한 당화 패턴 중 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에 따르면, GT-5s로부터 유래되거나 이와 상동성인 세포주는 본원에서 바람직한 것으로 기재되는 당화 패턴, 특히 표 1로부터 선택된 당화 패턴을 갖는 FSH를 발현할 수 있다. GT-5s로부터 유래되거나 이와 상동성인 세포주에 의해 생성되는 FSH의 유사한 당화 패턴은 바람직하게는 특히 상대량의 bisGlcNAc, 상대량의 시알화된 글리칸, 상대량의 황산화된 글리칸, 상대량의 2,6-커플링된 시알산, 상대량의 푸코스, 상대량의 테트라안테나리인 글리칸, 상대량의 갈락토스를 갖는 글리칸 분지, 및 Z 수로 구성되는 군으로부터 선택된 당화 패턴 중 하나 이상, 바람직하게는 상기 당화 패턴 모두에서 20% 또는 그 미만, 바람직하게는 15% 또는 그 미만, 10% 또는 그 미만 또는 5% 또는 그 미만만큼 GT-5s로부터 수득된 FSH의 당화 패턴과 상이하다. 또한, 본 발명에 따른 FSH는 바람직하게는 FSH, 더욱 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 특정 당화 특징, 바람직하게는 표 1로부터 선택된 당화 패턴을 갖는 인간 FSH이다. 세포주 GT-5s 뿐만 아니라 이로부터 유래된 세포주 및 이에 상동성인 세포주가 특히 유리한데, 이는 이들이 특히 FSH 단백질과 관련하여 매우 안정적이고 균일한 단백질 생성을 제공하기 때문이다. 이들은 매우 우수한 배치간 일관성(batch-to-batch consistency)을 가지며, 즉, 생성된 단백질 및 이의 당화 패턴은 다양한 생성 작업으로부터 수득되거나, 다양한 스케일 및/또는 다양한 배양 절차로 생성되는 경우에 유사하다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 다양한 당화 패턴은 FSH를 발현시키기 위해 상기 세포주를 이용하는 다양한 생성 작업에서 매우 재현성이 있다.
본 발명에 따른 FSH는 당화되고, 즉, 이는 폴리펩티드 사슬에 부착된 하나 이상, 바람직하게는 4개의 올리고당류에 의해 변형된다. 글리칸 또는 탄수화물로도 언급되는 이러한 올리고당류는 선형 또는 분지된 당류 사슬일 수 있고, 바람직하게는 복합체-유형의 N-결합된 올리고당류 사슬이다. 분지의 수에 따라, 올리고당류는 모노-, 비-, 트리- 또는 테트라안테나리(또는 심지어 펜타안테나리)로 언급된다. 모노안테나리 올리고당류는 분지되어 있지 않은 반면, 비-, 트리- 또는 테트라안테나리 올리고당류는 각각 1개, 2개 또는 3개의 분지를 갖는다. 따라서, 보다 높은 안테나리티(antennarity)를 갖는 당단백질은 보다 많은 올리고당류 종점을 갖고, 더욱 기능성인 말단 당류 단위, 예를 들어, 시알산을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "적어도 트리안테나리"는 트리안테나리, 테트라안테나리 및 펜타안테나리 올리고당류를 포함하는 적어도 3의 안테나리티를 갖는 올리고당류를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "적어도 테트라안테나리"는 테트라안테나리 및 펜타안테나리 올리고당류를 포함하는 적어도 4의 안테나리티를 갖는 올리고당류를 나타낸다. 복합체-유형 N-글리칸과 관련하여, 이등분면 GlcNAc 잔기는 바람직하게는 분지 또는 안테나로 간주되지 않고, 따라서 FSH의 안테나리티에 추가되지 않는다.
본원에서 언급되는 FSH의 당화 패턴은 특히 본 발명에 따른 FSH 제조물 내의 모든 FSH 단백질의 전체 당화 패턴을 나타낸다. 특히, FSH 단백질 내에 포함되고, 이에 따라 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 임의의 글리칸 구조가 당화 패턴에서 고려되고 반영된다.
용어 "시알산"은 특히 뉴라민산의 임의의 N- 또는 O-치환된 유도체를 나타낸다. 이는 5-N-아세틸뉴라민산 및 5-N-글리콜릴뉴라민산 둘 모두를 나타낼 수 있으나, 바람직하게는 5-N-아세틸뉴라민산만을 나타낸다. 시알산, 특히 5-N-아세틸뉴라민산은 바람직하게는 2,3- 또는 2,6-결합을 통해 탄수화물 사슬에 부착된다. 바람직하게는, 본원에 기재된 FSH 제조물에서, 2,3- 뿐만 아니라 2,6-커플링된 시알산 둘 모두가 존재한다.
FSH의 시알화 정도는 보통 Z-수로 표현된다. Z-수는 당단백질의 글리칸 구조의 상대 음성 전하를 나타낸다. Z-수는 하기 식에 의해 계산된다:
Z = A1% * 1 + A2% * 2 + A3% * 3 + A4% * 4
상기 식에서, A1%는 -1의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A2%는 -2의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A3%는 -3의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이고, A4%는 -4의 전하를 갖는 글리칸의 백분율이다. 이러한 백분율은 하전된 글리칸 뿐만 아니라 하전되지 않은 글리칸을 포함하는 FSH에 부착된 모든 글리칸과 관련하여 계산된다. 글리칸의 전하는 글리칸에 포함된 임의의 하전된 단당류 단위 또는 치환기, 특히, 시알산 잔기 및/또는 설페이트기 및/또는 포스페이트기에 의해 제공될 수 있다. FSH의 글리칸의 전하는 일반적으로 이의 시알산 잔기에 의해서만 결정되고, FSH는 일반적으로 4개의 글리칸 구조를 가지므로, Z-수는 FSH 상의 시알산의 양 또는 FSH의 산도에 대한 지표이다. 그러나, FSH가 또한 유의한 양의 황산화된 글리칸을 포함하는 경우, Z-수는 시알산 및 설페이트기의 조합된 양에 대한 지표이다.
본 발명에 따른 "상대량의 글리칸"은 FSH 제조물의 FSH 당단백질 또는 FSH를 포함하는 조성물 내의 FSH 당단백질 각각에 부착된 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 특히, 상대량의 글리칸은 FSH 단백질 내에 포함되고, 이에 따라 FSH 제조물 또는 FSH를 포함하는 조성물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 100%의 글리칸은 FSH 제조물의 FSH 당단백질 또는 FSH를 포함하는 조성물 내의 FSH 당단백질 각각에 부착된 모든 글리칸을 나타낸다. 예를 들어, 60%의 상대량의 이등분면 GlcNAc를 갖는 글리칸은, FSH 단백질 내에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 60%가 이등분면 GlcNAc 잔기를 포함하는 반면, FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 40%가 이등분면 GlcNAc 잔기를 포함하지 않는 FSH 제조물을 나타낸다.
본원에 제공된 상기 수, 특히 특정 당화 특성의 상대량은 바람직하게는 근사값 수로 이해되어야 한다. 특히, 상기 수는 바람직하게는 10% 이내로 더 높고/높거나 낮을 수 있고, 특히 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내로 더 높고/높거나 낮을 수 있다.
"FSH 제조물"은 FSH를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 조성물 또는 물질일 수 있다. 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있고, FSH에 더하여 추가 성분을 포함할 수 있다. 특히, FSH 제조물은 FSH 및 적합한 용매, 예를 들어, 물 및/또는 알콜을 포함하는 용액, 또는, 예를 들어, FSH를 함유하는 용액의 동결건조 후에 수득되는 분말일 수 있다. FSH 제조물의 적합한 예는 세포 내에서의 FSH의 발현 후, 특히 FSH 또는 FSH를 포함하는 약학적 조성물의 정제 후에 수득되는 조성물이다. FSH 제조물은 FSH에 더하여, 예를 들어, 용매, 희석제, 부형제, 안정화제, 보존제, 염, 애쥬번트 및/또는 계면활성제를 함유할 수 있다. 용어 "FSH 제조물"은 특히 "FSH를 포함하는 조성물"의 의미로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 바람직하게는 본원에서 유의어로 사용된다.
"상대량의 2,6-커플링된 시알산"은 전체량의 시알산에서 2,6-커플링된 시알산이 차지하는 특정 백분율 또는 백분율 범위를 나타낸다. 따라서, 100%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산은 모든 시알산이 2,6-커플링된 시알산인 것을 의미한다. 예를 들어, 60%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산은 FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 단백질의 올리고당류 사슬에 부착되는 모든 시알산의 60%가 2,6-결합을 통해 부착되는 반면, FSH 단백질에 포함되고, 이에 따라 상기 FSH 제조물 내의 FSH 단백질의 올리고당 사슬에 부착되는 모든 시알산의 40%가 2,6-결합을 통해 부착되지 않고, 예를 들어, 2,3-결합 또는 2,8-결합을 통해 부착되는 FSH 제조물을 나타낸다.
용어 "다양한 당화 패턴"은 특히 당화 패턴이 다수의 상이한 글리칸 구조를 포함하는 제조물 또는 조성물 내의 FSH 단백질의 당화 패턴을 나타낸다. 상이한 글리칸 구조는 적어도 하나의 단당류 단위 및/또는 적어도 하나의 화학적 변형, 예를 들어, 설페이트 잔기, 아세틸 잔기 등의 존재/부재, 양 및/또는 위치가 상이한 올리고당류 구조이다. 특정한 "상이한 글리칸 구조"는 바람직하게는 이의 상대량이 당화 패턴 내의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.02%, 더욱 바람직하게는 적어도 0.03%, 적어도 0.05%, 적어도 0.07%, 적어도 0.1%, 적어도 0.15%, 적어도 0.2%, 적어도 0.25%, 적어도 0.3% 또는 적어도 0.5%인 경우에만 이와 관련된 것으로 간주된다. 다양한 당화 패턴은 특히 적어도 5개의 상이한 글리칸 구조를 포함하는 당화 패턴이다. 바람직하게는, 다양한 당화 패턴은 적어도 7개, 더욱 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 가장 바람직하게는 적어도 60개의 상이한 글리칸 구조를 포함한다. 다양한 당화 패턴은 특히 당화 패턴이 각각의 제조물 또는 조성물 내에서 CHO 세포로부터 수득되는 FSH보다 더 상이한 글리칸 구조를 포함하는 제조물 또는 조성물 내의 FSH의 당화 패턴을 나타낸다. 특히, 당화 패턴은 CHO 세포로부터 수득되는 FSH보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 더 상이한 글리칸 구조를 포함한다.
용어 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥 핵산 및 리보핵산 뿐만 아니라 데옥시리보핵산을 포함한다. 이는 자연 발생 뿐만 아니라 합성 누클레오티드를 포함할 수 있고, 이는, 예를 들어, 메틸화, 5'- 및/또는 3'-캡핑에 의해 자연적 또는 합성적으로 변형될 수 있다.
용어 "벡터"는 이의 가장 보편적인 의미로 본원에서 사용되고, 이는 핵산이, 예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 숙주 세포에 도입되고, 적절한 경우 숙주 세포의 유전체로 통합되는 것을 가능케 하는 상기 핵산에 대한 임의의 중간 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 복제되고/되거나 발현된다. 벡터는 바람직하게는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 적합한 선택 마커는 숙주 세포에, 예를 들어, 특정 항생제에 대한 내성을 제공하는 내성 유전자이다. 추가의 적합한 선택 마커는, 예를 들어, DHFR 또는 GS와 같은 효소에 대한 유전자이다. FSH 뿐만 아니라 적합한 발현 카세트 및 숙주 세포에서 높은 수율로 재조합 단백질의 발현을 가능케 하는 발현 구성요소를 포함하는 재조합 단백질의 발현을 가능케 하는 벡터는 종래 분야에 널리 공지되어 있고, 또한 시판되며, 따라서 본원에서 상세한 설명을 필요로 하지 않는다.
용어 "세포" 및 "세포들" 및 "세포주"는 상호교환적으로 사용되고, 바람직하게는 하나 이상의 포유동물 세포, 특히 인간 세포를 나타낸다. 상기 용어는 세포 또는 세포 집단의 프로제니(progeny)를 포함한다. 당업자는 "세포들"이 단일 세포의 프로제니를 포함하고, 프로제니가 자연적, 우연적, 또는 계획적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 본래의 모(parent) 세포와 반드시 완전히 동일(형태 또는 전체 DNA 상보성에서)할 필요가 없음을 인지할 것이다. "세포"는 바람직하게는 살아있는 인간 또는 동물 신체 내에 통합되지 않는 분리된 세포 및/또는 배양된 세포를 나타낸다.
용어 "환자"는 본 발명에 따르면 인간, 비인간 영장류 또는 또 다른 동물, 특히 포유동물, 예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류, 예를 들어, 마우스 및 래트를 의미한다. 특히 바람직한 한 구체예에서, 환자는 인간이다. 인간 환자의 경우, FSH는 바람직하게는 인간 FSH이다. 환자는 남성 또는 여성일 수 있고, 바람직하게는 여성이다.
용어 "약학적 조성물"은 특히 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약학적으로 허용되는 성분을 함유하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 활성 화합물 또는 이의 염 또는 프로드러그와 함께 담체, 희석제 또는 약학적 부형제, 예를 들어, 완충제, 보존제 및 긴장성 개질제를 포함한다.
FSH에 대한 국제 단위(IU)는 인간 소변 FSH 및 LH에 대한 네번째 국제 표준(Storring, P.L. & Gaines Das, R.E. (2001) Journal of Endocrinology 171, 119-129)을 의미하며, 이는 증가된 난소 중량 증가 방법(Steelman, S.L. & Pohley, F.M, (1953) Endocrinology 53, 604-616)에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 용어 "불임 치료"는 인간 또는 동물 피검체의 생식 또는 출산과 관련된 기능이상 또는 질병의 치료를 의미한다. 특히, 불임 치료는 보조생식기술, 배란유도, 체외수정, 자궁강내 정액주입 뿐만 아니라 종자 세포 성숙, 예를 들어, 난포생성 및 정자발생의 구현가능(enablement) 또는 개선을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "유의한 양의 cAMP가 방출되지 않음" 또는 유사한 표현 각각은 특히 cAMP의 최대 방출을 발생시키는 농도의 FSH를 이용한 자극 후에 세포 또는 조직에 의해 수득되는 cAMP 방출의 양의 25% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 15% 미만, 10% 미만, 7.5% 미만, 5% 미만 또는 2.5% 미만의 양의 세포 또는 조직에 의한 cAMP의 방출을 나타낸다. 이러한 세포 또는 조직은 과립막 세포 또는 세르톨리 세포와 같은 FSH에 의한 자극에 민감하거나 반응하기 쉽다. FSH와 독립적인 cAMP 방출, 즉, FSH의 부재하에서 또한 발생하는 cAMP 방출은 상기와 관련된 것으로 간주되지 않아야 한다. 바람직하게는, "유의한 양의 cAMP의 방출" 또는 "cAMP의 유의한 방출"은 FSH의 부재하에서의 cAMP 방출을 초과하는 임의의 cAMP의 방출, 특히, 측정의 부정확성을 초과하는 cAMP의 임의의 검출가능한 방출이다. cAMP 방출을 측정하기 위한 표준 절차는 실시예에 기재되어 있고, 이는 cAMP의 유의하거나 유의하지 않은 방출을 결정하는데 사용될 수 있다. "cAMP의 방출"은 cAMP의 세포내 방출 및/또는 cAMP의 세포외 방출 또는 분비, 바람직하게는 cAMP의 분비만을 나타낸다. cAMP는 세포 신호전달에서 두번째 메신저 분자로 작용하는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트를 나타낸다. cAMP는 아데닐릴 사이클라제에 의해 ATP로부터 세포내에서 합성된다. "cAMP 신호전달과 독립적"인 생물학적 과정 또는 신호전달 경로는 바람직하게는 아데닐릴 사이클라제의 활성화를 수반하지 않는다.
생식샘스테로이드 또는 성 호르몬으로도 공지된 "성 스테로이드"는 특히 척추동물 안드로겐 또는 에스트로겐 수용체와 상호작용하는 스테로이드 호르몬을 나타낸다. 용어 "성 스테로이드"는 안드로겐, 예를 들어, 합성대사스테로이드, 안드로스텐디온, 데히드로에피안드로스테론, 디히드로테스토스테론 및 테스토스테론; 에스트로겐, 예를 들어, 에스트라디올, 에스트리올 및 에스트론; 및 프로게스테론을 포함한다. 바람직하게는, 성 스테로이드는 자연 발생 성 스테로이드, 더욱 바람직하게는 자연 인간 성 스테로이드를 나타낸다. 본 발명에 따른 바람직한 성 스테로이드는 에스트라디올 및 프로게스테론, 특히 프로게스테론이다.
본 발명은 최적의 당화 패턴을 갖는 개선된 재조합 FSH 제조물이 유의한 cAMP 방출이 유도되지 않는 낮은 FSH 농도에서 프로게스테론과 같은 성 스테로이드의 분비를 유도할 수 있다는 발견을 기초로 하는 한 양태에 따른다. 특히, 이러한 특정 양태에서, 본 발명에 따른 개선된 FSH는 통상적으로 사용되는 소변 FSH 또는 CHO 세포로부터 수득된 재조합 FSH보다 훨씬 낮은 농도에서 성 스테로이드 분비를 유도한다. 이에 의해, 유해효과의 위험을 감소시키고, 또한 생산 비용을 낮추는 개선된 FSH가 훨씬 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 동등한 용량으로 제공되는 경우, 이러한 구체예에서 개선된 FSH는 통상적으로 사용되는 FSH에 비해 환자의 신체에서 보다 긴 활성을 제공하는데, 이는 투여 후 긴 시간 후에 매우 낮은 농도의 FSH만이 순환에 남아 있는 경우에도, 본 발명의 상기 구체예에 따른 FSH가 여전히 이의 생물학적 활성을 발휘하고, 바람직하게는 종자 세포 성숙 및/또는 성 스테로이드의 방출을 자극하거나 공동자극하기 때문이다. 더욱이, 높은 농도에서, 본 발명에 따른 개선된 FSH 및 통상적으로 사용되는 소변 또는 CHO-유래 FSH는 동등한 효과를 나타낸다. 따라서, 통상적으로 사용되는 FSH에 비해 과다투여의 추가 위험이 없다.
또한, 본 발명자는 본 발명에 따른 개선된 FSH가 통상적으로 사용되는 소변 또는 CHO-유래 FSH와 비교하는 경우 유사하거나 심지어 더 높은 약리학적 효과를 갖는 것을 시노몰구스 원숭이에서 입증하였다. 이는, 본 발명에 따른 FSH가 래트 및 원숭이에서 소변 또는 CHO 세포로부터 수득된 통상적인 FSH 제조물보다 낮은 최대 혈청 농도(Cmax) 및 순환 반감기를 나타내므로 특히 놀랍다. 보다 낮은 생체이용율에도 불구하고, 개선된 FSH는 유사하거나 보다 높은 약리학적 효과를 가지므로, 본 발명에 따른 개선된 FSH가 소변 또는 CHO-유래 FSH보다 높은 특정 치료 활성을 갖는 것으로 결론내릴 수 있다. 수득된 임상 데이터에 따르면, 인간에서, 본 발명에 따른 개선된 FSH는 통상적인 FSH 제조물보다 유의하게 높은 Cmax를 갖지만; 순환 반감기는 약간 낮고, 그렇지만, 개선된 FSH에 대해서는 동등하였다. 가장 놀랍게는, 본 발명에 따른 개선된 FSH 제조물은 인간에서의 치료 효과, 특히 단일 용량만의 투여 후에도 난포 성장을 나타내었다. 대조적으로, 통상적으로 사용되는 FSH 제조물의 단일 용량 투여 후에는 효과가 관찰될 수 없다. 따라서, 개선된 FSH를 이용하여 환자의 훨씬 더 정밀한 치료가 가능한 것이 예상된다. 특히, 환자의 불임을 치료하고 특히 개선시키기 위해 정확하게 일정 시간에 지정되고 크기 조절된 용량을 이용하는 것이 가능하며, 잠재적으로 장기간의 지속적인 치료가 필요하지 않다. 이에 의해, 또한 다태 임신의 위험이 감소된다.
요약하면, 본 발명에 따른 개선된 FSH 제조물이 더욱 효과적이다. 따라서, 보다 작은 용량이 환자에게 투여될 수 있고, 이는 보다 적은 유해효과를 야기시키고, 환자에 대해 더욱 편리하고, 덜 비용집약적이다. 또한, 더욱 특이적이고 상세한 투여 요법이 개선된 FSH를 이용하여 가능하다. 또한, 감소된 반감기는 원치않는 부작용을 감소시키고, 요법의 종료 후에 인간 신체로부터 FSH의 신속한 제거를 또한 제공한다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 본 발명에 따른 FSH 제조물의 보다 높은 특이적 치료 활성은 개선된 당화 패턴을 기초로 하는 것으로 추정한다. 특히, 이등분면 GlcNAc 잔기의 높은 양 및/또는 2,6-커플링된 시알산의 높은 양 뿐만 아니라 황산화된 글리칸의 높은 양이 높은 활성의 원인일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 FSH 제조물은 또한 훨씬 더 다양하고 복잡한 당화 패턴을 나타내고, 이는, 예를 들어, CHO 세포로부터 수득된 통상적인 FSH 제조물에 비해 제조물에 더욱 다양한 글리칸 구조가 존재하는 것을 의미한다. CHO-유래 FSH는 표적 세포에서 하나의 단일한 경로만을 활성화시킬 수 있는 반면, 본 발명에 따른 개선된 FSH는 이의 독특한 당화 패턴으로 인해 다수의 상이한 경로를 통해 이의 생물학적 활성을 명백히 발휘하여 증가된 생물학적 반응을 발생시키는 것으로 생각된다. 본원의 실험 데이터에 의해 제시되는 바와 같이, 이러한 경로 중 일부는 cAMP 신호전달을 수반하는 반면, 다른 신규한 경로는 cAMP 독립적이다.
상기 발견의 관점에서, 본 발명은, 첫번째 양태에서, FSH 제조물을 제공하며, 이러한 제조물 내의 FSH는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 당화 패턴을 갖는다:
(i) 적어도 20%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및/또는
(ii) 적어도 30%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및/또는
(iii) 적어도 30%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산; 및/또는
(iv) 다양한 당화 패턴.
특정 구체예에서, 본 발명은 FSH 제조물을 제공하며, 이러한 제조물 내의 FSH는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 당화 패턴을 갖는다:
(i) 적어도 35%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 적어도 60%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및
(iii) 적어도 30%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산.
바람직하게는, 상기 FSH는 재조합 FSH이고, 이에 따라 숙주 세포, 바람직하게는 인간 숙주 세포 내에서의 재조합 생성에 의해 수득된다. 각각의 당화 패턴을 제공하는 적합한 인간 숙주 세포가 이후에 기재된다.
바람직하게는, 당화 패턴은 상기 특징 (i), (ii) 및 (iii) 중 적어도 2개(특히, 특징 (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), 또는 (ii) 및 (iii)), 더욱 바람직하게는 상기 특징 (i), (ii) 및 (iii) 모두를 포함한다. 또한, 당화 패턴은 적어도 15%의 상대량의 적어도 테트라안테나리인 글리칸, 및/또는 적어도 80%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸, 및/또는 적어도 95%의 상대량의 갈락토스를 갖는 글리칸, 및/또는 적어도 60%의 상대량의 말단 갈락토스 단위를 갖는 글리칸 분지, 및/또는 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 2.5%의 상대량의 설페이트기를 갖는 글리칸을 추가로 포함할 수 있다. 말단 갈락토스 단위는 임의로 시알산 잔기를 추가로 가질 수 있다. 조성물 내의 재조합 FSH는 바람직하게는 적어도 200의 Z-수를 갖는다.
bisGlcNAc를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 25%, 적어도 27%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 38% 또는 적어도 40%이다. 더욱 바람직하게는, 이는 약 25% 내지 약 60%의 범위, 특히 약 35% 내지 약 60%의 범위 또는 약 38% 내지 약 50%의 범위 또는 약 40% 내지 약 45%의 범위이다. 한 구체예에 따르면, 이는 약 42%이다. 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 83%, 적어도 85% 또는 적어도 88%, 더욱 바람직하게는 약 85% 내지 약 98%의 범위 또는 약 88% 내지 약 95%의 범위, 가장 바람직하게는 약 90%이다. Z-수는 바람직하게는 적어도 210, 더욱 바람직하게는 적어도 215, 적어도 220, 적어도 230 또는 적어도 240이다. 보다 높은 Z-수는, 예를 들어, 산성 및/또는 음성으로 하전된 FSH 단백질에 대해 FSH 제조물을 부화시킴으로써 수득된다. 바람직하게는, 적어도 테트라안테나리인 글리칸의 상대량은 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18% 또는 적어도 19%, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 또는 적어도 21%이다. 적어도 트리안테나리인 글리칸, 특히 트리- 및 테트라안테나리인 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55%이다. 바람직하게는, 푸코스를 갖는 글리칸의 상대량은 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 또는 적어도 78%이다. 이는 약 70% 내지 약 90% 범위, 특히 약 75% 내지 약 85% 범위일 수 있다. 바람직하게는, 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 53%, 적어도 55%, 적어도 60% 또는 적어도 65%, 특히 약 40% 내지 약 99% 범위, 바람직하게는 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 60% 또는 약 53% 내지 약 70%이다. 바람직하게는, 2,3-커플링된 시알산 대 2,6-커플링된 시알산의 비는 약 1:10 내지 약 7:3, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 3:2 또는 약 1:2 내지 약 1:1, 가장 바람직하게는 약 2:3 내지 약 1:1 범위이다. 바람직한 구체예에서, 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 2,3-커플링된 시알산의 상대량을 초과한다. 갈락토스를 갖는 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 약 98%이다. 바람직하게는, 시알산 잔기에 의해 임의로 변형되는 갈락토스 단위를 갖는 글리칸 분지의 상대량은 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 또는 적어도 73%이다. 이는 바람직하게는 약 60% 내지 약 95%의 범위, 더욱 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%의 범위이다. 바람직하게는, 설페이트기(황산화된 글리칸)를 갖는 글리칸의 상대량은 적어도 1%, 적어도 1.5%, 적어도 2%, 적어도 2.5%, 적어도 3% 또는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 7%, 적어도 10% 또는 적어도 12%이다. 한 구체예에 따르면, 설페이트기를 갖는 글리칸의 상대량은 50%, 바람직하게는 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20%를 초과하지 않는다.
바람직한 구체예에서, 제조물 내의 FSH는 다양한 당화 패턴을 가지며, 상기 제조물 내의 FSH는 적어도 45개 또는 바람직하게는 적어도 50개의 상이한 글리칸 구조를 포함하고, 상기 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%의 상대량을 갖는다. 한 구체예에 따르면, 제조물 내의 FSH는 적어도 35개 또는 바람직하게는 적어도 40개의 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상기 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.1%의 상대량을 갖고/갖거나, 제조물 내의 FSH는 적어도 20개 또는 바람직하게는 적어도 25개의 상이한 글리칸 구조를 포함하고, 상기 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나는 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.5%의 상대량을 갖는다. 한 추가 구체예에서, 제조물 내의 FSH는 상응하는 제조물 내의 CHO 세포로부터 수득되는 FSH보다 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50% 더 상이한 글리칸 구조를 포함하며, 상기 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나는 각각의 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%, 0.1% 또는 0.5%의 상대량을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 N-글리콜릴 뉴라민산(NeuGc) 또는 검출가능한 양의 NeuGc를 포함하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 또한 바람직하게는 Galili 에피토프(Galα1,3-Gal 구조) 또는 검출가능한 양의 Galili 에피토프를 포함하지 않는다.
본 발명은 특히 인간 당화 패턴을 갖는 FSH를 제공한다. 이러한 당화 특성으로 인해, 부작용을 유도하는 외래 면역원성 비-인간 구조가 부재하며, 이는 특정한 외래 당 구조, 예를 들어, 설치류 생성 시스템에 대해 공지된 면역원성 비-인간 시알산(NeuGc) 또는 Galili 에피토프(Gal-Gal 구조), 또는, 예를 들어, 효모 시스템으로부터 공지된 바와 같은 면역원성 고-만노스 구조와 같은 다른 구조에 의해 야기되는 것으로 공지된 원치않는 부작용 또는 불이익이 회피되는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 제조물 내의 재조합 FSH의 당화 패턴은 하기 특징 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 포함한다:
(i) 약 25% 내지 약 50% 범위의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 적어도 35%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸;
(iii) 적어도 53%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;
(iv) 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸; 및
(v) 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리인 글리칸.
특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 하기 표 1에 나열된 당화 패턴 중 하나를 갖는다:
표 1: 특정한
당화
파라미터
표 1에 나열된 구체예 1 내지 12에서, 바람직하게는 이등분면 GlcNAc의 상대량은 적어도 20% 대신 적어도 25%이고/이거나; 2,6-커플링된 시알산의 상대량은 바람직하게는 적어도 53% 대신 적어도 55%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%이고/이거나; 황산화된 글리칸의 상대량은 바람직하게는 적어도 2.5% 대신 적어도 3%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%이다. 표 1에 나열된 당화 패턴은 바람직하게는 인간 당화 패턴이고/이거나 NeuGc 및 Galili 에피토프를 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은 인간 숙주 세포 또는 인간 세포주에서의 생성에 의해 수득되는 재조합 FSH 제조물을 제공한다. 바람직하게는, 재조합 FSH는 인간 골수 세포주, 바람직하게는 무한증식 인간 골수성 백혈병 세포주, 특히 세포주 GT-5s 또는 이로부터 유래되는 세포주 또는 GT-5s에 상동성인 세포주로부터 수득된다. 상기 세포주에서 생성된 FSH는 상기 기재된 바와 같은 당화 패턴을 나타내고, 특히 본원에 기재된 유리한 치료 및 약리학적 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 적합한 세포주, 특히 상기 기재된 바와 같은 세포주, 바람직하게는 세포주 GT-5s, GT-5s로부터 유래된 세포주 또는 GT-5s에 상동성인 세포주에서 FSH를 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합 FSH 제조물을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 각각 생성되는 재조합 FSH는 분리되고, 임의로 정제될 수 있다.
따라서, 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 (i) FSH의 발현에 적합한 조건하에서 FSH 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산을 포함하는 인간 세포주, 바람직하게는 세포주 GT-5s 또는 상동성 세포주로부터 유래된 인간 세포주를 배양하는 단계; 및 (ii) FSH를 분리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다.
발현에 사용되는 인간 숙주 세포는 바람직하게는 골수세포, 특히 무한증식 골수성 백혈병 세포이고, 바람직하게는 세포주 GT-5s이거나 이로부터 유래되거나, 이와 상동성인 세포주이다. 인간 숙주 세포는, 이들이 FSH를 발현하도록 배양된다. 적합한 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다.
FSH의 분리는 바람직하게는, (a) FSH가 인간 세포에 의해 분비되는 배양 상층액을 수득하거나, FSH가 분비되지 않는 인간 세포를 용해시키는 단계; (b) 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 배양 상층액 또는 세포 용해질로부터 FSH를 분리시키는 단계; 및 (c) 임의로, 바람직하게는 염기성 FSH 이소형을 제거하는 세척 단계, 예를 들어, 약 pH 5.0 또는 약 pH 4.5 또는 약 pH 4.0에서의 세척 단계를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 염기성 FSH 이소형을 제거함으로써 FSH의 산성 분획을 수득하는 단계의 추가 단계를 포함한다.
바람직하게는, FSH 알파 서브유닛을 코딩하는 핵산 및 FSH 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산이 인간 숙주 세포에서의 발현을 가능케 하는 적합한 발현 벡터에 포함되는 발현 카세트에 포함된다. FSH 알파 서브유닛을 코딩하는 핵산 및 FSH 베타 서브유닛을 코딩하는 핵산은 동일한 벡터에 포함될 수 있으나, 바람직하게는 별개의 벡터에 포함된다. 또한, 이들은 또한 IRES 구성요소와 같은 적절한 구성요소를 이용하여 하나의 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포에 의해 분비된다. 바람직한 구체예에서, 인간 세포의 배양은 발효기 내 및/또는 혈청 비함유 조건하에서 수행된다.
재조합 FSH에 적합한 정제 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 61/263,931호, 유럽 특허 출원 번호 EP 09 014 585.5호 및 PCT 특허 출원 번호 WO 2011/063943호에 기재되어 있다.
인간 숙주 세포 또는 인간 세포주에서의 생성에 의해 수득가능한 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물과 관련하여 본원에 기재된 특징을 나타낸다. 특히, 이의 당화 패턴은 상기 기재된 특징 중 하나 이상, 바람직하게는 표1 및/또는 청구항 제 1항 내지 제 6항에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 당화 패턴을 포함한다.
본 발명의 양태의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH는 재조합 인간 FSH(rhFSH), 바람직하게는 인간 세포주에서의 생성에 의해 수득가능한 재조합 인간 FSH(rhFSH), 예를 들어, 인간 FSH 서브유닛을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 및 숙주 세포 내에서 상기 하나 이상의 핵산을 발현시키기 위한 구성요소를 포함하는 세포주 GT-5s이다. 바람직하게는, rhFSH의 알파 서브유닛은 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열, 또는 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:1과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 상동성 또는 바람직하게는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에서, rhFSH의 알파 서브유닛은 위치 52 및 78에 아스파라긴 잔기를 포함하고, 이는 아미노산 Asn52 및 Asn78에서 당화된다. rhFSH의 베타 서브유닛은 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열, 또는 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:2와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 상동성 또는 바람직하게는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에서, rhFSH의 베타 서브유닛은 위치 7 및 24에 아스파라긴 잔기를 포함하고, 이는 아미노산 Asn7 및 Asn24에서 당화된다.
한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 (a) cAMP의 유의한 양이 방출되지 않는 농도에서, 및/또는 (b) cAMP 신호전달과 독립적인 신호전달 경로를 유도함에 의해 과립막 세포 내의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있다.
한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의해 종자 세포 성숙을 자극하거나 공동자극할 수 있다. 놀랍게도, 상기 기재된 당화 패턴이 본원에 기재된 약리학적 및 치료 장점을 나타내는 재조합 FSH의 각각의 새로운 약리학적 프로파일을 발생시키는 것이 실험에서 밝혀졌다.
본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 과립막 세포 검정에서 결정될 수 있는 바와 같은(예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같음) 이후에 기재되는 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다. 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 상기 기재된 당화 패턴을 갖는 재조합 FSH 및 특히 세포주 GT-5s에서의 생성에 의해 수득가능한 재조합 FSH는 본원에 기재된 약리학적 및 치료적 장점을 발생시키는 이후의 기재되는 특징을 나타낸다.
재조합 FSH 제조물은 과립막 세포에 의한 cAMP 방출의 유도에 필요한 최소 농도 아래인 농도에서 과립막 세포 내의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있는 한 구체예에 따른다. 하기 언급되는 프로게스테론, 에스트라디올 및/또는 cAMP의 방출은 특히 하기 실시예 2에 기재된 바와 같은 조건하에서 약 1*104 내지 약 1*106 과립막 세포/ml, 바람직하게는 약 5*104 내지 약 1*105 과립막 세포/ml의 시험관내 방출을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 cAMP 방출을 유도하지 않거나, 20pmol/ml 미만, 15pmol/ml 미만, 10pmol/ml 미만, 5pmol/ml 미만의 cAMP 방출을 유도하는 농도에서 적어도 100ng/ml, 적어도 150ng/ml, 적어도 200ng/ml, 바람직하게는 적어도 250ng/ml, 적어도 300ng/ml 또는 적어도 400ng/ml의 프로게스테론을 방출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)에 의해 요구되는 농도보다 낮은 FSH 농도에서 적어도 100ng/ml, 적어도 200ng/ml, 바람직하게는 적어도 300ng/ml 또는 적어도 400ng/ml의 프로게스테론을 방출할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)가 상응하는 각각의 동등하게 높은 프로게스테론의 방출을 발생시키지 않는 농도에서 적어도 100ng/ml, 적어도 200ng/ml, 바람직하게는 적어도 300ng/ml 또는 적어도 400ng/ml의 프로게스테론을 방출할 수 있다. 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 FSH는 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)보다 더욱 강하게 프로게스테론의 생성의 자극을 각각 유도한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 cAMP 방출을 유도하지 않거나, 20pmol/ml 미만, 15pmol/ml 미만, 10pmol/ml 미만, 5pmol/ml 미만의 cAMP 방출을 유도하는 FSH 농도에서 적어도 50nmol/l, 적어도 75nmol/l, 적어도 100nmol/l, 적어도 125nmol/l 또는 적어도 150nmol/l의 에스트라디올을 방출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)에 의해 요구되는 농도보다 낮은 FSH 농도에서 적어도 50nmol/l, 적어도 75nmol/l, 적어도 100nmol/l, 적어도 125nmol/l, 적어도 150nmol/l, 적어도 200nmol/l, 적어도 250nmol/l, 적어도 300nmol/l 또는 적어도 350nmol/l의 에스트라디올을 방출할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)가 상응하는 각각의 동등하게 높은 에스트라디올의 방출을 발생시키지 않는 농도에서 적어도 50nmol/l, 적어도 75nmol/l, 적어도 100nmol/l, 적어도 125nmol/l, 적어도 150nmol/l, 적어도 200nmol/l, 적어도 250nmol/l, 300nmol/l 또는 적어도 350nmol/l의 에스트라디올을 방출할 수 있다. 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)보다 더욱 강하게 에스트라디올의 생성의 자극을 각각 유도한다.
cAMP 방출 및 성 스테로이드의 발현에 대한 본원에 기재된 각각의 특징은, 예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이 과립막 세포 검정을 이용하여 분석되고 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 바람직하게는 약학적 조성물로 제공된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 본원에 정의된 바와 같은 불임 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물을 포함하는 약학적 조성물이다. 약학적 조성물은 추가의 약학적 활성제, 특히 다른 생식샘자극호르몬, 특히 LH 및/또는 CG, 바람직하게는 재조합 및/또는 인간 LH 또는 CG와 같은 불임 치료에 유용한 특정 추가 작용제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 재조합 FSH를 포함하는 약학적 조성물은 상기 추가 약학적 활성제와 조합하여 사용되도록 설계될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 불임 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물 뿐만 아니라 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 환자로의 투여를 포함하는 불임 치료 방법을 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 유의한 양의 cAMP가 방출되지 않는 농도에서 이미 프로게스테론과 같은 성 스테로이드의 방출, 특히 과립막 세포에서의 프로게스테론의 방출을 자극하거나 공동자극할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 FSH는 과립막 세포에 의한 cAMP 방출의 유도에 필요한 최소 농도 미만의 농도에서 과립막 세포에서 프로게스테론과 같은 성 스테로이드의 방출을 자극할 수 있다.
더욱이, 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 cAMP 신호전달과 독립적인 신호전달 경로의 유도에 의해 프로게스테론의 방출, 특히 과립막 세포에서의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있다. 바람직하게는, 불임 치료는 본 발명에 따른 재조합 FSH에 의해 cAMP 신호전달과 독립적인 신호전달 경로를 유도하여 프로게스테론 방출을 자극하는 것을 포함한다. 그러나, cAMP 신호전달을 포함하는 다른 신호전달 경로가 재조합 FSH에 의해 추가로 활성화될 수 있다. 다른 구체예에서, 불임 치료는 본 발명에 따른 재조합 FSH에 의한 cAMP의 유의한 방출의 유도를 수반하지 않는다.
추가 구체예에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의해 종자 세포 성숙을 자극하거나 공동자극할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 cAMP와 또한 독립적인 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 상기 기재된 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의한 종자 세포 성숙을 자극하거나 공동자극하기 위한 상기 기재된 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 유의한 cAMP 방출이 유도되지 않는 FSH 농도에서 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 상기 기재된 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 통상적으로 사용되는 소변 FSH 또는 CHO 세포로부터 수득되는 재조합 FSH보다 훨씬 낮은 농도에서 성 스테로이드 분비를 유도하기 위한 상기 기재된 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 불임 치료를 위한 각각의 용도의 약리학적 및 치료적 장점이 상기에 상세히 논의되어 있다.
특히, 불임 치료는 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의한 종자 세포 성숙의 자극 또는 공동자극을 포함할 수 있다. 그러나, 불임 치료는 추가로 cAMP 신호전달을 수반하는 하나 이상의 다른 생물학적 과정에 의한 종자 세포 성숙의 자극을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 불임 치료는 상기 다른 생물학적 과정에 의한 종자 세포 성숙의 자극을 수반하지 않는다.
종자 세포 성숙은 바람직하게는 난포 성장 및/또는 정자발생을 포함한다. 더욱이, FSH가 종자 세포 성숙을 자극하는 생물학적 과정은 바람직하게는 과립막 세포에 의한 성 스테로이드, 특히 프로게스테론의 분비를 포함할 수 있다. 바람직하게는, cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정은 메신저 분자로서 cAMP를 수반하지 않는 신호전달 경로에 의해 유도되는, 바람직하게는 과립막 세포에 의한 성 스테로이드, 특히 프로게스테론의 분비를 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 단지 단일 용량의 투여 후에도 생물학적 효과를 유도할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 FSH 제조물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 FSH 제조물 또는 약학적 조성물의 단지 단일 용량의 투여 후 환자, 특히 인간 환자에서 난포 성장 및/또는 난자 성숙을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 단지 단일 용량의 투여 후에 달성된 생물학적 효과가 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물에 비해 더 높고, 특히 난포 성장 및/또는 난자 성숙이 치료되는 환자의 보다 높은 비율에서 더욱 현저하고/하거나 달성된다. 특히, 상기 단일 용량은 적어도 10 IU FSH, 바람직하게는 적어도 15 IU FSH, 적어도 20 IU FSH 또는 적어도 25 IU FSH, 및/또는 1000 IU FSH 또는 그 미만, 바람직하게는 750 IU FSH 또는 그 미만, 500 IU FSH 또는 그 미만, 300 IU FSH 또는 그 미만, 200 IU FSH 또는 그 미만, 150 IU FSH 또는 그 미만, 100 IU FSH 또는 그 미만 또는 50 IU FSH 또는 그 미만을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단일 용량은 약 10 IU 내지 약 500 IU FSH, 더욱 바람직하게는 약 20 IU 내지 약 300 IU FSH, 예를 들어, 약 25 IU FSH, 약 75 IU FSH 또는 약 100 IU FSH를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물보다 낮은 순환 반감기를 갖는다. 특히, 이는 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서 낮은 순환반감기를 갖는다. 바람직하게는, 순환 반감기는 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물의 순환 반감기보다 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 낮다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물, 특히 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서의 FSH 제조물보다 낮은 생체이용율을 갖는다. 바람직하게는, 생체이용율은 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물의 생체이용율보다 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 더 낮다. 이와 관련된 생체이용율은 바람직하게는 혈청 FSH 농도가 규정된 양의 FSH의 투여 후 다양한 시점에서 결정되는 약동학 연구에서 수득되는 곡선하영역(AUG) 값을 나타낸다. 순환 반감기 및 생체이용율은 바람직하게는 피하 주사에 의한 FSH의 투여 후, 특히 단일 용량 투여 후에 결정되며, 상기 단일 용량은 바람직하게는 약 10 내지 약 1000 IU FSH, 더욱 바람직하게는 약 25 IU 내지 약 500 IU FSH 또는 약 50 IU 내지 약 300 IU FSH, 특히 약 100 IU FSH를 포함한다. 특히, 순환 반감기 및 생체이용율은 하기 실시예 6에 개시된 바와 같이 결정된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물, 특히 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서의 FSH 제조물의 치료 효능과 유사하거나 심지어 더 높은 치료 효능을 갖는다. 용어 "치료 효능"은 바람직하게는 피검체에 투여되는 경우 에스트라디올 및/또는 인히빈-B의 방출을 자극하는 능력을 나타낸다. 치료 효능은 바람직하게는 피하 주사에 의한 FSH의 투여 후, 특히 단일 용량 투여 후에 하나 이상의 피검체의 혈액 또는 혈청 내의 에스트라디올 및/또는 인히빈-B 농도를 측정함으로써 결정되며, 상기 단일 용량은 바람직하게는 약 10 내지 약 1000 IU FSH, 바람직하게는 약 25 IU 내지 약 500 IU FSH 또는 약 50 IU 내지 약 300 IU FSH, 특히 약 100 IU FSH를 포함한다. 특히, 치료 효능은 하기 실시예 5에 개시되는 바와 같이 결정된다. 특히, 유사한 치료 효능은 서로 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하로 상이한 에스트라디올 및/또는 인히빈-B 혈청 농도를 발생시키는 각각의 FSH 제조물에 의한 에스트라디올 및/또는 인히빈-B 방출의 자극을 나타낸다.
특히, 인간 소변으로부터 수득되는 FSH 제조물은 폐경후 여성의 소변으로부터 수득된다. CHO 세포에서 발현된 FSH 제조물은, 예를 들어, CHO 세포주 CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]에서 발현된다. 인간 소변으로부터 수득된 FSH 제조물 및 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물, 특히 Bravelle 및 Gonal-f 각각은 바람직하게는 시판되고, 승인된 약학적 제조물이다. 다양한 FSH 제조물의 효과, 특히 FSH 제조물의 순환 반감기, 생체이용율 및 치료 효능을 비교하는 경우, FSH 제조물은 동일한 투여 경로 및 유사하거나 동일한 추가 조건을 이용하여 동일 투여 요법으로 유사한 피검체 군에 이들을 투여함으로써 분석된다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 5 IU/L 미만의 환자의 순환 내 FSH 농도를 발생시키는 용량으로 환자에 투여된다. 특정 구체예에서, 환자에게 투여되는 용량은 약 4 IU/L 미만, 특히 약 3 IU/L 미만, 약 2 IU/L 미만, 약 1 IU/L 미만 또는 약 0.5 IU/L 미만인 환자의 순환 내 FSH 농도를 발생시킨다. 환자의 순환 내 FSH의 농도는, 예를 들어, 약 0.01 내지 약 5 IU/L, 특히 약 0.05 내지 약 2 IU/L, 약 0.1 내지 약 1.5 IU/L 또는 약 0.2 내지 약 1 IU/L 범위이다. 특히, FSH는 cAMP의 유의한 방출을 유도하지 않는 용량으로 환자에 투여된다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 특정 구체예에서 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 상기 농도에서 치료 효과를 유도한다. 그러나, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 또한 환자의 순환 내에서 보다 높은 FSH 농도를 발생시키는 용량으로 투여될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 불임 치료는 보조생식기술, 배란유도, 체외수정, 예를 들어, 세포질내정자주입을 이용한 체외수정, 생식세포자궁관내이식, 자궁강내 정액주입, 여성에서의 무배란 장애의 치료, 여성에서의 난자 성숙에 대한 중증 호르몬 결핍 장애의 치료, 남성에서의 정자 생성 결핍의 치료, 및/또는 종자 세포 성숙, 예를 들어, 난포생성 및 정자발생, 특히, 예를 들어, 체외수정 자극 프로토콜 동안 및/또는 무배란 장애 치료를 위한 여성에서의 난포 성숙의 구현가능(enablement) 또는 개선을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 FSH 제조물은 환자로의 비경구 투여용이다. 특히, 재조합 FSH는 주사 또는 주입, 예를 들어, 정맥내, 근내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 재조합 FSH는 약학적 조성물로 제공된다. 적합한 투여 요법은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 당 분야의 일반적 지식으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 단일 단위 용량 또는 다수 단위 용량의 형태로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 본 발명에 따른 재조합 FSH를 포함하고, 용매, 예를 들어, 물, 완충 물질, 안정화제, 보존제, 부형제, 계면활성제 및 염으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 멸균 용액이다. 단일 단위 용량은 바람직하게는 약 10 IU 내지 약 750 IU FSH, 더욱 바람직하게는 약 25 IU 내지 약 500 IU FSH, 약 50 IU 내지 약 400 IU FSH, 또는 약 100 IU 내지 약 300 IU FSH를 포함한다. 다수 단위 용량은 다수의 단일 용량, 특히, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20 또는 적어도 50의 단일 용량을 제공하기에 충분한 FSH를 포함한다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 주사 펜의 형태로 존재할 수 있다.
도면
도 1은 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 제조물 1: 빈 사각형, 제조물 2: 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 수득된 FSH(Gonal F; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 cAMP 방출을 도시한다.
도 2는 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 제조물 1: 빈 사각형, 제조물 2: 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 수득된 FSH(Gonal F; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 에스트라디올 합성을 도시한다.
도 3은 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 제조물 1: 빈 사각형, 제조물 2: 채워진 삼각형) 또는 CHO 세포로부터 수득된 FSH(Gonal F; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 프로게스테론 합성을 도시한다.
도 4는 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 cAMP 방출을 도시한다.
도 5는 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 에스트라디올 합성을 도시한다.
도 6은 다양한 농도의 개선된 재조합 인간 FSH(FSH(발명); 빈 사각형) 또는 소변 FSH(Fostimon; 채워진 다이아몬드)로 자극된 분리된 과립막 세포의 프로게스테론 합성을 도시한다.
도 7은 표준 소변 FSH 및 CHO 세포로부터 수득된 표준 재조합 FSH에 비한 개선된 재조합 인간 FSH를 이용한 Steelman-Pohley 검정의 결과를 도시한다. 3일 동안의 매일 투여 후의 미성숙 암컷 래트에서의 난소 중량 증가가 사용되는 FSH 농도에 대해 플로팅된다.
도 8은 FSH(발명), 소변 FSH Bravelle 또는 CHO 세포에서 발현되는 재조합 FSH Gonal-f의 단일(A) 및 반복(B) s.c. 주사 후의 시노몰구스 원숭이에서 관찰된 에스트라디올(E2) 및 인히빈-B의 혈청 농도를 도시한다. 각각의 막대는 4마리의 동물의 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 9는 단일 i.v. 또는 s.c. 주사 후의 암컷 시노몰구스 원숭이에서의 FSH의 혈청 농도를 도시한다. 각각의 기호는 4마리의 동물 군의 평균 값을 나타낸다.
도 10은 FSH 당화 부위에 부착될 수 있는 복합체-유형 글리칸 구조의 개략적 도면을 도시한다. (a) 비안테나리, (b) 트리안테나리 및 (c) 테트라안테나리 구조가 제시된다. 시알산 및 갈락토스 잔기 중 하나 이상이 또한 상기 구조에 부재할 수 있고, 상기 구조는, 예를 들어, 이등분면 GlcNAc 잔기, 푸코스 잔기 및/또는 설페이트기를 추가로 포함할 수 있다. Sia: 시알산; Gal: 말단 갈락토스로도 본원에 언급되는 갈락토스; GlcNAc: N-아세틸글루코사민; Man: 만노스.
실시예
실시예 1: FSH (발명)의 제조
FSH는 인간 FSH의 알파 및 베타 사슬(알파 사슬 등록 번호 NT_007299.13; 베타 사슬 등록 번호 NT_009237.18)을 갖는 2개의 발현 작제물로 안정적으로 트랜스펙션된 GT-5s 세포의 배양에 의해 생성된다. FSH 알파 사슬의 발현을 위한 플라스미드는 자연 형태보다 효소 억제제 메토트렉세이트에 대해 보다 높은 내성을 갖는 뮤린 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)의 돌연변이된 형태의 유전자를 가지며, FSH 알파 사슬의 발현을 위한 두번째 플라스미드는 퓨로마이신 내성 유전자를 갖는다.
FSH(발명) 발현을 위한 세포주의 트랜스펙션을 상기 기재된 2개의 발현 플라스미드를 이용한 누클레오펙션(nucleofection)에 의해 수행하였다. 안정적 항체 생성 세포 클론의 선택 및 증폭을 위해, 퓨로마이신 및 메토트렉세이트를 증가하는 농도로 첨가하였다. 증폭된 세포 푸울(pool)을 Clone PixFL 기술에 의한 단일 세포 클로닝 또는 제한희석에 의한 단일 세포 클로닝을 위해 반고체 매트릭스에 시딩하였다. 클론을 온전한 FSH 분자의 고분비에 대해 스크리닝하였다.
FSH는 혈청 비함유 조건하에서 회분(batch), 유가배양(fed-batch) 또는 관류 과정의 최종 FSH 생성 GT-5s 클론의 발효에 의해 생성된다. 발효는 보통 2-3주 동안 수행된다.
발효 후, 상층액은 0.2 ㎛ 필터를 이용한 멸균 여과 단계 전에 세포 및 세포 부스러기를 제거하기 위해 2 ㎛ 필터를 통해 여과된다. 정제 방법은 포획 단계로서 역상 크로마토그래피(RPC) 후, 농축 단계 및 이후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한다. 임의로, 용리액이 이후 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 적용되어 덜 산성인 FSH 내용물이 제거된다. 이는 요망되는 FSH 분획의 용리 전에 덜 산성인 FSH 이소형을 용리하기 위해 pH 5.0("pH 5.0에서의 부화") 또는 pH 4.5("pH 4.5에서의 부화")에서의 세척 완충액을 이용한 결합된 FSH의 세척에 의해 수행된다. 연마 단계로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 높은 순도로 FSH가 획득된다.
실시예 2: 과립막 세포 검정
과립막 세포 검정을 수행하기 위해, 일차 세포가 난모세포의 수집 동안 IVF 환자의 난포액으로부터 분리된다. 적혈구 세포와 같은 다른 세포 유형을 제거하는 Ficoll 구배 원심분리 후, 과립막 세포는 안드로스텐디온(androstendione) 또는 테스토스테론을 함유하는 배양 배지에서 5-7일 동안 24 내지 96 웰 플레이트 포맷에 시딩된다. 상기 기간 후, 세포(웰 당 2 내지 4*104 세포)가 다이어그램에 제시된 단계(웰 당 400 ㎕ 배지)에서 1 pg/ml 내지 2 ㎍/ml 사이의 범위의 FSH로 자극된다. 3 내지 4시간의 인큐베이션 후, 상층액의 절반이 cAMP 검정을 수행하기 위해 수거된다. 또 다른 24시간 후, 세포가 나머지 상층액에서의 동결 해동에 의해 용해된다. 용해질이 프로게스테론 및 에스트라디올 검정에서 적용된다.
FSH(발명) 및 Gonal F의 비교
첫번째 세트의 실험에서, FSH(발명)가 Gonal F(Merck Serono SA)와 비교된다. Gonal F는 CHO 세포에서 재조합적으로 생성된 FSH이다. 결과는 도 1 내지 3에 제시된다. 두번째 메신저 cAMP가 동등한 FSH 농도의 Gonal F 및 FSH(발명) 생성물에서 동등한 양으로 생성되는 반면, 스테로이드 프로게스테론 및 에스트라디올은 CHO 세포에서 재조합적으로 생성되는 FSH(Gonal F)에 비해 FSH(발명) 생성물의 경우에 훨씬 낮은 FSH 농도에서 방출된다.
FSH(발명) 및 Fostimon의 비교
또 다른 세트의 실험에서, FSH(발명)를 인간 소변에서 분리된 FSH 생성물인 Fostimon(IBSA Institut Biochimique SA)에 대해 비교하였다. 결과가 도 4 내지 6에 제시된다. cAMP 수준은 둘 모두의 생성물에 대해 동등한 용량 범위의 FSH에서 유사하게 발생하는 반면, 성 스테로이드는 Fostimon에 비해 유의하게 낮은 농도의 FSH(발명)에서 생성된다.
주: 상기 검정은 다양한 공여자를 이용하여 수행되므로, 자극 프로파일에서의 차이는 각각의 검정에서 사용되는 공여자에 기인될 수 있다.
실시예 3: Steelman-Pohley 검정
FSH의 활성을 또한 Steelman-Pohley 검정에 의해 결정하였다. 검정을 약전에 따라 수행하였다. 특히, 미성숙 암컷 래트에서의 난소 중량 증가를 3일 동안 매일 각각 제공되는 3개의 상이한 FSH 농도의 투여 후에 측정하였다. 역가가 평행선 평가를 이용하여 계산된다. 결과가 도 7에 제시된다.
표 2: 소변 FSH과의 비교 후의 FSH(발명)의 계산된 활성
소변 표준의 활성: 7,135 IU/mg
Steelman-Pohley 검정에 의해 입증되는 바와 같이, FSH(발명) 및 소변 및 재조합 표준 FSH의 생체내 활성은 래트에서 유사하다.
실시예 4: 글리코프로파일링(Glycoprofiling)
다양한 FSH 제조물의 글리코프로파일을 당화의 구조 분석에 의해 결정하였다. 글리코프로파일링은 당화 부위의 복잡한 글리칸 구조에 대한 정보를 발생시킨다. 글리코프로파일링을 위해, 온전한 N-글리칸이 PNGase F를 이용하여 단백질 코어로부터 방출된다. 명백한 정밀검사(workup)를 위해 젤 또는 젤 블록에서 분해가 수행된다. 자유 N-글리칸이 형광 마커 2-아미노벤즈아미드로 표지된다. N-글리칸의 정제된 샘플이 형광측정법 검출과 함께 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)에 의해 분리된다. 이러한 분석은 하기 결과를 제공하였다:
표 3: 다양한
당화
특성의 상대량
표시된 단위를 갖는 FSH에 대한 N-글리칸의 상대량이 제시된다. Puregon은 CHO 세포에서 생성된 또 다른 재조합 인간 FSH이다.
또한, FSH의 글리칸 내의 2,3-커플링된 시알산 및 2,6-커플링된 시알산의 비를, 시알리다제 A(2,3- 및 2,6-커플링된 시알산 분해) 및 시알리다제 S(2,3-커플링된 시알산만 분해함)에 의해 방출된 시알산의 양을 비교함으로써 분석하였다.
표 4: 시알산 결합의 상대량
FSH(발명)에서, 2,3-커플링된 시알산보다 2,6-커플링된 시알산을 더 포함하는 시알산 잔기는 약 1:1의 비의 2,3- 및 2,6-결합에 의해 글리칸에 커플링되는 반면, 소변 FSH Bravelle(Ferring Pharmaceuticals Inc.)에서, 상기 비는 약 3:1로 2,3-결합된 시알산이 선호된다. CHO 세포에서의 재조합 생성으로 인해, Puregon(Organon/EssexPharma) 및 Gonal F(Merck Serono)는 어떠한 이등분면 N-아세틸갈락토사민도 갖지 않으며, 2,3-커플링된 시알산만 포함한다.
안테나리티, 말단 갈락토스 단위 및 Z-수를 상기 측정, 및 FSH로부터의 방출 후의 글리칸의 전하 분포의 결정에 의해 계산하였다.
표 5: 다양한
FSH
의
당화의
안테나리티
FSH 상의 비-, 트리- 및 테트라안테나리 N-글리칸의 상대량이 제시된다.
표 6: 말단 갈락토스 단위의 상대량
말단에 갈락토스 단위를 갖는 FSH 상의 N-글리칸 분지의 상대량이 제시된다.
표 7: 다양한 FSH의 Z-수
FSH 제조물의 Z-수, 즉, 상대 산도가 제시된다. 보다 높은 Z-수는 보다 산성인 FSH 제조물을 나타낸다.
결론적으로, 본 발명에 따른 FSH(FSH(발명))는 특히 산성 이소형의 부화 후에 높은 정도의 이등분면 N-아세틸글루코사민, 높은 안테나리티 및 높은 정도의 시알화, 및 높은 황산화 정도를 갖는다. 상기 3개의 당화 파라미터 중 하나 이상으로 인해, FSH(발명)는 통상적인 재조합 또는 소변 FSH 제조물에 비해 우수한 활성을 갖는 것으로 추정된다.
또한, FSH(발명)는 또한 고도로 푸코실화되며, 약 1:1의 2,3- 대 2,6-시알화의 비 또는 보다 높은 양의 2,6-시알화를 갖는다.
또한, FSH 제조물의 글리칸 구조를 또한 방출된 글리칸의 질량분광법에 의해 분석하였다. 하기 결과가 수득되었다:
표 8: 다양한
당화
특성의 상대량
표 9: 다양한
FSH
의
당화의
안테나리티
표 10: 황산화된 글리칸의 상대량
설페이트 기를 갖는 FSH 상의 N-글리칸의 상대량이 제시된다.
실시예 5: 약리학적 효과
FSH(발명)의 약리학적 프로파일을 암컷 래트 및 원숭이에서의 다양한 생체내 약리학 및 독성학 연구 및 생체내 생물학적 검정에서 연구하였다. 분자 마커로서, 에스트라디올 및 인히빈-B를 사용하였다. 이들 마커는 FSH를 이용한 자극 후에 난소에 의해 방출된다. 에스트라디올은 난포 성장 및 성숙을 책임지는 반면, 인히빈-B는 자연 네거티브 피드백 메커니즘의 일부이다. 더욱이, 인히빈-B는 FSH에 의한 난소 자극에 대한 우수한 대용 마커인 것으로 이전에 밝혀졌다.
5.1 성숙한 래트에서의 FSH 처리
100 IU FSH(발명)/kg의 b.w.에 의한 단일 s.c. 용량으로 성숙한 암컷 래트를 처리한 후, 혈청 인히빈-B 수준은 투여 후 2-3일 동안 증가하였고, 다시 기준선 수준으로 감소하였다. 100 IU FSH(발명)를 이용한 발정주기에 따른 래트의 반복 투여는 혈청 프로게스테론 및 인히빈-B의 현저한 증가를 발생시켰고, 이는 다수의 배란 후 황체 세포에서의 호르몬 발생을 반영한다. 1200 IU FSH(발명)/kg의 7-d 반복 용량이 투여된 용량 범위 발견 연구에서 유사한 발견을 관찰하였다. 동일 연구에서 연구된 참조 생성물(Gonal-f, Bravelle)을 함유하는 FSH에 비한 FSH(발명)의 약역학 활성의 차이가 관찰될 수 없었다.
암컷 래트에서 수행된 28-일의 반복 용량 독성 연구에서, 난소의 용량-관련 확장 및 그라프 난포(Graafian follicle)의 수의 증가가 모든 용량 군(30, 100, 300 IU/kg b.w.)에 대해 관찰되었다. 상기 발견과 관련하여, 대조군에 비해 상승된 인히빈-B 수준이 처리 기간 동안 인지되었다. 처리된 동물의 인히빈-B 수준은 30 IU FSH(발명)/kg b.w./일의 저용량 수준에서 시작하는 용량-관련 방식에서 증가되었다. 모든 발견은 완전히 가역적이었다.
5.2
성숙 원숭이에서의 FSH 처리
FSH(발명)의 단일 및 반복 용량 후의 약리학 프로파일을 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 시노몰구스 원숭이는 인간에 대한 밀접한 유사성을 기초로 하여 가장 적절한 동물 모델로 간주된다. 상기 연구는 규칙적 월경 주기를 나타내는 성적으로 성숙한 암컷 동물로의 FSH의 단일 용량 투여로 구성되었다. 상기 동물을 이의 발정주기의 단계를 기초로 하여 시험군으로 무작위로 할당하였다. 동물로의 시험 항목 투여를 월경 개시 1 내지 3일 후에 시작하였다. 상기 연구는 4개의 군을 포함하였고, 이는 100 IU/kg b.w.의 FSH(발명), 소변 FSH Bravelle 또는 CHO 세포에서 발현된 재조합 FSH Gonal-f의 단일한 s.c. 볼루스 주사에 의해 처리된 4마리의 동물을 각각 포함하였다. 에스트라디올 및 인히빈-B 수준의 분석을 위한 혈액 샘플링을 투여전, 및 투여 후 지정된 시점에 모든 동물로부터 수행하였다. 투여 후의 시점을 발정주기의 다양한 단계를 반영하도록 선택하였다. 결과가 도 8A에 제시된다.
모든 시험된 FSH 물질에 대해, 처리된 동물의 에스트라디올 및 인히빈-B 수준은 시험 물질의 단일 투여 후 5일 동안 증가하였고, 기준선 수준으로 다시 감소하였다. 표준 중기-주기 에스트라디올 서지(surge)가 시험일 14 내지 22일에서 거의 모든 동물에 대해 관찰되었다. FSH(발명)는 에스트라디올 수준에서 가장 높은 증가를 나타내었다. 이러한 실험은 낮은 AUG 수준에서 FSH(발명)에 대해 적어도 동등한 약리학적 효능을 입증(실시예 6 참조)하며, 이는 수용체 자극에서의 높은 활성을 나타낸다.
추가로, 원숭이에 반복된 FSH 용량이 투여되는 유사한 연구를 수행하였다. 상기 반복된 용량 연구는 3개의 군을 포함하였고, 이는 연속적인 7일 동안 100 IU/kg b.w.의 FSH(발명), Bravelle 또는 Gonal-f의 반복된 매일의 s.c. 볼루스 주사에 의해 처리된 4마리의 동물을 각각 포함하였다. 혈액 샘플링은 단일 용량 연구에 기재된 바와 같았다. 100 IU FSH(발명)/kg b.w., 100 IU Bravelle/kg b.w. 또는 100 IU Gonal-f/kg b.w.로 s.c.로 반복적으로 처리된 동물의 에스트라디올 및 인히빈-B 수준은 7일의 전체 처리 기간에 걸쳐 증가하였다(도 8B 참조). 처리 종료 후, 호르몬 수준은 천천히 감소하였고, 5-7일 후에 정상 수준에 도달하였다. FSH(발명)의 반복 투여 후에 관찰된 최대 에스트라디올 및 인히빈-B 농도는 단일 투여 후에 관찰된 농도에 비해 훨씬 높았고, 이를 또한 정상 발정주기의 수준과 비교하였다. FSH(발명)의 반복된 s.c. 투여 후에 관찰된 약역학 효과는 이러한 생성물 부류에 대해 예상된 바와 같았고, 동일 연구에서 참조 생성물에 대해 관찰된 효과와 동등하였다.
난포 성장의 유도
약역학 파라미터의 분석이 포함된 4-주의 아만성 독성 연구를 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 4마리의 성적으로 성숙한 암컷 시노몰구스 원숭이를 각각 포함하는 4개 군에 28일 동안 매일 1회 반복된 피하 주사에 의해 FSH(발명)를 처리하였다. 용량 수준은 저용량, 중간 용량, 및 고용량 군 각각에 대해 30, 100, 및 300 IU/kg b.w./일이었다. 상기 주요 연구에 더하여, 군 당 2마리의 암컷 동물을 대조군 및 고용량 군에 대해 6주 회복 기간을 예정하였다. 에스트라디올 및 인히빈-B의 분석을 위한 혈액 샘플을 처리 기간(투여전, 1일 및 28일) 전 및 처리 기간 종료시, 17일에서 6시간 p.a., 및 회복 기간(70일)의 종료시에 회수하였다.
4주 동안 30, 100 또는 300 IU FSH(발명)/kg b.w./일을 이용한 반복 처리는 절대 및 상대 난소 중량을 증가시켰고, 최종 희생시에 그라프 난포의 수를 증가시켰다. 추가로, 모든 용량 군의 소수의 동물은 황체의 수에서의 약간의 감소를 나타내었다. 상기 발견과 관련하여, 에스트라디올 및 인히빈-B의 증가된 혈청 수준이 모든 용량 군에서 관찰되었다.
5.3
유해효과의 분석
FSH(발명)의 임의의 예상치 않은 유해효과의 위험을 분석하기 위해, 주요 안전성 약리학 파라미터(ECG, 심장박동수, 혈압, 호흡률)를 래트 및 시노몰구스 원숭이에서의 4주 중요 독성 연구에 포함시켰다. 상기 연구는 주요 시스템에 대한 FSH(발명)의 일반적 작용에 대한 어떠한 증거를 제공하지 않았고, 이에 따라, FSH(발명)는 안전한 것으로 간주될 수 있고, 유해한 부작용을 나타내지 않는다.
실시예 6: 약동학
연구의 목적은 시노몰구스 원숭이로의 피하 또는 정맥내 투여에 의한 Bravelle 및 Gonal-f에 비한 FSH(발명)의 생체이용율 및 약리학을 연구하기 위한 것이었다. 상기 연구를 규칙적 월경주기를 나타내는 성적으로 성숙한 암컷 동물로 수행하였다. 동물을 이의 발정주기의 단계를 기초로 하여 시험 군에 무작위적으로 할당하였다. 동물로의 시험 항목 투여를 월경 개시 1 내지 3일 후에 시작하였다. 연구는 4개의 군을 포함하였고, 이는 100 IU/kg b.w. FSH(발명)의 단일한 i.v. 볼루스 주사 또는 100 IU/kg b.w, FSH(발명), Bravelle® 또는 Gonal-f®의 단일한 s.c. 볼루스 주사에 의해 처리된 4마리의 동물을 각각 포함하였다. FSH 수준의 분석을 위한 혈액 샘플링을 투여 후 여러 시점에서 모든 동물로부터 수행하였고, 이는 발정 주기의 다양한 단계를 반영하였다.
동물 중 어느 것도 연구의 과정 동안 조기에 사망하지 않았고, 전신 독성의 임상적 증상을 나타내지 않았다. 시험 또는 참조 항목-관련 영향 또는 국소 불내성이 인지되지 않았다.
186.13 mIU FSH/mL의 Cmax-수준이 100 IU FSH(발명)/kg b.w.를 이용한 단일한 s.c. 치료 후 8 시간 p.a.에서 인지되었다. FSH(발명)의 계산된 평균 혈청 제거 반감기는 16.85 시간이었다. 혈청 수준이 도 9에 제시된다. 단일 노출 후의 원숭이 혈청에서의 독성역학 파라미터의 평균 값이 표 11에 제공된다.
표 11: 암컷 시노몰구스 원숭이로의 FSH의 단일한 s.c. 볼루스 주사 후에 계산된 독성역학 파라미터.
72.77%의 상대 생체이용율(F)이 정맥내로 투여된 FSH(발명)에 비해 피하 투여 후의 FSH(발명)에 대해 계산되었다. 하기의 FSH-노출비가 단일 노출 후에 인지되었다: FSH(발명)(s.c.) < FSH(발명)(i.v.) < Bravelle < Gonal-f.
시노몰구스 원숭이에서의 다수 용량 연구 및 래트 및 누드 마우스에서의 연구로부터 유사한 데이터가 또한 수득되었다:
시노몰구스 원숭이에서의 반복 용량 연구를 단일 용량 연구와 유사하게 수행하였다. 상기 연구는 3개의 군을 포함하였고, 이는 연속적인 7일 동안 100 IU/kg b.w. FSH(발명), Bravelle 또는 Gonal-f의 반복된 매일의 s.c. 볼루스 주사에 의해 처리된 4마리의 동물을 각각 포함하였다. 10-1000 IU/kg b.w. Gonal-f의 용량을 사용한 용량을 원숭이에서의 약동학 및 독물학 연구와 관련하여 선택하였다. 동물 중 어느 것도 연구의 과정 동안 조기에 사망하지 않았고, 전신 독성의 임상적 증상을 나타내지 않았다. 시험 또는 참조 항목-관련 영향 또는 국소 불내성이 인지되지 않았다. 결과는 참조 생성물(Gonal-f, Bravelle)을 함유하는 FSH에 비한 원숭이에서의 FSH(발명)의 Cmax- 및 AUC-값이 감소되어, FSH(발명) 처리된 동물에서 더 낮은 약물 노출을 발생시킨 것을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 동일 연구에서 수득된 약리학 데이터는 FSH 수용체의 효과기로서 에스트라디올 및 인히빈-B 생성을 자극하는 능력과 관련하여 FSH 생성물 사이에 차이가 없는 것으로 밝혀졌다(실시예 5 참조).
누드 암컷 마우스에 s.c. 주사에 의해 5 ㎍ FSH를 투여하였고, 혈액에서의 FSH 농도를 모니터하였다. 약동학 프로파일 FSH(발명) 뿐만 아니라 Gonal-f 및 Bravelle이 Cmax 및 AUC0-t last-값과 관련하여 매우 동등하였다. 5.1 ± 1.9 %ID, 6.7 ± 0.4 %ID 및 5.5 ± 0.4 %ID의 Cmax 수준이 FSH(발명), Bravelle 및 Gonal-f의 단일 피하 주사 후에 각각 관찰되었다. 71.6 ± 25.4 %ID, 99.1 ± 12.9 %ID 및 79.7 ± 9.7 %ID의 AUC0-t last-값이 FSH(발명), Bravelle 및 Gonal-f 각각에 대해 관찰되었다. 일반적으로, 혈액으로부터의 청소 및 상대 약물 노출은 연구된 모든 물질에 대해 동등하며, 통계적으로 관련된 차이가 측정되지 않았다. 투여된 FSH의 생체분포의 연구시, 난소 및 자궁에서의 FSH의 축적(또한, 신체로부터의 FSH의 제거에서의 역할로 인해 신장에서의 높은 축적)이 관찰되었다.
성숙 암컷 래트에 s.c. 주사에 의해 100 IU/kg b.w. FSH(발명), Bravelle 또는 Gonal-f의 단일 또는 다수 용량이 제공되었고, FSH의 혈청 농도가 모니터되었다. 결과는 참조 생성물(Gonal-f, Bravelle)을 함유하는 FSH에 비해 래트에서 FSH(발명)의 혈청 반감기 및 AUC-값이 감소되어 FSH(발명) 처리된 동물에서 낮은 약물 노출을 발생시키는 것을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 동일 연구에서 수득된 약리학 데이터는 FSH 수용체의 효과기로서 에스트라디올 및 인히빈-B 생성을 자극하는 능력과 관련하여 FSH 생성물 사이에 차이가 없는 것을 나타내었다(실시예 5 참조).
실시예 7: 인간에서의 약동학 및 약역학
임상 연구에서, FSH(발명)를 지원자에 투여하고, 약동학 및 약역학 파라미터를 결정하였다. 건강한 암컷 지원자에 단일 s.c. 용량으로 25 IU, 75 IU 또는 150 IU FSH(발명)를 투여하였고, 순환에서의 FSH 농도를 모니터하였다. 추가로, 또한 난포의 수 및 크기를 약물처리 전 및 후에 분석하였다.
예비 결과로서, 다양한 연구실에 의해 측정된 소변 및 재조합 FSH의 공개된 데이터에 비해 FSH(발명)의 최대 혈청 농도(Cmax)의 거의 두배가 관찰되었다. 피하 투여 후의 순환 반감기(t1 /2)는 FSH(발명)(~33 h ± 3 h), 재조합 CHO-세포 유래 FSH(Gonal-f: 37 h ± 28 h(le Cotonnec et al. (1994) Fertility and Sterility 61, 679-686) 및 소변 FSH(MetrodinHP: 45 h ± 21 h (le Cotonnec et al. (1993) Human Reproduction 8, 1604-1611)에 대해 동등하다. 약역학 데이터는 난포 성장이 25 IU FSH(발명)의 단일 용량이 이미 투여된 일부 환자에 대해 관찰될 수 있는 것을 나타내었다. 이는 비교측정기 Bravelle 및 Gonal-f의 경우에 관찰될 수 없다. 75 및 150 IU FSH(발명)의 경우, 모든 피검체는 확대된 난포를 나타내었고, 하나의 환자는 크기가 배가된 하나의 난포를 가졌다.
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<211> 92
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1 5 10 15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90
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<211> 111
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85 90 95
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100 105 110
Claims (20)
- 재조합 난포-자극 호르몬(FSH) 제조물 내 재조합 FSH가 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 당화 패턴을 갖는, 재조합 FSH 제조물:
(i) 적어도 20%의 상대량의 이등분면(bisecting) N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸; 및/또는
(ii) 적어도 30%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸; 및/또는
(iii) 적어도 30%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산; 및/또는
(iv) 다양한 당화 패턴. - 제 1항에 있어서, 당화 패턴이 특징 (i), (ii) 및 (iii) 중 적어도 2개, 바람직하게는 특징 (i), (ii) 및 (iii) 모두를 포함하는 재조합 FSH 제조물.
- 인간 세포주 GT-5s 또는 이로부터 유래된 세포주 또는 이와 상동성인 세포주에서의 생성에 의해 수득가능한 재조합 FSH 제조물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 재조합 FSH 제조물:
(a) 적어도 85%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸을 포함하는 당화 패턴;
(b) 적어도 18%의 상대량의 적어도 테트라안테나리(tetraantennary)인 글리칸을 포함하는 당화 패턴;
(c) 적어도 200의 Z-수;
(d) 인간 재조합 FSH; 및/또는
(e) 인간 세포주 또는 인간 세포에 의해 생성됨. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 당화 패턴이 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 재조합 FSH 제조물:
(i) 약 25% 내지 약 50% 범위의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리인 글리칸;
(iii) 적어도 35%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸;
(iv) 적어도 53%의 상대량의 2,6-커플링된 시알산;
(v) 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸;
(vi) 적어도 220의 Z-수;
(vii) 적어도 95%의 상대량의 갈락토스를 갖는 글리칸;
(viii) 적어도 60%의 상대량의 시알산 잔기에 의해 임의로 변형된 말단 갈락토스 단위를 갖는 글리칸 분지;
(ix) 적어도 3%의 상대량의 설페이트기를 갖는 글리칸;
(x) 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%의 상대량을 갖는, 적어도 45개의 상이한 글리칸 구조를 포함함;
(xi) 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.1%의 상대량을 갖는, 적어도 35개의 상이한 글리칸 구조를 포함함;
(xiii) 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나가 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.5%의 상대량을 갖는, 적어도 20개의 상이한 글리칸 구조를 포함함; 및/또는
(xiv) 상이한 글리칸 구조들 중의 각각의 하나가 각각의 제조물 내의 FSH의 글리칸 구조의 전체량의 적어도 0.05%의 상대량을 갖는, 상응하는 제조물 내의 CHO 세포로부터 수득된 FSH와 적어도 40% 더 상이한 글리칸 구조를 포함함. - 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 당화 패턴이 하기 특징을 포함하는 재조합 FSH 제조물:
(i) 약 25% 내지 약 50%의 상대량의 이등분면 N-아세틸글루코사민(bisGlcNAc)을 갖는 글리칸;
(ii) 적어도 16%의 상대량의 적어도 테트라안테나리인 글리칸;
(iii) 적어도 35%의 상대량의 푸코스를 갖는 글리칸;
(iv) 약 53% 내지 약 99% 범위의 상대량의 2,6-커플링된 시알산; 및
(v) 적어도 88%의 상대량의 하나 이상의 시알산 잔기를 갖는 글리칸. - 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 제조물 내의 재조합 FSH가 표 1에 나열된 구체예 중 어느 하나에 따른 당화 패턴을 갖는 재조합 FSH 제조물.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FSH가 (a) cAMP의 유의한 양이 방출되지 않는 농도에서, 및/또는 (b) cAMP 신호전달과 독립적인 신호전달 경로를 유도함에 의해 과립막 세포 내의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있는, 재조합 FSH 제조물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FSH가 cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의해 종자 세포를 자극하거나 공동자극할 수 있는 재조합 FSH 제조물.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, FSH가 과립막 세포 검정으로 결정될 수 있는 바와 같은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 재조합 FSH 제조물:
(a) 과립막 세포에 의한 cAMP 방출의 유도에 필요한 최소 농도 미만의 농도에서 과립막 세포 내의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있음;
(b) cAMP 방출을 유도하지 않거나, 10pmol/ml 미만의 cAMP 방출을 유도하는 FSH 농도에서 약 5*104 내지 약 1*105 과립막 세포/ml에서 적어도 200ng/ml의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있음;
(c) 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)에 의해 요구되는 농도보다 낮은 농도에서 약 5*104 내지 약 1*105 과립막 세포/ml에서 적어도 100ng/ml의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있음; 및/또는
(d) 인간 소변 FSH 또는 CHO 세포에서 생성된 재조합 FSH(Gonal F)가 프로게스테론의 상응하는 방출을 발생시키지 않는 농도에서 약 5*104 내지 약 1*105 과립막 세포/ml에서 적어도 100ng/ml의 프로게스테론의 방출을 자극할 수 있음. - 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, FSH가 단일 용량의 투여 후에 여성 인간에서 난포 성장을 유도할 수 있고, 단일 용량이 바람직하게는 25 내지 500 IU FSH를 포함하고, 바람직하게는 비경구, 특히 피하 주사에 의해 투여되는 재조합 FSH 제조물.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물을 포함하는 약학적 조성물.
- 불임 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 제 12항에 따른 약학적 조성물.
- 제 13항에 있어서, 환자에게 투여되는 용량이 약 0.05 내지 약 2 IU/L, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 IU/L의 범위의 환자의 순환 내 FSH 농도를 발생시키는 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물.
- cAMP와 또한 독립적인 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 제 12항에 따른 약학적 조성물.
- cAMP 신호전달과 독립적인 생물학적 과정에 의한 종자 세포 성숙을 자극하거나 공동 자극하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 제 12항에 따른 약학적 조성물.
- 유의한 cAMP 방출이 유도되지 않는 FSH 농도에서 성 스테로이드의 분비를 유도하고/하거나 자극하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 제 12항에 따른 약학적 조성물.
- 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 보조생식기술, 배란유도, 체외수정, 예를 들어, 세포질내 정자 주입, 생식세포자궁관내이식, 자궁강내 정액주입을 이용한 체외수정, 여성에서의 무배란 장애의 치료, 여성에서의 난자 성숙에 대한 중증 호르몬 결핍 장애의 치료, 남성에서의 정자 생성 결핍의 치료, 및/또는 종자 세포 성숙, 예를 들어, 난포생성 및 정자발생, 특히, 예를 들어, 체외수정 자극 프로토콜 동안 및/또는 무배란 장애 치료를 위한 여성에서의 난포 성숙의 구현가능(enablement) 또는 개선을 포함하는 불임 치료에 사용하기 위한, 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물.
- 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물이 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 재조합 FSH 제조물 또는 약학적 조성물:
(i) 단지 단일 용량의 투여 후에 난포 성장 및/또는 난자 성숙을 유도할 수 있음; 및/또는
(ii) 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물보다 낮은 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서의 순환 반감기를 가짐; 및/또는
(iii) 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물보다 낮은 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서의 생체이용율을 가짐; 및/또는
(iv) 인간 소변으로부터 수득되고/되거나 CHO 세포에서 발현되는 FSH 제조물의 치료 효능과 유사하거나 이보다 높은 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및/또는 마우스 중 하나 이상에서의 치료 효능을 가짐. - 난포 성장 및/또는 난자 성숙을 유도하고/하거나 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 FSH 제조물 또는 제 12항에 따른 약학적 조성물의 용도.
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